用于辅助和新辅助疗法以及早期肿瘤的治疗的vegf特异性拮抗剂的制作方法

专利名称：用于辅助和新辅助疗法以及早期肿瘤的治疗的vegf特异性拮抗剂的制作方法
用于辅助和新辅助疗法以及早期肿瘤的治疗的VEGF特异性拮抗剂
背景技术：
癌是对人类健康最致命的威胁之一。仅在美国，癌每年侵袭近130万名新患者并且是次于心血管疾病的死亡的第二大主要原因，占死亡的约4分之1。实体瘤是造成大多数这类死亡的原因。尽管在某些癌的医学治疗上有了显著的进步，但在过去的20年中，所有癌的总的5年存活率仅提高了约10%。癌或者恶性肺瘤以不受控制的方式转移并迅速生长，使得及时的检测和治疗变得非常困难。
癌治疗的现行方法是相对非选择性的并通常在癌已经发展至更加恶性的阶段后靶向肺瘤。手术移除患病组织；放射疗法收缩实体瘤；以及化学疗法迅速杀死分裂细胞。尤其是化学疗法引起了大量副作用，在某些实例中如此严重以致限制了可提供的剂量并因此阻碍了可能有效的药物的使用。而且，癌常常对化学治疗药物产生耐药性。为了阻止向恶性或转移性状态的发展，借此减少与癌相关的发病率和死亡率，早期或良性肿瘤的治疗是所需要的。
对于大多数新近被诊断为患有可手术的癌的患者来说，标准的治疗是确定性手术以及之后的化学疗法。这种治疗目的在于尽可能多的除去原发的和转移的疾病以便预防复发并提高存活率。事实上，这些患者中的大多数在手术后都不具有残留肿瘤的可见迹象。然而，他们中许多人后来会发生复发并最后死于他们的疾病。这是因为少量存活的肿瘤细胞
后变得无法检测而发生的。
因此，为了在这些残留的微转移的癌细胞开始重新群体化并变得难
重要。在过去的几十年中，辅助疗法上的发展通常是集中于不同化学治疗剂的使用而增加的。许多化学疗法方案已经在辅助地治疗患有早期主要癌适应症例如肺，乳^^和结肠直肠癌的患者中显示出临床益处。
Strauss等人./ C/z.w (9腳/ 22:7019 (2004); International Adjuvant LungCancer Trial Collaboration Group (国际辅助肺癌试验协作组)7V五"g/ /M^/350:351-60 (2004)。 Moertel等人.^打"/"ter" 122:321-6 (1995);IMPACT345:939-44 (1995); Citron等人，《/C7/" O"co/21 :1431-9(2003)。
尽管化学基础的辅助疗法有公认的益处，但与任何类型的化学疗法都相关的一种主要缺陷是显著的毒性。通常化学治疗药物并不靶向肺瘤部位，并且不能分辨正常细胞和肿瘤细胞。由于漫长的治疗和其对患者生活质量持久的影响，在辅助情况(setting)中的毒性问题是特别具有挑战性的。而且，在具有较低复发风险的患者中辅助化学疗法的益处还不清楚，使得对于他们来说是否值得忍受化学疗法的副作用变得有疑问。
一种在主要的确定性手术之前^是供的辅助疗法即新辅助疗法已经作为癌疗法的另 一个重要部分出现。在确定性手术之前提供新辅助治疗有几个优点。第一，由于肺瘤体积、腹水和胸腔积液的减少，它可以帮助改善患者在手术前的体力状态。第二，肺瘤体积的减小可使得手术范围变小因此保护患者的器官和其功能。这对于例如乳腺癌患者来说是特别有价值的。肺瘤体积的减小还可使本来不能手术的肿瘤能够手术。最后，新辅助疗法可提高通过手术完全除去肿瘤的机率，由此提高存活率。在过去的十年间，已有许多对使用不同化学治疗剂和或放射以治疗患有例如乳腺癌、头颈癌、直肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、子宫颈癌、食道和胃癌以及前列腺癌的癌患者的新辅助疗法的临床试验。综述参见Tanvetya廳等人，So^/z细Mo/.丄98:338-344 (2005)。
如上文所讲，与任何类型的化学疗法都有关的一种主要的缺陷是显著的毒性。许多新辅助化学疗法方案是麻烦的，需要在很长的一段时间内频繁的治疗。而且，在具有较低复发风险的患者中新辅助化学疗法的益处，尤其是存活率益处还不清楚，使得对于他们来说是否值得等待而不是立即手术变得有疑问。
血管生成是重要的细胞事件，其中血管内皮细胞增殖、修剪(prune )并重组以从现存的血管网络形成新的血管。令人瞩目的证据是对于正常
的和病理学的增殖过程来说血管联结(vascular supply)的发育是必须的。氧和养分的传递以及分解代谢产物的去除代表了多细胞生物体中发生的大部分生长过程中的限速步骤。
尽管新血管的引入被认为是肿瘤血管生成的主要方式，但近来的数据已表明有些肺瘤可通过借用(co-opting)现有的宿主血管生长。之后被借用的血管系统退化，导致肺瘤退化，其最终被在肿瘤边缘的缺氧诱导的血管生成所逆转。
正常和非正常的血管生成的关键的正向调节物之一是血管内皮生长因子(VEGF)陽A。 VEGF-A是包括VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、VEGF-E、 VEGF-F和P1GF的基因家族的一部分。VEGF-A主要与两个高亲和力的受体酪氨酸激酶VEGFR-l(Flt-l)和VEGFR-2(Flk-l/KDR)结合，后者是VEGF-A的血管内皮细胞促有丝分裂信号的主要递质。此外，神经毡蛋白-1已一皮确i人为肝素结合的VEGF-A同种型的受体并可在血管发育中起作用。
除了是血管生成因子外，VEGF作为多效的生长因子在其他生理过程例如内皮细胞存活和增殖、血管通透性和血管舒张、单核细胞趋化性和4丐内流中表现出多种生物效应。而且其他研究已经报道了 VEGF对少数非内皮细胞类型例如视网膜色素上皮细胞、胰管细胞和施万氏细胞(Schwann cell)的促有丝分裂作用。
对于VEGF作为病理状态中血管生成的主要调节物的认可已引起了对在涉及病理血管生成的状态中阻断VEGF活性的许多尝试。
在大多数恶性肿瘤中VEGF表达被上调并且VEGF的过表达与许多实体瘤中更晚期的阶段或与更差的预后相关。因此，抑制VEGF信号通路的分子已被用于治疗其中病理血管生成显著的相对晚期的实体瘤。
尽管有证据暗示VEGF在涉及病理血管生成的疾患或者疾病(包括晚期和转移性或扩散性肿瘤)的发展中的作用，但是关于VEGF在早期或良性癌、休眠之后肿瘤的复发中或者在来自休眠肿瘤、恶性肿瘤或微转移(micrometastase)的继发部位的肿瘤的发展中的作用了解得少。如依据下列公开内容的综述明显的，本发明解决了这些和其他需求。发明概述
与化学疗法相结合的VEGF特异性拮抗剂的使用已表现出对患有转移性结肠直肠癌和非小细胞肺癌以及其他癌的患者是有益的，但关于VEGF特异性拮抗剂疗法对良性或早期肿瘤；休眠、手术或其他干预后肿瘤的复发；来自休眠肿瘤、恶性肿瘤或微转移的继发性部位肿瘤的发展；或在辅助或新辅助情况中的影响知之甚少。本文中我们提供了证明VEGF特异性拮抗剂可被用于早期肿瘤包括良性的、癌前的、非转移性的和可手术的肿瘤的治疗的结果。所述结果进一步证明了 VEGF特异性拮抗剂可被用于癌(例如良性或恶性癌)的新辅助疗法或用于预防和/或减小癌复发(例如良性或恶性癌)的可能性，包括辅助疗法的方法。本发明构成了为患有癌包括良性的、早期和可手术的癌的患者提供(手术前和手术后)更有效的、毒性更小的护理的重大医疗突破。
因此，本发明以治疗受治疗者中良性的、癌前的或非转移性的癌的方法为特征，所述方法包括对受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂。在某些实施方案中，VEGF特异性拮抗剂的施用预防了良性的、癌前的或非转移性的癌变成扩散性或转移性癌。例如，良性的、癌前的或非转移性的癌可是O期、I期或II期癌，而在某些实施方案中，VEGF特异性拮抗剂的施用预防了良性的、癌前的或非转移性的癌发展为下一期例如I期、II期、III期或IV期癌。在某些实施方案中，将VEGF特异性拮抗剂以足够治疗受治疗者中良性的、癌前的或非转移性的肿瘤或预防良性的、癌前的或非转移性的肺瘤变成扩散性或转移性癌的量和时间施用。在某些实施方案中，施用VEGF特异性拮抗剂减小了良性的、癌前的或非转移性的肺瘤的肿瘤大小、肿瘤负荷或肿瘤数目。还可以将VEGF特异性拮抗剂以降低良性的、癌前的或非转移性的肿瘤中的血管密度的量和时间施用。
如本文所述的，本发明的方法可被用于治疗例如0期(诸如原位癌)、I期或II期癌。新辅助和辅助疗法的方法可被用于治疗任何类型的癌例如良性的或恶性的。在本发明的某些实施方案中，所述癌是上皮细胞实体瘤，包括但不限于胃肠癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、
10肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、头颈癌、肝癌
和软组织癌(例如，B细胞淋巴瘤诸如NHL和多发性骨髓瘤以及白血
病诸如慢性淋巴细胞性白血病)。在另一个实施方案中，所述良性的、 癌前的或非转移性的肿瘤是息肉、腺瘤、纤维瘤、脂肪瘤、胃泌素瘤、 胰岛素瘤、软骨瘤、骨瘤、血管瘤、淋巴管瘤、脑脊膜瘤、平滑肌瘤、 横紋肌瘤、鳞状细胞乳头状瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、胆管嚢腺瘤
(cystanoma)、平滑肌瘤、间皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、沙眼、肉芽瘤、 错构瘤、移行细胞乳头状瘤、唾液腺的多形性腺瘤、硬纤维瘤、皮样嚢 乳头状瘤(dermoid cystpapilloma )、嚢腺瘤、局灶性结节状增生或结节 状再生性增生。在另 一个实施方案中，所述方法被理想地用于治疗腺瘤。 腺瘤的非限制性实例包括肝细胞腺瘤、肾腺瘤、后肾腺瘤、支气管腺瘤、 肺泡腺瘤、肾上腺腺瘤、垂体腺瘤、曱状旁腺腺瘤、胰腺腺瘤、唾液腺 腺瘤、肝细胞腺瘤、胃肠腺瘤、管状腺瘤和胆管腺瘤。
本发明还以包括对受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂以 在受治疗者中预防良性的、癌前的或非转移性的癌的发生或复发的方法 为特征。在本发明的某些实施方案中，受治疗者处于患癌、息肉或癌综 合征的危险。在一个实例中，受治疗者具有癌、息肉或遗传性癌综合征
(例如1型多发性内分泌腺瘤(MENl))的家族史。在本发明的某些方 面中，受治疗者处于发展良性的、癌前的或非转移性的胃肠肿瘤、硬纤 维瘤或腺瘤(例如胃肠腺瘤、垂体腺瘤或胰腺腺瘤)的危险。在某些实 施方案中，所述方法在从未患过肿瘤的受治疗者、从未患过临床可检测 的癌的受治疗者、只患过良性肿瘤的受治疗者中预防所述良性的、癌前 的或非转移性的癌的发生或复发。
在另一个方面，本发明以治疗受治疗者中0期、I期或II期胃肠肿 瘤的方法为特征，该方法包括对受治疗者以足够治疗受治疗者中0期、 I期或II期胃肠肺瘤的量和时间施用VEGF特异性拮抗剂。胃肠肿瘤可 是胃肠系统的任何0期、I期或II期的癌，包括肛门癌、结肠直肠癌、 直肠癌、食管癌、胆嚢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌和小肠癌。在一个实施 方案中，胃肠肿瘤是0期(例如高级别腺瘤)或I期肿瘤。在一个实施 方案中，受治疗者之前没有经历过治疗胃肠肿瘤的切除术。在另一个方面，本发明以治疗处于发展胃肠肿瘤危险的受治疗者的 方法为特征，该方法包括以足够预防受治疗者中胃肠肿瘤的发生或复发 的量和时间对受治疗者施用VEGF特异性拮抗剂。所述胃肠肿瘤可是任
何胃肠肺瘤，包括但不限于腺瘤、 一种或多种息肉或者0、 I或II期癌。 在上述方法的某些实施方案中，受治疗者是超过50岁的人类，患
有遗传性癌综合征或有结肠癌或息肉的家族史。遗传性胃肠癌综合征的
非限制性实例包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)、加德纳综合征、胰腺 癌和遗传性非息肉病性结肠直肠癌(HNPCC)。在某些实施方案中，受 治疗者之前可已经历或没有经历过结肠镜检查。在一个实施方案中，将 VEGF特异性拮抗剂以减少患有FAP的受治疗者中腺瘤性结肠直肠息 肉的数目的量和时间施用。
在另 一个方面，本发明以预防或降低受治疗者中癌复发的可能性的 方法为特征，该方法包括以足够预防或降低受治疗者中癌复发的可能性 的量和时间对受治疗者施用VEGF特异性拮抗剂。本发明包括预防患有 肿瘤的受治疗者中癌复发的方法，该方法包括去除肿瘤(例如使用确定 性手术)和之后对受治疗者施用VEGF特异性拮抗剂的步骤。本发明包 括预防受治疗者中肿瘤再生长的方法，该方法包括去除肿瘤(例如使用 确定性手术)和之后对受治疗者施用VEGF特异性拮抗剂的步骤。在相 关方面，本发明包括预防受治疗者中癌复发或降低受治疗者中癌复发的 可能性的方法，该方法任选地包括在手术之前对受治疗者施用有效量的 VEGF特异性拮抗剂，进行确定性手术，和在手术后施用有效量的VEGF 特异性拮抗剂，其中手术后VEGF特异性拮抗剂的施用预防癌复发或降 低癌复发的可能性。在另一个相关方面，本发明包括预防受治疗者中癌 复发或降低受治疗者中癌复发的可能性的方法，该方法包括在不存在任 何其它的抗癌治疗剂的情况下对受治疗者施用有效量的VEGF特异性 拮抗剂，其中所述施用预防受治疗者中癌复发或降低受治疗者中癌复发 的可能性。
对于上文的每一个方面来说，肿瘤可是任何类型的肿瘤，包括但不 限于本文描述的实体瘤，以及特别是肿瘤和腺瘤。受治疗者可具有休眠 肿瘤或微转移，其可是或可不是临床上可检测的。在这一方面的一个实
12施方案中，将VEGF特异性拮抗剂以足够减少休眠肿瘤或微转移的新血 管形成的量和时间施用。在另一个实施方案中，将VEGF特异性拮抗剂 以足够预防临床可检测的肿瘤发生或其转移或者增加受治疗者生存持 续时间的量和时间施用。
在一个实施方案中，VEGF特异性拮抗剂是单一疗法。在另一个实 施方案中，受治疗者之前已经治疗过肿瘤，例如使用抗癌疗法。在一个 实例中，抗癌疗法是手术。在另一个实施方案中，在施用VEGF特异性 拮抗剂之前、之时(例如同时地)或之后用其它的抗癌疗法进一步治疗 受治疗者。抗癌疗法的实例包括但不限于手术、放射疗法(放射线疗法)、 生物疗法、免疫疗法、化学疗法或这些疗法的组合。
在受治疗者已经经历过确定性手术的实施方案中，通常在受治疗者 已经从手术复原一段时间后施用VEGF特异性拮抗剂。这段时间可包括 伤口愈合或手术切口愈合所需要的时间段、降低伤口裂开风险所需要的
时间段或受治疗者恢复至与手术前的健康水平本质上相似或更好的健 康水平所需要的时间段。确定性手术完成和V E GF特异性拮抗剂的首次 施用之间的时间段还可包括药物假期所需要的时间段，其中受治疗者需 要或要求在治疗方案之间的一段时间。通常，确定性手术完成和VEGF 特异性拮抗剂疗法开始之间的时间段可包括少于一周、1周、2周、3 周、4周(28天)、5周、6周、7周、8周、3个月、4个月、5个月、6 个月、7个月、8个月、9个月、IO个月、ll个月、l年、2年、3年或 更久。在一个实施方案中，确定性手术和施用VEGF特异性拮抗剂之间 的时间段大于2周并小于1年。
上述的每一个方面可进一步包括监测受治疗者癌的复发。 本发明还提供了在受治疗者例如人类患者中手术去除可手术的癌 之前的新辅助疗法的方法，该方法包括对患者施用有效量的VEGF特异 性拮抗剂例如贝伐单抗，其中患者已经被诊断为患有肿瘤或癌。VEGF 特异性拮抗剂可单独或与至少 一种化学治疗剂结合施用。
本发明还包括治疗患有可手术的癌的受治疗者的方法，该方法包括 在手术前对受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂并且之后进行 手术，借以切除癌。在一个实施方案中，所述方法进一步包括在手术后对受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂以预防癌复发的步骤。
在另一个方面，本发明涉及新辅助疗法的方法，该方法包4舌在确定
性手术前对患有可手术的癌的受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮 抗剂例如贝伐单抗，以及至少一种化学治疗剂。所述方法可被用于延长 受治疗者的无病生存期(disease free survival, DFS)或总体生存期(overall survival, OS)。在一个实施方案中，在治疗开始后约2至5年评估DFS 或OS。
在另 一个方面，本发明包括减小具有不可切除的肿瘤的受治疗者中 肿瘤大小的方法，该方法包括对受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮 抗剂，其中所述施用减小了肺瘤大小由此允许肿瘤的完全切除。在一个 实施方案中，所述方法进一步包括在完全切除肿瘤后对受治疗者施用有 效量的VEGF特异性拮抗剂。
在另一个方面，本发明涉及治疗受治疗者中癌的方法，该方法包括 以下步骤a)包括多个治疗周期的第一阶段，其中每个周期包括以预定 的间隔对受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗，以 及至少一种化学治疗剂；b)确定性手术，借以去除癌；以及c)包括多个 维持周期的第二阶段，其中每个周期包括以预定的间隔对受治疗者施用 有效量的VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗，但没有任何化学治疗剂。 在一个实施方案中，第一阶段包括第一个多个治疗周期，其中施用 VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗以及第 一化学疗法方案，之后是第二 个多个治疗周期，其中施用VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗以及第二 化学疗法方案。在一个实施方案中，如果待治疗的癌是乳腺癌，那么第 一化学疗法方案包括阿霉素和环磷酰胺而第二化学疗法方案包括紫杉 酉f。
本发明提供了包括在确定性手术后对患有转移性或非转移性的癌 的受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗的方法。在 一个实施方案中，所述方法进一步包括至少一种化学治疗剂的使用。所 述方法可被用于延长受治疗者的DFS或OS。在一个实施方案中，在治 疗开始后约2至5年评估DFS或OS。在一个实施方案中，受治疗者在 治疗后至少1至5年是无病的。在一个方面，该方法包括以下步骤a)包括多个治疗周期的第一阶 段，其中每个周期包括以预定的间隔对受治疗者施用有效量的VEGF 特异性拮抗剂例如贝伐单抗，以及至少一种化学治疗剂；以及b)包括多 个维持周期的第二阶段，其中每个周期包括以预定的间隔对受治疗者施 用有效量的VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗，但没有任何化学治疗 剂；其中组合的第一和第二阶段在最初的手术后治疗后持续至少一年。 在一个实施方案中，第一阶段包括第一个多个治疗周期，其中施用 VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗以及第 一化学疗法方案，之后是第二 个多个治疗周期，其中施用VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗以及第二 化学疗法方案。如果待治疗的癌是乳腺癌，那么例如，第一化学疗法方 案包括阿霉素和环磷酰胺而第二化学疗法方案包括紫杉醇。
在上述每一个方面的某些实施方案中，VEGF特异性拮抗剂是与 VEGF结合或者减少VEGF表达或生物活性的化合物。VEGF特异性拮 抗剂可以是下列示例性化合物中的任何一个与VEGF特异性结合的多 肽、VEGF特异性核酶、VEGF特异性肽体(peptibody)、与编码VEGF 多肽的核酸分子的至少一部分互补的反义核碱基寡聚体、与编码VEGF 多肽的核酸分子的至少一部分互补的小RNA分子或适体。特异性结合 VEGF的多肽可是可溶的VEGF受体蛋白或其VEGF结合片段或者是嵌 合的VEGF受体蛋白例如Flt-1/Fc、 KDR/Fc或Flt/KDR/Fc。特异性结 合VEGF的多肽还可是抗VEGF抗体或其抗原结合片段。抗VEGF抗 体或其抗原结合片段可是单克隆抗体、嵌合抗体、完全人类抗体或人源 化抗体。在本发明的方法中有用的示例性抗体包括贝伐单抗 (AVASTIN )、 G6-31、 B20-4.1和其片段。所述抗体或其抗原结合片#殳 还可是缺少Fc部分、F(ab，)2、 Fab或Fv结构的抗体。
依赖于疾病的类型和严重度，VE GF特异性拮抗剂例如贝伐单抗的 优选剂量为本文所描述并且可从约1 /xg/kg变化至约50mg/kg，最优选 从约5 mg/kg变化至约15 mg/kg,包括但不限于7.5 mg/kg或10 mg/kg。 施用的频率将依赖于疾病的类型和严重度而变化。为了将施用重复几天 或更久，依赖于疾患，将治疗维持直到如通过本文描述的或本领域已知 的方法所测量的治疗了癌或达到所需的治疗效果。在一个实例中，将本发明的VEGF特异性拮抗剂(例如抗体)以从约5 mg/kg变化至约15 mg/kg,包括但不限于7.5 mg/kg或10 mg/kg的剂量每周、每两周或每 三周施用一次。但其他剂量方案可以是有效的。通过常规的技术和测定 容易地监测本发明的疗法的过程。
在上述每一个方面的另外的实施方案中，局部或系统地(例如口服 或静脉内地)施用VEGF特异性拮抗剂。在一个实施方案中，将使用 VEGF特异性拮抗剂的治疗延长直到患者在达选自由l年、2年、3年、 4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年和12年所组成的组 的时间段是无癌的。
尽管可在施用VEGF特异性拮抗剂之前、之时或之后以许多不同的 方式治疗受治疗者，但在本发明的每一个方面的一个实施方案中，受治 疗者没有进行手术或化学疗法的治疗。在其他实施方案中，如由临床医 生所评价或本文所描述的，使用VEGF特异性拮抗剂的治疗是单一疗法 或持续VEGF特异性拮抗剂治疗期持续时间的单一疗法。
在其他实施方案中，使用VEGF特异性拮抗剂的治疗是与其它的抗 癌疗法相结合的，所述其它的抗癌疗法包括但不限于手术、放射疗法、 化学疗法、分化疗法(differentiating therapy)、生物疗法、免疫疗法、 血管生成抑制剂和抗增殖化合物。使用VEGF特异性拮抗剂的治疗还可 包括上文类型的治疗方案的任何组合。此外，细胞毒性剂、抗血管生成 剂和抗增殖剂可与VEGF特异性拮抗剂结合使用。在一个实施方案中， 抗癌疗法是化学疗法。例如，化学治疗剂选自诸如烷化剂、抗代谢物、 叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和相关的抑制剂、长春花生物碱、 表鬼臼毒素(epipodopyyllotoxin)、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓朴异构 酶抑制剂、干扰素、铂配位(cooridnation)络合物、蒽醌取代的尿素、甲 基肼衍生物、肾上腺皮质抑制药、肾上腺皮质甾类 (adrenocorticosteroide )、孕酮、雌激素、抗雌激素、雄性激素、抗雄 性激素、促性腺激素释放激素类似物等。在某些方面，化学治疗剂和 VEGF特异性拮抗剂并行(concurrently )施用。
在包括其它的抗癌疗法的实施方案中，可在施用VEGF特异性拮抗 剂之前、之时(例如同时地)或之后用其它的抗癌疗法进一步治疗受治疗者。在一个实施方案中，抗癌疗法是包括施用伊立替康、氟尿嘧啶、 曱酰四氬叶酸、吉西他滨或其组合的化学疗法。在一个实施方案中，可
将单独或与抗癌疗法一起施用的VEGF特异性拮抗剂作为维持疗法施
用。在一个方面，前列腺癌、卵巢癌和乳i^癌的抗癌疗法可是;;敫素疗法。
在一个示例性实施方案中，将VEGF特异性拮抗剂与抗癌疗法结合施 用，该抗癌疗法不包括抗Her2抗体或者其片段或衍生物(例如 Herceptin⑧抗体)。
本发明的方法对治疗和预防早期肿瘤，由此预防向更晚期发展，引 起与晚期癌相关的发病率和死亡率的下降是尤其有益的。本发明的方法 还对预防肺瘤的复发或肿瘤的再生长(例如在去除原发肿瘤后一直存在 的休眠肺瘤)或对减少或预防微转移的发生或增殖有益。
对于本发明的方法来说，癌可是实体瘤，例如诸如乳腺癌、结肠直 肠癌、直肠癌、肺癌、肾细胞癌、神经力交质瘤(例如间变性星形细胞瘤、 间变性少突星形细胞瘤、间变性少突神经胶质瘤、多形性胶质母细胞 瘤)、肾癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、类癌(carcinoid carcinoma)、头颈癌、黑素瘤和卵巢癌。在一个实施方案中，癌是胃肠 癌。
在本发明上述每一个方面的另外的实施方案中，将VEGF特异性拮 抗剂以一定量或一定时间(例如特定的治疗方案的全部时间)施用以减 少(例如20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%或更 多的)肿瘤或癌(包括但不限于良性的、癌前的或非转移性的癌)中的 癌细胞数目；以减小肿瘤、息肉或腺瘤的大小；以减小肿瘤负荷；以抑 制(即降低至某种程度和/或停止)癌细胞浸润入外周器官+;以减少 激素分泌；以减少息肉的数目；以减小肿瘤或癌(包括但不限于良性的、 癌前的或非转移性的癌)中血管密度；以抑制肿瘤转移；以减少或抑制 肿瘤生长或肺瘤细胞增殖；以减少或预防休眠肿瘤的生长；以减少或预 防微转移的生长或增殖；以减少或预防治疗或去除后胂瘤的再生长；以 增加或延长易患或被诊断为患有良性的、癌前的或非转移性的肿瘤的受 治疗者的DFS或OS;和/或以将与癌相关的一种或多种症状緩解至某种 程度。在一个实例中，生存期被测量为受治疗者的DFS或OS，其中在治疗开始后约2至5年评估DFS或OS。在一些另外的实施方案中，VEGF 特异性拮抗剂被用于预防受治疗者中癌的发生或复发。在 一 个实例中， 约四年后在受治疗者的群体中评估癌复发的预防以证实在群体的至少 约80%中没有发生疾病复发。在另一个实例中，VEGF特异性拮抗剂被 用于减小受治疗者中肿瘤或癌复发的可能性。在一个实例中，在约3年 时评估癌复发，其中与只用化学疗法治疗的受治疗者相比，癌复发被减 少了至少约50%。
本发明的方法还可包括监测受治疗者癌或肿瘤的复发。 根据下列的详细描述、附图和权利要求，本发明的其他特征和优点 将是明显的。
附图简述


图1A-1F是显示Apc"^+腺瘤和正常绒毛中VEGF-A表达的系列显 微照片。用VEGF-A探针在来自14周大Apc"^+小鼠的小肠(图1A、 1D)和大肠(图1B、 1E)的肠腺瘤以及正常绒毛(图1C、 1F)上进 行的原位杂交表明上皮细胞(arrow,箭)和基质细J包(arrow head,箭 头)中VEGF-A的表达。明视野图1A-1C，暗视野图1D-1F。
图2A-2F是显示VEGF-A的抑制降低肿瘤负荷并延长生存期的系 列图示。图2A是显示组中单独小鼠的肿瘤负荷的图示。通过从肿瘤负 荷的最大值到最小值的条标示肿瘤负荷。白色十字标示组平均值。 *P<0.008， **p<5.3xl(T5。 N指明动物的凄t目。图2B是通过直径和作为 肿瘤总数目的百分比显示肿瘤分布的系列图示。N指明组中肿瘤的数 目。图2C是显示治疗3周后(上)和治疗6周后(中)肿瘤大小频率 覆盖(overlay)的系列图示。下部的图示显示与第0天相比的肿瘤大小
频率覆盖(下)。竖线示出这样一种大小---卜于或等于该大小时mAb
G6-31处理的动物中肿瘤频率较大；其在3周处理组中为1 mm而在6 周处理组中为1.2 mm。图2D是显示对肠中位置绘制的平均肿瘤直径的 图示。N分别指明在第一、第二、第三和第四肠四分之一区中每组的肿 瘤数目。第0天组包括12只动物，其他组为10只。S:胃；C:盲肠， R:直肠。条代表SEM。与mAb G6-31三或六周相比，*P<1.0xl(T10，**p<0.002。图2E是显示十四只Apcmm/+、 Villin-Cre(黑色柱)和Apcmin/+、 VEGFlQX、 Villin-Cre(灰色柱)小鼠的平均肿瘤直径的以降序显示的图示。 条代表标准偏差(SD)。图2F是显示mAb G6-31(灰线)或对照IgG(黑 线)处理的小鼠的Kaplan-Meier的图示。中空的箭指明治疗的持续时间。 用灰色的箭表示中值生存期。*P<2.4xl(T3。 N指明组中小鼠的数目。
图3A-3L显示抗VEGF-A处理在改变肿瘤形态学但不是增殖指数 上的作用。图3A-3B是亚曱基蓝染色的小肠的空肠段的显微照片。图 3C-3D是显示H&E染色的来自空肠的切片的低放大倍数图像的显微照 片。图3E-3F是显示H&E染色的来自空肠的肿瘤切片的高放大倍数图 像的显微照片。图3G-3J是显示肺瘤组织和正常粘膜的使用Ki-67抗体 进行免疫组织化学染色的显微照片。以H&E复染。图3K是显示表示 为Ki-67的阳性细胞核相对于细胞核总数目的百分比的增殖指数的图 示。条代表SEM。图3L是来自用对照IgG(Nl-N4)或mAb G6-31(N5-N8) 处理的动物的正常粘膜溶解产物的蛋白质印迹分析。来自用对照 IgG(Tl-T4)或mAb G6-31(T5-T8)处理的动物的肺瘤溶解产物。
图4A-4C显示用mAb G6-31处理时减小的肿瘤血管区域密度。图 4A-4B是免疫组织化学染色的来自空肠的肿瘤的80 /mi切片的共焦图 像。绿色-CD31，血管内皮细胞；蓝色-E-钙粘蛋白，上皮细月包；红色-平滑肌肌动蛋白。图4C是显示表示为CD31的阳性区域相对于所分析 的总肿瘤区域的百分比的血管密度的图示。条代表SEM; n指明所分析 的肺瘤数目。
图5A-5D是显示抗VEGF-A处理抑制垂体肿瘤生长的系列图示。 图5A是显示对照IgG (黑线)和mAb G6-31 (灰线)处理的组在处理 9、 25、 39、 53和67天时的平均肿瘤体积的图示。条代表SEM。 N指 明组中小鼠的数目。图5B是显示用对照IgG(实线)或mAbG6-31 (虚 线)处理的单独小鼠的肿瘤体积的图示。由于不健康将七只小鼠在研究 终点前安乐死(线在67天时间点前结束)。图5C是显示在处理开始后 9、 25、 39、 53和67天时评价的对照IgG (黑线)和mAb G6-31 (灰线) 处理的组的无肿瘤倍增的-生存期的图示。图5D是显示在处理1、 7、 14、 21、 28和35天时对照IgG (黑线)和mAb G6-31 (灰线)处理的皮下垂体肿瘤移植物的肿瘤体积测量值的图示。条代表SEM。 N指明组中小鼠的数目。图6是显示垂体腺和Menl+〃垂体Ai瘤表达VEGF-A、 VEGFR-1和 VEGFR-2的图示。显示了野生型垂体腺(黑色柱)、来自Menl+ 、鼠 的非肿瘤性的垂体腺组织(灰色)、来自Menl+ 、鼠的小的未处理的垂 体腺瘤、对照IgG处理的垂体肿瘤(红色)和mAb G6-31处理的垂体 肿瘤(蓝色)的VEGF-A、 VEGFR-1和VEGFR-2的相对表达。条代表 SEM。 Ns:不显著。图7是来自Menl+、卜鼠的代表性的垂体肿瘤的系列MRI图像。显 示了对照IgG和mAbG6-31处理的小鼠在处理9、 39和67天时具有垂 体腺瘤的冠状切面。对于第9天，用黄色星号突出了垂体腺瘤的边缘。 在处理开始后9、 39和67天时，分别地，对照IgG处理的肿瘤的体积 是23.2、 55.9和142.0 mm3，而mAb G6-31处理的肿瘤的体积是18.9、 27.2和35.3 mm3。图8A-8H是显示Menl+ 、鼠的垂体肿瘤和胰腺肿瘤的组织学检查 的系列图像。图8A-8B显示H&E染色的垂体肺瘤而图8E-8F显示H&E 染色的胰腺肿瘤。图8C-8D显示用泛内皮(panendothelial )标记 MECA-32进ff的原位垂体胂瘤的免疫组织化学染色而图8G-8H显示用 泛内皮标记MECA-32进行的原位胰腺肺瘤的免疫组织化学染色。图81 是显示在对照IgG和抗VEGF处理的动物中测定垂体肺瘤中血管密度的 结果的图示而图8J是显示在对照IgG和抗VEGF处理的动物中测定胰 腺肿瘤中血管密度的结果的图示。条代表SD。 Ns二不显著。图9A-9D是显示催乳素染色阳性的来自Menl+/—小鼠的垂体肿瘤和 垂体肿瘤移植物的系列图像。显示了用抗催乳素抗体进行的原位垂体肿 瘤(图9A-9B)和皮下垂体肿瘤移植物(图9C-9D)的免疫组织化学染 色。图9E和9F是显示靠近乳腺的移植的垂体肿瘤表现出催乳素诱导的 分泌变化(图像的左边)的图像。图10A-10D显示在具有垂体肿瘤和垂体肿瘤移才直物的小鼠中血清 催乳素和生长激素水平被升高。图IOA是显示对来自19只未处理的、 带有肿瘤的Menl仏小鼠的垂体肿瘤体积(mm3)绘制的血清PRL(ng/ml)水平的图示，表明正相关。图IOB是显示对在研究终点时对照IgG (黑 色三角形)和mAb G6-31 (灰色球形)处理的Menl"-小鼠的垂体肿瘤 体积绘制的血清PRL水平的图示。图IOC-IOD是显示在处理1天和35 天时来自具有垂体腺瘤移植物的小鼠的血清催乳素(C )和生长激素(D ) 水平的图示。图11是显示在胰岛肿瘤发育的小鼠Rip-T/5Ag模型中早期肿瘤发展 期间抗VEGF处理("干预")的作用的图示。图示显示与用同种型匹配 的对照单克隆抗体处理相比，用抗VEGF抗体处理后9至11周时通过 血管生成胰岛的平均数目测量的肿瘤血管生成的下降。图12A和12B显示退化试验的结果，其中在胰岛肿瘤发育的小鼠 Rip-T/3Ag模型中用抗VEGF抗体和同种型匹配的对照单克隆抗体处理 之间未检测到肺瘤负荷或生存期的显著差异。图12A是显示与用同种 型匹配的对照单克隆抗体处理的那些小鼠相比，用抗VEGF抗体处理的 小鼠中肿瘤负荷的图示。图12B是显示与用同种型匹配的对照单克隆抗 体处理的那些小鼠相比，用抗VEGF抗体处理的小鼠随着时间存活的图 示。疗法抑制肿瘤的再生长的有效性的图示。图14A-14D是显示与邻近的正常垂体前叶(下方的点线)相比， 原发未处理的垂体腺瘤(图14A，点线之上)对生长激素呈变化并弱的 阳性的系列图像。四个移植的垂体胂瘤(对照IgG处理的)中的一个对 生长激素呈弱的阳性(图14B)。来自用mab G6-31 (图14C )或对照 IgG (图14D)处理的小鼠的原发垂体肺瘤对生长激素呈病灶阳性。发明的详细描述 I.定义术语"VEGF，，或"VEGF-A";故用来指165个氨基酸的人类血管 内皮细胞生长因子和相关的121、 145、 189和206个氨基酸的人类血管 内皮细胞生长因子(如由例如Leung等人Sc/e"ce， 246:1306 (1989)和 Houck等人Mo/.五m/ocn'"., 5:1806 (1991)所描述的)，以及其天然存在的等位的和加工过的形式。VEGF-A是包括VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E、 VEGF-F和P1GF的基因家族的一部分。VEGF-A主要与两个 高亲和力的受体酪氨酸激酶VEGFR-l(Flt-l)和VEGFR-2(Flk-l/KDR)结 合，后者是VEGF-A的血管内皮细胞促有丝分裂信号的主要递质。此外， 神经毡蛋白-1已被确认为肝素结合的VEGF-A同种型的受体并可在血 管发育中起作用。术语"VEGF"或"VEGF-A，，还指来自非人类物种 例如小鼠、大鼠或灵长目动物的VEGF。有时通过术语例如用于人类 VEGF的hVEGF或用于鼠科动物VEGF的mVEGF标示来自特定物种 的VEGF。术语"VEGF，，还被用来指含有165个氨基酸的人类血管内 皮细胞生长因子的氨基酸8至109或1至109的多肽的截短形式或片段。 可例如通过"VEGF(8-109)"、 "VEGF(1-109)"或"VEGF165"来识别本 申请中所提及的任何这种形式的VEGF。如在天然VEGF序列中所标示 的对"截短的"天然VEGF的氨基酸位置编号。例如，在截短的天然 VEGF中的氨基酸位置17 (曱硫氨酸)也是天然VEGF中的位置17 (曱 硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-l 受体的结合亲和力。
如本文所用的，术语"VEGF变体"是指包括天然VEGF序列中的 一个或多个氨基酸突变的VEGF多肽。任选地， 一个或多个氨基酸突变 包括氨基酸取代。为了简化本文所描述的VEGF变体的名称，应当注意 的是号码是指沿公认的天然VEGF的氨基酸序列的氨基酸残基的位置 (在Leung等人，如上和Houck等人，如上中所提供的)。
"天然序列"多肽包含具有与来自自然的多肽的相同氨基酸序列的 多肽。因此，天然序列多肽可具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽 的氨基酸序列。可从自然分离或可通过重组或合成方法生产这种天然序 列多肽。术语"天然序列"多肽尤其包含所述多肽的天然存在的截短的 或分泌的形式(例如细胞外结构域序列)、所述多肽的天然存在的变体 形式(例如可选择地剪接的形式)和所述多肽的天然存在的等位变体。 多肽"变体"意指具有与天然序列多肽至少约80%的氨基酸序列同 一性的生物活性多肽。这种变体包括，例如，其中在多肽的N或C末 端添加或缺k一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，变体具有与天然序列多肽至少约80%的氨基酸序列同一性、更优选地至少约90%的氨基酸 序列同一性、以及甚至更优选地至少约95%的氨基酸序列同一性。
"VEGF生物活性，，包括与任何VEGF受体结合或4壬何VEGF信号 转导活性例如调节正常和非正常的血管生成和血管发生(Ferrara和 Davis-Smyth (1997)五油cnwe i ev. 18:4-25; Fe服a (1999)丄Mo/. M^/. 77:527-543 );促进胚胎的血管发生和血管生成(Carmeliet等人(1996) A^m/w 380:435-439; Ferrara等人(1996) AAa/Mre 380:439-442 );以及调节 雌性生殖道中的和为了骨生长以及软骨形成的周期性血管增殖(Ferrara 等人(1998) A^mm似e丄4:336-340; Gerber等人.(1999) 7V^"" 5:623-628 )。除了作为血管生成和血管发生中的血管生成因子之外， VEGF作为多效的生长因子在其他生理过程例如内皮细胞存活、血管通 透性和血管舒张、单核细胞趋化性和4丐内流中表现出多种生物效应 (Ferrara和Davis-Smyth (1997),如上和Cebe-Suarez等人.Ce〃. Mo/. h/e 63:601-615 (2006))。而且最近的研究已经报道了 VEGF对少数非内 皮细胞类型例如视网膜色素上皮细胞、胰管细胞和施万氏细胞的促有丝 分裂作用。Guerrin等人.(1995)丄Ce〃P/y;wW. 164:385-394; Oberg-Welsh 等人.(1997) Mo/. Ce〃.五"^cnwo/. 126:125-132; Sondell等人.(1999) 爆丽c/. 19:5731-5740。
本文在第III部分描述"VEGF特异性拮抗剂"。 "抗VEGF抗体"是以足够的亲和力和特异性与VEGF结合的抗体。 所选纟奪的抗体将通常具有对VEGF的足够强的结合亲和力，例如抗体可 以lOOnM-l pM之间的Kd值结合hVEGF。可例如通过表面等离子体共 振为基础的测定(例如，如PCT申请公开第WO 2005/012359号中描述 的BIAcore测定)；酶联免疫吸附测定(ELISA );以及竟争测定(例如 RIA的)确定抗体亲和力。在某些实施方案中，本发明的抗VEGF抗体 可被用作靶向并干预其中涉及VEGF活性的疾病或疾患的治疗剂。抗体 还可经受其他的生物活性测定，例如为了评价其作为治疗剂的效力。这 种测定是本领域已知的并取决于目标抗原和抗体的预期用途。实例包括 HUVEC抑制测定(如下文的实施例中所描述的)；肿瘤细胞生长抑制测 定(例如，如WO 89/06692中所描述的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性
23(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)的测定(美国专利5,500,362);以 及激动性活性或血细胞生成的测定(参见WO 95/27062 )。抗VEGF抗 体通常不会与其他VEGF同源物例如VEGF-B或VEGF-C结合，也不 与其它生长因子例如P1GF、 PDGF或bFGF结合。关于抗VEGF抗体的 另外的信息可在第m部分，A找到。
遍及本说明书和权利要求书中，免疫球蛋白重链中残基的编号是如 Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫学关注 的蛋白质的序列)，第5版，Public Health Service( 7>共卫生局)，National Institutes of Health (美国国家卫生研究院)，Bethesda， Md. (1991)中的 EU索引的编号，明确地通过引用并入本文。"如Kabat中的EU索引" 是指人类IgGl EU抗体的残基编号。
术语"抗体"被以最广泛的意义使用并特别地涵盖单克隆抗体(包 括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体) 以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。
依照本发明的"Kd"或"Kd值'，是在一个实施方案中通过如下列 测定所描述的用抗体的Fab形式和VEGF分子进行的》文射标记的VEGF 结合测定(RIA)来测量的通过使Fab与最小浓度的(1251)标记的 VEGF(109)在未标记的VEGF滴定系列存在的情况下平衡，之后用抗 Fab抗体包被的板捕获结合的VEGF,测量Fab对VEGF的溶液结合亲 和力(Chen等人，(1999)/Mo/^0/293:865-881)。为确立测定的条件， 用溶于50 mM碳酸钠(pH 9.6 )的5 ug/ml的捕获抗Fab抗体(Cappel Labs) 将微量滴定板(Dynex)包纟皮过夜，并随后用溶于PBS的2。/。(w/v)的牛血 清白蛋白于室温(约23 °C )封闭二至五小时。在非吸附性(non-adsorbant) 板(Nunc #269620)中，将100 pM或26 pM的[^1]VEGF(109)与感兴趣的 Fab例如Fab-12的系列稀释液混合(Presta等人，(1997) Oz"cw 57:4593-4599)。之后将感兴趣的Fab孵育过夜；但孵育可持续65小时 以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板以便于室温孵育一小时。 之后去除溶液并将板用溶于PBS的0.1%的吐温-20洗八次。当板已干， 加入150 ul/孔的闪烁体(MicroScint-20; Packard )，并将板在Topcount Y计数器(Packard)上计数十分钟。选择产生小于或等于最大结合的20%的每种Fab的浓度用于竟争性结合测定中。依照另一个实施方案， Kd或Kd值是通过使用表面等离子体共振测定(使用了 BIAcoreTM-2000 或BIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ))于25。C用固定的 hVEGF (8-109) CM5芯片以~10响应单元(RU )测量的。简单地说， 依照供应商的说明书将羧曱基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5, BIAcore Inc.)用7V-乙基W-(3-二曱氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和,羟基丁 二酰亚胺(NHS)活化。在以5 ul/分钟的流速注入前用10 mM醋酸钠，pH 4.8将人类VEGF稀释至5 ug/ml( 0.2 uM)以获得约10响应单元(RU ) 的偶联蛋白。注入人类VEGF之后，注入1M的乙醇胺以封闭未反应的 基团。为了动力学测量，将两倍的Fab系列稀释液(0.78nM至500 nM ) 于25。C以约25 ul/min的流速注入含有0.05%的吐温20的PBS(PBST) 中。用简单的一对一 Langmuir结合模型(BIAcore评估软件3.2版)通 过同时拟合締合和解离感应谱(sensorgram)计算締合速率(k。n )和解离
速率(k。ff)。将平衡解离常数(Kd)计算为k。ff/k。n的比率。参见例如
Chen，Y.等人，(1999) J. Mo/Ao/ 293:865-881。如果通过上文的表面等 离子体共振测定的结合速率(on-rate)超过106 M" S",那么可通过在 逐渐增加浓度的人类VEGF短形式(8-109 )或小鼠VEGF存在的情况 下如在分光4义，例如装备了停流的分光光度计(spectrophometer ) ( Aviv Instruments)或具有搅拌吸收池的8000系列SLM-Aminco分光光度计 (The腦Spectronic )中所测量的使用测量25°C时溶于PBS， pH 7,2的 20 nM抗VEGF抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发=295 nm;发 射二340nm, 16nm带通)的增大或减小的荧光淬灭技术确定结合速率。
"封闭性"抗体或抗体"拮抗剂"是抑制或降低其结合的抗原的生 物活性的抗体。例如，VEGF特异性拮抗剂抗体结合VEGF并抑制VEGF 的诱导血管内皮细胞增殖的能力。优选的封闭性抗体或拮抗剂抗体完全 抑制抗原的生物活性。
除非以其他方式指出，遍及此说明书使用词组"多价抗体"表示含 有三个或更多抗原结合位点的抗体。例如，多价抗体被改造为具有三个 或更多抗原结合位点并通常不是天然序列的IgM或IgA抗体。
"Fv"片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。这一区由紧密締合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚物组成，例如在scFv中所述締合性质上可是共价的。它处于这样的构型一一每个可变结构域
的三个CDR相互作用以界定Vh-Vl二聚物表面上的抗原結合位点。六个CDR或其子集共同将抗原结合特异性赋予抗体。但是，单个的可变结构域(或仅包含三个对抗原特异的CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常以比完整结合位点低的亲和力。
如本文所用的，"抗体可变结构域"是指包括互补决定区(CDR;即CDR1、 CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列的抗体分子的轻链和重链的一部分。vh是指重链的可变结构域。v^是指轻链的可变结构域。依照本发明中所使用的方法，可按照Kabat (Sequences ofProteins of Immunological Interest (免疫学关注的蛋白质的序歹'j )(National Institutes of Health (美国国家卫生研究院)，Bethesda， Md.，1987和1991))定义分配纟合CDR和FR的氨基酸位置。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号也按照Kabat的编号。
如本文所用的，术语"互补决定区"(CDR;即CDR1、 CDR2和CDR3)是指其存在是抗原结合所必需的抗体可变结构域的氨基酸残基。每个可变结构域通常具有被鉴定为CDR1、 CDR2和CDR3的三个CDR区。每个互补决定区可含有来自如由Kabat所定义的"互补决定区，，的氨基酸残基(即，轻链可变结构域中的大约24-34(Ll)、 50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域中的31-35(H1)、 50-65(H2)和95-102(H3)残基；Kabat等人，Se《wewces q/"/VotezVw o//m附wwo/og/ca/ /w/ems/ (免疫学关注的蛋白质的序列)，第5版.Public Health Service (公共卫生局)，National Institutes of Health (美国国家卫生研究院)，Bethesda， MD.(1991))和/或来自"高变环"的那些残基(即，轻链可变结构域中的大约26-32(Ll)、 50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的26-32(Hl)、53隱55(H2)和96-101(H3)残基；Chothia和Lesk, Mo/. 196:901-917(1987))。在某些实例中，互补决定区可包含来自按照Kabat定义的CDR区和高变环两者的氨基酸。例如，抗体4D5的重链的CDRH1包含氨基酸26至35。
"框架区"(此后的FR)是除了 CDR残基以外的那些可变结构域
26残基。每个可变结构域通常具有被鉴定为FR1、 FR2、 FR3和FR4的四个FR。如果按照Kabat定义CDR，那么轻链FR残基位于大约l-23(LCFRl)、 35-49(LCFR2)、 57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)残基而重链FR残基位于重链残基中的大约l-30(HCFRl)、 36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)残基。如果CDR含有来自高变环的氨基酸残基，那么轻链FR残基位于轻链中的大约l-25(LCFRl)、33-49(LCFR2)、 53-90(LCFR3)和97-107(LCFR4)残基而重链FR残基位于重链残基中的大约l-25(HCFRl)、 33-52(HCFR2)、 56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)残基。在某些实例中，当CDR含有来自如Kabat所定义的CDR和高变环的那些氨基酸的氨基酸时，那么FR残基将被相应地调整。例如，当CDRH1包括氨基酸H26-H35时，重链FR1残基是在1-25位置而FR2残基是在36-49位置。
"Fab"片段含有轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1 )。 F(ab，)2抗体片段含有一对通常通过它们之间的铰链半胱氨酸在它们的羧基末端附近共价连接的Fab片段。抗体片段的其他化学偶联也是本领域已知的。
"单链Fv"或"scFV"抗体片段含有抗体的Vh和Vl結枸域，其中这些结构域存在于单个的多肽链中。通常Fv多肽进一步包括Vh和V^结构域之间的多肽连接体，其使scFv能够形成抗原结合所需要的结构。scFv的综述，参见Pluckthim在77ze尸/za削aco/ogy o/ Mowoc/owa/v4""6c^m (单克隆抗体的药理学)，113巻，Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag， New York ，第269-315页(1994)。
术语"双抗体"是指具有两个抗原结合位点的小的抗体片段，该片段包含与同一条多肽链(Vh和VJ中的轻链可变结构域(Vj相连的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许相同链上两个结构域之间配对的连接体，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体纟皮更加完整地描述于例如EP 404,097; WO93/11161以及Hollinger等人，尸roc.胸/. JcaA Sc/.园,90:6444-6448(1993)中。
词组"线性抗体"是指Zapata等人，8(10):1057-1062(1995)中描述的抗体。简单地说，这些抗体含有一对串联的Fd区段 (Vh-Ch1-Vh-Ch1 )，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线 性抗体可是双特异性或单特异性的。
如本文所用的，术语"单克隆抗体"是指从基本上均一的抗体的群 中获得的抗体，即所述群所包含的单个抗体除了可以较小量存在的可能 自然发生的突变以外是完全相同的。针对单一的抗原性位点的单克隆抗 体是高特异性的。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗 体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原上单一的 决定簇。修饰语"单克隆，，表明抗体的特征是从基本上均一的抗体群中 获得的，并不被解释为需要通过任何特定的方法生产抗体。例如，将依 照本发明使用的单克隆抗体可通过首次由Kohler等人，256:495 (1975)描述的杂交瘤方法制得，或可通过重组DNA的方法(参见，例 如美国专利第4,816,567号)制得。还可使用例如Clackson等人，淑騰 352:624-628 (1991)和Marks等人.,她/. 5,W. 222:581-597 (1991)中描 述的技术从噬菌体抗体文库分离"单克隆抗体"。
本文单克隆抗体特别包括"嵌合"抗体(免疫球蛋白)，以及这些 抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利第4,816,567 号；和Morrison等人，Prac. Ato/.爿cW. "&4 81 :6851-6855 (1984))， 所述"嵌合"抗体中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于
部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类或亚类的抗体中的相应序
列完全相同或同源。
非人类(例如鼠科动物)抗体的"人源化"形式是含有最少的来自 非人类免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。对于大部分来说，人源化抗体是 人类免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者高变区的残基被来自具有 所需要的特异性、亲和力和能力的非人类物种例如小鼠、大鼠、兔或非 人类灵长目动物的高变区(供者抗体)的残基取代。在一些实例中，人 类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人类残基取代。此外， 人源化抗体可包含在受者抗体或供者抗体中找不到的残基。进行这些修 饰以进一步完善抗体性能。通常，人源化抗体将包括基本上全部的至少一个、通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环与非人类 免疫球蛋白的高变环一致并且全部或基本上全部的FR区是人类免疫球
蛋白序列的FR区。人源化抗体还将任选地含有免疫球蛋白恒定区(Fc ), 通常是人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。对于进一步的细节，参 见Jones等人，A^wre 321 :522-525 (1986); Riechmann等人，A^ww 332:323-329 (1988);和Presta, Cwa Op. 5Vn/".历o/. 2:593-596 (1992)。
"人类抗体"是具有与通过人生产的抗体和/或使用如本文所公开
的任何 一 项制造人类抗体的技术制得的抗体的氨基酸序列 一 致的氨基 酸序列的抗体。人类抗体的这一定义尤其排除了含有非人类抗原结合残 基的人源化抗体。可使用本领域已知的不同技术生产人类抗体。在一个 实施方案中，人类抗体选自噬菌体文库，其中噬菌体文库表达人类抗体 (Vaughan等人.A^ww历otec/mo/ogy 14:309-314 (1996); Sheets等人. 尸亂胸/. JcW. 95:6157-6162 (1998》；Hoogenboom和Winter, 乂 Mo/.肠/" 227:381 (1991); Marks等人，Mo/.肠/" 222:581 (1991))。还 可通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物例如小鼠中制得人类 抗体，所述转基因动物中的内源免疫球蛋白基因已经被部分或完全地失 活。攻击后，观察了人类抗体的产生，其在包括基因重排、组装和抗体 谱的所有方面上都与在人类中所见到的非常相似。这一方法被描述于例 如美国专利第5,545,807; 5，545，806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016号和下列科学出版物中Marks等人，所o/rec/mo/ogy 10: 779-783 (1992); Lonberg等人，淑脏368: 856-859 (1994); Morrison, A^wre 368:812-13 (1994); Fishwild等人，Atowe 5/o&c/mo/ogy 14: 845-51 (1996); Neuberger,淑画肠/ec/mo/ogy 14: 826 (1996); Lonberg和 Huszar, /"&r", "ev. /wmwwo/. 13:65-93(1995)。可选择地，可经由针对目 标抗原产生抗体的人类B淋巴细胞(这类淋巴细胞可从个体中被回收或 可在体外被免疫)的无限增殖化制备人类抗体。参见，例如Cole等人，
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (单克隆抗体和癌疗法)，Alan R. Liss,第77页(1985); Boerner等人，/画,/.' 147 (l):86-95 (1991) 和美国专利第5,750,373号。
"亲和力成熟的"抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个原的亲和力上的改善。优选的亲和力成熟的抗体具有对目标抗原的纳摩 尔或甚至皮摩尔级的亲和力。通过本领域已知的程序生产亲和力成熟的
抗体。Marks等人.所o/7fec/mo/ogy 10:779-783 (1992)描述了通过VH和 VL结构域改组(shuffling)的亲和力成熟。由以下描述了 CDR和/或框架 残基的随机的诱变Barbas等人.尸racA^. *SW, 91 :3809-3813
(1994); Schier等人，169:147-155 (1995); Yelton等人./mmw"o/. 155:1994-2004 (1995); Jackson等人，/附mw"o/. 154(7):3310画9 (1995) 和Hawkins等人，Mo/. 5zo/. 226:889-896 (1992)。
抗体的"功能性抗原结合位点"是能够结合目标抗原的位点。抗原 结合位点的抗原结合亲和力不必与抗原结合位点所来自于的母体抗体 一样强，但结合抗原的能力必须是使用已知的评估抗体对抗原的结合的 多种方法中的任何一种可测量的。而且，本文的多i"介抗体的每一个抗原 结合位点的抗原结合亲和力在数量上不必相同。对于本文的多聚体抗体 来说，可使用如美国专利申请公开第20050186208号的实施例2中所描 述的超速离心分析评价功能性抗原结合位点的数目。依照这一分析方
的不同数目而计算复合物的平均分子量。将这些理论值与所获得的实际 的实验值对比以便评价功能性结合位点的数目。
具有指定抗体的"生物特性"的抗体是具有该抗体的一种或多种使 其区别于与相同抗原结合的其他抗体的生物特性的抗体。
为了筛查与感兴趣的抗体所结合的抗原上的表位结合的抗体，可进 4亍常头见的交叉封闭测定例如Antibodies, A Laboratory Manual (抗体的实 -验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港实-睑室)，Ed Harlow 和David Lane (1988)中描述的测定。
"物种依赖性抗体，，是对来自第 一哺乳动物物种的抗原具有比对来 自第二哺乳动物物种的该抗原的同源物的亲和力更强的结合亲和力的 抗体。通常，物种依赖性抗体"特异性地结合"于人类抗原(即具有不 超过约lxl0々M，优选地不超过约lxl0—8M，并最优选地不超过约lxl(T9 M的结合亲和力(Kd)值)，但具有对来自第二非人类哺乳动物物种的抗原的同源物的结合亲和力比所述抗体对人类抗原的结合亲和力弱至
少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍。物种依赖性抗体可以 是如上文所定义的不同类型的抗体中的任何一种，但通常是人源化或人 类抗体。
如本文所用的，"抗体突变体"或"抗体变体"是指物种依赖性抗 体的氨基酸序列变体，其中物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基已 被修饰。这种突变体必须具有与物种依赖性抗体的小于100%的序列同
一性或相似性。在一个实施方案中，抗体突变体将具有与物种依赖性抗
体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75%,更优选地至少 80%,更优选地至少85%，更优选地至少90%，并最优选地至少95%的 氨基酸序列同 一性或相似性的氨基酸序列。本文关于这一序列的同 一性 或相似性被定义为在比对序列并引入空位(如果需要)以达到最大百分 比的序列同一性后，候选序列中与物种依赖性抗体残基相同(即同样的 残基)或相似(即来自以共同侧链特性为基础的相同组的氨基酸残基， 参见下文)的氨基酸残基的百分比。对可变结构域外部的抗体序列的 N-末端、C-末端或内部的延伸、缺失或插入都不应当被理解为影响序列 同一性或相似性。
为了增加含有本发明的氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期，如例如 美国专利5,739,277中所描述的，可对抗体(尤其是抗体片段)附加一 个补救受体结合表位。例如，可将编码补救受体结合表位的核酸分子在 框架中与编码本发明的多肽序列的核酸连4妻以便通过改造的核酸分子 表达的融合蛋白含有补救受体结合表位和本发明的多肽序列。如本文所 使用的，术语"补救受体结合表位"是指IgG分子(例如IgG,、 IgG2、 IgGs或IgG4)的Fc区的表位，其起到增加IgG分子的体内血清半衰期 的作用(例如Ghetie等人，i ev. /mw頭o/. 18:739-766 (2000)，表1 )。 其Fc区中具有取代以及具有增加的血清半衰期的抗体还描述于 WO00/42072、 WO 02/060919; Shields等人，,所o/, CT em. 276:6591-6604 (2001); Hinton, 所o/. C力em. 279:6213-6216 (2004))中。在另一个实施 方案中，通过例如附加其他多肽序列也可增加血清半衰期。例如，可将 用于本发明方法中的抗体或其他多肽附加于与FcRn受体或血清白蛋白
31结合肽结合的血清白蛋白或血清白蛋白的一部分以便血清白蛋白与抗
体或多肽例如WOO 1/45746中所公开的这些多肽序列结合。在一个实施 方案中，将被附加的血清白蛋白肽含有DICLPRWGCLW的氨基酸序列。 在另一个实施方案中，通过这些方法增加了 Fab的半衰期。对于血清白 蛋白结合肽序列也参见Dennis等人，J.所o/. CAew. 277:35035-35043 (2002)。
"嵌合VEGF受体蛋白"是具有来自至少两个不同蛋白质(其中至少 一个是VEGF受体蛋白)的氨基酸序列的VEGF受体分子。在某些实施 方案中，嵌合VEGF受体蛋白能够结合VEGF并抑制VEGF的生物活性。
"分离的"多肽或"分离的"抗体是已经从其自然环境的 一个组分中 识别并分离和/或回收的多肽或抗体。其自然环境的污染物组分是会干 扰多肽或抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其他蛋白质 的或非蛋白质的溶质。在某些实施方案中，多肽或抗体将被纯化(l) 以至大于如通过罗氏法(Lowry method)测定的多肽或抗体的95%重量， 并最优选的大于99%重量，(2)以至足以通过使用转杯式测序仪获得 N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)以至通过在 还原或非还原条件下使用考马斯蓝或银染色的SDS-PAGE达到同质性。 分离的多肽或抗体包括重组细胞中原位的多肽或抗体，因为多肽天然环 境的至少一个组分将不存在。然而，通常将通过至少一个纯化步骤制备 分离的多肽或抗体。
所谓的"片段"，意指优选地含有参考核酸分子或多肽的全长的至少 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%或更多 的多肽或核酸分子的一部分。片l殳可含有10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90或100、 200、 300、 400、 500、 600或更多核苷酸或者10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 120、 140、 160、 180、 190、 200或更多氨基酸。
"抗血管生成剂，，或"血管生成抑制剂，，是指直接或间接地抑制血管 生成、血管发生或不需要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多 肽、分离的蛋白质、重组的蛋白质、抗体、或者其轭合物或融合蛋白。应当理解的是，抗血管生成剂包括结合血管生成因子或其受体并阻断其 血管生成活性的那些剂。例如，抗血管生成剂是如上文定义的血管生成
剂的抗体或其他拮抗剂，例如VEGF-A或VEGF-A受体(诸如KDR受 体或Flt-l受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂诸如Gleevec (曱磺酸伊 马替尼)。抗血管生成剂还包括天然的血管生成抑制剂例如血管他丁、 内皮4也丁等。参见，例如Klagsbrun和D，Amore， Jwww. i ev. P/^Wo/., 53:217-39 (1991); Streit和Detmar， Owcoge"e, 22:3172-3179 (2003)(例 如歹'J出恶性黑素瘤的抗血管生成疗法的表3); Ferrara & Alitalo, A^w" MeAc/"e 5:1359-1364 (1999); Tonini等人，O"coge"e， 22:6549-6556 (2003) (例如列出已知的抗血管生成因子的表2)以及Sato. /"A C//". (9"co/., 8:200-206 (2003)(例如表1列出临床试验中所使用的抗血管生成剂)。
"治疗"是指治疗性处理和预防疾病的或预防性的措施。需要治疗的 那些包括已经患有良性的、癌前的或非转移性的肿瘤的那些以及其中癌 的发生或复发有待被预防的那些。
术语"治疗上有效的量"是指治疗或预防哺乳动物中疾病或病症的 VEGF特异性拮抗剂的量。在癌前的、良性的或早期肿瘤的实例中，治 疗上有效的量的VEGF特异性拮抗剂可减少癌细胞的数目；减小原发肿 瘤的大小；抑制(即减慢至某种程度和优选地停止)癌细胞浸润入外周 器官中；抑制(即减慢至某种程度和优选地停止)肿瘤转移，抑制(至 某种程度)肿瘤生长；和/或使与所述病症相关的一种或多种症状緩解 至某种程度。对于肿瘤休眠或微转移的治疗来说，治疗上有效的量的 VEGF特异性拮抗剂可减少微转移的数目或增殖；减少或预防休眠肿瘤 的生长；或在治疗或去除(例如，使用抗癌疗法诸如手术、；故射疗法或 化学疗法)后减少或预防肿瘤的复发。药物可以某种程度预防生长和/ 或杀死存在的癌细胞，它可是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。对于 癌治疗，体内效力可例如通过评定存活的持续时间、疾病发展时间 (TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、緩解的时间和/或生活质量来 测量。有效的量可增加无病生存期(DFS)、增加总体生存期(OS)、减 小复发的可能性、延长复发的时间、延长远处复发的时间(即在原发部 位外部的复发)、治愈癌、改善癌症状(例如使用癌特定的4企查所测量的)、减少第二原发癌的出现等。
"可手术的"癌是被局限于原发器官并适于手术的癌。 "生存期"是指患者依然活着，并包括无病生存期(DFS)、无发展
生存期(PFS)和总体生存期(OS)。可通过Kaplan-Meier法评估生存 期，并使用分层的时序检验(stratified log-rank test)计算生存期的任何 差异。
"无病生存期(DFS)"是指患者自治疗开始或自最初的诊断保持活 着、没有复发癌所持续的确定的一段时间，例如约1年、约2年、约3 年、约4年、约5年、约10年等。在本发明的一个方面，依照意向治 疗的原则分析DFS，即在他们的指定的疗法的基础上评估患者。用于 DFS的分析的事件可包括癌的原处(local )、区域和远处的复发，继发 性癌的发生和没有之前事件(例如，乳腺癌复发或第二原发癌)的患者 中的由于^f壬^f原因的死亡。
"总体生存期"是指患者自治疗开始或自最初的诊断保持活着所持 续的确定的一段时间，例如约l年、约2年、约3年、约4年、约5年、 约10年等。在本发明的研究中，用于生存期分析的事件是由于任何原 因的死亡。
所谓的"延长生存期"，意指在已治疗的患者中相对于未治疗的患者 (即相对于没有用VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体治疗的患者)， 或相对于对照治疗方案例如仅用化学治疗剂诸如紫杉醇的治疗增加 DFS和/或OS。在治疗开始之后或在最初的诊断之后，监测生存期至少 约六个月，或至少约一年，或至少约2年，或至少约3年，或至少约4 年，或至少约5年，或至少约10年等。
生存期分析中的"危害比"是两个生存期曲线之间差异的概括，表示 在随访的时间段内与对照相比治疗时死亡风险上的降低。危害比是事件 比率的统计学定义。为了本发明，将危害比定义为表示在任何时间上的 特定点实验组(arm)中的事件的概率除以对照组中的事件的概率。
本文术语"并行地"被用于指两种或更多种治疗剂的施用，其中所述 施用的至少一部分在时间上重叠。因此，并行施用包括当在停止一种或 多种剂的施用后继续 一 种或多种其他剂的施用时的给药方案。
34所谓的"单一疗法"，意指在治疗期的过程中仅包括一种用于癌或肿
瘤治疗的治疗剂的治疗方案。使用VEGF特异性拮抗剂的单一疗法意指 在治疗期期间在不存在其它的抗癌疗法的情况下施用VEGF特异性拮 抗剂。
所谓的"维持疗法"，意指被提供以减小疾病复发或发展的可能性的 治疗方案。可将维持疗法提供达任何长度的时间，包括延长的直到受治 疗者寿命的时间段。可将维持疗法在最初的疗法之后或与最初或其它的 疗法联合起来提供。维持疗法所使用的剂量可变化并且可包括与用于其 他类型疗法的剂量相比减少的剂量。
本文"新辅助疗法"或"手术前疗法"是指在手术前提供的疗法。新辅 助疗法的目的是提供即时的系统的治疗，可能地根除微转移(不然其会 增殖，如果遵照手术随后是系统疗法的标准顺序)。新辅助疗法还可帮 助减小肿瘤大小由此允许完全切除最初不可切除的胖瘤，或保留部分器 官和其功能。而且，新辅助疗法允许在体内评定药物效力，这可指导随
后的治疗选择。
本文"辅助疗法"是指在手术后不能检测到残留疾病的迹象时提供 的疗法，以降低疾病复发的风险。辅助疗法的目的是预防癌的复发并因 此减^f氐癌相关的死亡的几率。
本文"标准的护理，，化学疗法是指常规使用以治疗特定癌的化学治 疗剂。
如在医学团体中使用该术语的方式使用"确定性手术"。确定性手术 包括例如手术的或其他方面的导致肿瘤去除或切除的程序，所述程序包 括导致所有很可见的肿瘤去除或切除的那些程序。确定性手术包括，例 如完全或有疗效的切除或者完全的全切除肺瘤。确定性手术包括在一个 或多个阶段内发生的程序并包括例如切除肿瘤前进行一个或多个手术 或其它程序的多阶段手术的程序。确定性手术包括移走或切除肿瘤，包 括所涉及的器官、部分器官和组织以及周围器官例如淋巴结、部分器官 或组织的程序。
术语"癌"或"癌的"是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞 生长为特征的生理疾患。这一定义中包括良性的和恶性的癌以及休眠的肿瘤或微转移。所谓的"早期癌"或"早期肿瘤"意指未扩散或转移的或者 -故分类为0、 I或II期癌的癌。
术语"癌前的"是指通常先于癌或发展为癌的状况或生长。"癌前的" 生长将具有以可通过细胞周期调节、细胞增殖或分化的标记测定的不正 常的细胞周期调节、增殖或分化为特征的细胞。
所谓的"发育异常，，意指组织、器官或细胞的任何不正常的生长或发
育。优选地，发育异常是高级别或癌前的。
所谓的"转移"意指癌从其原发部位向体内其他地方的扩散。癌细胞
可,人原发肺瘤脱离，渗入淋巴管和血管，通过血流循环并在体内别处的 正常组织中的远处病灶中生长(转移)。转移可以是原处或远处的。转 移是相继的过程， 一见肿瘤细胞从原发肿瘤脱离，通过血流移动并在远处 部位停留的情况而定。在新的部位，细胞建立血液供给并可生长以形成
威胁生命的块(mass)。肺瘤细胞中刺激性和抑制性分子通路都调节这 一行为并且在远处部位中肺瘤细胞和宿主细胞之间的相互作用也是显 著的。
所谓的"微转移"意指已从原发肿瘤向身体其他部分扩散的少量细 胞。微转移在筛查或诊断试验中可或不可被检测。
所谓的"非转移性的"意指是良性的或保留在原发部位并没有渗入 淋巴管或血管系统或原发部位以外的组织的癌。通常，非转移性的癌是 为0、 I或II期癌，并且偶尔为III期癌的任何癌。
提到肿瘤或癌为"O期"、"I期"、"II期"、"III期"或"IV期"是指使 用本领域已知的总体时期分组或罗马数字分期法(Overall Stage Grouping or Roman Numeral Staging method)的月中瘤或癌的分级。尽管 癌的实际阶段依赖于癌的类型，但通常，0期癌是原位病变，I期癌是 小的局部的肿瘤，II和III期癌是表现出涉及局部淋巴结的局部晚期肺 瘤，和IV期癌代表转移性癌。每种类型肿瘤的具体阶段是熟练的临床 医生已知的。
如本文所用的"胂瘤"是指所有肿瘤性的细胞生长和增殖(无论恶性 或良性的)以及所有癌前的和癌的细胞和组织。
所谓的"原发肿瘤"或"原发癌"意指起初的癌而不是定位于在受治疗者体内的其他组织、器官或位置的转移性的病变。
所谓的"良性肺瘤"或"良性癌"意指保持局限于起源的部位并且不 具有浸润、侵入或转移至远处部位的能力的肿瘤。
本文"癌复发"是指治疗后癌的再次发生，并包括原发器官中癌的再 次发生以及癌在原发器官外部再次发生时的远处复发。
所谓的"肿瘤休眠"意指其中肿瘤细胞存在但肿瘤发展不是临床上 明显的长时间静止状态。在筛查或诊断试验中休眠肿瘤可或不可被检 测。
所谓的"肿瘤负荷"意指体内癌细胞的数目、肿瘤的大小或癌的量。
肿瘤负荷也^:称为肿瘤负载。
所谓的"肿瘤数目"意指肿瘤的数目。
所谓的"受治疗者"意指哺乳动物，包括但不限于人类或非人类的哺 乳动物，例如牛科动物、马科动物、犬科动物、绵羊科动物或猫科动物。 优选地，受治疗者是人类。
受治疗者"群体"是指患有癌的受治疗者组，例如在临床试验中，或
如肺瘤学家纟安照FDA批准用于特定适应症的、例如癌新辅助疗法所见 到的。在一个实施方案中，群体包括至少3000例受治疗者。
术语"抗癌疗法"是指在治疗癌中有用的疗法。抗癌治疗剂的实例包 括但不限于例如手术、化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放 射疗法的剂、抗血管生成剂、细胞凋亡剂、抗微管蛋白剂以及治疗癌的 其他剂，例如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR) 拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂HER1/EGFR抑制剂(诸如埃罗替尼 (TarcevaTM)、血小板衍生的生长因子的抑制剂(诸如GleevecTM (曱 磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布)、干扰素、细胞因子； 与下列目标ErbB2、 ErbB3、 ErbB4、 PDGFR-/5、 BlyS、 APRIL、 BCMA 或VEGF受体、TRAIL/Apo2中的 一 个或多个结合的拮抗剂(例如中和 抗体)以及其他的生物活性和有机的化学剂等。本发明中也包括其组合。
如本文所用的，术语"细胞毒性剂"是指抑制或阻断细胞功能和/或 导致细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如I'31、 I125、 Y卯和Re186)、化学治疗剂和毒素例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性的毒素或其片段。
"化学治疗剂"是在癌的治疗中有用的化学化合物。化学治疗剂的实 例包括在癌的治疗中有用的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂
例如漆替派和CYTOXAN⑧环磷酰胺(cyclosphosphamide );烷基磺酸 酯例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶例如苯佐替派 (benzodopa )、卡巴敏、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa); 乙撑亚胺和曱基蜜胺(methylamelamines)包括六曱蜜胺、曲它胺、三亚 乙基裤酰胺(trietylenephosphoramid )、 三亚乙基辟u代磷酰胺 (triethiylenethiophosphoramide) 和 三 羟曱 基 蜜 胺 (trimethylolomelamine );多聚乙酰(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)； 喜树石威(包括合成类似物拓朴替康)；苔藓抑素；callystatin; CC-1065 (包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；自念珠藻环肽 (尤其是自念珠藻环肽1和自念珠藻环肽8 );多拉司他汀；duocarmycin (包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1 );艾榴素(eleutherobin);水鬼 蔑石威(pancratistatin); 甸冲支3册炎月酉孚(sarcodictyin); spongistatin; 氛齐例^口 苯丁酸氮齐、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、双 氯乙基曱胺、盐酸曱氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司 汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲例如亚硝基脲氮芥、氯脲菌素、福 莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimnustine );抗生素例如 烯二炔类抗生素(诸如加里刹霉素，尤其是加里刹霉素711和加里刹霉 素"II (参见，例如Agnew, CAem M Ewg/" 33: 183-186 (1994)); 达内霉素包括达内霉素A; 二磷酸盐例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以 及新制癌菌素发色团以及相关的色素蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿 克拉霉素(aclacinomysins )、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博 来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌素、色霉 素(chromomycinis )、放线菌素D、道诺霉素、地托比星、6-重氮-5-氧 -L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧阿霉素(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代 阿霉素、2-吡咯啉代阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊 达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、 橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、
38罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐
柔比星；抗代谢物例如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物例如 二曱叶酸、曱氨蝶呤、蝶酰蝶呤、三曱曲沙；噤呤类似物例如氟达拉滨、 6-巯基。票呤、硫咪。票呤、硫鸟。票呤；嘧咬类似物例如安西他滨、阿扎胞 苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双去氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他 滨、氟尿苷；雄性激素例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄 烷、睾内酯；抗肾上腺物例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充 物例如亚叶酸(frolinic acid);醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖香；氨基果糖 酸；恩尿嘧啶；安吖啶；百垂布昔(bestrabucil);比生群；依达曲沙 (edatraxate ); defofamine;地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine ); 依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达 明(lonidainine );美登醇(maytansinoid)例如美登素和安丝菌素；米托胍 腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol); 二胺硝吖咬(nitraerine);喷司 他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸乙肼(podophyllinic acid; 2-ethylhydrazide );曱千肼；PSK 多糖络合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋锗；细交链孢菌酮酸； 三亚胺醌；2，2'，2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、疣孢霉 素(verracurin) A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine));乌4立坦；长 春地辛；达卡巴。秦；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷； gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara C");环磷酰胺；噻替派；紫杉烷例如 TAXOL 紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N丄)、 ABRAXANETM无Cremophor且白蛋白改造的紫杉醇纳米颗粒制剂 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)和TAXOTERE 多西紫杉醇(doxetaxel) (Rh6ne隱Poulenc Rore Antony, France); 苯丁酸 氮芥(chlomnbucil); GEMZAR⑧吉西他滨；6-硫鸟噤呤；巯基。票呤； 曱氨蝶呤；铂类似物例如顺铂和碳铂；长春碱；鉑；依托泊苷(VP-16); 异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新》成；NAVELBINE⑧长春瑞滨；诺消灵； 替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立 替康(Camptosar, CPT-ll)(包括与5-FU和曱酰四氢叶酸一起的伊立替康 的治疗方案)；拓朴异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟曱基鸟氨酸
39(difluorometlhylornithine ) (DMFO);类浮见黄醇例如—见黄酸；卡培他滨； 考布他汀；曱酰四氢叶酸(LV);奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案 (FOLFOX);减少细胞增殖的PKC-a、 Raf、 H-Ras、 EGFR(例如埃罗替 尼(TarcevaTM))和VEGF-A的抑制剂以及上述任何一种物质的药学上可 接受的盐、酸或衍生物。
这一定义中还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素 剂例如抗雌激素药和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括诸如三 苯氧胺(包括NOLVADEX⑧三苯氧胺)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基 三苯氧胺、曲沃昔芬、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、 LY117018、奥那司 酮和FARESTON托瑞米芬；抑制在肾上腺中调节雌激素产生的芳香酶 的芳香酶抑制剂，例如，诸如4(5)-咪唑、氨鲁米特、MEGASE⑧醋酸曱 地孕酮、AROMASIN 依西美坦、福美坦(formestanie )、法倔唑、 RIVISOR⑧伏氯唑、FEMARA⑧来曲哇和ARIMIDEX⑧阿那曲唑；以及 抗雄性激素药例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林； 以及曲沙他滨(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核普酸，尤其 是抑制在粘附细胞(abherant cell)增殖中涉及的信号通路中的基因(例 如，诸如PKC-ce、 Raf和H-Ras)的表达的那些；核酶例如VEGF表达 抑制剂(诸如ANGIOZYME⑧核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗例如基 因疗法疫苗，诸如ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID 疫苗；PROLEUKIN rIL-2; LURTOTECAN⑧拓朴异构酶1抑制剂； AB ARELIX⑧rmRH; 长春瑞滨和埃斯培4立霉素(参见美国专利第 4,675,187号)以及上述任何一种物质的药学上可接受的盐、酸或衍生 物。
当本文使用"生长抑制剂"时是指在体外和/或体内抑制细胞生长的 化合物或组合物。因此，生长抑制剂可是显著减小S期中细胞的百分比 的剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进行(在除了 S期的某处) 的剂，例如诱导G1停滞和M期停滞的剂。典型的M期阻断剂包括长 春碱类(vincas)(长春新碱和长春花碱)、TAXOL⑧和拓朴异构酶II抑制 剂例如阿霉素、表柔比星、道诺霉素、依托泊苷和博来霉素。停滞Gl 的那些剂也扩溢至S期停滞，例如DNA烷化剂诸如三苯氧胺、泼尼松、达卡巴溱、双氯乙基曱胺、顺铂、曱氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。
进一步的信息可在The Molecular Basis of Cancer (癌的分子基础)， Mendelsohn和Israel编辑，第1章,Murakami等人题名为"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs (纟田胞周期调节、致癌基 因和抗肿瘤药物)"，(WB Saunders: Philadelphia, 1995),具体地可在第 13页中找到。
术语"细胞因子"是用于由 一种细胞群释放的对其他细胞起细胞间 介质作用的蛋白质的通用术语。这种细胞因子的实例是淋巴因子、单核 因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素例如人类生长激素、 N-蛋氨酰人类生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；曱状腺素；胰岛 素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促滤泡素(FSH)、 促曱状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH);表皮生长因子；肝细胞生 长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肺瘤坏死因子a 和卩；米勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血 管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长因子例 如NGF-a;血小板生长因子；转化生长因子(TGF)例如TGF-ce和TGF-/3; 胰岛素样生长因子I和II;红细胞生长素(EPO);骨诱导因子；干扰素 例如干扰素a、p和集落刺激因子(CSF )例如巨噬细胞-CSF( M-CSF )、 粒细胞-巨噬细胞-CSF (GM-CSF)和粒细胞CSF ( G-CSF );白细胞介 素(IL)例如IL陽1、 IL-l仏IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL画5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL画ll、 IL-12;月中瘤坏死因子例如TNF-o;或TNF-)S以及其 他多肽因子包括LIF和kit配基(KL)。如本文所用的，术语细胞因子 包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因 子的生物活性等价物。
如本申请中所用的术语"前药"是指药学上活性物质的前体或衍生 物形式，其与母体药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并且能够被酶促 地活化或转化成更有活性的母体形式。参见，例如Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy (癌化学疗法中的前药)，，Sz'ocAem/caZ So"'e(y rra"sac"o/w, 14,第375-382页，第615期Meeting Belfast (1986)和 Stella等人,"Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery(前药革巴向药物递送的化学方法)，，，Z)z>ecto/ DWveo^， Borchardt 等人(编辑)，第247-267页，Humana Press (1985)。本发明的前药包括 但不限于含磷酸酯前药、含硫代,岸酸酯前药、含硫酸酯前药、含肽前药、 D-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含iS-内酰胺前药、含任选地取代 的苯氧基乙酰胺的前药或含任选地取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧 啶和其他可转化为更有活性的无细胞毒性的药物的5-氟尿苷前药。可被 衍生为前药形式以便用于本发明的细胞毒性药物的实例包括但不限于 上文描述过的那些化学治疗剂。
所谓的"放射疗法"意指使用定向的7射线或/3射线以产生对细胞的 足够的损害以便限制其正常地起作用的能力或完全毁坏细胞。应当理解 的是有许多本领域已知的方法来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治 疗是作为 一次施用提供的并且典型的剂量从10单位变化至200单位(戈 瑞)每天。
所谓的"减少或抑制"意指导致优选地20%或更多，更优选地50%或 更多并且最优选地75%、 85%、 90%、 95%或更多的总体下降的能力。 减少或抑制可指正被治疗的病症的症状、转移或微转移的存在或大小、 原发肿瘤的大小、休眠肺瘤的存在或大小或者在血管生成病症中血管的 大小或数目。
所谓的"反义核碱基寡聚体"意指无论长度，与基因的编码链或 mRNA的至少一部分互补的核i成基寡聚体。
所谓的"核碱基寡聚体"意指含有通过连接基团连在一起的至少八 个核碱基，优选地至少十二个并且最优选地至少十六个碱基的链的化合 物。这一定义中包括天然的和非天然的寡核苷酸(修饰的和未修饰的)， 以及寡核香酸模拟物例如蛋白核酸、锁定核酸和阿拉伯糖核酸
(arabinonucleic acid )。许多的核石咸基和连接基团可被用于本发明的核 碱基寡聚体，包括通过引用并入本文的美国专利公开第20030114412号
(参见例如公布文本的第27-45段)和第20030114407号(参见例如公 布文本的第35-52段)中描述的那些。核碱基寡聚体还可被靶向至翻译 起始和终止位点。在某些实施方案中，反义核碱基寡聚体包含从约8至 30个核苷酸。反义核碱基寡聚体还可包含至少40、 60、 85、 120或更多个与VEGF mRNA或DNA互补的连续的核苷酸，并可以与全长 mRNA或基因一样长。
所谓的"小RNA"意指长度为至少15个核苷酸，优选地17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34或 35个核苷酸并且长度甚至多达50或100 (包括之间的所有整数)个核 苷酸的任何RNA分子(单链或双链的)。在某些实施方案中，小RNA 能够介导RNAi。如本文所用的，词组"介导RNAi"是指辨别哪个RNA 将一皮通过RNAi才几理(machinery)或过程降解的能力。术语小RNA中 包括"小干扰RNA"和"微小RNA"。通常，微小RNA ( miRNA )是通过 切酶(Dicer)从约70个核苷酸的发夹前体RNA加工来的小的(例如17-26 个核苷酸)、单链非编码的RNA。小干扰RNA (siRNA)具有相似的大 小并且也是非编码的；但是siRNA是从长的dsRNA加工来的并且通常 是双链的。siRNA还可包括短的发夹RNA ，其中siRNA双链体的两条 链都包含于单一的RNA分子中。小RNA可被用于描述两种类型的 RNA。这些术语包括双《连RNA、单链RNA、分离的RNA(部分纯化的 RNA、本质上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA)以及通过添加、 缺失、耳又代和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同的改 变的RNA。这种改变可包括添加非核苷酸物质，例如在小RNA的末端 或内部(在RNA的一个或多个核苷酸处)。本发明的RNA分子中的核 香酸还可包括非标准的核香酸，包括非天然存在的核苷酸或脱氧核糖核 苷酸。对核酸分子的其它修饰参见上文的"核碱基寡聚体"。在一个实施 方案中，RNA分子包含3'羟基基团。
术语"静脉内输注"是指在大于约5分钟，优选地在约30至90分钟 之间的 一段时间内将药物引入动物或人类患者的静脉中，但是依照本发 明，可选择地将静脉内输注施用10小时或更短。
术语"静脉内团注"或"静脉内推注"是指将药物施用于动物或人类 的静脉中以便身体在约15分钟或更短，优选地5分钟或更短的时间内 接受药物。
术语"皮下施用"是指通过从药物贮器相对緩慢地持续地递送而将 药物引入动物或人类患者的皮肤下，优选地在皮肤和下面的组织之间的嚢(pocket)中。可通过向上捏或拉起皮肤并离开下面的组织来产生嚢。
术语"皮下输注"是指通过从药物贮器相对緩慢地持续地递送一段
时间，包括但不限于30分钟或更短，或者90分钟或更短，而将药物引 入动物或人类患者的皮肤下，优选地在皮肤和下面的组织之间的嚢中。 任选地，可通过在动物或人类患者的皮肤下植入的药物递送泵的皮下才直 入来进行输注，其中泵在预定的时间段例如30分钟、90分钟或跨越治 疗方案的长度的时间段内递送预定量的药物。
术语"皮下团注"是指在动物或人类患者的皮肤下方施用药物，其中 团注药物递送优选少于约15分钟，更优选少于5分钟并且最优选少于 60秒。优选地在皮月夫和下面的组织之间的嚢中施用，其中通过例如向 上捏或拉起皮肤并离开下面的组织来产生嚢。
词语"标记"在本文使用时是指直接或间接地与多肽轭合的可4企测 的化合物或组合物。标记可是本身可被检测的(例如放射性同位素标记 或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可催化可^皮检测的底物化合物 或组合物的化学变化。
II.使用VEGF特异性拮抗剂进行早期肺瘤治疗以及新辅助疗法和辅助 疗法
本发明以使用VEGF特异性拮抗剂治疗患有良性的、癌前的或非转 移性的肿瘤的受治疗者；治疗患有休眠肿瘤或微转移的受治疗者；或者 治疗患有发展中的癌的受治疗者或治疗具有发展癌的风险的受治疗者 为特征。例如，4吏用两种独立的方法抑制VEGF,即使用靶向VEGF-A 的单克隆抗体(mAb)的单一疗法和VEGF-A的遗传缺失， -使用早期肠 腺瘤形成的Apc"^+小鼠模型我们已经证明了， VEGF信号转导的抑制 足以停止肿瘤生长并且在肠腺瘤模型中提供了长期的生存益处。使用靶 向VEGF-A的单克隆抗体(mAb),我们也已经i正明了， VEGF-A的抑 制足以在1型多发性内分泌腺瘤(MEN1)的小鼠模型中抑制垂体腺瘤的 生长并降低过量的激素分泌。而且，使用小鼠胰岛肿瘤模型(RIP-T/3Ag) 和耙向VEGF-A的单克隆抗体(mAb )，我们已经证明了 VEGF的抑制 导致肺瘤血管生成显著减少，并且当被用作使用手术或化学治疗剂的细
44胞减少后的疗法时，阻止了肿瘤的再生长。本发明还以在新辅助疗法和
辅助情况中VEGF拮抗剂的使用为特征。
III. VEGF特异性拮抗剂
VEGF特异性拮抗剂是指能够与VEGF结合，减小VEGF表达水平， 或中和、阻断、抑制、取消、减小或干扰VEGF生物活性(包括VEGF 与一种或多种VEGF受体结合和VEGF介导的血管生成以及内皮细胞存 活或增殖)的分子(肽或非肽的)。优选地，VEGF特异性拮抗剂减小 或抑制至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或 更多的VEGF的表达水平或生物活性。优选地，通过VEGF特异性拮抗 剂抑制的VEGF是VEGF同种型或多种VEGF同种型，例如 VEGF(8-109)、 VEGF(1-109)、 VEGF165、 VEGF121、 VEGF145、 VEGF189 或VEGF206。
在本发明的方法中有用的VEGF特异性拮抗剂包括特异性结合 VEGF的肽或非肽的化合物，例如抗VEGF抗体和其抗原结合片4殳，与 VEGF特异性结合的VEGF多肽的拮抗剂变体或其片段，以及与VEGF 特异性结合由此隔绝其与一种或多种受体结合的受体分子和衍生物(例 如可溶的VEGF受体蛋白或其VEGF结合片段，或嵌合的VEGF受体 蛋白)，融合蛋白(例如VEGF-Trap (Regeneron))和VEGF^-白树毒素 (Peregrine)。 VEGF特异性拮抗剂还包括与编码VEGF多肽的核酸分子 的至少一个片段互补的反义核碱基寡聚体；与编码VEGF多肽的核酸分 子的至少一个片段互补的小RNA;靶向VEGF的核酶；VEGF的肽体； 以及VEGF适体。
A在Map我举
在本发明的方法中有用的抗VEGF抗体包括以足够的亲和力和特
原结合片段。抗VEGF抗体通常不会与其他的VEGF同源物例如 VEGF-B或VEGF-C结合，也不与其它生长因子例如P1GF、 PDGF或 bFGF结合。
在本发明的某些实施方案中，抗VEGF抗体包括但不限于，与通过杂交瘤ATCC HB 10709生产的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1相同的表位 结合的单克隆抗体；依照Presta等人(1997) Cancer Res. 57:4593-4599产 生的重组的人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于被称为贝伐单抗 (BV; Avastin )的抗体。贝伐单抗包括突变的人类IgGl框架区和来 自阻断人类VEGF与其受体结合的鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗 原结合互补性决定区。贝伐单抗的约93%的氨基酸序列(包括大部分的 框架区)衍生自人类IgGl,而约7。/。的序列衍生自鼠抗体A.4.6丄贝伐 单抗具有约149,000道尔顿的分子量并且是糖基化的。贝伐单抗和其他 人源化抗VEGF抗体被进一步描述于2005年2月26日发布的美国专利 第6，884，879号中。抗体的更多的实例包括但不限于如PCT申请7>开第 WO2005/012359号中描述的G6或B20系列抗体(例如G6-31 ， B20-4.1 )。 更多的抗体参见美国专利第7,060,269、 6,582,959、 6,703,020号；第 6,342,219号；第6,054,297号；W098/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1;美国专利申请公开第2006009360、 20050186208、 20030206899、 20030190317、 20030203409和20050112126号；以及 Popkov等人，Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)。可 在本发明中4吏用的抗体的其他实例包括与包含残基F17、 M18、 D19、 Y21、 Y25、 Q89、 191、 KlOl、 E103和C104的或可选择地包含残基F17、 Y21、 Q22、 Y25、 D63、 183和Q89的人类VEGF上的功能表位结合的 那些抗体。
依照本发明的G6系列抗体是一种抗VEGF抗体，其书于生自依照 PCT申请/>开第WO2005/012359号的图7、 24-26和34-35中任何一个 的G6抗体或G6衍生抗体的序列。在一个实施方案中，G6系列抗体与 包含残基F17、 Y21、 Q22、 Y25、 D63、 183和Q89的人类VEGF上的
功能表位结合。
依照本发明的B20系列抗体是一种抗VEGF抗体，其衍生自依照 PCT申请公开第WO2005/012359号的图27-29中任何一个的B20抗体 或B20衍生抗体的序列。在一个实施方案中，B20系列抗体与包含残基 F17、 M18、 D19、 Y21、 Y25、 Q89、 191、 KlOl、 E103和C104的人类 VEGF上的功能表位结合。
46依照本发明"功能表位"是指对抗体结合起积极作用的抗原的氨基 酸残基。抗原中起积极作用的残基中任何一个的突变(例如，野生型 VEGF的丙氨酸突变或同系物突变)将扰乱抗体的结合以致抗体的相对
亲和力比率(IC50突变型VEGF/IC50野生型VEGF)将大于5 (参见 WO2005/012359的实施例2)。在一个实施方案中，通过;容液结合噬菌 体展示ELISA确定相对亲和力比率。简单的说，将96孑L Maxisorp免疫 板(NUNC)于4。C用待测抗体的Fab形式以溶于PBS中2 ug/ml的浓度包 被过夜，并用PBS、 0.5。/。BSA和0.05%吐温20 ( PBT )于室温封闭2h。 将噬菌体展示hVEGF丙氨酸点突变体(残基8-109形式)或野生型 hVEGF( 8-109)于PBT中的系列稀释液首先在Fab包被的4反上于室温孵 育15分钟并将板用PBS、 0.05%吐温20 ( PBST)清洗。用在PBT中1: 5000稀释的抗M13单克隆抗体辣根过氧化物酶(Amersham Pharmacia ) 轭合物检测结合的噬菌体，用3,3'，5,5'-四曱基联苯胺(TMB, Kirkegaard & Perry Labs， Gaithersburg, MD)底物显色约5分钟，用1.0 M的H3P04淬 灭反应并在450 nm用分光光度法读数。IC50值的比率 (IC50,ala/IC50,wt)代表结合亲和力(相对结合亲和力)减小的倍数。 S. 憂伴为、子
两种最完全表征的VEGF受体是VEGFR1(也称为Flt-l)和VEGFR2 (也称为KDR和鼠科同系物的FLK-1 )。每个受体对每个VEGF家族成 员的特异性不同但VEGF-A与Flt-l和KDR都结合。全长Flt-l受体包 括具有七个Ig结构域的胞外结构域、跨膜结构域和具有酪氨酸激酶活 性的胞内结构域。胞外结构域涉及VEGF的结合而胞内结构域涉及信号 传导。
与VEGF特异性结合的VEGF受体分子或其片段可被用于本发明的 方法中以结合VEGF蛋白并使VEGF蛋白掩蔽，由此使其不能进行信号 转导。在某些实施方案中，VEGF受体分子或其VEGF结合片段是可溶 的形式例如Flt-l。受体的可^^形式通过与VEGF结合而对VEGF蛋白 的生物活性施加抑制性作用，由此使其不能与存在于目标细胞表面上的 其天然受体结合。还包括VEGF受体融合蛋白，其实例描述于下文。
嵌合VEGF受体蛋白是具有衍生自至少两种不同蛋白质(其中至少一种是VEGF受体蛋白(例如flt-l或KDR受体))的氨基酸序列的能 够与VEGF结合并抑制VEGF生物活性的受体分子。在某些实施方案中， 本发明的嵌合VEGF受体蛋白由衍生自仅两种不同的VEGF受体分子的 氨基酸序列构成；但是可将包含来自flt-l和/或KDR受体胞外配体结合 区的一个、两个、三个、四个、五个、六个或所有七个的Ig样结构&戈 的氨基酸序列与来自其他无关蛋白质的氨基酸序列(例如免疫球蛋白序 列)连接。与Ig样结构域结合的其他氨基酸序列对于本领域的技术人 员来说是明显的。嵌合VEGF受体蛋白的实例包括例如可i^的Flt-1/Fc、 KDR7Fc或FLt-l/KDR/Fc (也被称为VEGF Trap )(参见，例如PCT申 请公开第W097/44453号)。
本发明的可溶的VEGF受体蛋白或嵌合VEGF受体蛋白包括未经由 跨膜结构域而固定在细胞表面的VEGF受体蛋白。像这样，VEGF受体 的可溶形式，包括嵌合受体蛋白，尽管能够与VEGF结合并使VEGF 失活，但并不包含跨膜结构域并因此通常不会变得与表达分子的细胞的 细胞膜有关联。
C. *齊
核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶RNA分子。核酶通过对互 补的目标RNA进行序列特异性杂交，之后进行核酸内切而起作用。可 通过已知的技术识别可能的RNA目标中的特异性核酶切割位点。进一 步的细节参见，例如Rossi, C匿"f肠/ogy, 4:469-471(1994)和PCT 申请公开第WO 97/33551号。以VEGF表达为目标的一种示例性核酶 是Angiozyme (参见，例如美国专利申请公开第20060035278号)。
A這谬
适体是形成与目标分子例如VEGF多肽特异性结合的三级结构的 核酸分子。适体的产生和治疗使用在本领域中已广泛建立。参见例如美 国专利第5,475,096号。VEGF适体是聚乙二醇化修饰的寡核苷酸，其 采用使其能够与胞外VEGF结合的三维构象。治疗上有效的以VEGF 为目标来治疗年龄相关的黄斑变性的适体的 一 个实例是哌加4也尼 (pegaptanib ) (MacugenTM, Eyetech， New York)。关于适体的更多的4言息 可在美国专利申讳^^开第20060148748中找到。
48欣#
肽体是与编码免疫球蛋白分子的 一 个片段或 一部分的氨基酸序列 相连接的肽序列。多肽可衍生自随机的序列，其通过用于特异性结合的 任何方法(包括但不限于噬菌体展示技术)来选择。在一个实施方案中， 所选择的多肽可被连接于编码免疫球蛋白Fc部分的氨基酸序列。与
VEGF特异性结合并拮抗VEGF的肽体在本发明的方法中也是有用的。 E #^#^#我##"^为、子
本发明的方法还以VEGF特异性拮抗性核酸分子(包括反义核碱基 寡聚体和小RNA)的使用为特征。
在一个实施方案中，本发明以针对VEGF RNA的反义核碱基寡聚 体的使用为特征。通过与互补核酸序列(有义或编码链)结合，反义核 碱基寡聚体能够大概通过经由RNA酶H的RNA链的酶切割抑制蛋白 质表达。
在本发明的方法和组合物中尤其有用的反义核碱基寡聚体的 一个 实例是吗啉代寡聚体。吗啉代物质(morpholinos)被用于阻断其他分子 对核酸分子中特异性序列的接近。它们可阻断其他分子对核糖核酸 (RNA)的小(~25碱基)区域的接近。吗啉代物质有时被称作PMO， 石粦酰二胺吗啉^寡一亥香酉臾(phosphorodiamidate morpholino oligo )的首 字母缩写。
吗啉代物质^L用于通过阻止细胞制造目标蛋白质或通过》f饰 mRNA前体的剪接而敲低基因功能。吗啉代物质是通过标准的核酸碱基 配对与RNA的互补序列结合的合成分子。尽管吗啉代物质具有标准的 核酸碱基，但那些碱基是与吗啉环而不是脱氧核糖环结合的并通过磷酰 二胺基团而不是磷酸盐连接。用无电荷的磷酰二胺基团取代阴离子的磷 酸盐消除了在通常生理pH范围内的离子化，因此，有才几体或细^^中的 吗啉代物质是无电荷分子。
吗啉代物质通过"空间阻断"或与RNA中的目标序列结合并阻断可 与RNA以其他方式相互作用的分子来起作用。由于吗啉代物质的完全 非天然的骨架，细胞蛋白质无法识别吗啉代物质。核酸酶不降解吗畔木代 物质而吗啉代物质不会活化toll样受体并且因此它们不会活化固有的免疫响应例如干扰素系统或NF-KB介导的炎症响应。还未知吗啉代物质
修饰DNA的曱基化。因此，针对VEGF的任何部分的可减少或抑制
中是尤其有用的。
本发明还以使用RNA干扰(RNAi)抑制VEGF的表达为特4正。 RNAi是通过引入双链RNA( dsRNA)而起始的转录后基因沉默的形式。 短的15至32个核香酸的双链RNA (通常被称为"siRNA"、"小RNA" 或"微小RNA")在线虫(Zamor等人，Ce〃 101 : 25-33 )和哺乳动物组 织培养细胞系(Elbashir等人，Mm/M 411 :494-498， 2001,据此通过引 用并入)中在下调基因表达方面有效。在哺乳动物中这一方法的进一步 的治疗效力由McCaffrey等人(A^/wre 418:38-39. 2002 )在体内证实。 小RNA在长度上至少是15个核苷酸，优选地17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35个才亥苦 酸，并且甚至在长度上多达50或100 (包括之间的所有整数)个核苷 酸。这种与VEGF的任何区域基本上一致或互补的小RNA被包括为本 发明的VEGF特异性拮抗剂。
小RNA的特殊要求和修饰是本领域已知的并被描述于例如PCT申 请公开第 WO01/75164号和美国申请公开第20060134787 、 20050153918、 20050058982、 20050037988和20040203145号中，其相 关的部分通过引用并入本文。在特定的实施方案中，可合成siRNA或 通过例如在酶切酶存在的情况下在dsRNA被加工为约17至约26个核 苦酸的RNA分子的条件下加工较长的双链RNA而产生siRNA。还可 通过相应的DNA片段(例如发夹DNA构建体)的表达产生siRNA。 通常，siRNA具有特有的2-至3-核苷酸的3，悬垂末端，优选地这些是 (2，-脱氧)胸苷或尿嘧啶。siRNA通常含有3'羟基基团。在某些实施 方案中，使用单链siRNA或平端dsRNA。为了进一步加强RNA的稳定 性，使3，悬垂对降解稳定。在一个实施方案中，通过含有嘌呤核苷酸例 如腺苷或鸟苷使RNA稳定。可选择地，通过修饰的类似物取代嘧啶核 苷酸，例如通过(2，-脱氧)胸苷(thymide)取代尿苷2-核苷酸悬垂是 可耐受的并且不影响RNAi的效力。2，羟基基团的缺乏显著增强了组织培养基中悬垂的核酸酶抵抗力。
可通过包括化学合成或使用果蝇体外系统的重组生产的多种方案
获4寻siRNA分子。可乂人公司移'H口 Dharmacon Research Inc.或Xeragon Inc. 商业地获得它们或者可使用商业上可得的试剂盒例如来自Ambion的 &7e"cwTM siRNA构建试剂盒(目录编号1620)或来自New England BioLabs的HiScribeTM RNAi转录试剂盒(目录编号E2000S)合成它们。
可选4奪地，可使用RNA体外转录的标准程序和dsRNA退火程序来 制备siRNA,所述程序例如Elbashir等人(Ge"&s & Dev. 15: 188-200, 2001), Girard等人(A^wre 442: 199-202 (2006))， Aravin等人(Mz似re 442: 203-207 (2006)), Grivna等人(Ge"&s Dev. 20: 1709-1714 (2006)》和Lau 等人(Sck"ce 313: 363-367 (2006))中描述的那些。
如Yu等人(尸rac. A^//.C/&4， 99: 6047-6052, 2002)或 Paddison等人(Ge"^ & Dev, 16: 948-958， 2002)中描述的短发夹RNA (shRNA),还可用于本发明的方法。设计shRNA以便将有义和反义链 包含于一个RNA分子中并通过核苷酸(3个或更多)环连接。可^f吏用 如前文和Yu等人如上中所描述的标准体外T7转录合成来合成并纯化 shRNA。还可将shRNA亚克隆进具有小鼠U6启动子序列的之后可被转 染进细胞中并用于shRNA的体内表达的表达载体中。
可获得用于将dsRNA转染或引入哺乳动物细胞中的多种方法。例 如，有若干商业上可获得的对siRNA的基于脂质的转染有用的转染试 剂，包括但不限于TransIT-TKOTM (Minis,目录号MIR 2150)、 TransmessengerTM (Qiagen, 目录号 301525) 、 01igofectamineTM和 Lipofectamine (Invitrogen,目录号 MIR 12252-011 和目录号 13778-075)、 siPORT (Ambion,目录号1631)、 DharmaFECT (Fisher Scientific,目录号T-2001-01)。还可商业获得用于基于电穿孔的siRNA 转染的方法的试剂，例如siPORTer (Ambion Inc.目录号1629)。还可 使用显微注射技术。还可从被引入细胞的表达构建体转录小RNA,其 中表达构建体包括用于转录可操作地与 一种或多种转录调节序列连接 的小RNA的编码序列。当需要时，质粒、载体或病毒载体还可纟皮用于 递送dsRNA或siRNA并且这种载体是本领域已知的。每种转染试剂的方案可从制造商获得。
IV.治疗〗吏用
尽管已知关于VEGF在血管生成中的作用的大量信息，但关于 VEGF在良性的、癌前的或非转移性的癌中或在辅助或新辅助情况中的 作用相对地所知甚少。我们已经发现VEGF特异性拮抗剂可被用于治疗 良性的、癌前的或非转移性的癌；用于治疗休眠肿瘤或微转移；用于预 防肿瘤复发或再生长；或用于在处于发展癌的风险的受治疗者中治疗或
转移性癌的受治疗者的辅助疗法；或用于治疗患有可手术的癌的受治疗 者的新辅助疗法，其中在手术去除受治疗者中可手术的癌之前提供所述 疗法。尽管下文中治疗应用一皮分为疗法、预防、新辅助疗法和辅助疗法，
A y^9f的分类
术语癌包含增殖病症的集合，包括但不限于癌前的生长、良性肿瘤、 恶性肿瘤和休眠胂瘤。良性肿瘤保持局限于起始的部位并且不具有向远 处部位浸润、侵入或转移的能力。恶性肺瘤会侵入并损害它们周围的其 他组织。它们还可获得从起初的部位脱离并通常通过血流或通过'淋巴结 所在的淋巴系统向身体的其他部分扩散(转移)的能力。休眠肿瘤是静 止的肿瘤，其中肿瘤细胞存在但肿瘤发展不是临床上明显的。
将原发肿瘤按其发生的组织类型分类；将转移性的肿瘤按癌细胞来 自于的组织类型分类。久而久之，恶性肿瘤的细胞变得更加不正常并显 得更不像正常细胞。癌细胞外观上的这一变化被称为肿瘤分级，并且癌 细胞被描述为良好分化的(低级别)、中度分化的、低分化的或未分化 的(高级别)。良好分化的细胞表现相当正常并且类似于它们起源于的 正常细胞。未分化的细胞是已经变得如此不正常以致不可能再确定细月包 的来源的细胞。
癌分期系统描述了在解剖学上癌已经扩散了多远并尝试将具有相 似预后和治疗的患者放入同样的分期组。可进行几个检验以帮助将癌分 期，包括活组织检查和某些成像检验例如胸部X射线、乳房X线照片、骨扫描、CT扫描和MRI扫描。血液检验和临床评估也被用来评估患者 的总体健康并检测癌是否已经扩散至某些器官。
为4夺癌分期，American Joint Committee on Cancer (美国癌症耳关合 委员会)使用TNM分类系统首次将癌，尤其是实体瘤，以字母类别形 式分类。将癌标明字母T (肿瘤大小)、N (可触诊的结节)和/或M (转 移)。Tl、 T2、 T3和T4描述原发病变的不断增加的大小；N0、 Nl、 N2、 N3指明渐进的晚期结节的复杂情况；以及MO和Ml反映了远处 转移的不存在或存在。
在第二种分期方法，也被称为总体时期分组或罗马数字分期法中， 结合原发病变的大小以及结节扩散和远处转移的存在，将癌分为O至IV 期。在这一系统中，病例-故分为由罗马ll字I至IV表示的四个时期， 或被分类为"复发"。对于某些癌，O期被称作"原位"或"Tis"，例如乳腺 癌的导管原位癌或小叶原位癌。高级别腺瘤也可纟皮分类为0期。通常I 期癌是小的局部的通常可治愈的癌，而IV期癌通常代表不可手术的或 转移性的癌。II和III期癌通常是局部晚期的和/或表现出局部淋巴结的 参与。通常，较高分期数字表示更广泛的疾病，包括较大的肿瘤大小和 /或癌向附近的淋巴结和/或原发肿瘤的相邻器官的扩散。这些时期被精 确地定义，但定义对于每种癌来说是不同的并且是本领域技术人员已知 的。
许多癌档案(registry), 例如NCI的Surveillance, Epidemiology, and End Results Program (监测、流行病学和最终结果项目)(SEER)使用了 总结分期。这一系统被用于所有类型的癌。它将癌病例分为五个主要的 类别
^位的是早期癌，其仅存在于其开始的细胞层。 肩部的是限于其开始的器官，没有扩散迹象的癌。 且誠的是已经超出初始的(原发)部位向邻近的淋巴结或器官和组 织扩散的癌。
远处的是已经从原发部位向远处器官或远处淋巴结扩散的癌。
^乂p的被用来描述没有足够的信息以表明时期的病例。
此外，对于癌来说在已经去除原发肿瘤后几个月或几年复发是常见的。在所有可见的肿瘤已经被根除后重现的癌被称为复发疾病。在原发 肿瘤的区域中重现的疾病是原处复发，而作为转移重现的疾病被称为远 处复发。休眠肿瘤是以存在肿瘤细胞但肿瘤发展不是临床上明显的静止 状态存在的肺瘤。微转移是已经从原发肺瘤向身体其他部分扩散的小转 移或许多细胞。在筛查或诊断试验中微转移可或不可被检测。本发明的 方法对预防休眠肺瘤或微转移的发生或者肿瘤的复发是有用的，例如在 〃f木眠肿瘤或微转移存在但可或不可被临床检测的情况下。
本发明的方法还对早期癌的治疗是有用的，包括但不限于良性的、
癌前的或非转移性的肿瘤。这包括任何O、 I或II期的肺瘤；任何非转 移性的II期肿瘤；任何通常先于癌或发展为癌的疾患，包括但不限于 发育异常；以及任何保持局限于起始的部位并且没有向远处部位浸润、 侵入或转移的肿瘤。良性的、癌前的或非转移性的肿瘤的实例包括息肉、 腺瘤、纤维瘤、脂肪瘤、胃泌素瘤、胰岛素瘤、软骨瘤、骨瘤、血管瘤、 淋巴管瘤、脑脊膜瘤、平滑肌瘤、横紋肌瘤、鳞状细胞乳头状瘤、听神 经瘤、神经纤维瘤、胆管嚢腺瘤、平滑肌瘤、间皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、 沙眼、肉芽瘤、错构瘤、移行细胞乳头状瘤、唾液腺的多形性腺瘤、硬 纤维瘤、皮样嚢乳头状瘤、嚢腺瘤、局灶性结节状增生和结节状再生性 增生。
由于在原发肿瘤生长和转移中都涉及血管生成，因此本发明提供的 抗血管生成治疗能够抑制肿瘤在原发部位的肿瘤性生长以及预防肿瘤 在继发部位的转移，由此允许通过其他治疗剂攻击肿瘤。本文有待治疗 的癌的实例包括实体和非实体或软组织的肿瘤。实例包括^f旦不限于癌、 淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这种癌的更具体的实例包括鳞状细 胞癌；肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌)； 腹膜癌，肝细胞癌，胃(gastric)或胃(stomach)癌(包括胃肠癌)； 胰腺癌；成胶质细胞瘤；子宫颈癌；卵巢癌；肝癌(liver cancer);膀 胱癌；肝细胞瘤；乳腺癌；结肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜或子宫癌、 唾液月泉癌；肾(kidney)或肾(renal)癌；肝癌(liver cancer);前列A良 癌；外阴癌；曱状腺癌；肝癌(hepatic carcinoma);和不同类型的头颈 癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL);小淋巴细胞性(SL)NHL;中等级别/滤泡性NHL;中等级别弥漫性NHL; 高级别免疫母细胞性NHL;高级别淋巴母细胞性NHL;高级别小无核 裂细胞性NHL;肺块性疾病NHL;套细胞淋巴瘤；AIDS相关的淋巴瘤； 以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL);急 性成淋巴细胞性白血病(ALL);毛细胞性白血病；慢性原始粒细胞性 白血病和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，以及与母斑细胞病、水肿(例 如与脑瘤相关的)和梅格斯综合征相关的非正常血管增生。更具体地， 可通过本发明的VEGF特异性拮抗剂治疗的癌包括乳腺癌、结肠直肠 癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前 列腺癌；肝癌；胰腺癌；软组织肉瘤，卡波西肉瘤、类癌、头颈癌、脑 瘤、神经月交质瘤(例如间变性星形细il包瘤、间变性少突星形细胞瘤、间 变性少突神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤)、黑素瘤、卵巢癌、间皮 瘤和多发性骨髓瘤。更优选地，本发明的方法被用于治疗人类患者中的 结肠直肠癌。
在 一 个实施方案中，将本发明的方法用于治疗被称为腺瘤的良性上 皮细胞肿瘤。腺瘤是具有腺性起源的良性肿瘤。腺瘤通常起源于用于分 泌的上皮细胞。上皮细胞遍布身体但4义仅是一部分这种细月包用于分泌。 被用于分泌的上皮细胞构成了被称为腺的身体特殊部分。腺承担形成身 体中许多物质的职责，所述物质包括^旦不限于汗、唾液、母乳、黏液和 激素。腺瘤可从身体中大多数腺的细胞形成。
腺瘤可以与恶性或癌性肿瘤相似的方式形成。腺瘤是良性的并因此 不会向其他器官或组织转移或扩散。尽管大多数腺瘤保持良性，但一些 腺瘤可发展为恶性肿瘤，并且如果其发生，新的恶性腺瘤被称为腺癌。 例如，结肠和直肠癌开始时可作为腺瘤或息肉但后来发展为腺癌；i气 管腺瘤可发展为肺癌。
常常，腺瘤对它们发展于其中的器官或腺组织具有显著影响。腺瘤 经常分泌过量水平的激素。当这发生时，对于受到影响的个体来说该作 用可能是相当不舒服的。在有些情况，这种作用可为致命的。然而，有 些腺瘤发展而没有任何可证实的作用。有某些类型的腺瘤在女性中更加常见，例如肝的腺瘤。其他的例如 结肠腺瘤是在高龄例如超过五十岁的成人中最常见的。此外，有使患者 容易发展腺瘤的因素。例如，使用口服避孕药的女性可能具有增加的发 展肝腺瘤的风险。某些类型的腺瘤，例如结肠腺瘤，可能是可遗传的。
与腺瘤相关的症状变化很大。例如，称作纤维腺瘤的乳腺腺瘤，通 常不产生症状并且可以很小以致受影响的个体不能发觉它。但是其他的 乳腺腺瘤可大到足以通过触摸而注意到。相比之下，肺腺瘤可产生发热、
寒战、呼吸短促和咳血(bloody cough )。
使用多种技术诊断腺瘤，包括采集血液和尿样品、超声成像、计算 机断层(CT)扫描和磁共振成像(MRI)。活体组织检查通常被用于确 定肿瘤是良性的还是恶性的。本发明的方法对于腺瘤的治疗、腺瘤复发 的治疗或预防(例如在具有休眠肺瘤或微转移的受治疗者中)或者对于 具有与腺瘤有关的任何危险因素的受治疗者中腺瘤的预防尤其有用。
C. f浙;#
在另一个实施方案中，本发明的方法被用于良性的、癌前的、非转 移性的或休眠的胃肠肿瘤或来自胃肠肿瘤的微转移的治疗。这包括任何 0、 I或II期肺瘤；通常先于胃肠癌或发展为胃肠癌的任何肿瘤或疾患； 以及保持局限于起始的部位并且没有向远处部位浸润、侵入或转移的任 何胃肠肿瘤。胃肠肿瘤中包括消化系统尤其是食管、胃、肝、胆道(胆 嚢、胆管、肝胰管壶腹(ampulla of vater))、肠、胰腺、结肠、直肠和 肛门的任何息肉、腺瘤、肺瘤或癌。这些在以下详述。
(%) WW
肛门癌是肛管或痔环的恶性肿瘤。肛门癌经常开始为肛门发育异 常。肛门发育异常由具有不正常变化，但没有显示出向周围组织侵入的 迹象的肛门细胞构成。肛门发育异常的最严重的形式被称为原位癌，其 中细胞的表现像癌细胞，但没有侵入到正常细胞所在的一边。随时间过 去，肛门发育异常最终变化至细胞变成扩散性并获得转移或脱离身体其 他部分的能力的点。肛门发育异常有时被称为肛门上皮内瘤样病变 (AIN)。当肛门癌开始扩散，它通常是通过直接侵入至周围组织中或 通过淋巴系统而扩散。尽管可能发生，但通过血液的肛门癌的扩散比较
56不常见。
已经将几种因素与肛门癌相关。最重要地，人类乳头瘤病毒(HPV) 的感染已经显示出与肛门癌相关并与几种其他的癌(包括子宫颈癌和头
颈癌)相关。另一种性传播病毒人类免疫缺陷病毒(HIV)已经与肛门 癌相关^:，感染HIV的个体具有增加的感染HPV的风险。由于肛门癌 在发展为肛门癌之前首先开始表现为肛门发育异常，因此有AIN史的 患者具有增加的发展肛门癌的风险。此外，在患有良性肛门病症例如肛
门瘘、肛裂、肛周脓肿或痔疮的患者中表现出增加的肛门癌比率。
本发明的方法对于早期肛门癌的治疗，肛门癌复发的治疗或预防 (例如在患有休眠肿瘤或微转移的受治疗者中)或具有任何与肛门癌相 关的风险因素的受治疗者中肛门癌的预防是尤其有用的。 问錄應i廯和i應濕
结肠是大肠((large intestine),也被称为大肠(large bowel))中最 长的部分。在西方世界的男性和女性中，结肠癌都是第三类最常见的癌。 在非洲裔美国人中发病率是最高的，他们也更可能死于这种疾病。结肠 癌的风险在50岁之后大大升高，但是每年在较年轻的人群中也有大量 病例纟皮才艮告。通常，结肠和直肠癌一皮划分在一起并具有与它们相关的相 同的风险因素。具有结肠癌、息肉或遗传性结肠癌综合征(例如FAP 和HNPCC)的个人或家族史的个体，以及患有溃疡性结肠炎或克隆病 的患者都处于较高的风险中并可能在比一般人群更早的年龄就需要筛 查。患有结肠癌的具有一级亲属关系(父母、兄弟姐妹或子女)的个体 发展癌的可能性是没有受感染的亲属的人的2至3倍。
可用临床医生已知的多种技术诊断结肠癌。由于这些时期常常不与 任何症状相关，筛查测试是诊断处于早期的结肠癌(例如息肉或腺瘤) 的最有效的方法。通常当息肉长成肿瘤时，其会出血或堵塞结肠而产生 症状。这些症状包括从直肠出血、排便后大便或厕所中的血、大便形状 的改变(即变稀)、腹部绞痛以及在不需要排便时感觉到需要排便。由 于肺瘤和息肉可间歇地出血，通过称为大便潜血试验(FOBT)的试验 可检测大便样品中的血液。FOBT单独只能发现约24%的癌。可弯曲的 乙状结肠镜检查或结肠镜检查也可被用于诊断结肠直肠癌。通常，将结肠直肠癌如下分期
0期(也称作原位癌)-癌局限于结肠壁最外面的部分。I期-癌已经扩散至结肠壁的第二和第三层，但没有到结肠壁的外部
或超出结肠壁。这也被称为杜克斯A期结肠癌。
II期-癌已经扩散穿过结肠壁，但是没有侵入任何淋巴结(这些是
帮助对抗感染和疾病的小结构)。这也被称为杜克斯B期结肠癌。
III期-癌已经扩散穿过结肠壁并且到淋巴结中，但是没有扩散至身
体其他区域。这也被称为杜克斯C期结肠癌。
IV期-癌已经扩散至身体其他区域(即肝和肺)。这也被称为杜克斯
D期结肠癌。
本发明的方法对于早期结肠直肠癌的治疗，结肠直肠癌复发的治疗或预防(例如在患有休眠肿瘤或微转移的受治疗者中)或具有任何与结肠直肠癌相关的风险因素(例如上文所描述的那些)的受治疗者中结肠直肠癌的预防是尤其有用的。
食管是连接咽喉与胃的肌肉质管。绝大多数的食管癌是从食管的内部膜(粘膜)而不是从构成食管其余部分的肌肉或软骨细胞发展的。食管的膜有些独特因为其在从咽喉向胃伸展时是变化的。在上端(近端)食管中，食管的膜与咽喉的膜类似，由鳞状细胞构成。因此当癌在这一区发展时，它们通常是鳞状细胞癌。在低端(末端)食管中，更常见的类型的癌被称为腺癌。
除了扩散性的癌，患者有时被诊断为癌前病变，称作原位癌。这些癌前病变可在发展为鳞状细胞癌或腺癌之前^皮发现。当食管的膜经历与癌的变化相似的变化4旦没有任何向更深组织中侵入时发生原位癌。因此，尽管细胞本身具有癌样特性，但由于没有侵入发生，因此没有扩散的风险。被认为是癌的前兆的另一种类型的病变本身被称为巴雷特食管，其在下文中被深入地讲解。
每年食管癌发生于约13,500个美国人中，导致约12，500例死亡。大多数患者在他们50多岁或60多岁的时候被诊断出，并且被诊断出的男性是女性的大约四倍。过去，绝大多数(~85%)被诊断的食管癌是在上端食管中发生的鳞状细胞癌。这种类型的癌的风险因素包括抽烟和
饮酒(alcohol use )。尽管它们都被认为是独立的风险因素(抽烟为更强的)，但在食管癌发展中这两种因素之间似乎有协同作用。食管鳞状细胞癌发展的其他潜在的致癌原是亚硝胺、石棉纤维和石油产品。
有腺癌(通常为低端食管的)风险的患者群体与这截然不同。当与鳞状细胞癌相比，腺癌之前是不太常见的疾病。但近来它已变得甚至比鳞状细胞癌更普遍。通常腺癌被认为是产生于巴雷特食管的环境中，所述巴雷特食管是食管的正常膜被与胃相似的膜所替代的一种病症。通过内窥镜检查诊断巴雷特食管，其中使用纤维光学照相机以俯视进入食管中并活体组织检查任何可疑区域。巴雷特食管被认为是低端食管长期暴露于胃酸所导致的。这种暴露发生于患有胃食管反流疾病(GERD)的患者中，其导致患者胃灼热、胃气胀、丧失食欲或随着食物或晚上睡觉时胃痛的症状。患有慢性GERD的患者具有发展巴雷特食管的风险并且因此具有较高的发展食管腺癌的风险。
尽管通过定义，巴雷特食管在食管的膜不正常时发生，但是可有不同水平的不正常程度。将其从发育异常的方面来分级，其被用于确定巴雷特食管将有多大可能发展至癌。由于这些被认为是具有发展至癌的高可能性的癌变前变化，具有高级别发育异常的巴雷特食管的患者应当每三个月接受 一 次内窥镜检查或实际地接受治疗。对于证明局部食管癌或发育异常的最灵敏的检测是内窥镜检查。用内窥镜检查，可用纤维光学照相机直接观察食管中所关心的位置，并且将不正常的位置，存或不存在流血，以及梗阻的量可视化。取决于食管癌的位置和程度，可能还需要进行喉镜检查(查看咽喉)或支气管镜检查(查看气管和气道)。如今的标准医护还包括在内窥镜检查期间进行超声波，称作内窺镜超声检查(EUS)。为正确的诊断癌并将癌分期，通常进行CT扫描、吞钡测试、X-射线以及其他更多的常规测试(包括血液筛查测试)。
本发明的方法对于早期食管癌的治疗，食管癌复发的治疗或预防(例如在患有休眠肺瘤或微转移的受治疗者中)或具有任何与食管癌相关的风险因素(例如上文所描述的那些)的受治疗者中食管癌的预防是尤其有用的。
59(7v」,对4
胆嚢是贮存并浓缩胆汁的小的梨形器官。胆嚢和肝通过肝管相连。
在美国胆嚢的原发癌每年感染约6000名成人。这些癌的大部分是^泉癌，
具有亚型例如乳头状的、结节状的、管状的，这取决于显微镜下肿瘤细胞的外观。比较不常见的亚型包括鳞状细胞、印戒细胞和腺鳞癌(腺棘皮癌)。
胆嚢癌在老年患者中最常见，诊断时年龄中值为62-66岁。它在女性中更常见，女性比男性比率为约3: 1。
尽管已经将胆嚢癌与胆结石、高的雌激素水平、吸烟、酒精、肥胖和女性性别相关联，但胆嚢癌的病因是未知的。而且患有炎性肠疾病(溃疡性结肠炎和克隆病)的患者发展肝外胆道癌的可能性是10倍。
通常，通过(thorough)病史和身体检查以及实验室工作(其包括代谢化学和肝功能组以寻找作为一般肝胆疾病的提示的血液中不同物质的不正常水平)来诊断胆嚢癌。通常还进行尿分析以评估这些物质中的一些的尿中水平。还可使用其它的技术例如超声、MRI、胆管造影和CT扫描。
本发明的方法对于早期胆嚢癌的治疗，胆嚢癌复发的治疗或预防(例如在患有休眠肺瘤或微转移的受治疗者中)或具有任何与胆嚢癌相关的风险因素(例如上文所描述的那些)的受治疗者中胆嚢癌的预防是尤其有用的。
W #痛
胃癌是胃的癌。在美国，胃癌目前列为第14大最普遍的癌。40岁前很少发生胃癌，但之后其发病率随年龄而增加。
超过90%的胃癌产生于胃的膜。由于这种膜具有腺，因此从其而来的癌被称为腺瘤或对于更晚期的形式来说称为腺癌。尽管有其他可从胃中产生的癌(淋巴瘤-来自淋巴组织、平滑肌肉瘤-来自肌肉组织、鳞状细胞癌-来自没有腺的膜)，但绝大部分是腺癌。
研究也已将幽门螺旋杆菌(//e"coZ^cter ; j;/on')感染与胃癌相关联。幽门螺旋杆菌与胃溃疡和慢性萎缩性胃炎有关，这可解释幽门螺旋杆菌感染的患者中胃癌的高发病率。然而，幽门螺旋杆菌在胃癌的发展中的
60确切作用还不清楚。
可用多种片企测精确地识别胃癌，包括钡射线双重比对(doublecontrast barium radiograph)(所i胃的"上端胃肠道"或"吞钡、(bariumswallow )")和上端内窥镜^r查术。包括CT扫描、PET扫描和腹腔镜检查的其他程序被用于胃癌的诊断。
本发明的方法对于早期胃癌的治疗，胃癌复发的治疗或预防(例如在患有休眠肿瘤或微转移的受治疗者中)或具有任何与胃癌相关的风险因素(例如上文所描述的那些)的受治疗者中胃癌的预防是尤其有用的。
〈v〃賴
有许多良性的肝肿瘤。血管瘤是最常见的肝良性肿瘤并且当在肝中形成良性的充血的肿瘤时发生。其他良性肿瘤包括腺瘤和局灶性结节状增生。尽管这些肺瘤没有侵入周围的组织或转移，但放射摄影成像时常常4艮难分辨良性和恶性肺瘤之间的差别。
肝细胞癌(HCC)是产生于肝细胞的癌，是最常见类型的原发肝癌并占所有肝癌的70%左右。产生于肝中的胆管的癌被称为胆管癌并占所有肝癌的10-20%。这些癌可产生于肝中的胆管(称为肝内胆管癌)或产生于从肝导出的胆管中(称为肝外胆管癌)。其他类型的罕见的癌可在肝中发生。这包括血管肉瘤(恶性充血肿瘤)和肝胚细胞瘤(一种在非常小的儿童中发展的罕见癌)。
有许多和肝癌相关的风险因素。在美国，肝癌的最常见的风险因素是肝硬化。在美国慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染也是肝癌常见的病因。世界范围内，其他的风险因素例如慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染和黄曲霉毒素Bl食品污染更加常见。
有几种^l用于^r测肝癌的筛查测试。 一种可能的筛查测试涉及Q!-胎蛋白(AFP)的血液水平的检测。发现AFP在胎儿血液中是以高水平存在的蛋白质，^S正常地在出生后消失。在HCC存在的情况下AFP水平升高并且可是肝癌发展的标志物。尽管对一些具有发展肝癌的高风险的患者常规地测试AFP水平，但不是所有肝癌都产生血液中高水平的AFP,而且到大多数患者被发现具有高AFP水平时，肿瘤已经处于晚期了。其他的血液蛋白有可能被用作肝癌的筛查工具。几项研究已显示蛋白质例如去-y羧基凝血酶原(DCP )和扁豆凝集素反应性部分(AFP-L3 ) 的使用也可被用作肝癌形成的标志物；然而，事实上很少使用这些蛋白质。
此外，当怀疑是肝癌时，进行超声、CT扫描、MRI、血管造影、 氟脱氧葡萄糖(fluorodexoyglucose )-正电子发射断层摄影(FDG-PET )、 活体组织才企查和剖腹探查(exploratory laporatomy )以进一步诊断并将 肝癌分期。
本发明的方法对于早期肝癌的治疗，肝癌复发的治疗或预防(例如 在患有休眠肿瘤或微转移的受治疗者中)或具有任何与肝癌相关的风险 因素(例如上文所描述的那些)的受治疗者中肝癌的预防是尤其有用的。
阔
胰腺是长约六英寸的梨形腺，位于腹部深处，在胃和脊推之间。需
指出的是胰腺被分为三个部分最宽的部分被称为头部，中间的部分是
本体而细末端被称为尾部。胰腺负责制造激素(包括帮助调节血糖水平 的胰岛素)和经由肠用于消化食物的酶。通过胰腺中的导管运输这些酶，
这些酶流入通常的胆管，所述胆管将酶运进肠。胰腺癌的发病率在60 和80岁之间是最高的，而在低于40岁的人群中非常少见。男性和女性 中的发病率大致相当，尽管近年来女性的发病率升高，这可能是因为女 性更高的吸烟率。吸烟者发展胰腺癌的可能性是二至三倍。如果一个人 的母亲、父亲或兄弟姐妹已经患有所述疾病，那么他的风险增至三倍。 乳腺癌或结肠癌的家族史也增加风险。这一增加的风险是由于致癌基因 上的遗传突变。这种疾病实际上的病因还不知道，但是被认为是遗传的 遗传上的变化和由环境暴露导致的变化联合的结果。
当医生怀疑患者可能患有胰腺癌时，超声、CT扫描和内窥镜检查 被用来诊断并将癌分期。某些患有胰腺癌的患者可能具有升高的糖抗原 19-9 (CA 19-9)水平。在具有升高的水平的患者中，所述水平在与其 他测试联合确认诊断上以及对在治疗期间监测所述疾病是有用的。可在
-;台疗期间周期性的检查所述水平以观察癌是稳定的还是恶化的。
本发明的方法对于早期胰腺癌的治疗，胰腺癌复发的治疗或预防 (例如在患有休眠肺瘤或微转移的受治疗者中)或具有任何与胰腺癌相关的风险因素(例如上文所描述的那些)的受治疗者中胰腺癌的预防是 尤其有用的。
(V叫V、*;#
小肠(small bowel )，也一皮称为小肠(small intestine ),是连才妻胃和 大肠(也称作结肠)的消化道部分。小肠有三个不同的部分l)十二指 肠，2)空肠以及3)回肠。令人惊讶的是，尽管与消化道的其余部分相比 小肠长度惊人地长，小肠的癌却非常少见。这包括在肠中开始的癌或从 另一个身体部位扩散到那里的癌。尤其是，在美国小肠癌占所有肠癌的 不到5%占已诊断的所有癌的约0.5%。
大多数小肠癌的病因是未知的。然而有一些可增加发展小肠癌的机 会的可能的风险因素。 一些实例包括克隆病、乳糜泻病、peutz-jegher 氏综合征和肠息肉病。
取决于显微镜下的外观和起源的细胞，有四种主要类型的小肠癌。
腺癌是最常见的类型。它通常在肠的膜或内层中开始，并通常在十二指
肠中发生。另一种类型是肉瘤并且典型的亚型是平滑肌肉瘤，其在小肠
的肌肉壁中开始并通常在回肠中发生。第三种类型是类癌，其在小肠的
特殊的产生激素的细胞中开始并通常发生在回肠中，有时在阑尾(其是
大肠的第一部分)中。第四种类型是淋巴瘤，其在小肠的淋巴组织中开
始并通常在空肠中发生。淋巴瘤的最典型的亚型是非霍奇金淋巴瘤。小
肠癌的一种不常见的亚型是胃肠道间质肿瘤，其可在小肠三个部分的任 何一个中发生。
通常使用完整病史、身体检查和大便样品、内窥镜检查或结肠镜检 查、钡C射线、CT扫描、超声或其他x射线诊断小肠癌。
本发明的方法对于早期小肠癌的治疗，小肠癌复发的治疗或预防 (例如在患有休眠肿瘤或微转移的受治疗者中)或具有任何与小肠癌相 关的风险因素(例如上文所描述的那些)的受治疗者中小肠癌的预防是 尤其有用的。
V.预防
在本发明的另 一个方面，我们已经发现VEGF特异性拮抗剂可被用于良性的、癌前的或早期癌的治疗，或者肿瘤复发的治疗或预防。可使 用所述方法治疗癌本身或预防癌向转移性或扩散期或者向更高级别或 时期的发展。例如，可使用本发明的方法治疗患有O期癌或息肉的受治 疗者以便预防向I期或更高期肿瘤发展。同样，在患有II期癌的患者中，
可使用所述方法预防癌向m期或iv期癌发展。
还可使用VEGF特异性拮抗剂预防肿瘤的复发。例如，如果肿瘤已 经被识别并治疗(例如用化学疗法或手术去除)，可使用VEGF特异性 拮抗剂预防结肠直肠肺瘤原处的复发或结肠直肠肿瘤的转移。为预防肿 瘤的复发，可使用VEGF特异性拮抗剂，例如治疗休眠肿瘤或微转移或 者预防休眠肿瘤或微转移的生长或再生长，其可是或可不是临床上可检 测的。
我们还已经发现VEGF特异性拮抗剂可被用于从未患过癌或具有 发展癌的风险的受治疗者中癌的预防。有多种已知的风险因素与癌相关 并且上文中描述了它们中的许多。示例性的风险因素包括高龄(即超过 50岁)、癌的家族史、HPV、 HIV、 HBV和HCV的病毒感染、使用口 服避孕药、肝硬化、溃疡性结肠炎、巴雷特食管、幽门螺旋杆菌感染以 及息肉或发育异常的存在。此外，认为已知患有遗传性癌综合征的受治 疗者具有发展癌的风险。这种综合征的非限制性实例包括APC、 HNPCC、加德纳综合征和MEN1。发展癌的另外的风险因素可根据临 床评估确定并包括升高水平的激素或血液蛋白例如PSA(前列腺癌)、 CA-125(卵巢癌)、AFP(肝癌)、DCP(肝癌)和CA 19-9(胰腺癌)。
VI.新辅助疗法
本发明提供在受治疗者，例如人类患者中在手术去除可手术的癌之 前的新辅助疗法的方法，其包括对患者(例如，其中患者已经被确诊为 肿瘤和/或癌)施用有效量的VEGF特异性拮抗剂，例如VEGF抗体。 任选地，将VEGF特异性拮抗剂与至少一种化学治疗剂联合施用。在手 术后对受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂以预防癌复发的其 它的步骤也可与本文描述的新辅助疗法一起使用。对于包括在手术后对 受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂的其它步骤的方法来说，可使用任何本文描述的辅助方法。
例如， 一种方法包括在受治疗者中治疗癌，该方法包括下列步骤
a)包括多个治疗周期的第 一 阶段，其中每个周期包括以预定的间隔对受 治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗，以及任选地至 少一种化学治疗剂；b)确定性手术，借以去除癌；以及任选地，c)包括 多个维持周期的第二阶段，其中每个周期包括以预定的间隔对受治疗者 施用有效量的VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗，以及有或没有任何化 学治疗剂。
对于新辅助疗法来说，可将VEGF特异性拮抗剂以一定量或一定时 间(例如特定的治疗方案的全部时间)施用以减少(例如20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%或更多的)肿瘤中癌细胞 的数目；以减小肿瘤的大小(例如以允许切除)；以减少肿瘤负荷；以 抑制(即降低至某种程度和/或终止)癌细胞浸润入外周器官中；以减 小肿瘤中血管密度；以抑制肿瘤转移；以减少或抑制肿瘤生长或肿瘤细 胞增殖；以减少或预防休眠肿瘤的生长；以减少或预防微转移的生长或 增殖；以增加或延长易患或被诊断为患有良性的、癌前的或非转移性的 肿瘤的受治疗者的DFS或OS;和/或以将与癌相关的 一种或多种症状緩 解至某种程度。
在一个实例中，施用新辅助疗法以延长DFS或OS,其中在开始施 用抗体后约2至5年评估DFS或OS。在某些实施方案中，在治疗开始 后或最初的诊断后约3-5年、约4-5年，或至少约4年或至少约5年评 估受治疗者的DFS或OS。通常，VEGF特异性拮抗剂是VEGF抗体例 如贝伐单抗。
在另一个实例中，与单独用化学疗法(例如紫杉烷，诸如紫杉醇) 治疗的受治疗者相比，抗体和/或化学疗法的施用可在受治疗者群体中3 年时降低约50%(其中此处"约50%"包括从约45%至约70%的范围)的 疾病复发(在原发器官中的癌复发和/或远处复发)，例如3年时降低约 52%的在原发器官中的复发，和/或3年时降低约53%的远处复发。
可按照已知的方法对受治疗者例如人类患者施用VEGF特异性拮 抗剂例如VEGF抗体，已知方法为例如静脉内施用(诸如为团注)或通过 一 段时间的持续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内
(intracerobrospinal )、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸 入途径施用。抗体的静脉内施用是优选的。
尽管可将VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体作为单一剂施用，但 任选地用VEGF抗体和一种或多种化学治疗剂的组合治疗患者。在一个 实施方案中，化学治疗剂中的至少一种是紫杉烷。组合的施用包括使用 分开的制剂或单一药学制剂联合施用或并行施用，以及以任一种顺序的 连续施用，其中优选地有一段时间两种(或所有)活性剂同时发挥它们 的生物活性。因此，可在VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体的施用之 前或之后施用化学治疗剂。在这一实施方案中，化学治疗剂的至少一次 施用和VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体的至少一次施用之间的时间 优选地为约l个月或更短，并最优选地为约2周或更短。可选择地，将 化学治疗剂和VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体以单一制剂或分开的 制剂并行对患者施用。使用化学治疗剂(例如紫杉烷)和VEGF抗体(例 如贝伐单抗)组合的治疗可对患者产生协同的或比加和更大的治疗益 处。
为此通常将化学治疗剂(如果施用)以已知的剂量或者由于药物的 组合作用或归因于抗代谢化学治疗剂的施用的消极副作用而任选地以 降低的剂量施用。可依照制造商的使用说明书或由熟练医师根据经验来 确定使用这种化学治疗剂的制剂和给药时间表。当所述化学治疗剂是紫 杉醇时，优选地将它每周(例如以80 mg/m2 )或每3周(例如以175 mg/m 或135 mg/m2 )施用。适当的多西紫杉醇的剂量包括60 mg/m2、70 mg/m2、 75 mg/m2、 100 mg/m2(每3周)；或35 mg/m2或40 mg/m2 (每周)。
上文公开了各种可组合的化学治疗剂。在本发明的某些实施方案 中，将与VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体组合的化学治疗剂包括但 不限于，例如紫杉烷(包括多西紫杉醇和紫杉醇)、长春碱类(vinca) (例如长春瑞滨或长春花碱)、铂化合物(例如碳铂和顺铂)、芳香酶抑 制剂(例如来曲唑、阿那曲唑或依西美坦)、抗雌激素药(例如氟维司 群和三苯氧胺)、依托泊苷、噻替派、环磷酰胺、曱氨蝶呤、多柔比星 脂质体、聚乙二醇化的多柔比星脂质体、卡培他滨、吉西他滨、COX-2
66抑制剂(例如塞来昔布)或蛋白体抑制剂(例如PS342)。
当对受治疗者施用蒽环类抗生素(例如阿霉素或表柔比星)时，优
选地在施用VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗之前和/或之后提供这一 施用。然而，可将具有减小的心脏毒性的经修饰的蒽环类抗生素例如多 柔比星脂质体(TLC D-99 (MYOCET⑧)、聚乙二醇化的多柔比星脂质体 (CAELYX⑧)或表柔比星与VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗组合。
在施用时间表的一个实施方案中，本发明的新辅助疗法包括第一步 骤，其中在多个新辅助周期中对患者施用VEGF特异性拮抗剂例如贝伐 单抗以及一种或多种的化学治疗剂，之后进行手术以确定性地去除肿 瘤。每个新辅助周期取决于特定的治疗计划，由一至三周组成。例如， 治疗周期可是三周，其意味着患者每三周接受一剂量的化学疗法和一剂 量的贝伐单抗。治疗周期也可是两周，其意味着患者每隔一周接受一剂 量的化学疗法和一剂量的贝伐单抗。新辅助治疗的整个第 一阶段可持续 约4-8个周期。在本发明的某些实施方案中，新辅助疗法在手术前持续 不超过一年，在一个实施方案中不超过六个月。取决于疾病的类型和严 重度，VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗的优选的剂量是在从约1 Mg/kg 至约50 mg/kg,最优选地在/人约5 mg/kg至约15 mg/kg的范围内，包 括但不限于7.5mg/kg或10mg/kg。在一些方面，化学疗法方案涉及传 统的高剂量的间歇施用。在一些其他的方面，没有预定间隔而使用较小 但更频繁的剂量来施用化学治疗剂("有节奏的化学疗法")。通过常规 技术和测定很容易监测本发明的疗法的进展。
除了 VEGF抗体和化学治疗剂之外，还可将其他的治疗方案与之组 合。例如，可施用第二(第三、第四等等)化学治疗剂，其中第二化学 治疗剂或是另 一种不同的紫杉烷化学治疗剂或是非紫杉烷的化学治疗 剂。例如，第二化学治疗剂可是紫杉烷(例如紫杉醇和多西紫杉醇)、 长春碱类(例如长春瑞滨)、铂化合物(例如顺铂和碳铂)、抗激素剂(例 如芳香酶抑制剂或抗雌激素药)、吉西他滨、卡培他滨等。示例性的组 合包括紫杉烷/铂化合物、吉西他滨/紫杉烷、吉西他滨/长春瑞滨、长春 瑞滨/紫杉烷、卡培他滨/紫杉烷等。可施用不同化学治疗剂的"混合物"。
可与VEGF抗体组合的其他治疗剂包括以下^壬何一种或多种另—一种VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂例如第二抗VEGF抗体、VEGF 变体、可溶的VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中 和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂及其任何组合。对使 用本发明抗体的组合肿瘤疗法有用的其他治疗剂包括涉及肿瘤生长的 其他因子例如EGFR、 ErbB2(也称为Her2)、 ErbB3、 ErbB4或TNF的拮 抗剂。在一个示例性实施方案中，VEGF特异性拮抗剂的组合物中不包 括抗ErbB2抗体或者其片段或衍生物(例如Herceptin⑧抗体)。在本发 明的某些实施方案中，可将抗VEGF抗体与以一种或多种酪氨酸激酶受 体例如VEGF受体、FGF受体、EGF受体和PDGF受体为靶的小分子 受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)组合使用。许多治疗性的小分子RTKI 是本领域已知的，包括但不限于瓦他拉尼(vatalanib) (PTK787)、埃罗 替尼(TARCEVA⑧)、OSI画7904、 ZD6474(ZACTIMA⑧)、ZD6126(ANG453)、 ZD1839、舒尼替尼(SUTENT⑧)、司马沙尼(semaxanib ) (SU5416)、 AMG706、 AGO 13736、伊马替尼(GLEEVEC⑧)、MLN-518、 CEP國701、 PKC匿412、拉帕替尼(lapatinib) (GSK572016)、 VELCADE⑧、AZD2171、 索拉非尼(NEXAVAR⑧)、XL880和CHIR-265。
上文联合施用的任何剂的适合的剂量是目前使用的那些并可由于 该剂和VEGF抗体的组合作用(协同)而被降低。
除了上文的治疗方案，可使患者经受放射疗法。
在本发明的某些实施方案中，所施用的VEGF抗体是完整的无保护 的抗体。但可将VEGF抗体与细胞毒性剂轭合。在某些实施方案中，轭 合的抗体和/或与其结合的抗原被细胞内化，导致轭合物杀死其所结合 的癌细胞的治疗效力增加。在一个实施方案中，细胞毒性剂靶向或干扰 癌细胞中的核酸。这种细胞毒性剂的实例包括美登醇(maytansinoids )、 加里刹霉素、核糖核酸酶和DNA核酸内切酶。
VII.辅助疗法
本发明提供辅助疗法的方法，其包括在确定性手术后对患有非转移 性的癌的受治疗者施用VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体。
例如，方法可包括以下步骤a)包括多个治疗周期的第一阶段，其
68中每个周期包括以预定的间隔对受治疗者施用有效量的VEGF特异性
拮抗剂例如贝伐单抗，以及任选地至少一种化学治疗剂；以及b)包括多 个维持周期的第二阶段，其中每个周期包括以预定的间隔对受治疗者施 用有效量的VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗，但没有任何化学治疗 剂；其中组合的第一和第二阶段在最初的手术后治疗后持续至少一年。 在一个实施方案中，第一阶段包括第一个多个治疗周期，其中施用 VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗以及第一化学疗法方案，之后是第二 个多个治疗周期，其中施用VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗以及第二 化学疗法方案。
对于辅助疗法来说，可将VEGF特异性拮抗剂以一定量或一定时间 (例如特定的治疗方案的全部时间)施用以减少(例如20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％、 100%或更多的)肿瘤中癌细胞的数目； 以减小肺瘤的大小；以减少肿瘤负荷；以抑制(即降低至某种程度和/ 或终止)癌细胞浸润入外周器官中；以减小肺瘤中血管密度；以抑制肺 瘤转移；以减少或抑制肿瘤生长或肿瘤细胞增殖；以减少或预防^^眠肿 瘤的生长；以减少或预防微转移的生长或增殖；以减少或预防治疗或去 除后肿瘤的再生长；和/或以将与癌相关的一种或多种症状緩解至某种 程度。在一些其它的实施方案中，可使用VEGF特异性拮抗剂以预防受 治疗者中癌的发生或复发。在一个实例中，在约四年后在受治疗者群体 中评估癌复发的预防以证实在群体的至少约80%中无疾病复发发生。在 另一个实例中，在约3年时评估疾病复发的预防，其中与Y又用化学疗法 治疗的受治疗者相比，疾病复发下降了至少约50%。
通常在受治疗者从手术中复原一段时间后施用VEGF特异性拮抗 剂。这段时间可包括伤口愈合或手术切口愈合所需要的时间段、降低伤 口裂开的风险所需要的时间段或受治疗者恢复至与手术前的健康水平 基本相似或更好的健康水平所需要的时间段。确定性手术完成和VEGF 特异性拮抗剂的首次施用之间的时间段还可包括药物假期所需要的时 间段，其中受治疗者需要或要求在治疗方案之间的一段时间。通常，确 定性手术完成和VEGF特异性拮抗剂疗法开始之间的时间段可包括少 于一周、l周、2周、3周、4周(28天)、5周、6周、7周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、IO个月、11个 月、l年、2年、3年或更久。在一个实施方案中，确定性手术和施用 VEGF特异性拮抗剂之间的时间段大于2周并小于1年。
在一个实例中，以有效延长无病生存期(DFS )或总体生存期(OS ) 的量施用VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体，其中在抗体最初施用后 约2至5年评估DFS或OS。在某些实施方案中，在治疗开始后或最初 的诊断后约3-5年、约4-5年或至少约4年或至少约5年评估受治疗者 的DFS或OS。
按照已知的方法对受治疗者例如人类患者施用VEGF特异性拮抗 剂例如VEGF抗体，已知方法为例如静脉内施用(诸如为团注)或通过 一段时间的持续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、 滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用。抗体的静月永内施用是优选的。
可将VEGF特异性拮抗剂作为单一剂施用。在其他的实施方案中， 用VEGF特异性拮抗剂和一种或多种化学治疗剂的组合治疗患者。在一 些实施方案中，化学治疗剂中的至少一种是紫杉烷。组合的施用包括使 用分开的制剂或单一 药学制剂的联合施用或并行施用，以及以任一种顺 序的连续施用，其中任选地有一段时间两种(或所有)活性剂同时发挥 它们的生物活性。因此，可在VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体的施 用之前或之后施用化学治疗剂。在这一实施方案中，化学治疗剂的至少 一次施用和VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体的至少一次施用之间的 时间优选地为约1个月或更短，并最优选地为约2周或更短。可选择地， 将化学治疗剂和VEGF抗体以单一制剂或分开的制剂并行对患者施用。 使用化学治疗剂(例如紫杉烷)和VEGF抗体(例如贝伐单抗)组合的 治疗可对患者产生协同的或比加和更大的治疗益处。
为此通常将化学治疗剂(如果施用)以已知的剂量或者由于药物的 组合作用或归因于抗代谢化学治疗剂的施用的消极副作用而任选地以 降低的剂量施用。可依照制造商的使用说明书或由熟练医师根据经-验来 确定使用这种化学治疗剂的制剂和给药时间表。当所述化学治疗剂是紫 杉醇时，优选地将它每周(例如以80 mg/m2 )或每3周(例如以175 mg/m2或13 5 mg/m2 )施用。适当的多西紫杉醇的剂量包括60 mg/m2 、 70 mg/m2 、 75 mg/m2、 100 mg/m2(每3周)；或35 mg/m2或40 mg/m2 (每周)。
上文公开了各种可组合的化学治疗剂。将与VEGF抗体组合的化学 治疗剂的实例包括但不限于，例如紫杉烷(包括多西紫杉醇和紫杉醇)、 长春碱类(例如长春瑞滨或长春花碱)、铂化合物(例如碳铂和顺铂)、 芳香酶抑制剂(例如来曲唑、阿那曲唑或依西美坦)、抗难激素药(例 如氟维司群和三苯氧胺)、依托泊苷、噻替派、环磷酰胺、甲氨蝶呤、 多柔比星脂质体、聚乙二醇化的多柔比星脂质体、卡培他滨、吉西他滨、 COX-2抑制剂(例如塞来昔布)或蛋白体抑制剂(例如PS342)。
当对受治疗者施用蒽环类抗生素(例如阿霉素或表柔比星)时，优 选地在施用VEGF抗体之前和/或之后提供这一施用，例如以在下文的 实施例中公开的方案，其中在手术后但在VEGF抗体和紫杉烷的施用之 前对受治疗者施用蒽环类抗生素/环磷酰胺的组合。然而，可将具有减 小的心脏毒性的经修饰的蒽环类抗生素例如多柔比星脂质体(TLC D-99 (MYOCET⑧)、聚乙二醇化的多柔比星脂质体(CAELYX⑧)或表柔比星与 VEGF抗体组合。
在一个施用时间表中，本发明的辅助疗法包括第一阶段，其中在多 个治疗周期中对患者施用VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体以及一种 或多种的化学治疗剂；和第二阶段，其中将VEGF特异性拮抗剂例如 VEGF抗体作为单一剂在多个维持周期内使用。每个治疗周期取决于特 定的治疗计划，由一至三周组成。例如，治疗周期可包括贝伐单抗作为 VEGF特异性拮抗剂并且可为三周，其意味着患者每三周冲妻受一剂量的 化学疗法和一剂量的贝伐单抗。治疗周期也可是两周，其意味着患者每 隔一周接受一剂量的化学疗法和一剂量的贝伐单抗。治疗的整个第一阶 段可持续约4-8个周期。在第二个维持阶段，取决于特定的周期的长度， 可两周一次或三周一次地提供贝伐单抗并持续约30-50个周期。在某些 实施方案中，辅助疗法从治疗的开始持续至少一年，并且在此之后密切 注意受治疗者的进展。取决于疾病的类型和严重度，VEGF抗体的优选 的剂量是在从约1 ug/kg至约50 mg/kg，最优选地在从约5 mg/kg至约 15 mg/kg的范围内，包招^旦不限于7.5 mg/kg或10 mg/kg。在一些方面，
71化学疗法方案涉及传统的高剂量的间歇施用。在一些其他的方面，没有 预定间隔而使用较小但更频繁的剂量来施用化学治疗剂("有节奏的化 学疗法")。通过常规技术和测定很容易监测本发明的疗法的进展。
与单独用化学疗法(例如紫杉烷诸如紫杉醇)治疗的受治疗者相比， 抗体和化学疗法的施用可在受治疗者群体中3年时降低约50%(其中此
处"约50%"包括从约45%至约70%的范围)的疾病复发(在原发器官中
的癌复发和/或远处复发)的可能性，例如在3年时降低约52%的在原
发器官中的复发和/或3年时降低约53%的远处复发。
本发明在本文提供了治疗患有非转移性的癌的人类受治疗者的群 体中的非转移性的癌的方法，其包括在确定性手术之后对受治疗者施用
有效量的VEGF特异性拮抗剂例如VEGF抗体和至少一种化学治疗剂， 并在四年或更多年后评估受治疗者以证实在约4年后至少约80%(优选 地至少约85%)的受治疗者中没有疾病复发发生。所述群体可包括3000 例或更多人类受治疗者。
本发明进一步涉及在患有非转移性的癌的人类受治疗者的群体中 降低疾病复发的可能性的方法，其包括在确定性手术之后对受治疗者施 用有效量的贝伐单抗和至少一种化学治疗剂，其中与单独用紫杉烷治疗 的受治疗者相比，3年时疾病复发的可能性降低至少约50%。
除了 VEGF抗体和化学治疗剂之外，还可将其他的治疗方案与之组 合。例如，可施用第二(第三、第四等等)化学治疗剂，其中第二化学 治疗剂或是另 一种不同的紫杉烷化学治疗剂或是非紫杉烷的化学治疗 剂。例如，第二化学治疗剂可是紫杉烷(例如紫杉醇和多西紫杉醇)、 长春碱类(例如长春瑞滨)、铂化合物(例如顺铂和碳铂)、抗激素剂(例 如芳香酶抑制剂或抗雌激素药)、吉西他滨、卡培他滨等。示例性的组 合包括紫杉烷/铂化合物、吉西他滨/紫杉烷、吉西他滨/长春瑞滨、长春 瑞滨/紫杉烷、卡培他滨/紫杉烷等。可施用不同化学治疗剂的"混合物"。
可与VEGF抗体组合的其他治疗剂包括以下任何一种或多种另一 种VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂例如第二抗VEGF抗体、VEGF 变体、可溶的VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中 和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂及其^壬〗可组合。对4吏用本发明抗体的组合肺瘤疗法有用的其他治疗剂包括涉及胂瘤生长的
其他因子例如EGFR、 ErbB2(也称为Her2)、 ErbB3、 ErbB4或TNF的拮 抗剂。在一个示例性实施方案中，VEGF特异性拮抗剂的组合物中不包 括抗ErbB2抗体或者其片段或衍生物(例如Herceptin⑧抗体)。在某些 实施方案中，可将抗VEGF抗体与以一种或多种酪氨酸;敫酶受体例如 VEGF受体、FGF受体、EGF受体和PDGF受体为靶的小分子受体酪氨 酸激酶抑制剂(RTKI)组合使用。许多治疗性的小分子RTKI是本领域 已知的，包括但不限于瓦他拉尼(PTK787)、埃罗替尼(丁八1^￡￥八@)、 OSI-7904、 ZD6474(ZACTIMA )、 ZD6126(ANG453)、 ZD1839、舒尼替 尼(SUTENT⑧)、司马沙尼(SU5416)、 AMG706、 AG013736、伊马替尼 (GLEEVEC⑧)、MLN-518、 CEP画701、 PKC画412、拉帕替尼(GSK572016)、 VELCADE⑧、AZD2171、索拉非尼(NEXAVAR⑧)、XL880和CHIR画265。
上文联合施用的任何剂的适合的剂量是目前使用的那些并可由于 该剂和VEGF抗体的组合作用(协同)而被降^氐。
除了上文的治疗方案，可使患者经受放射疗法。
在某些实施方案中，所施用的VEGF抗体是完整的无^f呆护的抗体。 但可将VEGF抗体与细胞毒性剂轭合。在某些实施方案中，轭合的抗体 和/或与其结合的抗原被细胞内化，导致轭合物杀死其所结合的癌细胞
上的治疗效力增加。在一个实施方案中，细胞毒性剂靶向或干扰癌细胞 中的核酸。这种细胞毒性剂的实例包括美登醇、加里刹霉素、核糖核酸 酶和DNA核酸内切酶。
VIII.剂量、制剂和持续时间
以与良好的医疗实践相符合的方式配制、给药和施用VEGF特异性 拮抗剂组合物。以这个角度所考虑的因素包括所治疗的特定的病症、所 治疗的特定的受治疗者、患者个体的临床症状、病症的病因、剂的递送 部位、施用的方法、施用的时间表、和执业医师已知的其他因素。待施 用的VEGF特异性拮抗剂的"治疗上有效的量"将由这些考虑因素决定 并且对预防、改善、或治疗或稳定良性的、癌前的或早期癌；或治疗或 预防肿瘤、休眠肿瘤或微转移的发生或复发(例如在新辅助或辅助情况中)来说为必需的最小的量。VEGF特异性拮抗剂不需要，但任选地与 目前用以预防或治疗癌或发展癌的风险的 一 种或多种剂配制在 一 起。这
些其他剂的有效量取决于制剂中存在的VEGF特异性拮抗剂的量、病症 或治疗的类型以及上文所讨论的其他因素。通常以如上文中所用的同样 的剂量和施用途径使用这些或以迄今使用的剂量的约从1%至99%-使用 这些。
取决于疾病的类型和严重度，约1 /xg/kg至100 mg/kg(例如0.1-20 mg/kg)的VEGF特异性拮抗剂是对患者施用的最初的候选剂量，无论例 如是通过一次或多次分开的施用还是通过连续输注施用。取决于上文所 提及的因素，典型的每日剂量可从约1 /ig/kg变化至约100 mg/kg或更 多。尤其理想的剂量包括例如7.5 mg/kg、 10 mg/kg和15 mg/kg。对于 几天或更长时间的重复施用来说，取决于疾患，将治疗维持直到癌被治 疗，通过上文描述的或本领域已知的方法进行测量。但其#^剂量方案可 以是有用的。在一个实例中，如果VEGF特异性拮抗剂是抗体，那么将 本发明的抗体以从约5 mg/kg到约15 mg/kg的剂量范围，包括但不限于 7.5 mg/kg或10mg/kg每周、每两周或每三周施用一次。通过常规才支术 和测定很容易地监测本发明的疗法的进展。
在一个实例中，贝伐单抗是VEGF特异性拮抗剂。以100 mg和400 mg无防腐剂、 一次性使用的小瓶为治疗应用提供贝伐单抗以递送4 ml 或16 ml的贝伐单抗(25 mg/ml )。在240 mg脱水的a,a-海藻糖、23.2 mg 磷酸钠(单碱的、 一水合物)、4.8 mg磷酸钠(双碱的、无水的)、1.6 mg 聚山梨醇酯20和注射用水(USP)中配制100mg产品。在960 mg脱 水的ce,a-海藻糖、92.8mg磷酸钠(单碱的、 一水合物)、19.2 mg磷酸 钠(双碱的、无水的)、6.4mg聚山梨醇酯20和注射用水(USP)中配 制400 mg产品。
疗法的持续时间将持续至医学上表明的长度或直到达到所需要的 治疗作用(例如本文所描述的那些)。在某些实施方案中，VEGF特异 性拮抗剂疗法持续2个月、4个月、6个月、8个月、IO个月、l年、2 年、3年、4年、5年、或直到受治疗者终生的多年的时间。
通常良性的、癌前的或早期癌的緩解或治疗或者癌(良性的或恶性
74一种或多种症状或医疗问 题。治疗上有效量的药物可实现下列中的一种或组合以减少(例如
20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%或更多的)肿 瘤中癌细胞的数目；以减小肿瘤的大小；以减少肿瘤负荷；以抑制(即 降低至某种程度和/或终止)癌细胞浸润入外周器官中；以减小肿瘤中 血管密度；以抑制肿瘤转移；以减少或抑制肿瘤生长或肿瘤细胞增殖； 以减少或预防^f木眠肺瘤的生长；以减少或预防^t转移的生长或增殖；以 减少或预防治疗或去除后肿瘤的再生长(例如在辅助疗法中)；以增加 或延长易患或被诊断为患有良性的、癌前的或非转移性的肿瘤或恶性肿 瘤的受治疗者的DFS或OS;以减小肿瘤大小以允许手术(例如在新辅 助疗法中)；和/或以将与癌相关的一种或多种症状緩解至某种程度。在 一些其它的实施方案中，可使用VEGF特异性拮抗剂以预防受治疗者中 癌的发生或复发。在一个实例中，在约四年后在受治疗者群体中评估癌 复发的预防以证实在群体的至少约80%中无疾病复发发生。在另一个实 例中，在约3年时评估疾病复发的预防，其中与单独用化学疗法治疗的 受治疗者相比，疾病复发下降了至少约50%。
在一个实例中，以有效延长DFS或OS的量施用VEGF特异性拮抗 剂例如VEGF抗体，其中在抗体的最初施用后约2至5年评估DFS或 OS。在某些实施方案中，在治疗开始后或最初的诊断后约3-5年、约 4-5年或至少约4年或至少约5年评估受治疗者的DFS或OS。
在一个实施方案中，本发明可被用于增加易患或被诊断为患有良性 的、癌前的或非转移性的肿瘤的受治疗者的生存持续时间。生存持续时 间被定义为从药物的第 一次施用到死亡的时间。还可通过代表患者在治 疗期间死亡的风险的治疗组比对照组的分层的危害比(HR)来测量生 存持续时间。
在又一个实施方案中，本发明的治疗显著的增加了易患或被诊断为 患有癌的用各种抗癌疗法治疗的 一组受治疗者例如人类患者中的响应 率。响应率被定义为对治疗有响应的受治疗患者的百分比。在一个方面， 与单独用手术、放射疗法或化学疗法治疗的组相比，使用VEGF特异性 拮抗剂和手术、放射疗法或 一 种或多种化学治疗剂的本发明的组合治疗显著地增加了受治疗的患者组中的响应率，所述增加具有小于0.005的卡方p值。肺瘤、休眠肺瘤或微转移的发生或复发的治疗或预防涉及通常在肿 瘤最初的治疗或去除(例如使用抗癌疗法诸如手术、化学疗法或放射疗 法)后预防肿瘤和微转移形成。手术可留下残留的胂瘤细胞或休眠的樣i 转移的小瘤，其具有重新活化"血管生成程序，，并促进更多指数级的肿瘤 生长的潜力。尽管休眠肿瘤或微转移的存在未必是使用临床的测量或筛 查方法可检测的，但治疗上有效的量是足以预防或减小使用临床医生已 知的技术检测到休眠肿瘤、微转移、转移或肿瘤复发的量。在一个实例中，将通过手术去除肺瘤治疗肺瘤的患者之后用VEGF特异性拮抗剂治 疗并随着时间监测休眠肿瘤、微转移或肿瘤复发的一企测。可将VEGF 特异性拮抗剂与另 一种抗癌疗法(例如在VEGF特异性拮抗剂之前、同 时、或之后)组合施用并且可将一种或所有两种疗法作为维持疗法继续。癌的治疗中治疗效力的其它的测量方法被描述于美国专利申请公 开第20050186208号中。使用本领域已知的常规方法，通过将具有所需要的纯度的活性组分 与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合而制备治疗的制剂 (Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明顿药剂学)(第20版)，A. Gennaro编辑，2000， Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。 可接受的载体包括盐水或緩沖剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸； 抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约IO个残基)的多肽；蛋白 质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水的聚合物例如聚乙烯吡咯 烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、 二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA; 糖醇例如甘露醇和山梨糖醇；盐形成平衡离子例如钠；和/或非离子表 面活性剂例如TWEEN 、 PLURONICStm或PEG。任选地，但优选地，制剂优选地以大约生理浓度含有药学上可接受 的盐，典型地，例如氯化钠。任选地本发明的制剂可含有药学上可接受 的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度从0.1%变化至2.0% (通常 为v/v)。适当的防腐剂包括制药领域中已知的那些。苯曱醇、苯酚、间甲酚、尼泊金曱酯和尼泊金丙酯是防腐剂的实例。任选地，本发明的制剂可以0.005%至0.02%的浓度包含药学上可接受的表面活性剂。的活性化合物，优选具有互补活性的彼此没有不利影响的那些。这些分 子以对所预期目的有效的量适当地存在于组合中。还可将活性组分包埋入例如通过凝聚技术或通过界面聚合法制备 的微胶嚢，例如分别地羟曱基纤维素或明胶-微胶嚢和聚(异丁烯酸曱 酯)微胶嚢中，包埋入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶嚢)或粗乳液中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutic Sciences (雷明顿药剂学)，如上中。可制备持续释放的制剂。持续释放的制剂的适合的实例包括含有抗 体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品例如薄膜或微胶 嚢的形式。持续释放的基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙 基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、 L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、 可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸 共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球)和聚-D-(-)-3-羟丁酸。虽 然聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100 天，但某些水凝胶以较短的时间段释放蛋白质。当胶嚢包被的抗体留在 体内很长时间时，作为在37。C暴露于水气的结果它们可能变性或聚合， 导致生物活性的丧失和免疫原性上的可能的变化。取决于所涉及的机 制，可为稳定提出合理的策略。例如，如果发现聚合机制是通过硫-二 硫化物互换分子间的S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、从酸性溶 液冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂和开发特定的聚合物基质组 合物来达到稳定。按照已知的方法对受治疗者例如人类患者施用本发明的VEGF特 异性拮抗剂，已知方法为例如静脉内施用(诸如为团注)或通过一段时 间的持续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜 内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用。如果大量的副作用或毒性与 VEGF拮抗作用有关，那么局部施用是尤其需要的。离体策略也可被用于治疗应用。离体策略涉及用编码VEGF拮抗剂的多核苷酸转染或转化
从受治疗者获得的细胞。之后将转染或转化的细胞返还给受治疗者。细胞可是各种各样类型中的任何一种，包括但不限于造血细胞(例如骨髓
细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质化细月包或月/L细胞。
例如，如果VEGF特异性拮抗剂是抗体，那么可通过任何适合的方式来施用抗体，所述方式包括肠胃外的、皮下的、腹膜内的、肺内的和鼻内，以及如果需要局部免疫抑制治疗，则在病变处施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，抗体适合通过脉冲式输注，尤其是以逐渐减少的抗体剂量来施用。优选地，通过注射，最优选地通过静脉内或皮下注射给药，这部分地取决于施用是短期的还是长期的。
在另一个实例中，当肿瘤的病症或位置允许时，可例如通过直接注射局部施用VEGF特异性拮抗剂化合物，并且可周期性重复注射。为了预防或减少局部复发或转移，例如休眠肺瘤或微转移的局部复发或转移，还可对受治疗者在手术切除肿瘤后对受治疗者系统地递送VEGF特异性拮抗剂或直接对肿瘤细胞例如对肿瘤或瘤床递送VEGF特异性拮抗剂。
可选择地，可将抑制性核酸分子或含有编码VEGF特异性拮抗剂的核酸序列的多核芬酸递送至受治疗者的适当的细胞。在某些实施方案中，核酸可递送至肿瘤本身。
可通过适于所使用的载体的任何方法将核酸引入细胞中。许多这种方法是本领域中熟知的(如上文Sambrook等人，和Watson等人Recombinant DNA (重组DNA ),第12章，第2版，Scientific AmericanBooks, 1992)。基因递送方法的实例包括脂质体介导的转染、电穿孔、磷酸钓/DEAE葡聚糖法、基因枪和微注射。
IX.组合疗法
本发明还以使用本发明的两种或更多的VEGF特异性拮抗剂的组合或至少一种VEGF特异性拮抗剂与一种或多种其它的抗癌疗法的组
78合为特征。抗癌疗法的实例包括但不限于手术、放射疗法(放射线疗法)、
生物疗法、免疫疗法、化学疗法或这些疗法的组合。此外，可与VEGF
特异性拮抗剂组合使用细胞毒性剂、抗血管生成剂和抗增殖剂。
在 一 个实例中，VEGF特异性拮抗剂被用作确定性手术后非转移性的癌的治疗的辅助疗法。在这个实例中，可与或不与至少一种其它的化学治疗剂一起提供VEGF特异性拮抗剂。
在另 一个实例中，VEGF特异性拮抗剂被用作手术前可手术的癌的治疗的新辅助疗法。在这个实例中，可在手术前与或不与至少一种其它的化学治疗剂一起提供VEGF特异性拮抗剂。
在一个实例中，本发明以VEGF特异性拮抗剂和一种或多种化学治疗剂(例如混合物)的一起使用为特征。化学治疗剂的非限制性实例包括依立替康、氟尿嘧，定、曱酰四氢叶酸或其任何组合。组合的施用包括使用分开的制剂或单一药物制剂的同时施用，和以任一顺序的连续施用，其中优选地有一段时间两种(或所有)活性剂同时发挥它们的生物活性。可依照制造商的使用说明书或由熟练医师根据经验来确定使用这种化学治疗剂的制剂和给药时间表。化学疗法的制剂和给药时间表也描述于Chemotherapy Service (化学疗法服务)，M.C.Perry编辑，Williams&Wilkins, Baltimore, Md.(1992)中。化学治疗剂可在VEGF特异性拮抗剂的施用之前或之后，或与其同时提供。
的活性化合物，优选具有互补活性的彼此没有不利影响的那些。例如可希望在一种制剂中进一步提供与EGFR、 VEGF(例如与VEGF上不同的表位结合的抗体)、VEGFR和ErbB2(例如Herceptin⑧)结合的抗体。在一个示例性实施方案中，VEGF特异性拮抗剂的组合物不包括抗ErbB2抗体或者其片段或衍生物(例如Herceptin⑧抗体)。可选择地，或此外，组合物可包含细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和/或小分子VEGFR拮抗剂。这些分子以对所预期的目的有效的量适当地存在于组合中。
为了预防或治疗疾病，VEGF特异性拮抗剂的适当的剂量将取决于待治疗的疾病类型(如上文所定义的)、疾病的严重度和进程(无论是为了预防还是治疗的目的而施用VEGF特异性拮抗剂)、之前的疗法、患者的临床史和对VEGF特异性拮抗剂的响应，以及主治医师的判断。适合一次性或经过一 系列的治疗对患者施用VEGF特异性拮抗剂。在组合疗法方案中，将本发明的VEGF特异性拮抗剂和一种或多种抗癌治疗剂以治疗上有效或协同的量施用。如本文所使用的，治疗上有效的量是VEGF特异性拮抗剂和一种或多种其他治疗剂的联合施用或本发明的组合物的施用导致如上文所描述的癌的减少或抑制的那些量。治疗上协同的量是对协同地或显著地减少或消除与特定疾病相关的状况和症状来说必需的VEGF特异性拮抗剂和 一种或多种其他治疗剂的量。
可以足以减少或消除肿瘤、休眠肿瘤或微转移的发生或复发的量和时间同时或依次施用VEGF特异性拮抗剂和一种或多种其他治疗剂。可作为维持疗法施用VEGF特异性拮抗剂和一种或多种其他治疗剂以预防或减少肿瘤复发的可能性。
可将VEGF特异性拮抗剂单独包装或与其他抗癌治疗化合物组合包装为药盒。药盒可包括帮助对患者施用单位剂量的任选的组件例如使粉末形式重新构成的小瓶、注射用的注射器、定制的IV递送系统、吸入器等。此外，单位剂量药盒可包括组合物的制备和施用的说明书。可将药盒制造为一例患者一次使用的单位剂量、特定患者多次使用(以恒定的剂量或其中个别化合物可随疗法进展在效力上变化)；或者药盒可包含适于对多例患者施用的多次剂量("大包装")。可将药盒组件集合在纸盒、泡罩包装(blister pack )、瓶、管以及类似物中。
X.制造品
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有对上文描述的病症的治疗有用的材料的制造品。制造品包括容器、标签和包装附页(packageinsert)。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由各种材料例如玻璃或塑料形成。容器装有对治疗疾患有效的组合物并可具有无菌的进入孔(access port)(例如容器可是静脉内溶液包或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是抗VEGF抗体。容器上或容器所带的标签指示组合物被用于治疗特别的疾患。制造品可进一步包括第二个容器，该容器含有药学上可接受的緩沖剂例如磷酸盐緩沖盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可进一步包括其他出于商业和使用者立场所需要的材料，包括其他緩沖剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。此外，制造品包括具有使用说明书的包装附页，其包括例如关于不能将组合物与另一种组合物组合使用的警告；或指导组合物的使用者
将抗VEGF抗体组合物单独或与抗癌组合物组合对患者施用。术语"使用iJi明书"意指通过任何方式，例如以文件的形式诸如以包装附页或其他书面宣传材料的形式提供对可使用的疗法、药物、治疗、治疗方案以及类似物的指导。
X.材料的保藏
下列杂交瘤细胞系已经根据布达佩斯条约的规定由美国典型培养物保藏中心(ATCC), Manassas, VA， USA保藏。
抗体标号 ATCC编号 保藏日期
A4.6.1 ATCCHB-10709 1991年3月29日
实施例
实施例l.VEGF-A的抑制导致肠腺瘤生长的遏止和Apc"^+小鼠的长期生存
家族性腺瘤性息肉病(FAP)的综合征和大部分偶发性结肠直肠癌是由APC基因中的突变所导致的。除了包括上端胃肠道的硬纤维瘤和肿瘤的结肠外肿瘤之外，FAP患者在他们的下端胃肠(GI)道中发育了上百至上千个腺瘤性息肉。具有密码子850处的杂合性平截等位基因的Apcmin/、、鼠模拟了具有种系JPC突变的FAP患者的息肉病的某些特征(Moser等人，Sc/e"ce 247:322-324 (1990)， Su等人，S"'置e 256:668-670(1992) )。 Apcmin/、J、鼠中肿瘤形成的开始是在成年早期并且动物在C57BL/6的遗传背景下通常发育60-150个肠息肉。肿瘤发育导致小鼠寿命严重受损，通常在五个月的年龄左右由于贫血和/或血液蛋白不足导致死亡(Moser等人，5We"ce 247:322-324 (1990))。尽管患有FAP的人类通常发育结肠腺瘤，但是Apc"^+小鼠由于还未充分了解的原因而在小肠中发育绝大多数的息肉。这些息肉达到直径l-2mm的大小，而越大的息肉(直径多达4mm)以越低的频率出现。只偶尔观察到结肠 腺瘤，通常每只动物0-3个。
已经报道Apc参与包括增殖、凋亡、细胞迁移、细胞粘附、微管组 装、信号传导和染色体分离的细胞过程(在Nathke， i ev. Ce〃. Z)ev.
历o/. 20:337-366 (2004)中综述)。Apc的研究最彻底的功能是它作为Wnt 信号通路上)S-连环蛋白的调节子的作用(在Nathke， Mo/.尸W/w/. 52:169-173 (1999)中综述)。简单地说，在缺少Wnt信号转导的情况下， Apc与轴蛋白(axin)和GSK-3/5激酶结合以形成细胞质的/3-连环蛋白的 破坏性复合体，由此阻止其核转位和转录因子的T细胞因子/淋巴增强 因子(TCF/LEF)家族的随后的活化。TCF/LEF的转录目标包括参与上 文提到的细胞通路的分子。
研究异种移植物中肿瘤生长的机制有一些缺陷，因为这些模型不能 再现自然环境下的肺瘤发育。为了检验抗血管生成疗法对自然发生的遗 传上易患的非恶性肺瘤模型的作用，我们研究了肠腺瘤病的Apc"^+模 型。在下列实施例中，在用示例性的VEGF特异性拮抗剂即抗VEGF-A mAb进行短期和长期的处理后以及在肠上皮细胞中通过Cre-LoxP技术 将VEGF-A遗传缺失后分析Apcmin 、鼠的肿瘤表型。
为了下文所描述的实验，,人The Jackson Laboratory(Bar Harbor， ME)获得Apc誦 、鼠(库存编号002020, 5 )和12.4KbVilCre小鼠(库 存编号004586，此后为VillinCre, Madison等人，,CAew. 277:33275-33283 (2002))。之前已经^>开了 VEGF'。x/1°x小鼠(以后为 VEGF'。x)(Gerber等人，画"26:1149-1159 (1999))。将小鼠圈 养在屏障设施中的微隔离器笼子(micro isolator cage )中并随意喂食。 按照联邦政府规章和Institutional Animal Care and Use Committee (实验 动物管理与使用委员会)所批准的进行动物的养护和实验方案。
Apc"^+肠腺瘤中VEGF-A的表达
为了研究Apc誦"小鼠的肠肿瘤中VEGF-A的表达模式，我们在来 自14周大的小鼠的腺瘤上进行了原位杂交。对于这些实验来说，如早 前所描述的进行原位杂交(Ferrara等人，j附.丄尸a组162:1881-1893 (2003))。简单地说，将中性緩沖的福尔马林固定的、脱水的、并且石
82蜡包埋的肠组织切片在于37°C 20]Lig/ml蛋白酶K中脱蛋白15分钟之前 脱石蜡并水合。将["P]UTP标记的有义和反义RNA探针(riboprobe)于 55。C杂交过夜，之后于55。C在O.IX的标准柠檬酸盐盐水中高严紧性清 洗2小时。将干燥的载玻片于室温暴露于Kodak BioMax MR放射自显 影胶片(Eastman Kodak Co., Rochester, NY)3天，之后将胶片泡在NTB2 核径迹乳胶(Eastman Kodak Co.)中，于4。C在含有干燥剂的密封的塑 料载玻片盒中曝光28天，显影，并用(苏木素伊红)H&E复染。如之前 所描述的制备VEGF-A探针(Ferram等人.爿m. P^/w/. 162:1881-1893 (2003))。相应于NM—031836的核苷酸297-645， VEGF-A探针长度为 349个核苦酸。上游引物序列为5，-CAACGTCAC TATGCAGATCAT GCG (SEQ ID NO: 1);下游引物序列为5，-GGT CTA GTT CCC GAA ACC CTGAG(SEQIDNO: 2)。
在这些原位杂交实验中，与正常肠绒毛上皮细胞相比在上皮细胞中 观察到具有不同强度的VEGF-A表达，同时在腺瘤的基质细胞以及正常 绒毛的基质中观察到焦点突出的信号(图IA-F)。
VEGF-A的抑制降低Apcmin/、J、鼠的肿瘤负荷
为确定抗VEGF-A疗法对降低小鼠中良性肠肿瘤的肿瘤负荷是否 有效，我们用以小鼠-人类嵌合形式(以降低诱发免疫响应的可能性) 的抗VEGF-A的mAb G6-31处理了 Apc"^+小鼠。抗VEGF-A的mAb G6-31来自如(Liang等人.編.C/^w. 281 :951-961 (2006))所描述的人 类Fab噬菌体文库。为产生适于在小鼠中长期施用的抗体，将可变结构 域接枝到鼠科IgG2a恒定结构域中。将mAb G6-31 ( Liang等人，所o/. C/zem. 281 :951-961 (2006))或同种型匹配的对照鼠科IgG2a(抗GP120 ) 都以5 mg/kg的剂量以溶于PBS中90-140 /xl的体积每周一次腹膜内施 用。将处理持续3周、6周、直到一年，或直到发现小鼠濒死。在91士3 天大时开始每一组5-14只小鼠的处理。
我们选择mAb G6-31是由于它强有力地阻断小鼠和人类VEGF-A 的能力(Liang等人，,飾/. CAem. 281:951-961 (2006))。这与抑制人类 但不抑制小鼠VEGF-A的良好表征的抗VEGF的mAb A.4.6.1不同 (Gerber等人，Omcer T 仏60:6253-6258 (2000)， Liang等人，,历o/.C&m. 281 :951-961 (2006))。为了评估mAbG6-31对肺瘤负荷的短期影 响，在十三周大时开始每组IO只小鼠的处理并持续3或6周。为了确 定处理开始时年龄的肺瘤表型，在十三周大(第0天)时分析未处理的 对照组的十二只小鼠。
用抗VEGF-A的mAb处理3或6周显著降低了 Apcmm/、、鼠中的总 肿瘤负荷。第O天时，Apcmin/、J、鼠的平均肺瘤负荷是39.3 mm3 (从12.3 mn^变化到97.0 mm3)(图2A )。用对照IgG处理三周的小鼠的平均肺 瘤负荷为96.8mm3 ( 47.1-299.9 mm3),而用mAb G6-31处理3周的小 鼠的平均肿瘤负荷是23.5 mm3 (4.5-58.2 mm3 )。当mAb G6-31处理时 平均肿瘤负荷具有统计学上显著的76%的减少或减至1/4， p<0.008。用 对照IgG施用6周后，肿瘤负荷达到198.6 mmS的平均值(40.5-315.7 mm3),而用mAb G6-31处理的小鼠中的肺瘤负荷依旧低至28.4 mm3 (3.2-75.9 mm3 )，表现出平均肺瘤负荷上的显著的86%的减少或减至 1〃， p<5.3xl(T5 (图2A)。
相对于腺瘤数目下降，用mAb G6-31处理三和六周之后肿瘤负荷 的显著下降是由于腺瘤大小下降。用对照IgG处理三周后，平均肿瘤数 目是116±9(±SEM)，而mAb G6-31施用后平均肿瘤数目是 107±ll(p<0.28)。用对照IgG处理六周后，平均肿瘤数目是120±11，而 mAb G6-31施用后它是100±10(p<0.09)。在第0天时，小鼠具有100土9 个肺瘤的平均值。
为了分析肿瘤大小和数目，将从腺胃至直肠的肠道纵向打开，漂洗 并平展在滤纟氏上。用Notox Histo固定剂(Scientific Design Laborator Inc.， Des Plaines, IL)固定过夜并用亚曱基蓝0.1%的水溶液染色后，小肠和 大肠的每个肠腺瘤的数目、位置和直径由单一的对处理不知情的观察者 在Leica解剖显微镜上20X的放大倍数下通过目镜比例尺计数。通过这 一方法，可靠地记录具有0.3 mm或更大的直径的息肉。以半球计算胂 瘤体积。将每只小鼠的肿瘤负荷计算为其肿瘤体积的总和。用双尾的 Student's t检验计算P值。作为抗体处理的小鼠的对照，在处理开始的 年龄(13周)时分析非处理组的小鼠(第O天)。
没有在3或6周的处理期间腺瘤生长4来过抗VEGF-A处理的证据
84与用对照IgG处理的小鼠的肺瘤的较宽的大小分布(图2B,从顶部起 第二和第四个图示)相比，用mAb G6-31处理的小鼠中的肿瘤具有更 紧密的大小分布(图2B，中间和下部图示)。用对照IgG施用三周的小 鼠中平均息肉直径是1.28 mm以及用mAb G6-31的是0.85 mm
(p<9.2xl(Tm)，而用对照IgG施用六周的小鼠中平均息肉直径是1.64 mm以及用mAb G6-31的是0.86 mm ( p<2.7xl(T214 )。第0天时平均肺 瘤直径是0.97mm。
有趣的是，抗VEGF-A处理似乎抑制所有大小的肿瘤的生长。使用 mAb G6-31的3周处理之后，小肺瘤(直径0.3-1.0 mm,对于6周处理， 0.3-1.2 mm)的频率比对照处理的组中的高，而具有大于1.0 mm直径
(对于6周，〉1.2mm)的肿瘤的频率降低了 (图2C，顶部和中部图示)。 与第0天时胂瘤大小分布(图2C,底部图示)的比较表明在mAbG6-31 的施用开始时腺瘤的生长已经基本上被遏止。
而且，抗VEGF-A的mAb G6-31对抑制所有小肠区域内的腺瘤生 长是有效的。在三和六周的治疗后，与对照IgG处理相比在mAbG6-31 处理时观察到显著降低的平均肿瘤直径(图2D)。此外，在用mAbG6-31 处理的小鼠的第一肠四分之一区中的平均腺瘤直径从第0天时的小鼠 中观察到的(图2D中的双星号)显著降低。结肠腺瘤的平均肿瘤直径 的减少未达到统计显著性(图2D)。用mAb G6-31处理三周的小鼠中 大肠息肉的平均直径是1.3±0.3 mm(士SEM)，而对照IgG处理的小鼠中 的平均直径是2.5土0.4mm,具有p<0.064。 mAb G6-31处理六周后的大 肠肺瘤的平均直径是2.2±0.3 mm以及用对照IgG施用后的是2.6±0.3 mm，具有p<0.37。
肠上皮细胞中VEGF-A的缺失减小平均胂瘤直径 我们接下来将会仔细研究在Apc"^+模型中来自肠上皮细胞来源的 VEGF-A对腺瘤发育的贡献。为了这一目的，如上文所描述的，在13 周大的Apc"^+小鼠中评估了肿瘤直径和数目，所述小鼠与其中在肠上 皮细胞中用Cre/loxP技术有条件地缺失了 VEGF-A的小鼠(VEGF1。、 Villin-Cre小鼠)杂交。在十三周大时分析Apcm,n/+; Villin Cre和Apcm,n/+; VEGF|0X; Villin隱Cre小鼠。
85绒毛蛋白(肌动蛋白结合蛋白和专门的吸收细胞的刷状缘的主要结 构组分)的表达在肠的后肠内胚层中的胚胎发生期间开始，并之后延伸
穿过小肠和大肠的内胚层(Braunstein等人，Dev. D，. 224:90-102 (2002), Ezzell等人，i)eve/o/wze^/ 106:407-419 (1989)， Maunoury等人, ￡MS(9 7:3321- 3329 (1988)以及Maunoury等人，Deve/op附e"Z 115:717-728 (1992))。在成体中，绒毛蛋白分布随着隐窝的未成熟的增 殖的细胞中温和顶端极化和衬在小肠绒毛里的完全分化的细胞的刷状 缘中的强极化而变得弥漫(Robine等人，尸rac. TV"//.爿caA 82:8488-8492 (1985))。先前已经表征了由绒毛蛋白启动子驱动的Cre重 组酶(Villin-Cre)的表达，再现了在从隐窝到绒毛尖端以及十二指肠至 结肠的肠的上皮的每一个细胞中的绒毛蛋白基因的表达模式Madison 等人，,所o/. CAem. 277:33275-33283 (2002)。
表型分析显示对照Apcmm/+; Villin-Cre小鼠的平均肿瘤直径是 1.02土0.3mm(士SEM)，而Apcmm/+; VEGF'°X; Villin-Cre小鼠的平均肿瘤 直径是0.82士0.3mm (图2E),显示了 19.8。/o的减少(p〈7.2 x 1(T5)。两组 间肿瘤数目没有显著的差异。当Apcmin/+; Villin-Cre小鼠具有137±11 个肠腺瘤时，Apcmm/+; VEGFlox; Villin-Cre小鼠具有150±17个腺瘤 (p<0.27 )。
这些数据表明从十二指肠至结肠以及隐窝到绒毛尖端的所有肠上 皮细胞中的VEGF-A的缺失导致肿瘤生长的显著抑制，尽管与从抗 VEGF-A抗体的系统施用得到的抑制相比程度下降。因此，这些数据暗 示了上皮外来源的VEGF-A对Apcmm/+小鼠的肠腺瘤的生长有贡献。
VEGF-A的抑制延长了 Apc"^+小鼠的中值生存期
考虑到抗VEGF-A治疗在肿瘤生长抑制中的效力，我们想要研究使 用mAbG6-31的处理是否能为Apc"^+小鼠产生长期益处。为了这一 目 的，将mAbG6-31或对照IgG的施用持续直到52周或直到观察到小鼠 瀕死。有趣的是，mAbG6-31处理将中值生存期从使用对照IgG的24.0 周增加到使用mAbG6-31的33.6周，具有时序p〈2.4x l(T3 (图2F )。
当在32、 51、 64或66周(分别地在用mAb G6-31处理19、 38、 51或53周后)的年龄安乐死后分析用mAbG6-31处理的四只小鼠的肿瘤表型。如表l中所示，平均肺瘤直径依旧在与在十九周大的小鼠中所
见的水平接近的水平(用对照IgG处理六周的小鼠中为1.64 mm)。同 样地，肿瘤数目依旧与十三周大的小鼠的肿瘤数目相当(第0天组小鼠 具有59-161个肠腺瘤以及IOO的平均值)。组织分析中切片的平面上发 现的十五个结肠腺瘤(小鼠1-4中鉴别的总数目)中的三个(表l的第 2、 3和4号小鼠各一个)显示没有恶性的转变。
表l.关于G6-31长期处理的小鼠的肿瘤数据
小鼠_年龄(周)使用G6-31的周数 肿瘤数目 平均肿瘤直径(mm)肿瘤负荷(mm3)
^ ^ 5!ii ^~6.3
2 51 38 133 1.72 263.5
3* 64 51 85 2.21 3". 1
4* 66 53 150 1.63 382.2
*实验终点被安乐死的健康的动物
总的来说，长期的抗VEGF-A处理通常是良好耐受的并产生了增加 的Apc"^+小鼠的生存期。而且，与新的腺瘤形成和腺瘤生长的抑制一 致，鉴于小鼠年龄，用mAb G6-31长期处理的小鼠中肿瘤数目和平均 肺瘤直径保持得非常低。
在用抗VEGF-A处理的Apc"^+小鼠中正常的血清总蛋白、白蛋白 和三酸甘油酯水平以及减少的脾髓外造血作用
如通常观察的，用mAbG6-31处理的Apc隱"小鼠比用对照IgG处 理的小鼠显得更加警觉和敏感得多。而且在用对照IgG处理的动物中有 规律地观察到苍白的爪，使得联想到最初由Moser等人报道的进行性贫 血(Moser等人，Sc&"ce 247:322-324 (1990))，但在用mAbG6-31处理的 动物中未观察到。与该观察结果相符的，用对照IgG施用的Apcmin/N、 鼠的平均总血清蛋白和血清白蛋白下降，而用mAb G6-31处理的小鼠 中总蛋白和白蛋白水平处于正常范围内(表2)。表2.血清化学
总蛋白(g/dl广
白蛋白(g/dl)'
对照IgG 3周 G6-31 3周 i
对照IgG 6周 G6-31 6周 i
3.7±0.2 4細.2 3細.3 4.9±0,1
1細.1 2.6±0.1 1.6±0.2 2.7±0.1
268.9±82.5 75.5±4.9
591'1±81.3 71.1±4.3
*参考值3.9-5.5 g/dl **参考值2.3-3.2 g/dl ***参考值35-244 mg/dl ±平均值的标准误差(SEM)
如关于Apc匪"小鼠所报道的(Moser等人，Sc&"ce 247:322-324 (1990))并与血液蛋白不足一致，在用对照IgG处理的动物中，平均三 酸甘油酯水平升高了，然而当用mAb G6-31处理时它被降低至与参考 值相当的水平(表2)。
尽管在三或六周的处理后，体重上没有与处理相关的差异，但在用 对照IgG处理的小鼠中平均的脾的质量显著增加(p<2.3x lCr3)。在用 对照IgG施用三周后，小鼠具有0.26g或体重的1.17%的平均脾质量， 而用mAb G6-31处理三周的小鼠中的平均脾质量是0.11 g (体重的 0.49%)。用对照IgG处理的小鼠中平均脾质量的增加与髓外造血作用 (EMH，补偿性红细胞生成，在这一实例中继发于肠出血) 一致，其 通过脾的组织学检查来确认。用对照IgG处理6周的十只小鼠中的十只 显示出显著的EMH，而用mAb G6-31处理的两只小鼠具有中度的EMH， 五只具有轻微的EMH,和三只在它们的脾中没有诊断变化。用mAb G6-31处理18至53周的五只小鼠中的四只被诊断为脾中轻微到广泛的 EMH。
用mAb G6-31短期处理的小鼠的脾中的较低程度的EMH说明抗 VEGF-A疗法具有对减少肠出血的有利的影响。 用mAbG6-31长期处理后肾的变化
为了研究与施用高亲和力抗VEGF-A的mAb G6-31相关的可能的 毒性，在短期(3-6周)和长期(18-53周)处理后对胰腺、肝和肾进 行了组织学分析。为了进行组织学分析，将Notox固定的肠组织脱水并包埋在石蜡中，切片并用H&E染色以便按标准方案进行组织学分析。
在处理3-6周的动物中未注意到显著的毒性。用mAbG6-31长期处 理后，五只小鼠中的五只显示出可变的(轻微到严重)的弥散性球性肾 小球硬化(diffuse global glomerulosclerosis)和中度的胰腺的基质水肿 (反映血液蛋白不足)。这些观察结果与之前由于长期施用mAb G6-31 所观察到的毒性一致。重要地，由增加的中值生存期反映的健康的总体 改善超过副作用。
mAb G6-31处理时改变的肿瘤形态学并未伴随增殖指数上的变化
为了进一步表征使用抗VEGF-A的mAb G6-31处理后Apcmin/M、鼠 中的肠息肉，如上文所描述的进行了肉眼可见的和组织学的分析。用 mAb G6-31处理的息肉的总体形态学与用对照IgG处理的息肉的总体 形态学显著不同(图3A-B)。尽管来自用对照IgG施用的小鼠的肿瘤通 常具有相对完好的光滑的表面，但是来自用mAb G6-31处理的动物的 肿瘤在其表面上显出具有深的内陷。组织学分析表明来自mAb G6-31 和对照IgG处理的小鼠的肿瘤是管状腺瘤(图3C-F)。来自用对照IgG 处理的小鼠的腺瘤具有显著的绒毛内上皮增殖，垂直和侧向延伸，并且 通常从其底部(base)到腔表面增宽超过两倍。有最小量的纤维基质。 来自用mAb G6-31处理的小鼠的腺瘤特性地具有较少的绒毛内上皮细 胞，在腔表面处宽度较窄，较浅并涉及较少的邻近的绒毛。两种处理组 中的结肠息肉的组织学分析显示出具有大量纤维血管基质和不同量(多 至100%)的发育异常的上皮的有蒂的(pendu画lated )管状腺瘤。
为了评估肿瘤组织和正常粘膜中的增殖的程度，进行了使用Ki-67 抗体的间接的免疫组织化学染色(图3G-J)。为了这些实验，将Notox 固定的、脱水的和石虫普包埋的肠组织切片于99 °C在Target Retrieval (DAKO， Glostmp, Denmark)中孵育之前脱石蜡并水合，随后终止内源 的过氧化物酶活性并阻断抗生物素蛋白和生物素(Vector, Burlingame, CA)。将切片进一步用溶于PBS的具有3%牛血清白蛋白的10%的封闭 血清封闭30分钟。将组织切片与稀释于封闭血清中的第一抗体孵育60 分钟，用TBST緩沖液(DAKO)清洗并与第二抗体孵育30分钟，用 TBST清洗并于ABC Elite Reagent (Vector)中孵育30分钟，之后在金属强化DAB (Pierce， Rockford, IL)中孵育并用Mayer氏苏木素复染。所 使用的第一抗体是兔多克隆的抗Ki-67 (SP6， 1 : 200, Lab Vision, Fremont, CA)。所使用的第二抗体是生物素化的山羊抗兔(7.5/xg/ml， Vector )。于室温进行所有步骤。
在来自用对照IgG或用mAb G6-31处理的小鼠的肺瘤中，凄t量分 析显示相似量的Ki-67阳性细胞。同样，在两种处理之间正常的邻近的 粘膜的增殖指数相当(图3K)。从使用Ariol SL50载玻片扫描显微镜系 统(Applied Imaging, Inc.， San Jose， CA)获得的肿瘤组织和正常粘 膜的5 /mi的石蜡切片的图像利用Kisight测定(Ariol Review (v2.6))定 量增殖指数。由不知情的检查者人工鉴别并划定肿瘤组织和正常粘膜的 区域。将测量为Ki-67阳性细胞核相对于总细胞核的百分比的增殖指数 按照阳性阈值的定义基于细胞核颜色以半自动的方式定量。增殖指数测 量包括都处理6周的mAb G6-31处理组(11=3)中的29个肺瘤和对照IgG 组(n=3)中的44个肿瘤的分析。
为了检测通过mAb G6-31的生长抑制是否伴随着主要信号传导通 路的分子部分的表达水平上的变化，进行了蛋白质印迹分析。将空肠腺 瘤和正常邻近的粘膜用外科手术刀从mAb G6-31和对照抗体处理的小 鼠采集并用OMNITH115匀浆器在RIPA裂解緩冲液中机械匀浆。所使 用的第一抗体是兔多克隆的抗p38 MAPK、磷-p38 MAPK、 p42/p44 MAPK、磷-p42/p44 MAPK、 PTEN、 Akt、磷画Akt和磷-GSK3o;/iS (均为 1: 1000, Cell Signaling, Danvers, MA )。所使用的第二抗体是辣根过 氧化物酶4厄合的抗兔(1: 5000， Chemicon)。
尽管用mAb G6-31处理时许多所测试的分子的表达水平保持不变， j旦观察到四个肿瘤样品中的三个中的磷(phospho ) -p38 MAPK水平向 在正常粘膜中所发现的水平的适度复原(图3L; p-p38,将T5-T8与 N5-N8对比)。
mAb G6-31处理的肺瘤中血管密度降低
考虑到已知VEGF-A是经由VEGFR-2信号转导的血管内皮细胞的 促细胞分裂原，我们通过以抗CD31的抗体对厚组织切片的免疫组织化 学染色在用Mab G6-31和对照IgG处理的小鼠中检查肿瘤的血管网络(图4A-B )。为了共焦显微成像的目的，将小鼠用溶于PBS的1%的多 聚曱醛(PFA)在异氟烷(isofluorane)麻醉下灌注固定，将肠道平展 在滤纸上，并在包埋于O.C.T.并在干冰上冷冻之前用4%的PFA固定并 于4。C在溶于PBS的30%蔗糖中浸没过夜。以80 /mi进行冻干切片，在 4%的PFA中固定10分钟，用溶于PBS的0.2% Triton-X-lOO透化，并 用溶于含有0.2% Triton-X-lOO的PBS的5%正常的山羊血清封闭30分 钟。将第一抗体在封闭緩冲液中孵育过夜，第二抗体5-6小时，用PBS 清洗并用Hoechst 33342 (0.5 mg/ml; Sigma, St. Louis， MO)复染。所使 用的第一抗体是仓鼠单克隆抗CD31 ( 1: 500, Chemicon， Temecula， CA)、大鼠单克隆4元E-4丐粘蛋白(1: 2500, Zymed， South San Francisco, CA)和Cy3轭合的小鼠单克隆抗平滑肌肌动蛋白(1: 1000, Sigma)。所 使用的第二抗体是Cy5轭合的抗亚美尼亚仓鼠(1: 500, Jackson Immunoresearch， Cambridgeshire, UK)和ALEXA488举厄合的抗大鼠(1: 500, Molecular Probes, Eugene， OR)。
从用CCD照相机在Zeiss Axioplan2焚光显微镜(Thornwood, NY ) 上获得的数字图像中定量来自Apc"^+小鼠的肿瘤中的血管密度。四组
(用对照IgG或mAb G6-31处理3或6周的小鼠)中的每一组由两只 小鼠组成，并且分析了来自每组的11-22个胂瘤。使用ImageJ v.1.36 (http:〃rsb.info.nih.gov/ij/)经由CD31阳性荧光的基于阈值的分,殳计算 80/mi的肿瘤切片中的血管面积。之后将血管密度计算为CD31阳性像 素比总体肺瘤面积的比率。将来自每一组的所有肿瘤的值平均以产生组 的平均值。
血管密度的定量显示与在对照IgG处理的小鼠中所见的相比，来自 mAbG6-31处理的小鼠的胂瘤的血管部分减少(图4C )。用对照IgG施 用三周后平均肿瘤血管面积密度是23.2%，而用mAbG6-31施用后它降 低至18.6%。用对照IgG处理六周的肿瘤的平均血管面积是25.5%,而 来自用mAb G6-31处理的小鼠的肺瘤的平均血管面积密度是19.7%。
讨论
我们使用Apc,〃小鼠以研究VEGF-A在良性肠肺瘤发生中的作 用。在第一部分，设计实验以测量短期和长期抗VEGF-A处理对经历茁壮生长的建成的肠腺瘤的作用。我们已经展示了用抗VEGF-A的mAb G6-31处理显著降低了肺瘤负荷并延长了 Apc"^+小鼠的生存期。
已经对饮食和化学预防剂包括非甾体抗炎药物(NSAID )对Apcmin/+ 小鼠的肿瘤负荷的作用进行了若干研究(综述于Corpet等人，Oz"cw 五; zWem/0/. Bz》marA:e^ ZVev. 12:391-400 (2003)中)，http:〃corpet.net/min 有其最新的列表。这些研究中的许多报道了肿瘤数目上的显著下降。除 了选择性的COX-2抑制剂例如塞来昔布(Jacoby等人，Ca"cw 60:5040-5044 (2000))和A-285969 (Wagenaar-Miller等人，5r. Ca"cw 88:1445-1452 (2003))， NSAID例如吡罗昔康和舒林酸(其以COX-l和 COX-2为靶)在抑制Apc"^+小鼠中肿瘤形成的最强有力的剂之中
(Boolbol等人，Oz"cwW&y. 56:2556-2560 (1996)， Chiu等人，Ca"cwi as. 57:4267-4273 (1997), Hansen-Petrik等人，Ozwcw175:157-163 (2002), Ritland等人，Qzn:/"oge"&^ 20:51-58 (1999))。还已经成功地使 用联合治疗降低肺瘤数目。Torrance等人利用特异的表皮生长因子受体 抑制剂EKI-785与舒林酸组合并显示了几乎完全消除肺瘤数目
(Torrance等人，Ato. 6:1024-1028 (2000))。同样地，化学治疗剂 雷替曲塞(RTX)和5-氟尿嘧啶(FU)的联合作用导致Apc"^+肿瘤数 目的显著(37% )的降低(Murphy等人，C騰w肠/. 77^ 3:1169-1176 (2004))。最近，受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂AZD2171的短期施用 显示出在Apc誦"模型中减少肺瘤负荷(Goodlad等人，Cara'"oge"esz、 27:2133-2139 (2006))。他们注意到使用AZD2171的较早处理开始(在 6周时)能够减少肿瘤数目，而较晚的干预(在10周时)仅减小肿瘤 大小(Goodlad等人，如上)。然而，处理对血管密度没有作用(Goodlad 等人，如上)。AZD2171抑制若干RTK，包括但不限于VEGFR-1、 -2 和-3 ( Wedge等人，Ca"cw 7 仏65:4389-4400 (2005))。
我们观察到在13周时施用的抗VEGF-A的Mab G6-31没有减少现 有的肺瘤的数目，但它减少了肿瘤大小并似乎抑制了新腺瘤的形成。这 些结果与生存期上观察到的增加相关。然而，我们相信抗VEGF特异性 肿瘤预防方法(处理开始较早)可能可比我们的研究中所使用的肿瘤干 预方法(处理开始较晚)更有效地减少肿瘤数目是可能的。无论如何，
92抗VEGF特异性抑制在肺瘤生长的所有时期都有效。
我们的研究最后显示，靶向VEGF-A在Apc"^+模型中足以获得深 切的治疗效果。以MabG6-31系统的VEGF-A抑制与Apcmm/+; VEGF1(5X; Villin -Cre小鼠中仅在肠上皮区室中对VEGF-A的遗传缺失的对比表明 除了上皮细胞之外，其他细胞来源的VEGF-A在Apc"^+腺瘤生长中起 到重要作用。VEGF-A的这些其他的来源可能包括单核细胞(Sunayama 等人，Ozra'"oge"&^ 23: 1351-1359 (2002))和基质成纤维细胞(Seno 等人，7 仏62:506-511 (2002)， ( Williams等人，/"ve" 105 :1589-1594(2000))。我们的原位分析显示出腺瘤和正常绒毛中上皮 外的VEGF-A表达，支持所述观察结果。
基于大量的数据，可想到大量所观察到的mAb G6-31的抗肿瘤效 果是由血管生成的抑制介导的(Wise等人，A^/. v4caA Scz' 96:3071-3076 (1999), Zachary等人，CaW/owwc 49:568-581 (2001))。 事实上，已经在肿瘤异种移植研究中观察到响应抗VEGF-A单克隆抗体 的血管供给减少(Borgst腿等人，35: 1-10 (1998))。与这相一 致，与来自用对照IgG处理的小鼠的肿瘤相比，mAbG6-31施用三和六 周后观察到Apc"^+肠腺瘤的血管面积密度上的减少。
当VEGF-A抑制时所观察到的小于lmm的腺瘤的显著的累积表明 在Apc"^+小鼠的肠腺瘤中，如同已在Apc""模型中所见的，血管生成 开关(angiogenic switch)可发生得比通常所认为的肿瘤发育的血管生 成开关更早(Seno等人，C羅"&s. 62:506-511 2002))。
我们的研究中重要的并出人意料的结论是靶向单一的血管生成因 子的抗血管生成的单一疗法能高效的抑制肿瘤生长并能产生生存益处。 这似乎与最初从恶性肿瘤的研究中所了解的这种疗法的主要益处是使 肿瘤血管"正常化，，以便促进化学疗法的递送的观点(Jain等人，A^. 7:987-989 (2001))不同。可以想到，良性肿瘤获得突变的倾向减少可能 产生治疗抗性，这至少可在某种程度上解释差异。因此，我们的数据表 明了不需要化学治疗剂的非手术治疗良性肿瘤的可能性。
实施例2.在多发性内分泌腺瘤的小鼠模型中抗VEGF-A单 隆抗体抑制垂体腺瘤的生长并降低血清催乳素和生长激素水平
多发性内分泌腺瘤(MEN)是一种特征为涉及两个或更多内分泌 腺发生肿瘤的病症。当鉴定了曱状旁腺、胰岛细胞和垂体前叶中肿瘤的 联合发生时，将患者分类为1型MEN (MEN1)。发现一般导致蛋白 menin的平截或缺乏的M￡iV7基因中的突变引起了所述病症(综述于 Pannett等人，五m/ocr 6:449-473 (1999)中)。随着关于肿瘤
中其余的等位基因的频繁缺失的更多发现(Bystrom等人，尸rac. AAw/. Jcfld. "72 (7990」，Debelenko等人，Ca"cer
57:2238-2243 (1997), Larsson等人，A^mm 332:85-87(1988)), M五iW 已被分类为肿瘤抑制基因。尽管MEN1作为常染色体显性的病症在很 大程度上^皮遗传，但Affi7W基因的新生突变已被鉴定为MEN1散发病 例的起因。
menin的功能在很大程度上还未知。已表明到处表达的主要分布在 细胞核中的610个氨基酸的蛋白质参与转录调节、DNA加工和修复， 以及通过其与上文所提及的通路的蛋白质部分的体外相互作用的细胞 骨架组织(综述于Agarwal等人，//onw. MetoZ). T 仏37:369-374 (2005) 中)。然而迄今为止没有一种已鉴定的蛋白质相互作用提供了 MEN1中 的致瘤性的解释。
胰腺肿瘤(其超过50%是胃泌素瘤以及10-30%是胰岛素瘤)治疗 的现有标准是在胃泌素瘤的情况下基础酸排出量的减少，而手术被看作 是胰岛素瘤的最佳治疗。垂体肿瘤的治疗由伴随着取决于激素概况的不 同的药物疗法的选择性的手术构成，而曱状旁腺肿瘤的确定性治疗是手 术去除过分活跃的腺。但是曱状旁腺切除术的程度和时机具有可变性
(综述于Brandi等人，五m/ocn."o/.86:5658-5671 (2001) 中)。最近对诊断和治疗MEN1的新方法的产生上的最新进展进行了综 述(Viola等人，C匿争w. (9歸/. 17:24-27 (2005))。
通过同源重组，已经将小鼠基因Menl的外显子3-8作为缺失的靶
(Crabtree等人，Prac. A^/. JcaA 98:1118-1123 (2001))。到九
个月大时，杂合的Menl小鼠被报道发展胰岛损伤，伴随其它的常观察 到的曱状旁腺腺瘤。到16个月大时观察到胰岛、曱状旁腺、曱状腺、肾上腺皮质和垂体中更大更多数量的肿瘤(Crabtree等人，Prac. A^/. 爿c^/. 98:1118-1123 (2001)),特征与人类病症非常相似。
当抗VEGF-A方法已被用于衍生自人类恶性癌细胞系的各种临床 前模型的处理时(综述于Geber等人，Cfl"ceri 仏60:2178-2189 (2000)), 存在大量的证据显示VEGF-A介导的血管生成的阻断导致肺瘤抑制 (Gerber等人，Oz"cw M 60:6253-6258 (2000), Holash等人，Prac.胸/. Jed 固99:11393-11398 (2002)， Millauer等人，A^ww 367:576-579 (1994), Prewett等人，59:5209-5218 (1999), Wood等人， Oz"cwi &s. 60:2178-2189 (2000))。然而在自然情况下，肿瘤异种移植 物很难再现肿瘤发育。此外，在抑制良性肿瘤或内分泌腺起源的肺瘤的 生长上迄今没有尝试抗VEGF-A抗体疗法。为了研究在内分泌组织特异 性腺瘤的发育中VEGF-A的作用，我们考查了抗血管生成疗法对自然发 生的非恶性肿瘤模型MEN1的Menl+/—小鼠模型的作用。在用示例性 VEGF特异性拮抗剂抗VEGF-A单克隆抗体(mAb)短期处理后分析 Menl+/—小鼠中垂体腺瘤的肺瘤体积以及Balb/c棵小鼠中皮下垂体胂瘤 移植物的体积。此外，研究了用抗VEGF-A的mAb降低与MEN1相关 的升高的激素水平的可能性。
对于下文所描述的实验，从The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) 获得Menl+/—小鼠(库存编号004066 )而从Charles River Laboratories Inc. (Wilmington, MA)获得Balb/c棵小鼠。混合129-FVB背景的实验性的 Menl+/—雌性小鼠是通过将Menl+/—雄性和雌性小鼠杂交获得的。将小鼠 圈养在屏障设施中的微隔离器笼子中并随意喂食。按照联邦政府规章和 Institutional Animal Care and Use Committee (实验动物管理与4吏用委员 会)所批准的进行动物的养护和实验方案。
mAb G6-31处理抑制Menl+/—垂体腺瘤的生长
为了研究抗VEGF-A疗法在抑制垂体腺瘤的生长上是否有效，使 125只十一至十三个月大的雌性Menl+/—小鼠经受MRI以鉴别具有垂体 肿瘤的小鼠。14和28天后使带有肿瘤的小鼠再次经受成像以确定腺瘤 的生长速率。使研究开始时具有每天12.4%的平均肿瘤生长和15.58±4.0 mm3 (士SEM)平均肿瘤体积的九只小鼠的组接受对照IgG,而使研究开
95始时具有每天10.2%的平均肿瘤生长和16.70±5.7 mmS平均肿瘤体积的 八只小鼠的组接受抗VEGF-A的mAb G6-31，均达67天或直到发现小 鼠濒死。对于使用mAb G6-31和对照IgG抗体的处理，以溶于PBS的 100-200 jid体积每周 一次提供5 mg/kg的抗VEGF的mAb G6-31 ( Liang 等人，所o/. CAem. 281 :951-961 (2005))或同种型匹配的对照IgG (抗 GP120)的腹膜内注射。在13.5-14.5个月大时开始对患有原位垂体腺瘤 的八只(mAb G6-31 )或九只(对照IgG ) Menl+〃小鼠的施用并持续67 天或直到发现小鼠濒死。在移植后4个月开始具有皮下垂体腺瘤移植物 的23只(对照IgG)或35只(mAb G6-31 ) Balb/c棵小鼠的处理并持 续35天或者直到发现小鼠濒死或肿瘤体积已经达到3000 mm3的体积。 每两周用MRI将动物成像以追踪体内垂体&良瘤生长。在9.4T水平 孑L型磁体(9.4 T horizontal bore magnet， Oxford Instruments Ltd., Oxford, UK)获得并通过^f吏用用于传送和接收的3 cm体积型线圈(volume coil) (Varian, Inc.)的Varian Inova 4空制台(Varian, Inc., Palo Alto， CA)4空制 MRI图像。以4秒的重复时间，8的回波链长度，12 ms的回波间隔， 48ms的有效回波时间，六次平均使用快速自旋回波成像序列。图像矩 阵为1282，具有一见野(20 mm) 2和0.5 mm的层面厚度。S夸小鼠以臣卜姿 在医用空气中用2%异氟烷约束，并且用直肠探针监测体温并在15分钟 的图像获取期间用暖空气保持在37°C。成像后，在热表面上使动物复 原，之后将它们送回圈养设施。使用Analyze软件(AnalyzeDirect， Inc., Lenexa， KS )绘制的目标三维区域从MRI凄t据计算原发垂体肺瘤体积。 在处理的三十九天时，与对照IgG处理的组相比，在mAb G6-31 处理的组中观察到平均垂体肿瘤体积的统计学上显著的下降(图5A)。 在研究的终点(67天)，用mAbG6-31处理后平均肿瘤体积有统计学上 显著的72%的减小或减至1/3.7，具有小于0.016的p值。当大多^:(9 个中的6个)对照IgG处理的Menl+一肿瘤在整个处理期间继续茁壮生 长时，8个mAb G6-31处理的垂体腺瘤中的7个的生长显著减慢(图 5B)。在研究终点之前四只对照IgG和三只mAbG6-31处理的小鼠由于 不健康而被安乐死，其包括在处理第25天成像前的一只对照IgG处理 的小鼠。mAbG6-31处理的组中无肿瘤倍增的生存期被显著增加，具有时序p<0.019 (图5C),表明与用对照IgG处理的小鼠相比，垂体肿瘤 生长的抑制改善了那些小鼠的健康。mAb G6-31处理的组中两只小鼠的 肿瘤体积到处理的第67天时没有加倍。
抗VEGF-A抗体抑制皮下垂体腺瘤移植物的生长
为了才企测抗VEGF-A抗体处理对Menl+/—垂体腺瘤移植才莫型的效 力，按照下列程序在6-8周大的雌性Balb/c棵小鼠的侧腹中建立皮下肿 瘤。对于这些实验，将来自Menl"-小鼠的单个的原位垂体腺瘤取出并 切成约1 mm3的块，与BD Matrigel Matrix Basement Membrane( Matrigel 基质胶基底膜)(BD, Bedford, MA )混合并以200 pi体积对Balb/c棵 小鼠的背侧进行皮下接种。四个月后，将单个的皮下肿瘤(约900mm3 体积)取出、切碎与Matrigel混合并如前文所述进行接种以建立具有垂 体腺瘤移植物的小鼠的组。
使用卡尺工具(Fred V. Fowler Co. Inc.， Newton, MA)通过采集最大 的肿瘤直径和与其垂直的直径测量皮下垂体腺瘤移植物的肿瘤大小。使 用下列公式计算肿瘤体积V二7rab"6(a二最大肺瘤直径，匕=垂直直径)。
z使用上文描述的方法， -使在处理开始时具有515±42 mn^平均肿瘤 体积的35只小鼠的组接受mAbG6-31,而使在研究开始时具有527±64 mn^平均肺瘤体积的23只小鼠的组接受对照IgG,均达35天。在研究 终点时，对照IgG处理的肿瘤已经接近它们的体积的四倍至2071±152 mr^的平均值，而用mAb G6-31处理的小鼠中的肿瘤生长已经基本上 停止，第35天时的平均肿瘤体积为556士89mm3 (图5D )。 mAbG6-31 处理时的平均肺瘤体积有统计学上显著的73%的减小或减至1/3.7,具 有p〈1.9x l(T12。
这些数据证实抗VEGF-A的mAb G6-31在抑制由于Menl的杂合 性而易患的垂体腺瘤和类似的皮下垂体腺瘤移植物的生长上是有效的。
VEGF-A、VEGFR-1和VEGFR-2在正常垂体腺和在垂体肿瘤组织 中的表达
为了研究VEGF-A、 VEGFR-1和VEGFR-2在垂体组织中的表达水 平并检查它们的表达水平是否受到mAb G6-31处理的影响，我们对比 了在五个对照IgG处理的(平均体积96.2±8.7 mm3)和五个mAb G6-31
97处理的(35.2士4.0mm3)原位垂体腺瘤连同五个年龄匹配的小的未处理 的(9.7±2.9 mm )垂体腺瘤，来自Menl"—小鼠的四个年龄匹配的正常 垂体腺，以及八个年龄匹配的野生型垂体腺样品中VEGF-A、 VEGFR-1 和VEGFR-2的平均相对表达。还从五个对照IgG处理的(平均体积 2063±205 mm3)和五个mAb G6-31处理的(577±45 mm3)垂体腺瘤移 植物研究VEGF-A、 VEGFR-1和VEGFR-2的表达。
为了这些实'验，用RNeasy试剂盒(Qiagen， Hilden, Germany)依照 制造商的方案从快速冷冻的垂体腺瘤或正常垂体腺制备总的无DNA的 RNA。用Superscript III Platinum —步qRT-PCR试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)、 100 ng的总RNA、 45 nM的每种PCR引物以及12.5 nM Taqman探针以50 /xl的总体积进行一步定量RT-PCR。为了检测感兴趣 的基因的表达，使用了下列TaqMan基因表达分析引物和探针混合物 (Applied Biosystems , Foster City ， CA) : ^EGF-爿(测定 ID : Mm00437304—ml) 、 K五OF7 -/(测定 ID : Mm00438980—ml)以及 r五GF/ -2(测定ID: Mm00440099一ml)。使用在内部设备中合成的引物 和Taqman探针(正向引物序列ATGTTCCAGT ATGACTCCAC TCACG (SEQ ID NO: 3);反向引物序列GAAGACACCA GTAGACTCCA CGACA (SEQ ID NO : 4) ; Taqman探针序列AAGCCCATCA CCATCTTCCA GGAGCGAGA (SEQ ID NO: 5))检测04尸￡>//表达。
使用Applied Biosystems 7500实时PCR系统，以下列条件进行反 应反转录步骤(于48。C15分钟)，之后变性步骤(95。C2分钟)以及 40个95°C15秒和60°C1分钟的循环。使用04尸Z)/Z基因作为内源性对 照以及小鼠胎盘总RNA (Clontech, Mountain View， CA)作为参考， 用相对定量的方法(ddCt法)测定每种样品中基因表达的水平。
值得注意的是，与对照IgG处理的垂体肿瘤、小的未处理的肿瘤和 来自野生型或Menl+一小鼠的正常垂体腺相比，mAb G6-31处理的原位 腺瘤中VEGF-A平均相对表达被显著升高(图6)。两个皮下肿瘤移植 物样品中VEGF-A表达差不多高。在mAb G6-31处理的肿瘤中所观察 到的高水平的VEGF-A转录可能是经由mAb G6-31的对VEGF-A的系 统遮蔽的补偿机制的结果。然而，似乎升高的VEGF-A不足以使肺瘤生长。
尽管VEGFR-1的平均相对表达在不同的组织样品中表现得相当地 没有变化，但是与在肿瘤移植物、小的未处理肿瘤或来自野生型和 Menl+/—小鼠的正常垂体腺中所发现的相比，用对照IgG或mAb G6-31 处理的原位肿瘤样品中VEGFR-2的平均相对表达似乎下降了 (图6)。
MRI使得可以体内追踪肿瘤生长
如上文所描述的使用MRI通过每隔一周使动物经受成像而在整个 处理期间追踪原位垂体腺瘤的生长。将摄于处理开始后9、 39和67天， 具有来自 一只对照IgG和一只mAb G6-31处理的Menl+、J、鼠的代表性 的腺瘤的脑部的冠状切面的图示示于图7。
垂体和胰腺肿瘤的组织学
在mAb G6-31和对照IgG处理的小鼠中Menl"-垂体腺腺瘤是组织 学上相似的(图8A-B)。为了这些实验，将福尔马林固定的组织脱水并 包埋于石蜡中，切片并用苏木素-伊红(H&E)染色以便按照标准方案 进行组织学分析。通常，肺瘤细胞是小的( 10微米的直径)，具有高 的细胞核/细胞质比率，常常有丝分裂活跃，具有每十个625微米直径 的^L野多达40个有丝分裂象。肿瘤不定地为实体或嚢性的，与以前的 出血相符，具有多重的内皮细胞内衬的血管，急性出血的区域(在非内 皮内衬的空间中的完整的红细胞，缺乏纤维蛋白或细胞形成)，以及分 散的载满血铁黄素的巨噬细胞。具有可变的单细胞坏死和极小的纤维 化。肿瘤血管是不规则地隔开的，通常5-10微米(但是很少的大至50 微米)的直径，几乎没有非肿瘤的血管周围的基质细胞。
通过4吏用泛内皮细胞标记抗体MECA-32间接的免疫组织化学染色 在对照IgG和mAb G6-31处理的肿瘤之间观察血管沖莫式(图8C-D )。 为了这些实-睑，在终止内源性的过氧化物酶活性并阻断抗生物素蛋白和 生物素(Vector, Burlingame, CA)之前，将福尔马林固定、石蜡包埋 的组织切片脱石蜡。用溶于具有3% BSA的PBS中的10%的正常兔血 清将切片封闭30分钟。之后将组织切片与第一抗体孵育60分钟，与生 物素化的第二抗体孵育30分钟，并在ABC试剂(Vector, Burlingame， CA)中孵育30分钟，之后在金属增强的DAB (Pierce ， Rockford, IL )中孵育5分钟。之后将切片用Mayer氏苏木素复染。所使用的第一抗体 是0.1 /;ig/ml的山羊抗小鼠催乳素(R&D systems, Minneapolis, MN ) 和2 Aig/ml的大鼠抗小鼠泛内皮细胞抗原(克隆MECA32) ( BD Biosciences, San Jose, CA )。所使用的第二抗体是7.5 jLtg/ml的生物素 化的兔抗山羊(Vector, Burlingame ， CA )和2 5 /xg/ml的生物素化的兔 抗大鼠(Vector, Burlingame, CA )。泛内皮细胞抗原染色需要于99°C 用Target Retrieval (Dako, Carpenteria， CA)预处理20分钟。其他所有 步骤于室温进行。
mab G6-31处理将血管密度显著降低至对照IgG处理的肿瘤的血管 密度的46% (p值=0.009;图81)。在两个处理组中，肿瘤血管分布比 正常的邻近的垂体前叶中的少。为了定量血管密度，用Ariol SL-50载 if皮片扫描台(Ariol SL-50 slide scanning platform, Applied Imaging; San Jose, CA)使用10x的物镜分析MECA-32染色的切片。人工鉴定并划 出垂体肿瘤区域。相应于MECA-32染色确定像素颜色并相应地测量血 管面积。通过像素颜色和物体形状鉴别肿瘤细胞核。之后将血管面积相 对于垂体肿瘤细胞数目标准化。除了将MECA-32染色面积相对于胰岛 肿瘤面积标准化以外，同样地分析胰岛。
除了垂体肿瘤，经常在处理的Menl+"小鼠中鉴别胰岛肿瘤并在研 究终点对胰岛肿瘤进行组织学分析。胰岛肿瘤(被定义为在切片平面上 大于105/mi4々)通常是实体的，不具有显著的出血或坏死。来自用抗 VEGF-A的Mab G6-31处理的六只动物的肿瘤(n=32个肿瘤)平均只 有来自用对照IgG处理的五只动物的那些肿瘤(n=45个肿瘤；p值 =0.026)的面积的39%。用对照IgG处理的胰腺li瘤(图8E-F)表现 通常比用mAb G6-31处理的腺瘤(切片平面上肿瘤直径达5.0 mm)大 (切片平面上达7.0 mm)并且血管多。在用对照IgG处理的七只小鼠 中的四只中，胰腺肺瘤含有直径多达300 ^m的膨胀的、充血的、薄壁 的、内皮内衬的空间，而用mAb G6-31处理的小鼠中的胰腺腺瘤常常 缺乏显著的血管分布(图8G-H)。来自用mAb G6-31处理的八只小鼠 中的一只的胰腺肺瘤显露出膨胀的血管。从使用任一种处理的胰腺肺瘤 间歇发现载满血4失黄素的巨噬细胞，暗示胰岛出血。G6-31处理将胰岛肺瘤中的血管密度显著降低至对照IgG处理的胰 岛肿瘤中的血管密度的56% ( 值=2*10-7)。同样，来自MabG6-31处 理的小鼠的"正常的，，胰岛(在切片平面上小于105 /mi2)具有以较小幅 度减少至对照IgG处理的动物的血管密度的76%的血管密度(p值 =4*10-7;参见图8J)。用对照IgG处理的一只雄性动物具有唯一的12 mm 直径的肾上腺皮质的肿瘤，其为MEN1综合征腺中公认的肿瘤类型。
皮下垂体腺瘤移植物的组织学与原位垂体肺瘤的组织学相当，显示 内分泌肿瘤生长在远处位置的成功的再现。
Menl垂体腺瘤是催乳素瘤
MEN1患者中大约百分之六十的垂体腺瘤分泌催乳素(PRL),少 于25%的生长激素(GH)和5%的促肾上腺皮质激素(ACTH, Trump 等人，0/M89:653-669 (1996))。为了研究Menl仏小鼠的垂体腺瘤是否 分泌PRL，在对照IgG和mAb G6-31处理的原位垂体腺瘤以及垂体肺 瘤移植物上使用抗PRL抗体进行免疫组织化学染色。对照IgG处理的 六个垂体腺瘤中的六个和mAb G6-31处理的五个垂体腺瘤中的五个在 大约50-95%的细胞中显示出对催乳素的特异的阳性的染色，证实它们 是催乳素瘤(图9A-9B)。与这一结果相一致，Crabtree等人报道 MenlTSM"垂体肿瘤在免疫组织化学染色中为PRL阳性(Crabtree等人， ZVoc. A^/. Sd 98:1118-1123 (2001))。在使用任一种处理的垂体&i 瘤移植物中催乳素染色也是阳性的(图9C、 9D)。与来自这些肿瘤的功 能性催乳素分泌相一致，在对照IgG和抗VEGF-A处理的动物中，带 有移植的垂体腺瘤的雌性小鼠中的乳房组织总是显示中度的至显著的 泌乳变化(图9E, F)。
如通过免疫组织化学染色估定的，11个未处理的原发垂体肺瘤中 的6个是局灶性并对生长激素弱阳性的(图14A)，而四个移植的垂体 肿瘤中只有一个显示局灶性的弱的染色(图14B)。 G6-31和对照IgG 处理的原位垂体肿瘤中都存在生长激素表达(图6C, D)。正常垂体前 叶在~20-30%的细胞中显示强反应性(图14A)。
未处理和对照IgG处理的小鼠中血清催乳素水平与垂体肿瘤体积 相关并被mAb G6-31处理降低
101考虑到通过免疫组织化学分析来自Menl"—小鼠的所;险查的所有对 照IgG和所有mAb G6-31处理的垂体腺瘤都是催乳素阳性的，我们研 究了血清PRL水平在Menl仏带有垂体腺瘤的小鼠中是否升高。为了这 一目的，我们最初对46只未处理的雌性Menl仏小鼠分析了它们的垂体 肿瘤状态和血清PRL水平以及五只雌性的野生型的同窝出生的对照的 血清PRL水平。在Harbor UCLA (Torrance, CA)通过美国激素和肽计 戈'j(National Hormone & Peptide Program)分一斤血清〗崔乳素的量。
这些小鼠中的年龄范围是15.6至10.5个月，平均年龄13.3个月。 野生型小鼠中的平均血清PRL水平是43.8±25.3(±SEM) ng/ml。 46只 Menl+z-小鼠中的二十七只在MRI分析中不具有可4企测的垂体肿瘤。这 些小鼠中的平均血清PRL水平是69.0±24.6 ng/ml。 一组十只小鼠具有 1.7±0.6 mm3的平均体积的小的垂体肿瘤。这些小鼠中血清PRL水平被 升高至188.7±61.9 ng/ml的平均值。具有大的垂体肿瘤(平均体积 83.1±23,8 mm3 )的九只小鼠具有平均13239.8±3466.5 ng/ml的血清PRL。 这些数据证实Menl+z-小鼠中血清PRL水平和垂体肿瘤体积之间具有皮 尔逊相关系数R=0.94的正相关性(图10A)，表明血清PRL水平作为 证实垂体肺瘤状态的评估中的诊断工具可能是有用的。
为了检查抗VEGF-A处理是否对血清PRL水平有影响，我们在研 究终点(第67天)时分析了七只对照IgG和七只mAbG6-31处理的具 有原位垂体腺瘤的Menl+/—小鼠的血清。在对照IgG处理的小鼠中，平 均血清PRL水平^皮升高至12566.7±3047.4 ng/ml并通常随着逐渐增加的 肿瘤体积(116.2±18.5 mm3的平均值)而增加，R=0.80 (p<0.03)。在所 分析的mAb G6-31处理的Menl+/—小鼠中，血清PRL水平j呆持较低，为 5163.7±1608.9 ng/ml, j旦是与肺瘤体积(平均肿瘤体积35.3土6.5 mm3) 没有明显的统计相关性，R=-0.12以及p〈0.80 (图10B)。但是，这些数 据表明与对照lgG处理的小鼠相比，mAb G6-31在抑制垂体腺瘤生长的 同时，它还导致平均血清PRL降低，p<0.053。
在具有皮下垂体肿瘤移植物的小鼠中抗VEGF-A处理降低血清 PRL水平
虽然上文的数据显示在带有肿瘤的Menl"-小鼠中抗VEGF-A抗体处理降低PRL的血清水平，我们在Balb/c棵小鼠中皮下垂体腺瘤移才直 物的情况下进一步对其研究。从来自23只对照IgG和35只mAb G6-31 处理的小鼠的在处理开始(第1天)和研究终点(第35天)时采集的 样品测量血清PRL。尽管两种处理之间第1天时的平均血清PRL是相 当的，但是第35天时mAbG6-31的处理已经显著降低了血清PRL水平 (图IOC和D，分别地)。
尽管MEN1催乳素瘤的现有的治疗包括药物治疗或随后为放射疗 法的选4奪性的垂体切除术，我们的数据表明mAb G6-31处理导致伴随 显著的肿瘤生长抑制的PRL血清水平降低，提供了对MEN1患者的可 能的新的治疗方法。
Menl+一小鼠中血清胰岛素水平升高
为检查Menl+/—小鼠中血清胰岛素水平是否升高，分析了来自用对 照IgG处理的六只非禁食的小鼠和用mAb G6-31处理的六只非禁食的 小鼠的血清样品，所述小鼠均在组织学分析中被鉴定为胰腺病变。还用 超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒依照制造商的i兌明书(Mercodia， Uppsala, Sweden)分析了来自五只非禁食的年龄匹配的野生型小鼠的 血清胰岛素水平。没有观察到与处理的相关性，但与野生型小鼠(1.4±0.7 ng/ml (±SEM))相比，Menl+/—小鼠中平均血清胰岛素被显著地升高了 (对 照IgG， 3.8±2.6 ng/ml; mAb G6-31 ， 3.7±2.4 ng/ml )。
讨论
我们的数据表明在MEN1的小鼠模型中良性垂体腺腺瘤的生长需 要VEGF-A,因为显示使用抗VEGF-A的单克隆抗体的疗法足以抑制肿 瘤生长。
基于可获得的文献，可能所观察到的mAb G6-31的大部分抗肿瘤 作用是由VEGFR-2依赖性血管生成的抑制介导的(Wise等人，Prac. A^/. Jca<i. 96:3071-3076 (1999)和Zachary等人，CaWz'owwc.
49:568-581 (2001))。尽管在大的垂体腺瘤中VEGFR-2 mRNA的相对平 均表达没有受到抗VEGF-A处理的显著影响(图6 ),但MECA-32的免 疫组织化学染色显示出用Mab G6-31处理的垂体胂瘤和胰腺肿瘤中血 管分布上的非常显著的下降(约50%的减少)。垂体腺瘤和胰腺腺瘤中都已注意到抗VEGF-A处理的肺瘤生长相应的减少。正常力夷岛中的血管 密度也被抗VEGF-A处理显著降低，尽管变化的幅度(对照IgG处理 的25%减少)小于在胰腺腺瘤中所见的。
Mab G6-31处理的肿瘤中所观察到的高水平的VEGF-A转录可能是 经由Mab G6-31的对VEGF-A的系统遮蔽的补偿机制的结果。然而， 似乎如此升高的VEGF-A不足以使肿瘤生长。
除了展示使用抗VEGF-A的mAb G6-31的处理的单一疗法通过有 效地抑制腺瘤生长显著降低了 Menl+/—小鼠的肿瘤负荷，我们还展示了 血清催乳素水平也被降低。因此，我们的数据表明了内分泌的良性肿瘤
地，这种VEGF-A阻断可与药理剂组合。例如，对于分泌催乳素的A泉瘤， 可将VEGF-A拮抗剂与多巴胺激动剂组合。
实施例3.在多期癌发生的RIP-T^Ag模型中抗VEGF干预效力和退化 /生存效力
为了更好的理解在肿瘤生长的不同时期抗VEGF疗法的作用，我们 借助于i午多临床前的肿瘤才莫型，包括RIP-T/5Ag。 RIP-T/3Ag (Exelixis, Inc.)是由SV40大T抗原(TAg )(靶向胰腺的/5细胞，其中TAg通过 结合p53和Rb起强效致癌基因的作用)的转基因表达所产生(driven) 的小鼠胰岛肿瘤模型的有条件的形式。RIP-Tj8Ag与之前已描述过的 RIP-TAg模型(Hanahan， Atoww 315:115-122 (1985); Bergers等人， Science 284 (808-811)， 1999 )表型上是相似的。我们已经发现这一模型 发展经过一系列越来越攻击性的时期，包括在大约5周时VEGF信号转 导的活化和"血管生成开关，，(即形成新血管的过程的开始)。到IO周时 小肿瘤形成，与其恶性转化的开始一致。到12周时大的扩散性的癌形 成。因此，在十周大之前，小鼠中的细胞生长被认为不是恶性或转移性 的。10-12周大之间的时间段通常包括扩散性的癌的形成。
为了这些实验，按照标准的IACUC推荐圈养并处理RIP-Ti8Ag小 鼠，以5%的蔗糖水对小鼠提供高糖的食物以緩解由胰腺中分泌胰岛素 的/3细胞增多导致的血胰岛素过多的症状。在9-9.5或11-12周大时，用溶于灭菌的磷酸盐緩冲盐水中的5 mg/kg的抗VEGF抗体或同种型匹 配的抗豚草对照单克隆抗体的腹膜内注射每周两次处理小鼠。在"干预 实验"中，将9-9.5周大的小鼠处理14天然后^r查。在"退化实验"中， 将11-12周大的小鼠在处理7、 14和21天后检查。为检查生存期，将 另一组小鼠处理直到小鼠表现出发病或死亡。在干预和退化实验中的每 个确定的时间点，将每只小鼠的胰腺和脾取出并拍照。通过解剖出每个 球型肺瘤并计数而确定胰腺中的肿瘤数目。确定肿瘤负荷并测量每个肿 瘤的两个最大的直径并使用球体体积计算结果(x2乘以y)乘0.52来 计算体积。将小鼠胰腺中所有肺瘤的体积相加以确定总体的月中瘤负荷。 计算平均值和标准偏差，并使用Microsoft Excel的vll.3.3 (Microsoft, Inc.)将数据作图。使用Student's t检验进行来自不同组的肿瘤数目和负 荷间的统计学比较。使用JMP 6.0 (SAS Institute, Inc.)生成生存期分析 的Kaplan-Meier曲线并使用时序分析进行统计学比较。
使用抗VEGF抗体的9周大的动物的处理("干预"实验)产生肿瘤 血管生成上的显著减少(图11)。 ll周大的动物的处理("退化实验") 产生肿瘤血管分布和增殖的降低(图12A)。但是与干预实验不同，只 检测到肿瘤生长的短暂的减少并且对生存期没有影响(图12B)。这些 研究证明与晚期肿瘤相比这些早期肿瘤对以抗VEGF为目的的治疗剂 更敏感。
实施例4.抗VEGF和化学疗法在临床前模型中是有效的
手术可能留下残留的肿瘤细胞或休眠的微转移的结节，其具有重新 活化"血管生成程序，，并促进更加指数级的肿瘤生长的潜力。
我们已经通过^f吏用强效的化学疗法方案与抗VEGF疗法并4亍或顺 序地"细胞减少(cytoreduce)"肿瘤以及随后使用抗VEGF单克隆抗体 的维持疗法，用小鼠遗传性肿瘤和人类异种移植物以模仿肿瘤休眠。因 此，我们处理小鼠以预防肿瘤的复发，而不是在肿瘤形成或再形成为(包 括，在某些情况中)难治疗的、复发的或对更多的包括靶向抗VEGF 疗法的处理有抗性的肿瘤后追击(chasing)紳瘤。图13显示多西紫杉 醇在减少肿瘤负荷上十分有效，然而在大约2个月后休眠细胞再生长的观察结果。然而与抗VEGF同时发生的治疗抑制肿瘤再生长，即使它们
单独时对较大的更加建成的肿瘤的生长几乎没有影响。其它的数据表明
瘤的再生长。这些结果表明抗VEGF可被用于有效地阻断休眠胂瘤或微 转移的生长或再生长。这些发现与新血管形成是与肉眼可见的肺瘤的形 成相关的迅速的克隆扩增的先决条件的事实相符，并支持了 VEGF特异 性拮抗剂(例如抗VEGF抗体，包括但不限于G6或B20系列抗体)在 肺瘤最初的治疗后和新肿瘤形成，休眠肿瘤、恶性肿瘤或微转移的重新 活化之前在肿瘤Y木眠的维持和肿瘤再生长的抑制中的应用。
实施例5.使用贝伐单抗的新辅助疗法
这 一 实施例示例性说明了在患有可触知并可手术的乳腺癌的患者 的新辅助疗法中贝伐单抗的使用。
新辅助化学疗法已被广泛用于局部的晚期的或可能可手术的大的 孝L腺癌的治疗中。随机的实验已经证明新辅助化学疗法以与辅助化学疗 法相似的总体存活率减少了对乳房切除术的需要(由此保留乳房)。 Powles等人，,C//". O腳Z. 13:547-52 (1995); Fisher等人，丄C//". 16:2672-85 (1998)。
目前的疗法的最主要的目的是通过在患有可触知并可手术的乳腺 癌的患者中向化学疗法增加贝伐单抗来提供改善的临床益处。特别地， 新辅助疗法的临床效力的最主要的量度之一可以是病理完全缓解 (pathologic complete response, pCR )率。其他的量度包括总体緩解率 (OR)、临床完全緩解率(cCR)、无病生存期(DFS)或总体生存期(OS)。 此外，可通过例如手术并发症比率、毒性和对心脏功能的副作用来监测 治疗的副作用。某些基因表达或其他的生物标记活性也可被用作对治疗 的响应的才示i己。
病理完全缓解(pCR)已被用作治疗效力的预后标记。pCR是指新 辅助疗法后在手术时没有残留的肿瘤的组织学证据。研究已经表明达到 pCR的患者具有显著改善的生存期。但是没有标准的方法将病理緩解分 级并且pCR是否可被用作效力的替代标记仍然有争议。基于预定的标准和指导方针选择适于使用VEGF特异性拮抗剂的
新辅助疗法的患者，所述标准和指导方针取决于治疗下的特定的癌类型 而变化。例如，可基于患者的预期寿命、年龄、癌的组织学、血液学/ 肝和心脏功能，治疗史、生育状况和计划以及精神病学或成瘾状况来选 择患者。更重要的是，原发肿瘤应是可测量的和或可手术的。
治疗方案包括化学疗法加上VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗。任 选地，其他的治疗剂也可被用于所述方案。通常， 一般用于特定的癌类 型的化学疗法方案(如标准疗法方案)与贝伐单抗组合使用。例如，为 了新辅助治疗乳腺癌，可将多西紫杉醇、紫杉醇或阿霉素/环磷酰胺(AC ) 方案与贝伐单抗组合使用。可选择地，可将基于多西紫杉醇或基于紫杉 醇的方案和AC方案作为与贝伐单抗组合的化学疗法顺序使用。为了治 疗非小细胞肺癌，可将顺柏(单独或与其他化学剂例如吉西他滨、多西 紫杉醇或长春瑞滨组合)作为与贝伐单抗组合的主要化学剂使用。另一 方面，为治疗结肠直肠癌，可将基于5-FU的方案(例如FOLFOX)与 贝伐单抗组合使用。
可对患者以给定的剂量和间隔施用化学治疗剂和VEGF特异性拮 抗剂例如贝伐单抗许多个周期。例如，可将贝伐单抗以每三周15mg/kg 提供4个周期，或每两周10 mg/kg提供6个周期。在另一个实例中， 以7.5 mg/kg每两周或三周一次施用VEGF特异性拮抗剂例如贝伐单抗。 在治疗期间监测患者的响应。当新辅助疗法完成时，患者经历手术以去 除原发肺瘤，所述肿瘤是在新辅助疗法前可手术的或响应于新辅助疗法 变得可手术的。手术之后，使患者继续VEGF特异性拮抗剂疗法例如贝 伐单抗，与或不与化学疗法一起(取决于患者的特定状况)。任选地，
患者也可经受放射疗法。在治疗和治疗后的整个期间监测患者的进展。 与抗VEGF治疗相关的不良事件(AE )还应当被密切检测并控制。 从之前的研究已知的主要的AE包括高血压、蛋白尿、出血、血栓栓塞 事件、胃肠穿孔/瘘以及伤口愈合并发症。可用药物控制某些AE例如高 血压。如果AE是严重并不可控制的，则治疗应中断。
实施例6.使用贝伐单抗的辅助疗法200780051482.1
说明书第102/103页
这一 实施例示例性的说明了在患有切除的癌的患者的辅助治疗中 与化学疗法组合的贝伐单抗的使用。
基于预定的标准和指导方针选择适于使用贝伐单抗的辅助疗法的 患者，所述标准和指导方针取决于治疗下的特定的癌类型而变化。例如， 可基于患者的预期寿命、年龄、癌的组织学、血液学/肝和心脏功能、 生活方式史、治疗史、生育状况和计划以及精神病学或成瘾状况来选择 患者。更重要的是，在辅助治疗之前患者必须经历了他们的癌的完全切 除。所接受的切除的类型取决于特定的肺瘤类型。同样，为了初始时期 的分析和效力测定，代表患者的癌的足够的病理学材料应当是可得的。 在治疗时，手术应当是非常接近的，但患者必须从手术中充分的复原。
例如，患者必须在手术后不少于3-6周并不多于8-12周时开始辅助治疗。
治疗方案包括化学疗法加上贝伐单抗。任选地，其他的治疗剂也可 被用于所述方案。通常在治疗的第 一 阶段期间使用与贝伐单抗组合的化 学治疗剂，之后是贝伐单抗作为单一剂的剩余阶段的维持治疗。例如，
用化学治疗剂和贝伐单抗治疗患者约4-12个周期，之后单独用贝伐单 抗治疗达1至2年。化学治疗剂+贝伐单抗的治疗的每个周期的持续时 间取决于所使用的特定的剂和剂量。例如，可每三周为一个周期以15 mg/kg提供贝伐单抗，或每两周为一个周期以5 mg/kg提供贝伐单抗。 在另一个实例中，每两周或每三周以7.5mg/kg或10mg/kg提供贝伐单 抗。
将通常用于特定癌类型的化学疗法方案(例如标准疗法方案)与贝 伐单抗组合使用。例如，对于乳腺癌的辅助疗法，可将多西紫杉醇、紫 杉醇或阿霉素/环磷酰胺(AC)方案与贝伐单抗组合使用。可选择地， 可将基于多西紫杉醇或基于紫杉醇的方案和AC方案作为与贝伐单抗组 合的化学疗法顺序使用。为了治疗非小细胞肺癌，可将顺铂(单独或与 其他化学剂例如吉西他滨、多西紫杉醇或长春瑞滨组合)作为与贝伐单 抗組合的主要化学剂使用。另一方面，为治疗结肠直肠癌，可将基于 5-FU的方案(例如FOLFOX )与贝伐单抗组合使用。
使用贝伐单抗的辅助治疗的目的是改善患者的生存期，优选地无病生存期。同时，尤其是由于辅助治疗是长期的，因此与贝伐单抗有关的
任何不良事件都应一皮密切监测。可通过Kaplan-Meier法评估生存期，并 使用分层的时序检验计算生存期上的任何差异。使用Cox比例风险模型 的多变量分析被用来估计预后因素对生存期的同时的作用。用Cox比例 风险模型检查与预后因素的相互作用。SAS统计学软件包用于所有的计 算。当P值为0.05或更小时数据被认为是统计学上显著的。所有统计 学才企验都是双侧的。
与抗VEGF治疗相关的不良事件(AE)应当^^皮密切监测并控制。 从之前的研究已知的主要的AE包括高血压、蛋白尿、出血、血栓栓塞 事件、胃肠穿孑L/瘘以及伤口愈合并发症。可用药物控制某些AE例如高 血压。如果AE是严重并不可控制的，则治疗应中断。
其他实施方案
从之前的描述中，明显的是可对本文描述的发明做出变化和修改以 使它适合(adopt)各种用途和条件。这些实施方案也在下列权利要求 的范围内。
在本说明书中提及的所有出版物、专利申请和专利，包括美国临时 申请第60/870,741号(2006年12月19日提交)；第60/870,745号(2006 年12月19日提交)；第60/877,267号(2006年12月27日提交)；第 60/919,638号(2007年3月22日提交);第60/958,384号(2007年7 月5日提交)和第60/989,397号(2007年11月20日提交)，都通过引 用并入本文，其引用程度就如同指出将每一个独立的出版物、专利或专 利申请明确且单独地通过引用并入。
权利要求
1.一种治疗受治疗者中良性的、癌前的或非转移性的癌的方法，其包括对所述受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述VEGF特异性拮抗剂的所述施用预防所述良性的、癌前的或非转移性的癌变成扩散性或转移性的癌。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述良性的、癌前的或非转移性的癌是0期、I期或II期癌。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述VEGF特异性拮抗剂的所述施用预防所述良性的、癌前的或非转移性的癌向III期或IV期癌发展。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述VEGF特异性拮抗剂的所述施用减小肺瘤大小。
6. —种治疗具有癌、息肉或遗传性癌综合征的家族史的受治疗者的方法，其包括对所述受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂以预防所述受治疗者中良性的、癌前的或非转移性的癌的发生或复发。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述方法预防从未患有临床上可检测的癌的受治疗者或仅患有良性癌的受治疗者中所述良性的、癌前的或非转移性的癌的发生或复发。
8. —种在具有不可切除的肿瘤的受治疗者中减小肺瘤大小的方法，其包括对所述受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂，其中所述VEGF特异性拮抗剂的所述施用减小所述肿瘤大小由此允许所述肿瘤的完全切除。
9. 根据权利要求8所述的方法，其进一步包括在完全切除所述肺瘤后对所述受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂的步骤。
10. —种治疗患有可手术的癌的受治疗者的方法，其包括在手术之前对所述受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂和进行手术借以切除所述癌。
11. 根据权利要求10所述的方法，其进一步包括在手术后对所述受治疗者施用有效量的VEGF特异性拮抗剂以预防所述癌的复发的步骤。
12. 根据权利要求9或11所述的方法，其中所述VEGF特异性拮抗剂的所述施用预防微转移的增殖。
13. —种在患有可手术的癌的受治疗者中进行新辅助疗法的方法，其包括对所述受治疗者施用VEGF特异性拮抗剂。
14. 一种预防受治疗者中癌的复发的方法，其包括对所述受治疗者施用VEGF特异性拮抗剂，其中所述施用预防所述受治疗者中的癌复发。
15. —种减小受治疗者中癌复发的可能性的方法，其包括对所述受治疗者施用VEGF特异性拮抗剂，其中所述施用减小所述受治疗者中癌复发的可能性。
16. 根据权利要求14或15所述的方法，其中所述VEGF特异性拮抗剂的所述施用阻止或减小临床上可检测的肿瘤或其转移的发生的可能性。
17. 根据权利要求14或15中的任何一项所述的方法，其中所述受治疗者在施用VEGF特异性拮抗剂的所述步骤前已经经受确定性手术。
18. 才艮据权利要求1、 6、 8、 10、 13、 14、 15或17中的任何一项所述的方法，其中所述VEGF特异性拮抗剂是单一疗法。
19. 根据权利要求1、 6、 8、 10、 13、 14、 15、 17或18中的任何一项所述的方法，其中之前已经用抗癌疗法治疗所述受治疗者。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述抗癌疗法包括抗血管生成疗法。
21. —种预防受治疗者中肺瘤再生长的方法，其包括去除所述肿瘤并且之后对所述受治疗者施用VEGF特异性拮抗剂的步骤。
22. —种预防具有肿瘤的受治疗者中癌的复发的方法，其包括去除所述肿瘤并且之后对所述受治疗者施用VEGF特异性拮抗剂的步骤。
23. 根据权利要求21或22所述的方法，其进一步包括在所述肿瘤的去除和施用所述VEGF特异性拮抗剂之间的一段时间，其中所述一段时间大于2周。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述一段时间大于两周并小于l年。
25. 根据权利要求21或22所述的方法，其进一步包括在所述肿瘤的去除和施用所述VEGF特异性拮抗剂之间的一段时间，其中所述一段时间是28天。
26. 根据权利要求21或22所述的方法，其进一步包括在所述肿瘤的去除和施用所述VEGF特异性拮抗剂之间的一段时间，其中所述一段时间足以使手术切口充分愈合或减少伤口裂开的风险。
27. 根据权利要求21或22所述的方法，其中所述VEGF特异性拮抗剂是单一疗法。
28. 才艮据权利要求1、 6、 8、 10、 13、 14、 15、 18或22中的4壬何一项所述的方法，其进一步包括监测所述受治疗者的所述癌的复发。
29. 根据权利要求1、 6、 8、 10、 13、 14、 15、 18、 21或22中的任何一项所述的方法，其中所述癌或肿瘤是胃肠、结肠直肠、乳腺、卵巢、肺或肾的癌或肿瘤。
30. 根据权利要求l、 6、 8、 10、 13、 14、 15、 18、 21或22中的任何一项所述的方法，其进一步包括施用其它的抗癌疗法。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述其它的抗癌疗法是化学疗法。
32. 根据权利要求l、 6、 8、 10、 13、 14、 15、 18、 21或22中的任何一项所述的方法，其中所述VEGF特异性拮抗剂选自由与VEGF特异性结合的多肽、核酶、肽体、反义核碱基寡聚体、小RNA分子和适体所组成的组。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述与VEGF特异性结合的多肽是可溶的VEGF受体蛋白或其VEGF结合片段或者嵌合的VEGF受体蛋白。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述嵌合的VEGF受体蛋白是Flt画l/Fc、 KDR/Fc或Flt/KDR/Fc。
35. 根据权利要求32所述的方法，其中所述与VEGF特异性结合的多肽是抗VEGF抗体或其抗原结合片段。
36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述抗VEGF抗体是单克隆抗体。
37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述单克隆抗体是嵌合的、人源化的或完全人类抗体。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述单克隆抗体是贝伐单抗。
全文摘要
本文公开了使用抗VEGF特异性拮抗剂治疗良性的、癌前的或非转移性的肿瘤的方法。还公开了使用抗VEGF特异性拮抗剂治疗处于发展良性的、癌前的或非转移性的肿瘤风险的受治疗者的方法。还公开了使用抗VEGF特异性拮抗剂治疗或预防肿瘤复发的方法以及VEGF特异性拮抗剂在新辅助和辅助癌疗法中的应用。
文档编号A61K38/17GK101646450SQ200780051482
公开日2010年2月10日 申请日期2007年12月18日 优先权日2006年12月19日
发明者尼娜·克斯萨里, 纳波利昂·费雷拉, 罗伯特·D·麦斯 申请人:基因技术公司