专利名称：：葛根、山楂和红花黄酮类成分的提取纯化工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药复方的提取方法，具体涉及复方脑得生方中葛根、山楂和红花的提取方法及其提取物。
背景技术：
：复方脑得生收载于《中国药典》2005版一部，由三七、川芎、红花、葛根、山楂组成。治疗脑动脉硬化、缺血性脑中风及脑出血后遗症等病症有显著疗效。现代药理研究表明，葛根总黄酮具有扩张脑血管，解除脑血管痉挛，改善脑循环，增加脑血流量的作用。山楂的主要有效成分为黄酮类化合物，具有降血压、增加冠脉流量、强心、降血脂等作用。红花总黄酮具有扩张冠状动脉、改善心肌缺血、降低血压、抗脑缺血、保护祌经细胞及抑制血小板活化、缓解血栓形成、减轻血液循环障碍等作用。因此，开发研究复方脑得生方中葛根、山楂和红花三味药总黄酮提取物具有重要的意义。目前脑得生制剂多为片剂、蜜丸剂、颗粒剂、胶囊剂。以上各制剂中葛根、山楂、红花全部或部分以生药粉入药，以致服用剂量较大，质量可控性，不符合中药现代药化的要求。本研究采用正交实验设计法对葛根、山楂和红花三味药的总黄酮提取纯化作了全面系统的研究。内容具有较强的实用价值。
发明内容本发明的目的在于提供了一种复方脑得生方中葛根、山楂和红花的总黄酮有效部位的提取、纯化和提取物的干燥方法。本发明的又一目的在于提供采用上述方法获得的葛根、山楂和红花总黄酮提取物。本发明所述复方脑得生方中葛根、山楂和红花三味中药质量比例为葛根261份山楂(去核)157份红花91份。本发明的一种葛根、山楂和红花的提取纯化方法包括葛根、山楂和红花乙醇提取液浓縮后，过大孔树脂柱，水洗，再用乙醇洗脱，浓縮乙醇洗脱液，喷雾干燥。具体提取纯化步骤如下1)、取复方脑得生方中葛根、山楂和红花饮片，加浓度60-80%的乙醇回流提取三次，第一次加药材质量10倍量的乙醇提取2小时，第二次加8倍量的乙醇提取1小时，第三次加6倍量的乙醇提取1小时，合并3次提取液，减压回收乙醇，浓缩到无乙醇味，得提取浓縮液；2)、将步骤l)得到的提取浓缩液加水至每毫升含生药O.1克，过滤，得滤液；3)、将步骤2)得到的滤液过D-101大孔树脂柱进行吸附、用水洗和乙醇洗脱，吸附、水洗和乙醇洗脱工艺条件为吸附液流速为l一3倍柱体积/小时，吸附液量为4一5倍柱体积；水洗速率为3倍柱体积/小时，水洗体积为4一6倍柱体积；洗脱用乙醇的浓度为30-60%，流速为l一3倍柱体积/小时，用量为2—6倍柱体积；4)、收集乙醇洗脱液，浓縮至密度为1.05—1.10克/毫升，喷雾干燥，得到葛根、山楂和红花的提取物产品，提取物中总黄酮质量含量为78.1%。收集干燥的提取物产品，封口，放冷，称重，置干燥处保存。上述提取纯化优选条件所述步骤l)中加浓度70%的乙醇回流提取三次。所述步骤3)中吸附流速为1倍柱体积/小时，吸附量为3.5倍柱体积；水洗速率为3倍柱体积/小时，水洗体积为5倍柱体积；洗脱用乙醇的浓度为40%，流速为3倍柱体积/小时，用量为5倍柱体积。所述步骤4)中喷雾干燥条件为喷雾干燥器进风口温度为170°C，出风口温度为85°C，雾化盘转速为20000转/分钟。本发明中所述乙醇浓度％是指100体积乙醇水溶液中含乙醇体积分数。发明与现有技术相比，具有如下优点-1、有效成分转移率高且提取物总黄酮纯度高。对脑得生中葛根、山楂和红花三味药乙醇回流提取再过大孔树脂，除去了大量水溶性杂质，纯化得到的总黄酮有效部位，总黄酮转移率达到84.2%、质量含量高达78.1%。2、采用喷雾干燥可以明显縮短活性成分的受热时间，减少成分损失。3、喷雾干燥粉末较稳定均一，方便下一步制剂。3、本工艺采用D-101大孔树脂进行分离纯化。该树脂价格较低，而且安全性较高，是目前国内药品行业使用最多的一种大孔树脂。图1葛根、山楂和红花提取总黄酮工艺流程图图2葛根、山楂和红花提取液样品溶液上D101大孔树脂柱吸附总黄酮的泄漏曲线图3水洗量与水洗液中黄酮含量关系曲线(水洗量考察)图4水洗量与水洗液中干膏重关系曲线(水洗量考察)图540%乙醇为洗脱剂洗脱树脂柱中总黄酮的洗脱曲线图l所示工艺流程为取三味中药饮片(葛根261份、山楂157份、红花91份)14公斤，用70%乙醇回流提取3次，第一次用乙醇140升，回流提取2小时，第二次用乙醇为112升，第三次用乙醇为84升，分别回流提取l小时，3次得到的山楂提取液合并，回收乙醇，浓缩到无乙醇味，释至140升，过滤备用；滤液以1倍柱体积/小时速率通过大孔树脂(药材D-101大孔树脂二l:3)，吸附完全后先用以3倍柱体积/小时速率冲5倍柱体积蒸馏水，再用5倍柱体积的40%乙醇以相同流速洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至适量体积，喷雾干燥，得葛根、山楂和红花的提取物密封保存具体实施例方式下面结合实施例对本发明方法进一步说明。实施例l葛根、山楂和红花总黄酮的提取工艺实验(1)使用乙醇回流提取法进行实验，采用U(34)正交实验法考察乙醇回流提取葛根、山楂和红花总黄酮中乙醇浓度、乙醇用量(药材质量的倍数)、提取时间等因素的工艺参数，并采用紫外一可见分光光度法对提取物中总黄酮的含量进行测定，同时用高效液相法测定葛根素和羟基红花黄色素A的含量，并以此为指标进行比较分析。结果见表l，表2，表3，表4,表5。表1试验因素水平表因素水平A乙醇浓度(％)乙醇用B量(倍数)C时间一次数」L,丄、(空白)(小时)1606227082—1380102—1一1表2"(34)正交实验表总黄酮含葛根素含羟基红花黄色序号ABCD量(毫克/克生药)量(毫克/克生药)素A(毫克/克生药)1111133.90927.77701.65702122242.94879.90951.96423133361.385111.03532.19664212348.07679.50611.71905223257.681610.37782.02586231143.49889.83912.06867313252.466811.23191.74598321343.79987.75941.60109332149.,679210.16931.9221Kt46.08144.81840.40347.090K249.75248.14346.90246.305K:i48.64951.52157.17851.087R3.6716.70316.7754.782K,9.5749.5058.4589.441K29.9089.3499.86210.327K:19.72010.34810.8829.434<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3总黄酮量方差分析<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表4葛根素量方差分析<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表5羟基红花黄色素A量方差分析<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>正交试验结果表明(见表3，表4,),影响因素最大的为提取时间，乙醇浓度、乙醇用量无明显影响，直观分析出最佳提取工艺为A2B3C3.羟基红花A含量_表6验证试验结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从羟基红花黄色素A方差分析(表5)看，各因素对羟基红花黄色素A的含量无显著性差异。直观分析出最佳提取工艺为A2B3C3。综上所述，选定最合适的工艺条件为，70%乙醇，提取3次，提取时间(倍数)分别为2小时(10倍)，l小时(8倍)，1小时(6倍)。(2)验证试验取葛根，山楂，红花饮片(葛根261份、山楂157份和红花91份)，共3份，按照优选提取工艺进行验证试验，验证试验结果如表6:验证试验结果表明优选的提取工艺稳定可行。实施例2葛根、山楂和红花总黄酮的大孔树脂纯化工艺实验用前述优选提取条件提取得到的提取液进行如下实验-(1)D-101树脂纯化工艺实验①吸附条件优选实验采用正交试验方法以上样药液浓度(以样品中所含有的原药材量计)、径高比及上样流速作为考察因数，应用L9(34)正交表安排试验，因素及水平安排见表7。对以上9组试验分别测定总黄酮含量，并进行评价。分析结果见表8，表9。表7因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表8正交试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>体积/小时的流速通过。再用蒸馏水以2倍柱体积/小时速度洗脱，每个流分收集10毫升，测定并计算流分中总黄酮量(见图3)和干膏重(见图4)。由图可知，在5倍柱体积后的水洗脱液中黄酮损失较大，所以确定水洗体积为5倍柱体积。④乙醇洗脱浓度考察另取20g树脂五份上柱，按以上条件进行吸附，5倍柱体积水冲洗后，分别以适量30%、40%、50%、60%、70%乙醇以2倍柱体积/小时的流速洗脱，测定洗脱液中总黄酮含量，计算洗脱率；挥干溶剂，将浸膏衡重，精密称定并计算总黄酮的含量，结果见表IO表10不同浓度洗脱液中总黄酮的量总黄酮纯度总黄酮转移率总黄酮纯度x总黄酮转移率30%0.74900.64910.486140%0.75970.75480.573450%0.69110.77890.538360%0.60570.70110.424770%0.65530.77290.5065综合考虑总黄酮纯度与转移率选用40%乙醇洗脱。⑤洗脱速率考察按上述条件进行动态吸附，以80%乙醇为洗脱剂，分别以2，3,4倍柱体积/小时的速度洗脱，测定乙醇洗脱物中总黄酮量并计算洗脱率，结果表明洗脱速率为3倍柱体积/小时时洗脱率最高。⑥乙醇洗脱量考察按上述条件进行动态吸附，以40%乙醇为洗脱剂进行洗脱，定量收集流出液并测定其中总黄酮浓度。结果见图5。结果表明用100毫升(约5倍柱体积)40%乙醇以2倍柱体积/小时流速可以完全洗脱20g树脂所吸附的黄酮类成分。实施例3中试放大实验称取山楂饮片14千克，70%乙醇回流提取3次，第一次用乙醇140升，回流提取2小时，第二次用乙醇112升，回流提取1小时，第三次用乙醇84升，分别回流提取1小时。合并3次提取液，回收乙醇至无醇味，放置过夜，次日用滤布滤除沉淀，稀释至每毫升含生药O.l克的溶液，备用。将20千克药用级D101型大孔树脂用适量乙醇浸泡，湿法上柱，处理后备用。提取药液分两次上样加入树脂柱，每次70升，上样流速为l倍柱体积/小时，上样后先用5倍柱体积的蒸馏水冲洗，再用5倍柱体积40%乙醇以3倍柱体积/小时流速洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩至小体积(密度约为1.05克/毫升)，喷雾干燥(喷雾干燥器进风口温度为170'C，出风口温度为85'C，雾化盘转速为20000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置干燥处保存。采用紫外一可见分光光度法测定提取物中总黄酮的含量，计算转移率(转移率二提取物中总黄酮的含量/原药材中总黄酮的含量X100M)和收膏率(收膏率=提取物总质量/原药材总质量乂100%)。试验结果见表11。_表ll中试实验结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>二批中试放大研究结果表明其山楂总黄酮转移率达84.23%，提取物中总黄酮含量79.27%。表明本研究的工艺参数可行，工艺条件稳定，可望过渡到产业化生产。权利要求1.一种复方脑得生方中葛根、山楂和红花的总黄酮有效部位的提取物，其特征是，所述提取物中总黄酮质量含量为78.1％。2、权利要求1所述的复方脑得生方中葛根、山楂和红花的总黄酮有效部位的提取物的提取方法，其特征是提取步骤为1)、取复方脑得生方中葛根、山楂和红花饮片，加浓度60-80%的乙醇回流提取三次，第一次加药材质量IO倍量的乙醇提取2小时，第二次加8倍量的乙醇提取1小时，第三次加6倍量的乙醇提取1小时，合并3次提取液，减压回收乙醇，浓縮到无乙醇味，得提取浓縮液；2)、将步骤l)得到的提取浓縮液加水至每毫升含生药0.1克，过滤，得滤液；3)、将步骤2)得到的滤液过D-101大孔树脂柱进行吸附、用水洗和乙醇洗脱，吸附、水洗和乙醇洗脱工艺条件为吸附液流速为l一3倍柱体积/小时，吸附液量为4一5倍柱体积；水洗速率为3倍柱体积/小时，水洗体积为4一6倍柱体积；洗脱用乙醇的浓度为30-60%,流速为l一3倍柱体积/小时，用量为2—6倍柱体积；4)、收集乙醇洗脱液，浓縮至密度为1.05—1.10克/毫升，喷雾干燥，得到葛根、山楂和红花的提取物产品，提取物中总黄酮质量含量78.1%。3、如权利要求2所述的复方脑得生方中葛根、山楂和红花的总黄酮有效部位的提取物的提取方法，其特征在于所述步骤l)中加浓度70%的乙醇回流提取三次。4、如权利要求2所述的复方脑得生方中葛根、山楂和红花的总黄酮有效部位的提取物的提取方法，其特征在于所述步骤3)中吸附液流速为l倍柱体积/小时，吸附液量为3.5倍柱体积；水洗速率为3倍柱体积/小时，水洗体积为5倍柱体积；洗脱用乙醇的浓度为40%，流速为3倍柱体积/小时，用量为5倍柱体积。5、如权利要求2所述的复方脑得生方中葛根、山楂和红花的总黄酮有效部位的提取物的提取方法，其特征在于所述步骤4)中喷雾干燥条件为喷雾干燥器进风口温度为170。C，出风口温度为90。C，雾化盘转速为20000转/分钟。全文摘要复方脑得生方中葛根、山楂和红花黄酮类成分的提取纯化工艺。按质量比取葛根261份，山楂157份和红花91份，加浓度60-80％的乙醇回流提取三次，三次乙醇加入量分别为药材质量10、8、6倍量，提取时间分别为2、1、1小时，合并3次提取液，回收乙醇，浓缩到无乙醇味，得到的提取浓缩液，加水至含生药0.1克/毫升，过滤，滤液过D-101大孔树脂柱吸附、用水洗和乙醇洗脱，吸附液流速为1-3倍柱体积/小时，吸附液量为4-5倍柱体积；水洗速率为3倍柱体积/小时，水洗体积为4-6倍柱体积；洗脱用乙醇浓度为30-60％，流速为1-3倍柱体积/小时，用量为2-6倍柱体积；收集乙醇洗脱液，浓缩至密度1.05-1.10克/毫升，干燥，即得总黄酮质量含量78.1％提取物产品。文档编号A61K36/734GK101269135SQ20081004721公开日2008年9月24日申请日期2008年4月2日优先权日2008年4月2日发明者刘焱文,王光忠申请人:湖北中医学院