专利名称：：臭牡丹提取物及其用于治疗气道高反应性疾病的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种天然植物提取物的医药用途，特别涉及臭牡丹提取物及其用于治疗气道高反应性疾病的用途。
背景技术：
：气道高反应是一种常见的临床表现，主要见于支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、病毒性上呼吸道感染等急慢性呼吸道疾病。现一般认为气道高反应的发病机制是气道炎症，故药物治疗手段主要是从抗炎和对症治疗两个方向进行防治。目前常用的治疗气道高反应的药物有抗炎药物和支气管扩张剂两类，抗炎药物中较肯定的有两类皮质类固醇及色甘酸钠尼多酸钠，其中吸入性的皮质类固醇已成为治疗哮喘的一线药物；支气管扩张剂中常用的有氨茶碱、喘定。虽然这些药物可以治疗或缓解气道高反应，但不能解决病情反复发作和阻断气道结构重塑与肺功能衰退进程等问题。同时，这些药物对人体有着不同程度的副作用，且患者对这些药物的耐受性逐年增加。因此，从天然植物中分离出具有对抗气道炎症与降低气道高反应，且毒副作用小的药物成分，将有利于该类疾病的临床治疗，具有较大的社会效益。臭牡丹，学名C7eracfem/r腦6w"gez'5te"英文名ioseG/o^Zjower,科名马鞭草科K^&m^e^小灌木，广泛分布于华北、华南、西北及西南各省，生于山坡、林缘或沟旁。其作为药用植物，早已被各民族广泛使用并积累其丰富的药用经验，在传统医学中用于治疗痈疽，疔疮，乳腺炎，关节炎，湿疹，头痛，牙痛等症。但目前关于其活性成分的研究非常少，且均未涉及气道炎症或气道高反应疾病。
发明内容本发明的目的在于从臭牡丹中提取出三萜类提取物，并研究得到该提取物能用于治疗气道炎症或气道高反应疾病有显著疗效。本发明的另一目的在于制备出含有臭牡丹三萜类提取物的各种药学可接受形式的各种药物制剂。本发明通过下述方法从臭牡丹中提取出三萜类提取物将臭牡丹全株剪碎后加50wt。/。乙醇，置于82i:水浴锅内加热回流，提取回流液，浓縮蒸干，加双蒸水搅拌成混悬液，然后用石油醚萃取，分离弃去萃取液后再用氯仿萃取，回收氯仿萃取液，浓縮蒸干，得到占臭牡丹原药0.7%左右重量比的三砲类提取物。发明人进一步研究证实，臭牡丹中三萜类化合物可以减轻臭氧攻击所造成气道与肺泡病理改变、炎症反应及气道高反应，其效应接近糖皮质激素，有非常明显的降低气道高反应和减轻臭氧应激引起的气道与肺损伤的功能，是治疗气道高反应性疾病的有效部位，且未观察到臭牡丹总提物对外周血白细胞及肝肾毒性，安全性好。按药剂学方法，将本发明臭牡丹提取物中的三萜类化合物制备成临床药学上可接受的多种药物剂型作为治疗气道高反应性疾病的药剂，所说的药剂包括目前任何一种药剂学上所说的剂型，包括口服制剂中气雾剂、口服液、片剂、颗粒剂、微丸剂、胶囊剂中的任何一种。图l:臭牡丹三萜类提取物小鼠气道反应性曲线图(n=8);P<0.05vs正常对照组#PO.05vs模型组图2:臭牡丹三萜类提取物小鼠乳酸脱氢酶(LDH)活性条形图(n=8);PO.05vs正常对照组弁P<0.05vs模型组图3:各实验组小鼠肺脏病理切片图(HEX100);图4:各实验组小鼠肺脏病理切片图(HEX400);图5:各实验组小鼠肝病理切片图(HEX400)。具体实施例方式实施例l:臭牡丹三萜类提取物的分离制备野生臭牡丹全株，洗净、晾干，称取100克，剪碎后加入2L圆底烧瓶中，加50%乙醇1L;将圆底烧瓶置于82'C水浴锅内加热回流提取4小时，回收回流液。然后再加lL50。/。乙醇，重复上述操作一次。然后合并提取液，倒入烧杯中浓縮蒸干；再加双蒸水200ml，搅拌成混悬液；然后用200ml石油醚萃取二次，分离弃去萃取液后再用氯仿200ml分二次萃取，回收氯仿萃取液。从氯仿萃取液中取O.lml做其成分的预试检查，其余的浓縮蒸干，浓縮物称重，约为0.7克。然后将浓縮物做成乳化剂，方法如下将浓縮物置于烧杯中，加植物油1.5克，置于75'C水浴锅中，不断搅拌使其充分熔化待用。另取一干净烧杯，加阿拉伯胶0.375克，加双蒸水5ml，置于95'C水浴锅中，搅拌20分钟，然后冷却至70'C待用。然后把油相和水相两者混合起来，用乳钵研磨至无大颗粒状态，然后再加双蒸水调至总体积为25ml，然后再用超声波粉碎5min。然后置于密封的玻璃瓶中冷藏待用。药物成分的预试检查利用硅胶薄层板进行提取物的化学成分预试检查。用毛细吸管吸少量上述提取物分别点样于三块硅胶薄层板然后在第一块薄层板上喷洒香草醛-浓硫酸；在第二块薄层板上喷洒1%三氯化铁；在第三块薄层板上喷洒碘化铋钾，观察颜色变化。提取物的鉴定结果见表l:表l:对提取物作薄层硅胶预试检査的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>薄层硅胶预试检査是一种定性检验天然药物中成分的方法，其主要原理是通过一些化学反应引起的颜色变化来鉴定药物的某一类别的存在。三萜类物质经氯仿萃取后在香草醛-浓硫酸的作用下，生成橙色到蓝色物质，其颜色深浅与三萜含量成正比，酚类物质能够与1%三氯化铁反应变成蓝、暗绿或蓝紫色，生物碱能够与碘化铋钾反应而呈现桔红色或黄色。本实验所得提取物只可与香草醛-浓硫酸发生反应变成深蓝色，说明含有大量的三萜类物质，无酚类和生物碱。实施例2:臭牡丹三萜类提取物对小鼠气道高反应模型的作用1.动物分组及处理昆明小鼠50只，随机分成5组。给药方式为灌胃，灌胃量为lml/100g体重。①正常对照组每天用生理盐水灌胃一次，连续7天；②臭牡丹三萜类对照组组每天用臭牡丹三萜类提取物乳化剂灌胃一次，连续7天；③气道高反应模型组每天晚上用生理盐水灌胃，连续7天，灌胃第三天开始每天下午用臭氧攻击20分钟，连续5天；④激素治疗组(阳性对照)每天晚上用0.5mg/ml的糖皮质激素灌胃，连续7天，灌胃第三天开始每天下午用臭氧攻击20分钟，连续5天；⑤臭牡丹三萜类治疗组每天晚上用臭牡丹三萜类提取物乳化剂灌胃一次，连续7天，灌胃第三天开始每天下午用臭氧攻击20分钟，连续5天。2.观察指标①气道阻力(Buxco小动物肺功能检测系统)水合氯醛麻醉小鼠(剂量为0.3ml/100g)，然后切开小鼠气管，插管后连接Buxco小动物肺功能检测系统，测量小鼠在基础状态下的气道阻力；然后依次用0.39mg/ml，0.78mg/ml，1.56mg/ml和3.12mg/ml的乙酰甲胆碱(Mch)激发，测量小鼠在这四种不同激发状态下的气道阻力，分别除以该只小鼠在基础状态下的气道阻力值所得相对值即为气道阻力比值。以乙酰甲胆碱激发浓度为横坐标，气道阻力比值为纵坐标，绘制小鼠气道反应性曲线。曲线的升高幅度越大，表示小鼠对Mch的反应越明显，气道反应性越高。结果如附图1(n=8)所示，模型组呈现明显的气道高反应，臭牡丹三萜类提取物具有与激素类似的降低臭氧应激所导致的气道高反应的作用。臭牡丹三萜类提取物单独作用对小鼠气道反应性无影响。②支气管肺灌洗液(BALF)中的白细胞计数与分类开胸结扎一侧肺并切取后用4%多聚甲醛保存，另一侧肺用PBS液灌洗后保存灌洗液。灌洗方法是先用塑料管插入小鼠气道内，用缝合线扎紧，然后用lml注射器抽取0.5ml的PBS，缓慢注入小鼠一侧支气管肺内，然后缓慢回抽，反复三次，回收灌洗液。用1500r/min的转速离心支气管肺灌洗液，离心5min，取上清液测定乳酸脱氢酶(LDH)含量，测量方法参照乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书；沉淀物加500ul的白细胞计数液混匀，用计数板计数白细胞数量；然后再离心(1500r/minX5min)，取沉淀物做细胞涂片，瑞-吉染色液染色，分类计数。各实验组白细胞计数参见附图3。表l:各组小鼠中BALF的白细胞数及其分类计数(xl06/Lx±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>n=8,代O.05vs正常对照组#代0.05vs模型组结果提示模型组臭氧攻击可致支气管肺泡灌洗液中白细胞总数以及淋巴细胞、粒细胞数量增多，臭牡丹三萜类提取物单独作用与正常对照组无差异，但可以降低臭氧攻击下白细胞总数以及淋巴细胞、粒细胞数量，呈现抑制气道炎症的作用，其效应与激素治疗组相近。③支气管肺灌洗液(BALF)中的乳酸脱氢酶(LDH)活性测定乳酸脱氢酶是体内能量代谢过程中的一个重要的酶。此酶几乎存在于所有组织中。当少量组织坏死时，该酶即释放血而使测定的活力升高。从附图2显示:模型组臭氧攻击可致支气管肺泡灌洗液中LDH活性增高，反映细胞破坏增加，三萜类提取物可降低LDH活性，间接提示其细胞保护作用。对各组实验小鼠的肺脏作病理切片并染色，观察气道与肺组织的病变程度，各组病理切片见附图3(HExlOO)和附图4(HEx400)。其中图3-A为正常对照组，切片显示气道上皮结构完整，肺泡结构正常，无炎症改变；图3_B为臭牡丹三萜类提取物对照组，切片显示气道上皮结构完整，肺泡结构正常，气道壁有轻微炎症改变；图3-C为气道高反应模型组，切片显示气道上皮脱落，气道内有粘液分泌，肺泡结构呈实变，有大量炎症细胞渗出；图3_D为臭牡丹三萜类提取物治疗组，切片显示气道上皮结构完整，大部分肺泡结构正常，小部分有充血，气道壁有轻微炎症改变；图3-E为激素治疗组，切片显示气道上皮结构完整，大部分肺泡结构正常，小部分在水肿，气道壁有轻微炎症改变。附图4为高倍镜下图象，图4-A为正常对照组，切片显示气道上皮结构完整，肺泡结构正常，无炎症改变；图4-B为气道高反应模型组，切片显示气道上皮脱落，气道壁有大量淋巴细胞渗出，肺泡水肿、充血；图4-C为提取物三萜类治疗组，切片显示气道上皮结构完整，肺泡结构正常，无炎症改变；由附图3和附图4可以看出臭牡丹三萜类提取物能够减轻臭氧攻击所造成气道与肺泡病理改变，减轻炎症反应。⑤外周血中的白细胞计数对各组小鼠外周血中的白细胞进行计数，结果显示臭牡丹提取物对外周血白细胞总数无明显改变，未发现提取液有白细胞抑制的全身性毒副作用。◎肝、肾组织的病理切片对各实验组小鼠的肝、肾组织作病理切片。肝病理切片显微图见附图5:图5-A为气道高反应模型组，切片显示结构正常，无炎症改变；图5-B为臭牡丹总提物治疗组，切片显示结构正常，无炎症改变；图5-C为激素治疗组，切片显示结构正常，无炎症改变；肝、肾病理切片均未发现臭牡丹提取液对肝、肾组织有明显的毒性作用。实施例3:含臭牡丹三萜类提取物的药物制剂的制备取实施例1中的臭牡丹三萜类提取物，按本领域己知的常规方法制备各种药学上可接受的各种形式的药物组合物颗粒剂分别取臭牡丹三萜类提取物，经微晶纤维素、淀粉固化后混合均匀，以羟丙甲纤维素为粘合剂湿法制粒，将颗粒80摄氏度烘干，即得含臭牡丹三萜类提取物的颗粒剂。微丸剂取臭牡丹三萜类提取物，分别经微晶纤维素、淀粉固化后与辅料混和均匀，以羟丙甲纤维素为粘合剂，以空白丸核为底物制备得到直径在0.51.4之间的微丸。胶囊剂取臭牡丹三萜类提取物，分别经微晶纤维素、淀粉固化后混合均匀，干燥、粉碎、过筛后装入软胶囊，即得臭牡丹三萜类化合物胶囊剂。气雾剂取臭牡丹三萜类提取物，分别与生理盐水及其他公知的气雾制剂添加剂混和，得臭牡丹三萜类化合物气雾剂。片剂取臭牡丹三萜类提取物，处方量的臭牡丹三萜类提取物，与公知的片剂制剂辅料混和均匀，湿法制粒后压片。上述各种制剂用于治疗人气道高反应性疾病治疗时，给药量为包含28005600mg有效成分每天。权利要求1.一种臭牡丹提取物，其特征在于由下述方法制备臭牡丹全株剪碎后加50％乙醇，置于82℃水浴锅内加热回流，提取回流液，浓缩蒸干；加水搅拌成混悬液，然后用石油醚萃取，分离弃去萃取液后再用氯仿萃取，回收氯仿萃取液，浓缩蒸干，得到约占臭牡丹原药0.7％左右重量比的三萜类提取物。2.如权利要求1所述的臭牡丹三萜类提取物在制备治疗气道高反应性疾病药物中的用途。3.药物组合物，其中含如权利要求1所述的臭牡丹三萜类提取物作为有效成分，并含有常规药用载体。全文摘要一种臭牡丹提取物及其用于治疗气道高反应性疾病的用途，由臭牡丹全株提取得到约占臭牡丹原药0.7％左右重量比的三萜类提取物，并研究证实臭牡丹中三萜类化合物可以减轻气道与肺泡病理改变、炎症反应及气道高反应，其效应接近糖皮质激素，有非常明显的降低气道高反应和减轻臭氧应激引起的气道与肺损伤的功能，是治疗气道高反应性疾病的有效部位，且未观察到臭牡丹总提物对外周血白细胞及肝肾毒性，安全性好。文档编号A61K36/185GK101301403SQ200810031698公开日2008年11月12日申请日期2008年7月8日优先权日2008年7月8日发明者阳向,秦晓群,政邓申请人:中南大学