诊断致瘤力以及确定对抗癌疗法的抗性的制作方法

文档序号:1227781
专利名称:诊断致瘤力以及确定对抗癌疗法的抗性的制作方法
诊断致瘤力以及确定对抗癌疗法的抗性
本申请为分案申请,原申请的申请号为02815804.0 (PCT/US02/18549),申请日为2002年6月14日,发明名称为"诊断 致瘤力以及确定对抗癌疗法的抗性"。
本发明是2001年6月15日申请的美国申请第09/880,842号的 继续申请,美国申请第09/880,842号是1999年12月8日申请的美 国申请第09/456,886号的部分继续申请,美国申请第09/456,886号 是1997年12月16日申请的美国申请第08/991,862号的一个分案, 08/991,862号申请是1997年5月23日申请、目前已放弃的美国申请 第08/863,079的部分继续申请。
背景技术
多细胞生物中细胞的增殖和分化受到高度受控过程的支配。癌 症细胞的一个显著特点是对该过程缺乏控制;增殖和分化失去控制, 导致不受控制的生长。已经进行大量努力,以更好地理解正常细胞和 肺瘤细胞之间的这种差异。研究焦点的一个领域是生长因子,更具 体地说,是自分泌生长因子刺激。
生长因子是携带涉及生长、分化、迁移和基因表达的信息到细 胞去的多肽。 一般地说,生长因子在一个细胞内产生,作用于另一 个细胞,刺激增殖。然而,培养物中的某些恶性细胞表现对自分泌 生长机制更大或完全的依赖性。遵循该自分泌行为的恶性细胞避开 其它细胞生长因子产生的调节,因此它们的生长不受调节。
对自分泌生长控制的研究促进对细胞生长机制的理解,并导致 肿瘤诊断和治疗中的重要进步。为此,已经研究多种生长因子,包 括胰岛素样生长因子("IGF1"和"IGF2")、胃泌素释放肽("GRP,,)、 转化生长因子a和(3("TGF-a"和"TGF-b")以及表皮生长因子("EGF")。
本发明涉及一种最近发现的生长因子。该生长因子首先在高度 致瘤的"PC细胞,,的培养基中发现,"PC细胞"是从来自畸胎瘤的
3脂肪生成细胞系1246分离的依赖于胰岛素的变体。该生长因子在本 文中称为"GP88"。已经纯化和在结构上特征鉴定GP88。 GP88的 氨基酸测序指出GP88与小鼠颗粒体蛋白/上皮素前体有氨基酸序列 相似性。
颗粒体蛋白/上皮素("grn/epi,,)是6kDa多肽,属于新型的富含 双半胱氨酸多肽家族。美国专利第5,416,192号(Shoyab等)涉及6 kDa 上皮素,尤其是上皮素1和上皮素2。根据Shoyab,这两种上皮素 都由一种通用的63.5 kDa前体编码,该前体合成后立即被加工成为 更小的形式,以致于在生物样品中仅有的天然产物是所述6 kDa形 式。Shoyab等教导说该上皮素前体在生物学上没有活性。
与Shoyab等的教导相反,本发明发明人的实验室已经证明该 前体并不总是在其合成后立即受到加工。由本发明发明人部分进行 的研究已经证明该前体(即GP88)事实上作为携带20kDaN-连接糖 类部分的88kDa糖蛋白分泌。对GP88的N末端序列分析指出GP88 开始于所述gm/epi前体的氨基酸17,这证明从前体cDNA推导出的 蛋白序列的前17个氨基酸对应于信号肽,所述信号肽用于靶向膜定 位或耙向分泌。与Shoyab等的教导相反,GP88在生物学上是有活 性的,有生长促进活性,尤其是作为生产细胞的自分泌生长因子。
乳腺癌是世界范围内妇女发病或死亡的主要病因。已知雌激素 是雌激素受体阳性(ER+)人乳腺癌细胞在体内和体外生长的主要刺 激物 虽然雌激素最初是乳腺癌建立和增殖所需的,但乳腺癌病程 中依赖于雌激素的肿瘤发展指示较差的预后。已经假设乳腺癌细胞 中雌激素的促有丝分裂效应至少部分由自分泌生长因子介导,所述 自分泌生长因子包括由雌激素调节的生长因子。因此,鉴定和特征
腺癌细胞中雌激素的效应。
枸橼酸他莫昔芬("他莫昔芬")是一种非类固醇抗雌激素,通常 开处方给表现强烈抗雌激素和抗肿瘤性质的乳腺癌患者。见美国专 利第4,536,516号。他莫昔芬是一种与雌激素竟争结合雌激素受体的雌激素受体拮抗剂。其它抗雌激素包括雷洛昔芬、芳香酶抑制剂(如
Arimidex (阿那曲哇)、Femem )和雌激素受体负调节剂(如 Faslodex )。他莫昔芬的抗雌激素效应可能涉及其与雌激素竟争革巴组 织中结合位点的能力。其它抗雌激素如芳香酶抑制剂抑制或减少可 利用的雌激素的量。例如,芳香酶抑制剂预防雄激素转化为雌激素, 由此减少可利用的雌激素的量。雌激素受体负调节剂抑制或减少细 胞表面雌激素受体的数量。
目前可以乂人 AstraZeneca and Ban Laboratories 以商品名 Nolvadex⑧获得10mg和20 mg形式的他莫昔芬,他莫昔芬适用于转 移乳腺癌、乳腺癌的辅助疗法、原位腺管癌以及降低乳腺癌高危妇 女中乳腺癌的发病率。因此,可以使用他莫昔芬治疗和预防各种癌 症,尤其是乳腺癌。
然而,他莫昔芬给药伴随其对患者潜在的严重危险。例如,他 莫昔芬给药与卵巢癌风险增加有关。此外, 一些患者表现对他莫昔 芬预期有益效应的抗性。因此,他莫昔芬给予抵抗其益处的患者时, 卵巢癌的风险增加,同时延迟或引起所述患者放弃更有效的治疗, 由此对所述患者造成不必要的伤害。
因此,给予他莫昔芬应当限制于那些最有可能从他莫昔芬治疗 中受益的患者。在开始他莫昔芬治疗疗程前准确确定患者是否对他 莫昔芬给药的抗肿瘤效应敏感或有抗性将是有价值的诊断工具。
目前本领域教导患者体内缺乏雌激素受体对应于他莫昔芬抗 性。例行检测癌症患者体内雌激素受体存在与否,试图预测该患者 是否会对他莫昔芬疗法有抗性或有响应。根据目前的测试, 一般为 雌激素受体测试阳性的癌症患者("ER+"或"雌激素受体阳性患者") 开他莫昔芬的处方。
然而,大量ER+患者事实上抵挡他莫昔芬。因此,为ER+患者 例行开他莫昔芬的处方可能是有害的,并且增加患者发展卵巢癌或 其它形式癌症的风险。
5发明简述
本发明的发明人目前出人意料地发现在正常细胞中以受到严 格调控方式表达的糖蛋白(GP88)在来自正常细胞的高度致瘤性细胞 中过量表达和失去调控,GP88作为所述致瘤性细胞严格需要的生长 刺激物起作用,并且所述致瘤性细胞中对GP88表达或作用的抑制导 致抑制所述过量产生细胞的致瘤力。
本发明的发明人进一步出人意料地发现GP88的表达水平指示 患者是否抵抗抗雌激素化合物如他莫昔芬的药学效应。乳腺癌患者 体内肿瘤细胞的雌激素受体状态并不提供确定他莫昔芬是否是乳腺 癌患者合适或优选治疗疗程的足够信息。本发明提供确定患者是否 抵抗他莫昔芬的更准确工具,因此代表癌症治疗中有价值的进步。
本发明的优选实施方案提供诊断致瘤力的方法,包括从患者获 得包含细胞的生物样品,检测所述样品的细胞中的GP88,确定所述 样品中GP88阳性或染色细胞的数量,然后确定所述生物样品中 GP88阳性或染色细胞与总细胞数目的比例。该比例指示致瘤力。
本发明还提供确定受检查者是否抵抗抗雌激素的抗肿瘤效应的 方法。根据一个尤其优选的实施方案,检测来自患者的包含细胞的 生物样品中的GP88,然后确定所述样品中GP88的量。所述生物样 品中GP88的量指示对抗雌激素疗法的抗肿瘤效应的抗性。在另一优 选实施方案中,确定生物样品中GP88阳性或染色细胞的数量,然后 确定所述生物样品中GP88阳性或染色细胞与总细胞数目的比例。该 比例指示对抗雌激素疗法的抗肿瘤效应的抗性。
本发明的优选实施方案还提供诊断致瘤力和确定患者是否抵抗 抗雌激素的抗肿瘤效应的试剂盒。所述试剂盒优选包含一个容器以 及一种或多种用于检测GP88的化合物(如抗GP88抗体以及抗GP88 核苷酸探针)。
本发明的另 一 优选实施方案4是供治疗或预防癌症的方法。根据
6一个优选实施方案,测定从患者获得的生物样品中GP88的量,假如 所述样品中GP88的量少于约5%,则给予所述患者抗雌激素疗法。 或者,如果所述生物样品中GP88的量少于约10%,则给予雌激素 受体阳性患者抗雌激素疗法。在另一优选实施方案中,确定从患者
获得的生物样品中GP88阳性细胞的百分率,々支如所述生物样品中 GP88阳性或染色细胞的百分率少于约5%,则给予所述患者足以治 疗或预防所述癌症的量的抗雌激素疗法。或者,假如所述生物样品 中GP88阳性或染色细胞的百分率少于约10%,则给予雌激素受体 阳性患者抗雌激素疗法。
本发明提供用于诊断和治疗疾病的组合物,所述疾病包括但不 限于其中细胞表现GP88表达改变或对GP88响应改变的癌症。本文 中术语"表达改变"的使用指根据mRNA或蛋白的水平,与对应 正常细胞或周围的外周细胞相比,GP88的表达增加或过量表达增加 至少两倍,有时增加10倍或更多。术语"表达改变"也指表达失去 控制或变成组成型表达而不一定存在表达增强。术语对GP88的"响 应,,增加或改变指这样一种情况GP88赋予的任何生物学功能(如 生长、分化、病毒感染力)的增加导致与GP88表达改变同样或等同 的情况。
"瘤形成,,指在缺乏原始生长刺激的情况下持续存在的不正常 细胞生长或肿瘤细胞生长。术语"抗肿瘤效应"指逆转或抑制瘤形 成的性质。术语"癌症"指任何由不正常细胞生长引起的疾病,包 括但不限于乳腺癌、卯巢癌、肾癌、骨癌、胰癌、睾丸癌、肝癌、 脑癌和皮肤癌。术语"致瘤力"指细胞或组织表现瘤形成特性的程 度。
本文所用的"ER"除特别指出外,指雌激素受体。"PR"除特 别指出外,指孕酮受体。
"GP88阳性细胞,,或"GP88染色细胞"指那些在其中检测到 GP88的细月包。本文所用的"GP88阴性细胞,,指那些其中没有^f全测到GP88的细胞。细胞是GP88阳性还是阴性可能部分取决于检测方 法(即免疫染色、原位杂交、成象)的灵敏度。"细胞总数,,指在生物 样品中分析细胞的总数,并且可能包括在生物样品特定部分中存在
的所有或某种细胞。
术语"生物样品,,指来自脊推动物机体的材料,包括但不限于 血液、血清、血浆、尿、乳头吸出物、脑脊髓液、肝、肾、乳腺、 骨、骨髓、睾丸或卵巢和脑、结肠和肺。
本文所用的"抵抗"抗雌激素疗法的患者是对抗雌激素疗法的 抗肿瘤效应没有响应或响应降低或有限的患者。
术语"抗雌激素疗法"指给予预防雌激素或雌激素类似物形成 或者干扰雌激素或雌激素类似物功能的化合物。用于抗雌激素疗法 的化合物的例子在本文中称为"抗雌激素药",包括但不限于他莫 昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制剂(如Arimidex⑧、Femera⑧)以及雌激 素受体负调节剂(如Faslodex⑧)。
本文中术语"GP88"的应用指细胞提取物和细胞外液体中上皮 素/颗粒体蛋白前体,不仅包括依照图8和图9中氨基酸序列的小鼠 来源和人类来源的GP88,而且包括其它物种的GP88。此外,该术 语还包括其具有添加成分如糖部分的功能衍生物,包括糖蛋白或其 它^f'务饰结构。术语"GP88"和"PCDGF,,在本文中可互换^使用。术 语GP88还包括具有上述序列中存在的至少10个氨基酸的任何多肽 片段。该长度的序列可用作抗原以及用于制造与载体缀合的免疫原 性缀合物,生产特异性针对所述完整蛋白各种表位的抗体。所述多 肽用于筛选所述抗体以及目的在于检测生物体液中GP88的方法。本 领域内众所周知肽可用于产生针对更大蛋白的抗体。在本发明的 一个实施方案中,显示长度从12到19个氨基酸的肽已经成功地用 于发展识别全长GP88的抗体。
本发明的多肽可以共价结合或者不共价结合另 一种分子而存 在。例如,本发明的多肽可以通过一个或多个肽键与一种或多种其它多肽融合,例如谷胱甘肽转移酶、多组氨酸、绿荧光蛋白、myc 标记或其它受标记的化合物(如生物素)。
所述多肽大得足以包含抗原性独特决定簇或表位,所述独特决 定簇或表位可以用作免疫原,用于复制或测试针对GP88或其功能衍 生物的抗体。
一个实施方案包括基本不含其它哺乳动物肽的多肽。本发明的 GP88可以从细胞、组织或生物体液中通过生物化学方法或通过免疫 化学方法纯化。或者,可以在原核或真核表达系统和宿主细胞中通 过重组方法产生所述多肽。
GP88的"片段"指更小的肽,所述肽是该分子的任何亚部分。 这对应于例如但不限于小鼠GP88的K19T和S14R以及人GP88的 E19V和A14R (分别等价于鼠K19T和S14R)等区段。
GP88的"变体,,指基本类似于完整肽或其片段的分子。可以使 用本领域内已知方法通过直接化学合成变体肽,制备所述变体肽。
或者,可以通过修饰编码所述合成蛋白或肽的DNA,制备所述 肽的氨基酸序列变体。所述变体包括例如GP88氨基酸序列内残基的 缺失、插入或取代。可以制造缺失、插入和取代的任何组合来完成 最终构建物,只要所述最终构建物具有所需活性。在编码所述变体 肽的DNA制造的突变必须不改变可读框,并且优选不创造可能产生 二级mRNA结构的互补区。在遗传水平上制备这些变体定点诱变 (8)编码所述肽分子的DNA中的核苷酸,由此产生编码所述变体的 DNA,然后在重组细胞培养物中表达所述DNA。所述变体一般表现 与非变体肽相同的定性生物学活性。
GP88蛋白的"类似物"指与所述完整分子或其片段基本相似的 非天然分子。
本发明的抗体(中和抗体和其它抗体)优选用作其中细胞表现 GP88表达提高的癌症或其它疾病。术语"中和"应当理解为所述抗 体具有抑制或阻断GP88正常生物学活性的能力,所述GP88正常生
9物学活性包括但不限于GP88刺激细胞增殖、增加细胞存活率、阻断
细胞凋亡或诱导实验动物和人体内肿瘤生长的能力。通过各种途径
给予动物(包括人)有效量抗GP88抗体。在可替代的实施方案中,所 述抗GP88抗体用作诊断方法,检测疾病(例如但不限于癌症)中出现 的GP88表达改变、鉴定生长依赖于GP88并且响应GP88拮抗疗法 的疾病细胞。在又一实施方案中,所述抗GP88抗体用于传递化合物 例如细胞毒性因子或反义寡核苦酸到表达或响应GP88的细胞。
应当理解,根据本文的教导,应用本发明对特定问题或环境的 教导将在本领域内 一般技术人员的能力范围内。附图插入本说明书 并构成本说明书的一部分,举例说明本发明的实施方案,并且与发 明详述一起解释本发明的原则。本发明产品的例子以及应用它们的 方法见后面的实施例。
附图简述


图1比较1246、1246-3A和PC细胞系中GP88蛋白的表达水平。 在补充2。/。胎牛血清(FBS)的DME-F12培养基中培养细胞。通过免疫 沉淀和使用抗K19T抗体的蛋白质印迹分析测量GP88表达水平。
图1B比较1246、 1246-3A和PC细胞系中GP88 mRNA的表达 水平。使用编码RPL32的mRNA作为等量RNA载量的内部对照。
图1C比较无血清培养基和含血清培养基中GP88 mRNA在1246 细胞(左图)和PC细胞(右图)中的表达。结果显示。?88在1246细 胞中的表达受到添加胎牛血清的抑制,而在高度致瘤的PC细胞中没 有观察到所述抑制。
图2展示用浓度增加的抗GP88中和抗体治疗高度致瘤的PC细 月包的凌文应。
图3显示皮下注射106反义GP88转化PC细胞(底部)和空载体 转化对照PC细胞(顶部)的C3H小鼠。
图4显示C3H小鼠肿瘤组织和周围正常组织中GP88的体内表
10达水平。
图5显示雌激素受体阳性和雌激素受体阴性人乳腺癌细胞系中
GP88 mRNA的表达水平。
图6显示浓度增加的GP88对小鼠乳腺上皮细胞系C57生长的 效应。
图7显示用巨细胞病毒启动子控制的含反义取向GP88的表达 载体转染的PC细胞的生长性质和致瘤能力,以及用空载体转染的 PC细胞的生长性质和致瘤能力。
图8显示小鼠GP88的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。下划 线标出用作抗原产生抗GP88抗体的肽区K19T和S14R。在括号之 间指出pCMV哺乳动物表达载体中以反义取向克隆的区。
图9A显示人GP88cDNA的核普酸序列。在括号之间指出以反 义取向克隆进pcDNA3哺乳动物表达系统的区;和
图9B显示人GP88推导的氨基酸序列。下划线标出用作抗原发 展抗人GP88中和抗体的E19V区。还指出等价于小鼠S14R区的 A14R区。
图10显示排列以显示7个半重复的小鼠GP88的氨基酸序列, 所述7个半重复定义为颗粒体蛋白g、 f、 B、 A、 C、 D和e(右侧)。 该说明显示在认为是变异区的两个上皮素/颗粒体蛋白重复之间发 现用于产生GP88抗体(用于发展抗GP88中和抗体)的区K19T和 S14R。右侧根据Bateman等(6)指出所述重复的颗粒体蛋白分类。根 据Plowman等,1992 (5),颗粒体蛋白B和颗粒体蛋白A也分别定义 为上皮素2和上皮素1。
图11显示pCMV4和一个GP88 cDNA克隆的图示,该图示指 出用于克隆GP88反义cDNA进入所述表达载体的限制位点。
图12显示125I-rGP88与CCL-64细胞表面GP88细胞表面受体 的交联。使用双琥珀酰亚胺辛二酸(DSS)进行所述交联反应。在7% 聚丙烯酰胺凝力交上通过SDS-PAGE分析反应产物。图13显示125I-rGP88与3T3成纤维细胞、PC细胞和C57MG哺 乳动物表皮细胞表面GP88细胞表面受体的交联。结果显示这些各 种细胞系显示与CCL64细胞表面GP88细胞表面受体(图12)有相似 分子量的所述受体。
图14显示在非致瘤力MCF 10A和恶性(MCF 7、 MDA-MB-468) 人乳腺上皮细胞内的GP88表达水平。
图15显示GP88表达在人乳腺癌雌激素受体阴性MDA-MB-468 细胞中受到反义GP 8 8 cDN A转染的抑制。
图16显示PCDGF对MCF-7细胞增殖的效应。图16(A)图解 PCDGF在缺乏17P-雌二醇(E2)的情况下刺激MCF-7细胞的DNA合 成。图16(B)图解抗PCDGF抗体特异性抑制所述E2的促有丝分裂 效应。结果表示为三个平行测定的平均值土SD。
图17显示抑制PCDGF表达对E2的促有丝分裂效应的影响。 图17(A)图解通过用反义PCDGF cDNA转染进MCF-7纟田月包,抑制 PCDGF表达。图17(B)图解抑制MCF-7细胞中PCDGF表达抑制所 述E2的促有丝分裂活性。
图18显示PCDGF在MCF-7细胞中的过量表达导致能够在不存 在E2的情况下增殖并且抗他莫昔芬的细胞。图18(A)显示PCDGF 在04细胞和对照MCF-7C细胞中的表达。图18(B)显示04细胞和 对照MCF-7细胞在雌激素耗尽PFMEM培养基中的增殖。图18(C) 显示MCF-7细胞和04细胞对他莫昔芬反应的比较。结果表示为平 均值士SD。
图19显示测定MCF-7细胞中的PCDGF信号途径。图19(A)图 解MAP激酶抑制物对PCDGF促有丝分裂效应的影响。图19(B)图 解PCDGF激活MAP激酵。
图20显示PCDGF对MCF-7细胞中细胞周期蛋白Dl和c-myc 表达的效应。图20(A)显示通过PCDGF刺激细胞周期蛋白Dl表达。 图20(B)显示E2和PCDGF对c-myc表达的效应。图21 J
中的乳腺癌活组织4企查的GP88染色强度。
图22显示侵袭性腺管癌(IDC)肺瘤中雌激素受体状态与GP88 染色强度的相关性。
图23显示ER+IDC肿瘤对他莫昔芬的响应性与GP88染色强度 之间的相关性。当GP88染色强度增加时,雌激素受体阳性肺瘤变得 对抗雌激素治疗有抗性。
发明详述
下面将详细描述本发明目前优选的实施方案,所述实施方案将 与后面的实施例 一起解释本发明的原理。
GP88的生物学活性
本发明涉及用于治疗和诊断与GP88表达改变(增加)有关的疾病 的GP88及抗肺瘤和抗病毒组合物。或者本发明用于治疗和i貪断与对 GP88响应性增加有关的疾病。本发明的发明人^f吏用由三种细月包系构 成的小鼠模型系统,已经显示过量表达GP88的细胞形成肺瘤。亲本 细胞系1246是一种C3H小鼠脂肪生成细胞系,在胰岛素严格调控 下,在确定成分培养基中增殖和分化成为脂肪细胞。所述1246细胞 不能在同系动物(C3H小鼠)中形成肿瘤,甚至当以高细胞浓度注射时 也是如此。从不含胰岛素的培养基中维持的1246细胞分离一种依赖 于胰岛素的细胞系1246-3A。当对同系小鼠皮下注射106个所述 1246-3A细胞时,所述细胞失去分化和形成肿瘤的能力。通过体外-体内穿梭技术从1246-3A细胞发展出一种高度致瘤力的细胞系PC。 当对同系小鼠注射1(^个所述PC细胞时,所述细胞形成肿瘤。
相对于亲本非致瘤力的依赖于胰岛素的细胞系,依赖于胰岛素 的致瘤性细胞系过量表达GP88。此外,GP88过量表达的程度确实 与这些细胞的致瘤力程度相关,这第一次证明GP88在肿瘤发生中是
13重要的(图1)。参考图1,由于GP88由细胞合成但不分泌入培养基 中,因此测定细胞裂解物和培养基(CM)中的GP88水平。所有细月包 都在补充2%胎牛血清的DME/F12营养培养基中培养。当细胞达到 汇合后,收集细胞培养基(CM),并通过在含去污剂的緩冲液中温育 然后10,000xg离心,制备细胞裂解物。根据细胞数量归一化处理细 胞裂解物和条件培养基。如下所述,通过使用抗GP88抗体的蛋白质 印迹分析来自细胞裂解物和条件培养基的样品。
中和抗体的发展证实GP88在肿瘤发生中的关键作用。当在培 养基中加入针对小鼠GP88的K19T区的抗GP88抗体时,以依赖于 剂量的方式抑制高度致瘤力的PC细胞的生长(图2)。参考图2,在 96孔板中以2 x 104细胞/孔的浓度在补充人纤连蛋白(2 ng/ml)和人运 铁蛋白(10 ng/ml)的DME/F12培养基中培养PC细胞。细胞贴壁后, 在各孔中加入浓度增加的抗GP88 IgG组分。用相当浓度的非免疫性 IgG处理对照细胞。两天后,每孔加入0.25 mCi 311-胸苷处理6小时。 然后收获细胞,计数掺入DNA的3&胸苷,作为细胞增殖的量度。
然而,当PC细胞内GP88的表达受到反义GP88 cDNA的特异 性抑制时,GP88的生产减少,并且这些PC细胞再也不能在同系C3H 小鼠中形成肺瘤。此外,这些PC细胞重新获得对胰岛素的响应性。 参考图3和表1及表2,对C3H雌性小鼠皮下注射106个反义GP88 转染的PC细胞(如下文解释)或106个空载体转染的PC细胞。每日 监测小鼠体内的肿瘤出现。注射所述细胞45天后拍照。结果显示 与用作对照的注射空载体转染的PC细胞的小鼠不同,注射反义 GP88PC细胞的小鼠不发展肿瘤。
14表l.比较GP88反义转染细胞、对照转染细胞和PC细胞的致 瘤力质
注射的细胞检测到肿瘤的患有肿痛i的小平均胂瘤重量
平均天数鼠的数目(g)
PC15±3.05/59.0±3.2
P1415±3.75/57.8±2.7
ASGP88—0/5—
PC:对照,未转染的细胞
P-14:空载体对照转染的PC细胞
ASGP88:用含GP88反义cDNA的表达载体转染的PC细胞 在第45天切除和称重肿瘤。—-显示没有肺瘤形成。
表2.比较1246、 PC细胞和GP88反义细胞的性质
1246细胞PC细胞反义GP88细胞
生长和分化响应胰岛生长分化不依赖于胰恢复生长(分化?)对
素岛素的缺陷型胰岛素的响应
自分泌产生胰岛素相
关因子
细胞表面胰岛素受体细胞表面胰岛素受体细胞表面胰岛素受体
表达高表达非常低表达提高
GP88表达低GP88表达组成型地GP88表达受到反义
高抑制
GP88表达受到血清不受到血清抑制
抑制
GP88表达受到胰岛组成型GP88表达恢复胰岛素对内源
素调节GP88表达的调节
非致瘤力高度致瘤力非致瘤力
15GP88表达的比较指出肿瘤中的体内GP88水平比正常组织显 著更高(图4)。为C3H小鼠注射106个PC细胞。无痛性处死携带肿 瘤的小鼠。收集肿瘤、脂垫和结締组织。如上文针对图1所述,通 过在含去污剂的緩冲液中温育,制备细胞裂解物。测定组织提取物 的蛋白浓度,通过SDS-PAGE和随后^f吏用抗GP88抗体的蛋白质印 迹分析等量的每种样品蛋白,测定组织提取物中GP88的含量。结果 显示肿瘤提取物中GP88的水平是周围结締组织和脂肪組织中 GP88水平的至少10倍。
在正常细胞(1246纟田胞、成纤维细胞)中,GP88的表达受到调节, 尤其是胰岛素的调节,受到胎牛血清的抑制。在致瘤性细胞中,丧 失对正常生长的调节导致GP88表达增加和获得生长对GP88的依赖 性。因此,抑制GP88表达和/或作用是抑制肿瘤发生的有效方法。 在活組织检查中检测GP88表达提高,提供对于响应GP88抑制疗法 的肺瘤的诊断分析。
GP88也是人类癌症中的肿瘤诱导因子。如1246-3A细胞系中所 见,在几种人类癌症(包括但不限于乳腺癌)中已经很好地记录(13, M) 丧失对胰岛素(或对IGF-I)的响应性以及恶性度同时增加。具体地说, 乳腺癌伴随着获得胰岛素/IGF-I自分泌环,这也是发展本文讨论的小 鼠模型中发展致瘤力质的开始点。此外,GP88表达在人乳腺癌中提 高。参考图5,更具体地说,人GP88在雌激素受体阳性以及雌激素 受体阴性不依赖于胰岛素/IGF-I的高度恶性细胞中高度表达。此外, GP88是乳腺上皮细胞的有效生长因子(图6)。通过在补充10%胎牛 血清(FBS)的DME/F12培养基中培养MCF7、 MDA-MB-453和 MDA-MB-468细胞,获得图5中的数据。通过RNAzol方法和所制 备的poly-A+RNA,从每种细胞系提取RNA。使用"P标记的GP88 cDNA探针,对每种细胞系用3昭poly-A+ RNA通过RNA印迹分析 检查GP88 mRNA表达。
为RNA印迹分析啮齿动物细胞或组织(小鼠和大鼠)中的GP88mRNA表达,我们使用从核苷酸551开始到862 (对应于氨基酸序列 160到270)长度311 bp的小鼠GP88 mRNA探针。可以通过本领域 内技术人员众所周知的多种方法(Sambrook, Molecular Biology manual: 35)提取認A。优选方法是使用RNAzol (Cinnabiotech)或 Trizol (Gibco-BRL)溶液提取RNA,所述方法包括通过异硫氰酸胍和 苯酚-氯仿的单步提取。
为RNA印迹分析人细胞系中的GP88 mRNA表达,发展对应于 人GP88核苷酸1002到1674 (对应于氨基酸序列334-558)的672 bp 人GP88 cDNA探针。见实施例8中关于在优选实施方案中使用的 RNA印迹分析方法的详细具体描述。
参考图6,在浓度增加的从PC细胞条件培养基纯化的GP88(底 图)和在昆虫细胞中表达的重组GP88 (顶图)存在下,培养C57MG细 胞,证明浓度增加的GP88对小鼠乳腺上皮细胞系C57MG生长的生 长刺激效应。
针对成胶质细胞瘤、畸胎瘤和乳腺癌已经很好建立IGF-I自分 泌产生与恶性性增加之间的相关性。在这些癌症中,当与非致瘤力 人成纤维细胞和其它人类细胞系比较时,人类肿瘤中GP88表达提 高。GP88促进乳腺癌细胞的生长。
抗GP88抗体
本发明提供治疗和诊断与GP88表达增加有关的疾病的组合物。 也将适用于治疗和诊断与对GP88响应性增加有关的疾病。本发明的 组合物包括中和GP88生物学活性的抗GP88抗体。
本发明还涉及特异性针对GP88表位的抗体以及应用所述抗体 检测GP88分子的存在或测量GP88分子的数量或浓度、其功能衍生 物或动物物种的细胞中、细胞或组织提取物中、培养基或生物体液 中的同源物。此外,可以使用抗体将细胞毒性分子靶向特定位点。
为获得用于发展抗体的抗原,获得天然产生或以重组形式表达
17的GP88蛋白或其功能衍生物(优选具有至少9个氨基酸),用于免疫
动物,产生多克隆抗体或单克隆抗体。假如一种抗体能够与一种分 子反应,由此使所述分子与抗体结合,那么就说所述抗体能够结合 所述分子。特异性反应是指所述抗原能够以高度选择性的方式与其 对应抗体反应,并且不与多lt其它抗原刺激产生的抗体反应。 本文中术语抗体包括但不限于人类和非人类多克隆抗体、人类
和非人类单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、抗特应抗体(抗IdAb)和人源 化抗体。多克隆抗体是或者来自用抗原免疫的动物的血清、或者来 自鸡蛋的异源抗体分子群体。单克隆抗体("mAb")是针对特定抗原 的基本同源的抗体群体。可以通过本领域内技术人员已知的方法(如 美国专利第4,376,110号)获得mAb。所述抗体可以是包括IgG、 IgM、 IgE、 IgA、 IgD在内的任何免疫型和其任何亚型。生产针对GP88的 人类或非人类抗体的杂交瘤可以在体外或体内培养。为生产大量 mAb,体内是目前优选的生产方法。简要地说,将来自各个杂交瘤 的细胞腹膜内注射入姥鲛烷引发的Balb/c小鼠或Nude小鼠,生产包 含高浓度所需mAb的腹水液。可以使用本领域内技术人员众所周知 的标准层析方法,从所述腹水液或从培养物上清纯化mAb。
可以通过免疫表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠,制备针 对人GP88的人类单克隆Ab。使用来自这些转基因动物的淋巴细胞 产生的杂交瘤生产人类免疫球蛋白而不是小鼠免疫球蛋白。
由于大多数单克隆抗体来自小鼠来源和其它非人类来源,因此 它们的临床效率可能因为下面原因而有限给予人体的啮齿动物 mAb的免疫原性、效应物功能的弱募集以及从血清的快速清除。为 克服这些问题,可以将、鼠抗体的抗原结合特性通过称为人源化的 方法赋予人类抗体。人源化抗体包含来自亲本小鼠mAb的6个互补 决定区(CDR)的氨基酸序列,所述氨基酸序列被移植到人类抗体构架 上。已经证明人源化抗体中低含量的非人类序列(约5%)有效降低免 疫原性和延长人体内血清半衰期。方法例如应用单价噬菌体展示和组合文库策略于人源化单克隆抗体目前广泛应用于多种抗体的人源 化并且为本领域内技术人员众所周知。这些人源化抗体和使用上文 所述转基因动物发展的人类抗体对包括但不限于癌症的几种疾病有 才及大的治疗应用。
通过本领域内众所周知的多种免疫测定,根据特异性针对GP88
的抗体的存在筛选杂交瘤上清液和血清,所述免疫测定包括斑点印
迹和标准免疫测定(EIA或ELISA)。 一旦已经鉴定含有目的抗体的上 清液,可以进一步通过蛋白质印迹筛选,鉴定所述抗体结合的抗原 的大小。本领域内技术人员知道如何不必经过不必要的实验就制备 和筛选所述杂交瘤,以获得所需多克隆抗体或单克隆抗体。
嵌合抗体具有来自不同动物物种的不同部分。例如,嵌合抗体 可能具有来自小鼠mAb的可变区和人类免疫球蛋白恒定区。嵌合抗 体和生产它们的方法也是本领域内技术人员已知的。
抗独特型抗体("抗IdAb")是一种抗体,识别一般与抗体的抗 原结合位点有关的独特决定簇。如下制备抗IdAb:用要制备的抗 IdAb所针对的mAb免疫与所述mAb的来源相同物种和基因型的动 物(如小鼠品系)。接受免疫的动物通过生产抗这些独特型决定蔟的抗 体(抗IdAb),识别和响应所述免疫抗体的独特型决定簇。也可以使 用所述抗IdAb作为免疫原,在另一种动物中产生免疫反应,产生所 谓抗抗IdAb。所述抗抗IdAb可能在表位上与诱导所述抗IdAb的原 始mAb相同。因此,通过使用针对mAb独特型决定簇的抗体,有 可能鉴定表达具有相同特异性的抗体的其它克隆。
因此,可以使用针对GP88产生的mAb在合适动物体内诱导人 类和非人类抗idAb。使用来自所述免疫小鼠的脾细胞生产分泌人类 或非人类抗IdmAb的杂交瘤。此外,可以将所述抗IdmAb偶联到 载体例如匙孔蜮血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA),用于免疫其 它小鼠。来自这些小鼠的血清可以包含与特异性针对GP88多肽表位 的原始mAb有结合性质的人类或非人类抗抗IdAb。因此,所述抗
19Id mAb具有自身独特型表位或与需要评价的表位在结构上相似的独特型。
术语抗体也包括完整分子和其片段,例如能够结合抗原的Fab 和F(ab,)2。 Fab和F(ab,)2片段缺乏完整抗体的Fc片段,从循环中 更快清除,并且可能比完整抗体具有更少的非特异性组织结合。通 常使用酶例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)和胃蛋白酶(产生F(ab,)2片 段),通过蛋白水解切割产生所述片段。应当知道的是,根据本文针 对完整抗体分子公开的方法,可以使用本发明所用抗体的Fab和 F(ab,)2以及其它片段检测或定量GP88,以及治疗与GP88表达有关 的病理状态。
根据本发明,可以使用在体外中和GP88活性的抗体在体内中 和GP88活性,治疗与GP88表达增加或者对GP88响应性增加有关 的疾病,所述疾病例如〗旦不限于癌症和病毒感染。使用针对GP88 的抗体治疗患有与GP88表达增加有关的疾病的患者,优选人类患 者。所述治疗可以与其它抗肿瘤或抗病毒疗法一起进行。典型的治 疗方案包括在一周或几周、包括一个月到六个月之间的时间内给予 有效量特异性针对GP88的抗体。可以通过任何获得其既定目的的方 法给予本发明的抗体。例如,可以通过包括但不限于皮下、静脉内、 皮内、肌内、腹膜内和口服在内的各种途径进行给药。可以通过弹 丸式注射(bolus injection)或一定时间内逐渐灌注进行胃肠外给药。用 于胃肠外给药的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳浊液, 所述制剂中可以包含本领域内已知的辅助剂或赋形剂。也可以#4居 常规方法制备药用组合物例如片剂和胶嚢剂。应该知道,所需剂量 将依赖于接受者的年龄、性别和体重、同时进行的治疗的种类(如果 有的话)、治疗频率以及所需效应的性质。下文提供的有效剂量范围 并不是限制本发明,仅代表优选剂量范围。然而,正如本领域内技 术人员理解的,应该根据各个患者定制最优选的剂量,并且本领域 内技术人员能够根据各个患者定制最优选剂量。可以通过多剂或单
20剂给予每次治疗所需的总剂量。抗体的有效量从约0.01吗到约100
mg/kg体重,优选从约IO吗到约50mg/kg。可以单独给予抗体,或 者与针对同 一 疾病的其它治疗药物 一 起给予所述抗体。
才艮据本发明并且考虑所述中和抗体,GP88中和抗体可以用于有 必要抑制GP88生物学活性、即使不一定有GP88表达改变的所有治 疗情况,包括其中GP88细胞表面受体过量表达并进而导致生物学活 性提高的情况,或者其中GP88信号途径或受体改变、导致所述信号 途径总是"打开"的情况。针对生长因子和针对生长因子受体的中 和抗体已经成功地用于抑制其增殖依赖于该生长因子的细胞的生 长。人乳腺癌细胞中IGF-I受体和肺癌中铃蟾肽就如此。也可以使用 针对GP88的抗体传递化合物例如但不限于细胞毒性剂例如毒素、癌 毒素(oncotoxin)、有丝分裂毒素(mitotoxin)和免疫毒素或其它反义寡 核苷酸,以将它们特异性靶向表达GP88或响应GP88的细胞(30)。
允许抗原发展针对GP88的中和抗体的一个区是小鼠GP88中定 义为K19T的19个氨基酸的区,以及人GP88中的E19V,所述E19V 不在上皮素/颗粒体蛋白6 kDa重复之中,而是在这些重复之间,具 体地说是在被认为是变异区的颗粒体蛋白A (上皮素l)和颗粒体蛋 白C(》之间(见图10)。尽管不希望被理论所限制,但是还是认为该 区对于所述上皮素重复之外的GP88生物学活性是重要的。
表达GP88蛋白的细胞的存在。这可以通过免疫荧光技术完成,所述 免疫荧光技术使用荧光标记的抗体(见下文),并进行荧光显微显微镜 检查测、流式细胞术冲全测或荧光计检测。可以通过本领域内众所周 知的免疫测定方法检测本发明抗体和多肽的反应。
本发明的抗体可以在光学显微镜术、免疫荧光或免疫电子显微 镜术中进4亍组织学应用,以原位;险测组织样品或活组织检查中的 GP88蛋白。可以如下完成原位4企测从患者取组织标本,然后应用 合适标记的本发明的抗体。优选将所述标记抗体(或片段)应用或覆盖于所述生物样品,从而提供所述抗体(或片段)。通过使用这种程序,
有可能不仅确定GP88蛋白的存在,而且确定其在所检查组织中的分
布。使用本发明,本领域内技术人员将容易地理解,可以修改许多 种组织学方法(例如染色程序)以实现所述原位检观'。
<1十对GP88的测定通常包括在能够鉴定GP88蛋白的可^f企测标记 抗体存在下,温育生物样品例如生物体液、组织提取物、新鲜收获 或培养的细胞或它们的培养基,通过多种本领域内众所周知的技术 斗全测抗体。
可以用固相支持物或载体例如硝酸纤维素或其它能够固定化细 胞或细胞颗粒或可溶蛋白的固相支持物处理所述生物样品。洗涤所 述支持物,然后用可检测标记的抗GP88抗体处理。然后洗涤所述支 持物,除去未结合的抗体。随后通过常规方法检测所述支持物上结 合标记的量。固相支持物指能够结合抗原或抗体的任何支持物,例 如但不限于玻璃、聚苯乙烯聚丙烯、尼龙、改性纤维素或聚丙烯酰 胺。
可以根据众所周知的方法确定给定批号抗体对GP88蛋白的结 合活性。本领域内技术人员将能够通过使用常规实验,确定每种测 定的操作测定条件和最佳测定条件。
可以通过本领域内众所周知的多种免疫测定例如酶联免疫测定 (ELISA)或放射免疫测定(RIA)检测GP88蛋白或其功能衍生物以及 检测针对所述蛋白的特异性抗体。所述测定是本领域内众所周知的, 并且本领域内技术人员能够容易地知道如何使用本发明的抗GP88 抗体和GP88蛋白进行所述测定。
所述免疫测定用于4企测和定量在血清或其它生物体液以及组 织、细胞、细胞提取物或活组织中的GP88蛋白。在优选实施方案中, 测量组织标本中GP88的浓度,作为诊断与GP88表达增加有关的癌 症或其它疾病的方法。
据说某些类型癌症的存在以及恶性程度与GP88蛋白的水平增
22加"成比例,,。本文所用术语"成比例,,不是限制于蛋白水平与所 述癌症的恶性性质之间的线性或恒定关系。本文所用术语"成比例,,
指在本领域内技术人员能够容易测定的GP88蛋白浓度范围内,与 GP蛋白表达增加有关的癌症或其它疾病恶性性质的出现、重现或展 示与GP88蛋白的水平增加相关。
本发明的另一个实施方案涉及通过评价抗癌或抗病毒药物抑制 GP88表达或产生的能力,评价所述药物的功效。本发明的抗体用于 评价抗癌或抗病毒药物的方法,因为可以在其中一种上述免疫测定 中使用它们测定GP88蛋白的量。或者,如本文所述通过生物测定(细 胞增殖测定)测量所产生的GP88蛋白的量。可以组合使用生物测定 和免疫测定,进行更精确的评价。
另一个实施方案涉及用于诊断与GP88表达增加有关的癌症或 疾病的测定,所述测定基于测量组织或生物体液中存在的编码GP88 或其功能衍生物的mRNA序列的量,优选使用RNA-DNA杂交测定。 某些癌症的存在和恶性程度与所述mRNA存在的量成比例。对于所 述测定,mRNA的来源是活组织检查和周围组织。测量mRNA的量 的优选技术是使用具有互补碱基序列的DNA的杂交测定。
另一个相关实施方案涉及用于诊断与GP88响应性增加有关的 癌症或疾病的测定,所述测定基于对组织活检检测用抗GP88中和抗 体的治疗是否会抑制其生长或其它生物学活性。
另一个相关实施方案是测量抗癌或抗病毒药物疗效的方法,所 述方法包括测量所述药物对于抑制编码GP88的mRNA表达的效应 的步骤。相似地,可以使用所述方法通过测量所述药物抑制GP88 mRNA产生的能力,鉴定或评价GP88拮抗剂的功效。
核酸检测测定尤其是杂交测定可以基于所述核酸分子的任何特 征,例如其大小、序列或对限制性内切酶消化的敏感性。通过改变 报告检测或传递检测信号给观察者的方式,可以增加所述测定的灵 敏度。已经大量发展多种标记并为本领域内技术人员所使用,包括
23酶促标记、》文射性同位素标记、荧光标记、化学标记和-修饰石威基。
克服核酸对检测的灵敏度限制的 一种方法是在进行测定前选择 性扩增所述核酸。该方法被称为"聚合酶链反应"或PCR(美国专利
第4,683,202号和第4,582,788号)。所述PCR反应提供选择性增加特 定核酸序列浓度的方法,甚至当所述序列以前未被纯化并且仅在特 定样品中以单拷贝存在时也是如此。
GP88反义成分
本发明还提供GP88反义成分。已经显示在细胞内组成型表 达反义RNA抑制超过20种基因的表达,并且这份名单还在继续增 长。反义效应的可能机制是阻断翻译或阻止剪接,这两种机制都已 经在体外观察到。干涉剪接允许应用较不保守的内含子序列,因此 导致更高的特异性,抑制一种物种基因产物的表达而不抑制该基因 产物在另 一 物种中的同源物。
序列,所述RNA序列与其所特异性针对的特定mRNA分子足够互 补,引起所述反义RNA和所述mRNA之间的分子杂交,以便抑制 所述mRNA的翻译。所述杂交可以在体内条件下发生。所述反义 RNA的作用导致细胞中基因表达的特异性抑制。
根据本发明,用与GP88 cDNA反义的DNA转染致瘤性细胞抑 制内源GP88表达,并且抑制所述反义cDNA转染的细胞的致瘤力。 该反义DNA长约18-30个核苷酸,必须与所述GP88基因有足够互 补性,以便所述反义RNA能够与所述GP88基因(或mRNA)杂交, 抑制GP88基因表达,而不论所述作用是在剪接、转录或翻译水平。 根据本文的教导而不需过度实验,本领域内技术人员能够容易地鉴 别抑制程度,并且优选抑制程度足以抑制其增殖依赖于GP88表达的 细胞的生长。本领域内技术人员将认识到,反义RNA方法仅是可以 用于阻断特异性基因表达的多种已知机制。本发明的反义成分也能够与靶GP88 cDNA几个部分中的任一 个杂交,或者能够与GP88mRNA杂交,所述靶GP88 cDNA的部分 包括编码序列、3'或5'非翻译区或其它内含子序列。本领域内技术人 员所容易看出的,本发明所需的最小量同源性是这样的同源性所 述同源性足以导致与GP88 DNA或mRNA的杂交,抑制所述DNA 的转录或所述mRNA的翻译或功能,优选不影响其它mRNA分子的 功能和其它不相关基因的表达。
经由载体,通过转化或转染将反义RNA传递到细胞,所述载体 包括逆转录载体和质粒,其中有编码所述反义RNA的DNA以及合 适的调节序列,所述调节序列包括导致所述反义RNA在宿主细胞中 的表达的启动子。已经稳定转染以反义取向包含GP88cDNA片段的 各种反义表达载体。技术人员可以使用逆转录载体传递反义成分到 细胞。也可以通过脂质体完成传递。
为在体内疗法中应用反义技术的目的,目前优选的方法是使用 反义寡核苷酸,而不是进行构建入表达载体的反义cDNA片段的稳 定转染。优选长度为15-30碱基大小并且具有可以与靶GP88 cDNA 几个区中的任一个或者与GP88 mRNA杂交的序列的反义寡核普酸, 所述耙GP88 cDNA的区包括编码序列、3'或5'非翻译区或其它内含 子序列。最好选择编码针对GP88的反义寡核苷酸的序列作为具有最 有效反义效应的序列。控制反义寡核苷酸序列靶位点的因素与所述 寡核苦酸的长度、结合亲和性以及靶序列的可接近性有关。通过测 量对GP88蛋白翻译和GP88相关表型的抑制(如抑制培养物细胞的 细胞增殖),根据它们反义活性的效价在体外筛选序列。 一般地说, 已知可以使用反义寡核苦酸靶向所述RNA的大多数区(5'和3'非翻译 区、AUG起始区、编码区、剪接点和内含子)。
优选的GP88反义寡核苷酸是具有下列性质的寡核苷酸稳定、 对核酸酶(能够有力降解寡核苷酸的酶)有高复原性、具有合适药物代 谢动力学以允许它们在无毒剂量下到达疾病组织、并且具有跨越膜
25的能力。
可以使用硫代磷酸反义寡核苷酸。对磷酸二酯键以及杂环或糖 的修饰增加效力。至于对磷酸二酯键的修饰,可以使用硫代磷酸。 已经描述N3'-P5'氨基磷酸酯键,该键使寡核苷酸对核酸酶稳定并增
加与RNA的结合。肽核酸(PNA)键是核糖和磷酸二酯骨架的完全替 代物,对核酸酶稳定,增加与RNA的结合亲和力,并且不被RNAse H的切割。其碱性结构也能接受修饰,允许其优化成为反义成分。 至于对杂环的修饰,已经证明某些异环修饰增加反义效应,同时不 干扰RNAseH活性。所述修饰的例子是C-5洛唑修饰。最后,也可 以考虑对糖的修饰。2'-0-丙基和2'-甲氧乙氧基核糖修饰修饰使寡核 苷酸在细胞培养物和体内对核酸酶稳定。使用上述类型靶向c-raf-l 的寡核苷酸的细胞培养物和体内肿瘤实验导致增强的效<介。
传递途径将是根据上文标准测量,提供最佳反义效应的传递途 径。使用反义寡核苷酸的体外细胞培养测定和体内肿瘤生长测定已 经显示阳离子脂质体、逆转录载体和直接传递介导的传递是有效 的。另 一种可能的传递模式是使用针对肿瘤细胞表面标记的抗体进 行导向。针对GP88或其受体的抗体可以用于该目的。
重組GP88
本发明也涉及用于表达重组GP88多肽或其功能衍生物的DNA 表达系统,所述DNA表达系统基本不含其它哺乳动物DNA序列。 所述DNA可以是双链或单链的。所述DNA序列应当最好具有约20 个或更多核苷酸,以允许与另一种多核苷酸的杂交。为获得更高的 杂交特异性,优选至少50个核苷酸的长度,所述更高杂交特异性的 特征在于不存在与除编码所述GP88蛋白或其同源物或功能衍生物 的序列以外序列的杂交。
本发明还涉及上文的DNA分子、可表达々某介物或载体以及用所 述媒介物转染或转化并且能够表达所述多肽的宿主。所述宿主可以
26是原核细胞(最好是细菌)或真核细胞(最好是酵母或哺乳动物细胞)。
优选载体系统包括在昆虫细胞中表达的杆状病毒。所述DNA可以通
过转化、转导、转染、感染或本领域内已知的相关方法导入宿主生
物。除编码所述GP88多肽的DNA和mRNA夕卜,本发明还提供用于 表达所述核酸序列的方法。此外,所述遗传序列和寡核苦酸允许鉴 定和克隆具有与本文所述多肽GP88有序列同源性的序列的其它多 肽。
表达载体是能够表达已经克隆入所述载体的DNA (或cDNA)分 子并因此产生多肽或蛋白的载体(由于合适转录和/或翻译控制序列 的存在)。当将所述表达载体引入合适宿主细胞时,发生所克隆序列 的表达。假如使用一种原核生物表达载体,那么合适的宿主细胞将 是任何能够表达所述克隆序列的原核细胞。相似地,假如使用真核 表达系统,那么合适的宿主细胞将是任何能够表达所述克隆序列的 真核细胞。例如,可以使用杆状病毒载体克隆GP88 cDNA并随后在 昆虫细胞中表达所述cDNA。
可以根据常规技术,将编码GP88多肽或其功能衍生物的DNA 序列与载体DNA重组,所述常规技术包括平端化或用于连接的交错 化末端、限制酶消化以提供合适末端、根据需要填平粘端、碱性磷 酸酶处理以避免不希望的连接以及用合适连接酶进行连接。在(35) 中讨论用于所述操作的技术。
假如一种核酸分子包含含有转录和翻译调节信息的核苷酸序列 并且所述序列与编码所述多肽的核苷酸序列有效连接,那么这种核 酸分子就能够表达所述多肽。有效连接是这样的连接其中调节DNA 序列与要表达的DNA序列以允许基因表达的方式连接。基因表达所 需调节区的明确性质可能在生物之间各不相同,但 一 般应当包括一 个启动子区,在原核细胞中所述启动子区包含启动子(指导RNA转 录的开始)以及当转录成RNA时将引发蛋白合成起始的DNA序列。 所述区一般包含那些涉及转录、翻译起始的5'非编码序列,例如
27TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。
如果需要,可以通过所需方法(筛选合适cDNA文库或PCR扩 增)获得编码所述蛋白的基因序列的3'非编码区。可以为转录终止调 节序列例如终止和聚腺苷酸化的存在而保留该区。因此,通过保留 与编码所述蛋白的DNA序列天然相邻的3'区,可以提供所述转录终 止信号。当不提供所述转录终止信号或者所述转录终止信号在表达 宿主细胞中不能满意地起作用,那么可以用来自另一基因的3'区取 代。
两个DNA序列例如启动子区序列和GP88编码序列在下面情况 下有效连接假如序列间连接的性质并不导致引入移框突变或干扰 所述启动子序列指导所述多肽基因序列的转录。
所述启动子序列可以是原核的、真核的或病毒的。合适的启动 子是诱导型、阻抑型或组成型。合适原核启动子的例子见综述文献。
真核启动子包括但不限于小鼠金属硫蛋白I基因启动子、疱渗 病毒的TK启动子、gla4基因启动子、SV40早期启动子、小鼠乳腺 瘤病毒(MMTV)启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子。优选强启动子。 所述启动子的例子是那些识别T3、 SP6和T7聚合酶的启动子、噬菌 体入的PL启动子、recA启动子、小鼠金属石克蛋白I基因的启动子、 SV40启动子和CMV启动子。
诊断方法
技术领域
本发明还提供用于确定致瘤力的GP88诊断方法以及用于确定 患者是否抵抗抗雌激素疗法的抗肿瘤效应的诊断方法。如上文所述, GP88水平升高指示致瘤力增加。此外,本发明出人意料地发现GP88 水平升高指示对抗雌激素的抗肿瘤效应的抗性。
抗雌激素疗法干扰或抑制雌激素的功能或合成。例如,他莫昔 芬干扰雌激素结合其受体。芳香酶抑制剂如阿那曲唑干扰催化雄激 素转化成为雌激素的酶,由此降低雌激素水平。尽管不希望受到理论的限制,但是我们仍然相信GP88水平增 加促进细胞从生长依赖于雌激素转变为生长不依赖于雌激素。不依 赖于雌激素的细胞对雌激素存在与否不敏感,因此不受抗雌激素疗 法的影响。以前,用雌激素受体的存在作为抗雌激素疗法抗性必需
的预测标志。然而,当GP88水平增加并且细胞获得不依赖于雌激素 的生长时,雌激素存在与否不再足以指示所述患者是否响应抗雌激 素疗法。GP88水平以及伴随的和理论上的雌激素不依赖性(而不是 雌激素受体的存在)作为确定患者是否将抵抗或响应抗雌激素疗法的 增强的和更准确、更早期和可靠的预测标记。如上文解释的,考虑 到众所周知抗雌激素如他莫昔芬有在患者体内引起卵巢癌的趋势, 尤其是那些直到本发明出现前仍不知不觉地抵抗抗雌激素疗法的抗 肿瘤效应的患者,该新型预测标记尤其有价值。
本发明的优选实施方案涉及确定患者是否抵抗抗雌激素疗法的 抗肿瘤效应的方法。检测从患者获得的生物样品中的GP88蛋白或编 码GP88的多核芬酸,然后确定所述样品中GP88阳性细胞的数目以 及GP88阳性细胞与总细胞数的比例。GP88阳性细胞与总细胞数的 比例指示所述患者是否抵抗抗雌激素疗法的抗肿瘤效应。或者,通 过检测生物样品中的GP88,并从根据检测已知GP88蛋白或核酸量 获得的标准曲线("标准曲线技术,,)外推GP88的量,可以确定生物 样品中GP88的量。对于不容易在离散数量的细胞中检测GP88的生 物样品,所述标准曲线技术是测量GP88量的优选方法。例如,可以 使用标准曲线技术确定生物体液(如血清或脑脊髓液)中的GP88量。 生物样品中的GP88量指示所述患者是否抵抗抗雌激素疗法的抗肿 瘤效应。
优选的生物样品包括但不限于血液、脑脊髓液、血清、血浆、 尿、乳头吸出物、肝、肾、乳腺、骨、骨髓涂片、睾丸、脑、卵巢、 皮肤或肺。所述生物样品可以是任何大小、形状或组织类型,并且 包括任何细胞数量和/或细胞类型。所述生物样品可以包含非致瘤性
29细胞和致瘤性细胞。非致瘤性细胞可以包括但不限于来自正常组织、 外周组织、良性小叶癌、上皮细胞增生和任何其它良性病变的基质 细胞或上皮细胞。所述生物样品可以包括包含细胞或组织的生物体 液。
如上文讨论,可以通过任何合适方法;险测GP88蛋白,包括免 疫染色(如免疫组织学染色)、蛋白质印迹分析、色谱、微阵列、使用 抗GP88抗体的细胞分选仪。最好标记所述抗GP88抗体(如荧光染 料标记、生物素标记、酶标记、放射性同位素标记、荧光标记和化 学标记),用于合适的检测系统。也可以通过多种诊断成像技术,检 测GP88蛋白或其功能衍生物。术语"诊断成像"指使用标记分子检 测成像系统(如磁性共振成像、超声波等)中标记蛋白或核酸诊断疾病 疾病的任何技术。可以利用使用放射标记单克隆抗体的抗体成像诊 断多种癌症(如结肠癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌)。诊断成l象系统的 例子包括单克隆抗体成像系统如OncoScint⑧单克隆抗体成像系统, 该系统目前用于扫描才几体或对机体成4象,以i會断癌症。在常少见扫描 技术如MRI或超声波中可以使用单克隆抗体,以特异性一金测GP88 并确定生物样品中GP88的量或GP88阳性细胞的数目。
可以通过使用抗GP88核酸(如GP88 cDNA探针)的任何合适才全 测测定(如原位杂交、荧光原位杂交、逆转录酶-聚合酶链反应、RNA 印迹分析、DNA印迹分析、Southwestern印迹分析、RNAse/f呆护测 定、微阵列),用反义GP88核酸检测GP88核酸。最好使用例如酶 标记、放射性同位素标记、荧光标记或化学标记来标记所述抗GP88 核酸。
可以使用本领域内技术人员已知的任何合适方法(如显微镜才全 查、MRI、超声波、FACS分析、发光(luminex)检测、抗体微阵列、 数字扫描仪和细胞分选系统)计数GP88阳性细胞。例如,可以通过 以类似于Ki-67指数的方式,构建GP88指数,确定生物样品中GP88 阳性细胞的数目。Ki-67是一种DNA聚合酶标记,指示组织的增殖率。确定Ki-67阳性细胞的数目,表达为每1000个计数的细胞中Ki-67 阳性染色细胞的百分率。最好计数对GP88染色阳性的细胞,表达为 每1000个计数的细胞中GP88阳性染色细胞的百分率。然而,可以 计数任何数量的细胞。例如,为从患者获得更有代表性的细胞样品, 优选计数超过1000个细胞。假如所述样品看起来代表不同细胞类型 并且分析可利用的样品量有限,那么优选计数少于1000个细胞。
对于确定患者是否抵抗抗雌激素疗法的抗肿瘤效应的方法,最 好如下分级生物样品中GP88染色的存在和强度少于约5% GP88 阳性细胞被认为是GP88阴性;约10-25% GP88阳性细胞被认为是 GP88弱阳性(l+);约25-50% GP88阳性细胞(2+)被认为是GP88中 等阳性;超过约50% GP88阳性细胞被认为是GP88强阳性(3+)。根 据所述生物样品库的大小和/或用于鉴定GP88的检测技术(如免疫染 色、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、反向聚合酶链反应、RNA印 迹分析、蛋白质印迹分析、DNA印迹分析等),可以重新调整每个级 别GP88阳性细胞的百分率。例如,当使用更灵敏的GP88检测技术 或更大的生物样品库时,可以向下调节每个级别的GP88阳性或染色 细胞百分率。根据本发明的一个优选实施方案,至少约5%、更优选 10%、最优选25%的GP88阳性或染色细胞百分率指示对抗雌激素疗 法的抗肺瘤效应的抗性。在另一优选实施方案中,在雌激素受体阳 性患者体内至少约10% GP88阳性或染色细胞百分率指示对抗雌激 素疗法的抗肿瘤效应的抗性。
本发明还提供诊断致瘤力的方法,所述方法包括从患者获得生 物样品,检测所述生物样品中的GP88蛋白或编码GP88的多核苷酸, 确定所述样品中GP88阳性或染色细胞的数目以及给定样品中GP88 阳性或染色细胞与总细胞数相比的比例。GP88阳性或染色细胞与总 细胞数的比例指示致瘤力。检测生物样品中GP88最好如上文所述进 行,参考确定患者是否抵抗抗雌激素疗法的抗肿瘤效应的方法。
31在本发明的一个优选实施方案中,根据本领域内已知的标准强
度分级技术,以GP88阳性细胞百分率为基础,构建GP88染色强度 的分级等级。对于诊断致瘤力的方法,最好如下分级生物样品中 GP88染色的强度少于约1%GP88染色细胞被认为是GP88阴性或 0;约1-5% GP88染色细胞被认为是GP88弱阳性(l+);约5-25% GP88 染色细胞(2+)被认为是GP88中等阳性;超过约25%GP88染色细胞 (3+)被认为是GP88强阳性。根据所述生物样品库的大小以及用于鉴 定GP88的检测技术(如免疫染色、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、 反向聚合酶链反应、RNA印迹分析、蛋白质印迹分析、DNA蛋白质 印迹分析等),重新调整每个级别GP88染色细胞的百分率。例如, 当使用更灵敏的GP88检测技术或增加所述生物样品库时,可以向下 调节每个级别的GP88阳性或染色细胞百分率。根据本发明优选实施 方案,至少约1%的GP88染色细胞百分率指示致瘤力。
本发明还涉及诊断致瘤力或确定患者是否抵抗抗雌激素疗法的 抗肺瘤效应的试剂盒。本发明的优选试剂盒包含一个容器和一种用 于检测GP88的分子(如抗GP88抗体、GP88 cDNA探针、GP88寡聚 体探针)。试剂盒也可以包括用于生物样品免疫染色或原位杂交的试 剂。在优选实施方案中,本发明的试剂盒包括用于进行酶联免疫测 定("ELISA")的试剂(如抗GP88抗体、用于产生标准曲线的缀合的 和未缀合的重组GP88,用于检测的底物)。另一优选实施方案包括 用于实施检测GP88多核苷酸存在的反向聚合酶链反应方法的试剂。
本发明还提供治疗或预防癌症如乳腺癌的方法,所述方法包括 确定从患者获得的生物样品中GP88的量或GP88阳性细胞的百分 率,假如所述乳腺组织样品中GP88阳性或染色细胞的百分率少于约 5%,那么给予足以治疗或预防乳腺癌的量的他莫昔芬。在本发明另 一优选实施方案中,^假如所述生物样品中GP88阳性或染色细胞的百 分率少于约10%,那么给予雌激素受体阳性患者他莫昔芬或其它抗 雌激素疗法。假如GP88阳性或染色细胞的百分率大于5%,可以给
32予抗GP88疗法(即应用抗GP88抗体或反义GP88多核苦酸),恢复 对抗雌激素疗法的敏感性。根据每个病例确定足以治疗或预防癌症 的抗雌激素药的量。关于给予患者抗雌激素疗法的指导(如 Nolvadex⑧、雷洛昔芬、芳香酶抑制剂、雌激素受体负调节剂等)是 治疗医师容易获得并且已知的。
应当理解,根据本文的教导,应用本发明的教导于特定问题或 环境将在本领域内技术人员的能力范围内。本发明将通过下面非限 制性的实施例更完全地举例说明。
实施例1
PC细胞衍生的生长因子(GP88)介导人乳腺癌MCF-7细胞中的 雌激素促有丝分裂效应。
在雌激素受体阳性细胞中, 一种雌激素替代化合物17-P-雌二醇 (E2)在转录水平上以依赖于剂量和时间的方式刺激PCDGF表达。我 们在这里证明PCDGF在MCF-7细胞中介导雌二醇(E2)的促有丝分 裂效应。PCDGF取代E2刺激DNA合成。抗PCDGF中和抗体以依 赖于剂量的方式抑制E2的促有丝分裂效应。通过反义抑制对MCF-7 细胞中PCDGF表达的抑制也抑制E2的促有丝分裂效应。与此不同, PCDGF在MCF-7细胞中的过量表达导致能够在不存在雌激素的情 况下增殖并且抵抗他莫昔芬的MCF-7细胞。PCDGF象E2—样,刺 激促细胞分裂原激活的蛋白激酶活性。PCDGF能够取代E2,刺激细 胞周期蛋白Dl表达。抗PCDGF抗体抑制50% E2对细胞周期蛋白 Dl的激活。与此不同,PCDGF不刺激E2另 一个分子靶c-myc的表 达。我们得出结论自分泌PCDGF通过刺激细胞周期蛋白Dl,介 导E2的促有丝分裂效应。
根据PCDGF表达筛选人肺瘤细胞系指出PCDGF在雌激素受 体阴性(ER-)人类乳腺癌中高度表达。通过反义PCDGF cDNA转染抑 制这些细胞中的PCDGF表达导致当注射入棵鼠时抑制90%肿瘤发生率和肿瘤大小。这些数据提示PCDGF涉及维持胂瘤表型。如上文 指出,在ER+细月包中,应答雌激素受体刺激而产生的PCDGF介导 E2的促有丝分裂活性。当PCDGF过量表达时,细胞变得不依赖于 雌激素并且4氐抗抗雌激素的抗肿瘤效应。
结果
在^乏/夢濃,^餘沈T, PCZX F^^哀MCF-7勿f的ZWJ合成 我们首先检查加入PCDGF是否刺激在缺乏E2的情况下维持的 MCF-7细胞的DNA合成。在这些情况下,PCDGF的内源生产非常 低。在10 ng/ml PCDGF观察到3^胸苷掺入相对于对照增加2倍(细 胞在缺乏E2和PCDGF的情况下维持)(图16A)。图16A图解PCDGF 在缺乏E2的情况下刺激MCF-7细胞的DNA合成。将MCF-7细胞(每 孔105细胞)接种在DMEM和加入5% FBS的Ham,s F-12培养基的 1:1混合物中。48小时后,用PFMEM取代所述培养基,然后24小 时后用无血清a-MEM培养基取代。在培养基中 一式三份加入浓度增 加的人PCDGF。分别使用仅仅EtOH (CON)或1 (T9 E2 (E2)作为阴性 和阳性对照。24小时后加入3fi-胸苷(1 !iCi/ml)处理5小时。结果表 示为三次平行测定的平均值土SD。使用100 ng/ml PCDGF观察到4 倍的最大剌激(P〈0.001),与用IO'9 M E2观察到的最大刺激类似。 PCDGF刺激另一 ER+细胞系T47D的DNA合成。使用100 ng/ml PCDGF观察到2.9±0.3倍的刺激DNA合成。
用抗PCDGF抗体处理细胞抑制E2的促有丝分裂效应。根据这 些结果并假设E2刺激MCF-7细胞中的PCDGF表达,我们确定内源 PCDGF是否能够通过自分泌环介导E2的促有丝分裂效应。为该目 的,我们首先检查用阻断MCF-7细胞生产PCDGF的抗PCDGF抗 体处理是否会抑制E2的促有丝分裂活性。亲和纯化的抗人PCDGF 抗体的加入以依赖于剂量的方式抑制E2所刺激的细胞的生长(图 16B)。图16B图解抗PCDGF抗体特异性抑制E2的促有丝分裂效应。单独用l(T9 M E2 (E2)或者用浓度增加的亲和纯化的抗PCDGF抗体 处理MCF-7细胞50 ng/ml (Abl)、 100吗/ml (Ab2)、 200 pg/ml (Ab3) 和300 (ig/ml (Ab4)。用l(T9 M E2和300 |ig/ml免疫前IgG (prelgG) 处理的细胞和用10 ng/ml IGF-II (IGF)单独或者在300 )ig/ml抗 PCDGF抗体(Ab+IGF)存在下处理的细胞作为对照。结果如图,表示 为三次平行测定的平均值土SD。用300 |ig/ml抗PCDGF抗体观察到 对E2促有丝分裂效应74。/q的抑制(P〈0.003),而相似浓度的未免疫 IgG没有效应。该抗体浓度不显示细胞毒性。加入PCDGF (200 ng/ml) 恢复用抗PCDGF抗体处理的细胞的增殖。PCDGF抗体效应的特异 性也得到证明,因为它不能抑制MCF-7细胞的一种已知生长刺激物 胰岛素样生长因子II的刺激效应。这些结果显示PCDGF作为一种 自分泌生长因子作用,介导E2对MCF-7细胞的促有丝分裂效应。
对PCDGF表达的抑制在E2存在下抑制MCF-7细胞的生长。 下一步我们试图确定是否抑制MCF-7细胞中的PCDGF表达将阻止 E2的生长刺激效应。为该目的,我们检查其中PCDGF表达已经受 到反义PCDGF cDNA转染抑制的MCF-7细胞中E2的促有丝分裂效 应。对用相同细胞数目制备的样品进行蛋白质印迹分析,确定两个 有代表性的反义克隆Asl3和As22以及空载体对照转染MCF-7细胞 (MCF-7C)中的PCDGF水平(图17A)。图17A图解通过MCF-7细胞 中的反义PCDGF cDNA转染抑制PCDGF表达。通过蛋白质印迹分 析4企查反义(As13和As22)以及空载体对照转染细胞(MCF7-C)中的 PCDGF表达。用PFMEM中的l(T9 M E2处理AS13 (道1)、 AS22 (道 2)和MCF-7C细胞(道3)。 24小时后收集条件培养基,归一化到相同 细胞数目(4x106细胞),以测量PCDGF表达。Asl3细胞抑制80% PCDGF表达,而As22与MCF-7C细胞相比显示50%抑制。
然后在这些反义和对照MCF-7C细胞中片企查E2对DNA合成的 效应。[」H]胸苷掺入测定显示E2在MCF-7C细胞中的刺激效应与 PCDGF的抑制程度相关,在AS13和AS22中降低(图17B)。图17B图解抑制MCF-7细胞中的PCDGF表达抑制E2的促有丝分裂活性。 在反义和对照MCF-7C细胞中检查E2的促有丝分裂效应。用1(T9M E2 (E2)、 100 ng/ml重组PCDGF (PCDGF)或仅0.1% EtOH (CON)处 理AS13(实心条)、AS^(阴影条)和MCF-7C细胞(空心条)。如上文 所述测量3^1-胸苷掺入。结果如图,表示为平均值土SD。 AS13显示 对E2效应的最高抑制。E2介导的DNA合成在AS 13仅是MCF-7C 细胞中观察到的DNA合成的25% (P<0.001),在AS22中是60% (P<0.001)。加入PCDGF恢复反义克隆的增殖到在E2存在下培养的 对照MCF-7细胞中的水平。
PCDGF的《量4这#放雄濃邀#该 /4^必真者芬我#
根据上面结果,我们检查ER+ MCF-7细胞中PCDGF组成型过 量表达对它们的雌激素和他莫昔芬响应性的效果。用pcDNA3表达 载体转染MCF-7细胞,所述pcDNA3表达载体包含在巨细胞病毒启 动子控制下的PCDGF cDNA。获得几个PCDGF过量表达克隆,其 中包括一个命名为04的有代表性的克隆。图18A显示与耗尽E2 的培养基中的对照MCF-7C细胞相比,04细胞生产水平提高的 PCDGF。图18A图解04细胞和对照MCF-7C细胞中的PCDGF表 达。在PFMEM中培养04和空载体对照MCF-7细胞。24小时后收 集条件培养基,确定PCDGF表达。
04细胞中的胸苷掺入是MCF-7C细胞的2.2倍(P〈0.01),这证 明04细胞在缺乏E2的情况下增殖的能力(图18B)。图18B显示04 和对照MCF-7细胞在耗尽雌激素的PFMEM培养基中的增殖。细胞 一式三份接种在耗尽雌激素的PFMEM培养基中。细;!包或者在缺乏 E2的情况下维持(对照Con),或者用10-9 M E2或200 ng/ml PCDGF 处理24小时。然后加入31"1-胸苷,测量DNA合成。结果表示为平均 值士SD。此外,在耗尽E2的培养基内04细胞的胸苷掺入水平以及 用PCDGF或E2处理的MCF-7C细胞的胸苷4参入水平之间没有显著差异(P〉0.05)。与MCF-7C细胞不同,在04细胞加入E2或PCDGF 没有任何显著的加性效应。在长期生长测定中,虽然MCF-7C细胞 不能在缺乏E2的情况下生长,但04细胞以倍增时间42小时增殖, 该倍增时间接近MCF-7C细胞在E2存在下的倍增时间36小时。这 些数据指出在E2缺乏的情况下,PCDGF过量表达提供生长好处。 根据这些结果,检查04细胞和MCF-7C细胞的他莫昔芬响应 性。图18C显示MCF-7细胞和04细胞对他莫昔芬响应的比^^。 MCF-7C细胞(实心条)和04细胞(空心条)仅接受10-9 M E2,或者在 浓度增加的他莫昔芬存在下接受l(T9 M E2。还检查用200 ng/ml人 PCDGF和1 ^M他莫昔芬(T+P)处理的MCF-7C细胞。如图16所述 测量DNA合成。结果表示为仅用E2处理的细胞内DNA合成值的 百分率。他莫昔芬以依赖于剂量的方式抑制MCF-7C细胞增殖,在 100 nM抑制E2效应达60%,在500 nM抑制达80%,在1 他莫 昔芬达到最大抑制90% (图18C)。与此不同,表现对他莫昔芬显著 降低的响应性,因为它们的增殖不受100nM他莫昔芬的影响,而在 500 nM和1 ^M他莫昔芬分别仅观察到对E2效应的20%抑制和55% 抑制(P〈0.001)。有趣的是,在MCF-7细胞加入PCDGF降低他莫昔 芬抑制,从90%降到38%(P<0.0001)。这些数据显示PCDGF能够 克服他莫昔芬抑制,并且在MCF-7细胞中PCDGF表达增加导致他 莫昔芬抗性。
在所有转染细胞中评价与雌激素响应性有关的其它参数的状 态,例如雌激素受体表达、E2对雌激素响应元件的激活以及E2对 孕酮受体mRNA表达的刺激。这些测定中,在反义、对照和PCDGF 过量表达细胞之间没有观察到差异(数据未显示)。这些数据指出在 反义或过量表达细胞中观察到的E2增殖性响应改变不是由于ER数 目或功能的总体变化,而是与PCDGF表达的改变相关。PO)GF遞i5^f承^"^为、袭,^活f ^Jf濰卩"M4P ;哀^"途径冉濃 MC尸-7勿/S尹^D崩合A
下一步我们^r查MCF-7细胞中与E2相比,PCDGF刺激的信号 转导途径。已经显示E2刺激通过细胞周期G1期的进展。目前已经 阐明一些潜在的分子靶。已知E2刺激MCF-7细胞中的MAP激酶活 性。在下游,E2激活c-myc途径和D型细胞周期蛋白/cdk复合物。 最近的研究推断乳腺癌细胞中所述c-myc和细胞周期蛋白Dl途径独 立地受到E2激活。因此,我们尝试确定PCDGF是否能够取代E2, 在MCF-7细胞中刺激MAP激酶、细胞周期蛋白Dl和/或c-myc途 径。
两种方法显示MAP激酶涉及介导MCF-7细胞中的PCDGF活动。 首先,PCDGF对DNA合成的刺激效应以依赖于剂量的方式受到MEK 抑制物PD098059的抑制(图19A)。图19A显示MAP激酶抑制物对于 PCDGF促有丝分裂效应的影响。如图16所述培养MCF-7细胞。用 10 |iM (PD10)或30 |aM (PD30) PD098059预处理细胞60分钟,然后仅 加入媒介物(Con)或单独加入100 ng/ml重组人PCDGF (P)。胸苦掺入 数据表示为平均值土SD。 PCDGF效应几乎受到10 |iMPD098059的完 全废止。用30 |aM PD098059观察到完全抑制,已知该浓度在其它系 统中完全抑制MAP激酶活性。其次,通过使用体外MAP激酶测定, 我们显示PCDGF (200 ng/ml)引起MCF-7细胞中MAP激酶活性增加 三倍(图19B)。该效应被PD098059 (30 jaM)完全废止。图19B图解 PCDGF激活MAP激酶。细胞在PFMEM培养基中培养24小时,然 后在无血清a-MEM培养基中培养。检查的样品是用0、 50 ng/ml和 200 ng/ml人PCDGF处理10分钟的MCF-7细胞(分别是道1-3);以及 用200 ng/ml PCDGF和30 PD098059处理10分钟的MCF-7细胞 (道4)。如本文所述进行所述激酶测定。通过光密度扫描分析磷酸化 MBP带的强度。使用等量原始上清液检查MAP激酶表达(Erkl和 Erk2),作为归 一化MAP激酶活性的内部对照。PCDGF 4 AfC7勿/《^^/;发勿/d^欢资^ D/ ^这而不冉邀

进行实验确定PCDGF对细胞周期蛋白Dl表达的效应。PCDGF 在MCF-7细胞中以依赖于时间的方式刺激细胞周期蛋白Dl表达,5 小时后达到最大值,即未处理对照的4倍(图20A)。 PD98095以其抑 制PCDGF促有丝分裂效应的相同方式废止细胞周期蛋白Dl的刺激效 应。图20A显示PCDGF刺激细胞周期蛋白Dl表达。MCF-7细胞一 式三份在PFMEM培养基中培养,同时用1 pM他莫昔芬处理。用仅 补充200 ng/ml PCDGF或补充200 ng/ml PCDGF以及30 PD98095 (上)或10—9 M E2 (下)的新鲜培养基替换培养基。在指定时间裂解细胞, 用60 ng全细胞裂解物,使用抗细胞周期蛋白Dl抗体通过蛋白质印 迹分析测定细胞周期蛋白Dl表达。样品是用200 ng/ml PCDGF在0 小时(道l)、 3小时(道2)、 5小时(道3)和12小时(道4)处理的MCF-7 细胞;在5小时未处理的MCF-7细胞(道5);用200 ng/ml PCDGF和 PD08950在5小时处理的MCF-7细胞(道6);以及用10-9 M E2在时间 0小时、3小时和5小时处理的MCF-7细胞(分别是道7-9)。
PCDGF刺激细胞周期蛋白Dl表达伴随着pRb磷酸化和表达的 增加,pRb是Gl期进展严格所需的。PCDGF处理6小时后,pRB 变得高度磷酸化。24小时后,所有pRb都处于高度磷酸化的形式, 蛋白表达与未处理细^^目比增加到5倍。PD98095也阻断该效应(数 据未显示)。
下一步我们比较E2和PCDGF刺激c-myc表达表达的能力, c-myc表达是MCF-7细胞中雌激素作用的另 一个耙。如图20B所示, E2 (l(T9 M)在除去类固醇的MCF-7细胞中刺激c-myc表达快速增加, 3小时内达到最大4倍诱导。E2诱导的c-myc水平持续超过10小时。 与此不同,同一时期内PCDGF对c-myc蛋白表达没有效应(图20B)。 图20B图解E2和PCDGF对c-myc表达的效应。同时用1 他莫 昔芬处理MCF-7细胞。然后用l(T9 M E2 (上)或200 ng/ml PCDGF (下)处理细胞指定时间。使用60jig全细胞裂解物和抗myc多克隆抗体, 进行c-myc表达的蛋白质印迹分析;险测。
因为PCDGF诱导细胞周期蛋白Dl表达而不诱导c-myc表达, 所以我们确定内源PCDGF的增加是否涉及E2刺激细胞周期蛋白Dl 表达的能力。用抗PCDGF中和抗体(300吗/ml)处理MCF-7细胞在 加入所述抗体5小时后导致52±8%抑制E2对细胞周期蛋白Dl的刺 激。抑制程度在加入抗体后维持12小时。这些数据显示E2在MCF-7 细胞中刺激细胞周期蛋白Dl的能力至少部分由内源产生的PCDGF 介导。
讨论
我们以前报道,ER+人乳腺癌细胞表达PCDGF,并且E2以依赖 于剂量和时间的方式刺激PCDGF表达。我们在本文中证明PCDGF 介导E2的生长刺激效应。我们显示PCDGF刺激在缺乏E2的情况 下维持的人乳腺癌细胞MCF-7和T47D的增殖。我们随后显示用 抗PCDGF抗体阻端PCDGF自分泌途径抑制E2的促有丝分裂效应。 该效应特异性针对PCDGF,因为所述抗体不能抑制IGF-II的促有丝 分裂效应。通过显示反义cDNA转感染对PCDGF表达的抑制降低 E2对MCF-7细胞的促有丝分裂效应,并且与PCDGF表达的抑制程 度相关,进一步证明PCDGF参与E2的促有丝分裂效应。加入外源 PCDGF恢复这些反义细胞的增殖。此外,MCF-7细胞中PCDGF表 达增加导致能够在不存在E2的情况下增殖并且抗他莫昔芬的细胞。 E2响应性的其它参数如ER表达、雌激素响应元件荧光素酶报道基 因的激活或刺激孕酮受体表达没有改变,这指示转染细胞中E2促有 丝分裂效应的改变不是由于E2受体的改变,而明确地是由于PCDGF 表达的改变。
我们的结果显示PCDGF上调节细胞周期蛋白Dl,介导E2在 人乳腺癌细胞中的促有丝分裂效应。支持该假设的是,用抗PCDGF中和抗体处理MCF-7细胞5-12小时内,E2抑制52%细胞周期蛋白 Dl表达的激活。总之,本文描述的研究鉴定PCDGF至少部分是E2 对人乳腺癌细胞系MCF-7的促有丝分裂效应的新型介质。
实施例2 确定他莫昔芬抗性 我们已经显示通过反义cDNA转染抑制ER阴性乳腺癌细胞 中的GP88表达导致抑制致瘤力,这指出GP88过量表达在乳腺癌细 胞致瘤力中的重要性。因为乳腺癌在本质上是异质性的,并且可影 响腺体的各种细胞功能部分,所以优选检查进展模型各个阶段有代 表性的活组织检查,观察GP88表达。已经显示检测肿瘤标记是在 诊断或初级治疗时评价和预测乳腺癌临床发病病程的优选方法,并 且在确定疗法选择时是重要的。这些研究直接与妇女的健康相关, 因为它们提供了新型生长因子PCDGF作为潜在的乳腺癌预测标记 的分析。
使用亲和纯化的抗人GP88抗体,通过对石蜡包埋的活组织枱r 查的切片的免疫组织化学分析,跟踪GP88表达(图21)。所检查疾病 的进行期包括良性增生非典型腺管增生(ADH)^(原位腺管癌) DCIS—侵袭性腺管癌(IDC)^转移疾病。同时平行检查在乳腺癌进展 期间出现的代表遗传和生物学改变的选定标记。
对于所检查疾病的每个阶段(即包括上皮增生和纤维嚢性改变 的良性阶段、非典型腺管增生、原位腺管癌、侵袭性腺管癌;以及 转移乳腺癌),根据其它标记如Ki-67(增殖标记)、p53 (肿瘤抑制子)、 ER/PR (响应性)、cerbB2表达(生长因子受体)的检测平行检测GP88 表达,并与疾病的等级、阶段以及淋巴结状态进行相关研究。
通过组织病理学确定病变的阶-〖殳和类型以及通过检查几种其它 预测标记如Ki-67和ER/PR状态,对活组织4企查进行分类。结果指 出3级ER-/PR腺管癌中上皮细胞内的GP88表达对应于预后差的肿瘤。正常组织或良性小叶癌中的GP88表达为阴性。
方法
制备组织。从石蜡块上切下4^m厚的组织切片,固定在带电荷 的玻璃载玻片上。通过标准程序进行去石蜡、固定、抗原回收和切 片脱水。
制备抗人GP88抗体检测GP88表达的优选方法是通过使用亲 和纯化的抗人PCDGF抗体的免疫染色。用在本发明发明人是实验室 内表达和纯化的人重组PCDGF免疫兔或小鼠,发展多克隆或单克隆 抗人GP88抗体。对于多克隆抗体,通过硫酸钠沉淀和透析从兔抗血 清制备抗GP88 IgG组分。该组分在缀合GP88的Sepharose柱上层 析,进行亲和纯化,所述柱通过将纯人GP88偶联到CNBr活化的 Sepharose上而制备。通过SDS-PAGE层析分析所述高度纯化的抗体 组分,显示该组分包含对应于IgG的单一带,根据免疫染色,该组 分在固定细胞和组织切片上提供没有背景的高度特异性染色。或者, 可以使用抗GP88单克隆抗体。
如下进行免疫染色在湿度室内用特异性抗体在室温下温育如 上文所述制备的组织切片1小时,然后与抗GP88抗体温育。最好通 过与生物素化第二抗体和链霉抗生物素过氧化物酶复合物(Ventana 试剂盒)温育,检测抗体结合。最好通过将切片浸入3,3-二氨基联苯 胺溶液(0.25 mg/mL,含有3%过氧化氢),获得产色显影。然后最好 用苏木精负染所述载玻片,然后盖上盖玻片。
通过显微镜检查分析所述免疫染色数据。使用如下文指出的公 开方法为选定标记评分。在先技术的染色强度评分方法包括以下 用广泛使用的方法为核染色分级,确定ER和PR状态以及p53突变 形式的存在(<5%核染色-阴性;阳性染色为从弱(l+)到中等(2+)到强 (3+)的强度分级。通过膜染色的存在和强度评价c-erbB-2染色,并如 下分级<5%染色-阴性;阳性染色从弱(l+)到中等(2+)到强(3+)分级。分别对肿瘤细胞和周围基质的溶基质素-3表达进行分级,最好使用
用于ER/PR、 p53和c-erbB-2的方法进行评分。所述染色强度分级方 法可直接应用于4企测GP88。
我们的结果显示在正常组织和良性病变中,上皮细胞不对 GP88染色。与此不同,在ER7PR-侵袭性腺管癌中,上皮细胞显示 对GP88非常强的阳性染色。可以根据常规用于评分和标注其它乳腺 癌预测标记的方法,为GP88阳性上皮细胞的存在评分并分配级别。 下面评分和标注标准可用于评价GP88染色少于约5%染色是阴性; 约10-25%阳性染色分级为从弱(1+)到(中等25-50%阳性细胞(2+))到 强(3+)(多于50%阳性细胞)。只要获得大量样品的分析时,向下重新 调整每个级別阳性细胞的百分率。
除上文所述的方法和生物样品类型外,为预测抗雌激素疗法反 应而检测GP88表达可以延伸到测量生物体液如血清或血浆、尿或乳 头吸出物中GP88表达的增力口。为预测抗雌激素疗法反应而检测GP88 表达也可以容易地延伸到测量细胞提取物中的GP88表达增加。
所述检测方法包括但不限于酶联免疫测定,例如直接缀合酶(例 如但不限于过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素)或缀合荧光标记的抗 体或应用缀合的第二抗体(例如但不限于过氧化物酶、碱性磷酸酶、 链霉抗生物素或荧光标记)。
为选定标记评分的优选方法是本领域内众所周知的,在下面参考 文献中描述,所述参考文献的内容特此通过引用结合到本申请中 (l)Ferno, M. (1998)乳腺癌的预后因素,Anticancer Research, 18, 2167-2172; (2)Harbeck N., Dettmar, P., Thomssen, C., Henlselmann, B., Kuhn, W., Ulm, K., Janicke, F., Hofler, H., Graeff, H., Schmitt, M. (1998): 肺瘤生物学因子对淋巴结阴性乳腺癌存活率的预后影响,Anticancer Res. 18, 2187-2198; (3)Allred, D. C., Harvey, J. M., Berardo, M., Clark, G. M. (1998),通过免疫組织化学分析乳腺癌中的预后和预测因子, Mod. Pathol. 11, 155-168;和(4)Thor, A. D., Moore, D. H,, Edgerton, S. M., Kawasaki, E. S., Reihsaus, E., Lynch, H. T., Marcus, J. N., Scwartz,L., Chen, L. C., Mayall, B. H. (1992), p53抑制子基因产物积累增加是 乳&泉癌的独立预后变量,丄Natl. Cancer. Inst., 84, 845-855。
用抗GP88抗体的GP88染色 使用免疫组织化学技术,用抗GP88抗体对来自乳腺癌患者的石 蜡包埋的乳腺组织活组织检查进行染色。如图21所示,良性病变不 表现GP88染色,而侵袭性腺管癌("IDC")样品表现GP88细胞的强 染色。与良性病变相比,GP88表达在致瘤力侵袭性腺管癌中升高。
雌激素受体阳性(ER+)和雌激素受体阴性(ER-)侵袭性腺管癌 (IDC)胂瘤中的GP88染色强度 用抗GP88抗体对IDC肿瘤的生物样品进行免疫染色,根据它 们的雌激素受体状态(ER+^雌激素受体阳性,ER-=雌激素受体阴 性)和GP88染色强度等级进行分类。如图22所示,GP88染色强度 增加直接与IDC肺瘤中的雌激素受体损失相关。在染色强度0,所 有分析的IDC肿瘤样品都是ER+。在染色强度1, 80%的IDC肺瘤 是ER+, 20。/。是ER-。在染色强度2, 50%的IDC肿瘤是ER+, 50% 是ER-。在染色强度3, 20%的IDC肺瘤是ER+, 80%是ER-。因此, 当GP88染色强度增加时,ER+IDC肺瘤百分率降低。
根据GP88染色强度分类的ER+IDC肿瘤的他莫昔芬响应性 GP88染色强度增加指示细胞丧失生长对雌激素的依赖性,变为 不依赖于雌激素。细胞生长不再手来自激素例如雌激素的外部信号 控制,而是由来自GP88的自分泌生长信号控制。以前认为雌激素受 体的存在指示细胞是否能够响应抗雌激素疗法。然而,当细胞从雌 激素依赖型生长转换到不依赖于雌激素的生长时,雌激素受体的存 在与抗雌激素疗法是否有效不相关,因为细胞生长信号是组成型的, 不受雌激素或抗雌激素存在或不存在的控制。因此,有高水平GP88 (+2或更多)的雌激素受体阳性肿瘤抵抗抗雌激素疗法,尽管细胞具有雌激素受体。
为检查GP88水平增加对抗雌激素抗性的效应,从抵抗他莫昔 芬治疗的患者以及响应他莫昔芬治疗的患者获取IDC胂瘤样品。如 上文所述用抗人GP88抗体免疫染色所述肿瘤样品。如图23所示, 根据IDC肿瘤的GP88染色强度,在0到3的分级标准(x轴)上将它 们分级。沿y轴确定雌激素受体阳性(ER+)的总IDC肿瘤百分率,并 分类为响应他莫昔芬(白条)或抵抗他莫昔芬(黑条)。在染色强度级 别0,所有ER+ IDC肿瘤(40%的肿瘤总数目)都来自响应他莫昔芬的 患者。在染色强度级别1,所有ER+ IDC肿瘤(60。/。的肿瘤总数目) 都来自响应他莫昔芬的患者。然而,当染色强度从级别1增加到级 别2,所有ER+ IDC肺瘤(80。/。的肿瘤总数目)都来自抵抗他莫昔芬的 患者。在染色强度3,所有ER+肿瘤(30。/。的肿瘤总数目)都来自抵抗 他莫昔芬的患者。因此,当GP88强度从级别O增加到级别3时,甚 至ER+IDC肿瘤对他莫昔芬效应的抗性也不断增加。此外,当染色 强度从级别1增加到级别2,ER+IDC胂瘤完全从响应他莫昔芬转化 到抵抗他莫昔芬。尽管不希望被理论所限制,但是看起来从阶段3 到阶段4,他莫昔芬抗性肿瘤百分率随后的降低是由于GP88水平升 高时损失了雌激素受体(即ER+IDC肿瘤的百分率)。因此,图23证 明在丧失雌激素受体前,GP88水平增加将细胞从响应他莫昔芬疗 法的阶段(级别0和l)转化到抵抗他莫昔芬疗法的阶段(级别2和3)。 因此,与雌激素受体的存在相比,GP88作为指示患者是否响应抗雌 激素疗法或不受所述疗法过分伤害的更准确和更可靠的预后指标。
上面描述和附图〗叉举例说明能够实现本发明特征和好处的示例 实施方案。其意图不是限制本发明于本文详细显示和描述的实施方 案。可以修改本发明,加入直到目前未描述的但符合本发明精神和 范围的任何数量的变更、变化、取代或等价安排。本发明仅受到下 面权利要求的限制。
权利要求
1.抗GP88抗体和抗雌激素药在制备治疗或预防癌症复发的药物中的应用。
2. 权利要求1的应用,其中所述癌症选自乳腺癌、卯巢癌、 肾癌、骨癌、胰癌、睾丸癌、肝癌、脑癌、结肠癌、肺癌和皮肤癌。
3. 权利要求1的应用,其中所述抗雌激素药选自他莫昔芬、 雷洛昔芬、芳香酶抑制剂和雌激素受体负调节剂。
4. 抗GP88抗体和抗雌激素药在制备治疗或预防患者癌症复发的 药物中的应用,所述应用包括确定从所述患者获得的生物样品中的 GP88量;如果所述生物样品中的GP88量少于约5%,则给予足以治 疗或预防所述癌症的剂量的抗雌激素药。
5. 抗GP88抗体和抗雌激素药在制备治疗或预防患者癌症复发的 药物中的应用,所述应用包括确定从所述患者获得的生物样品中的 GP88量;如果所述生物样品中的GP88量少于约10%,则给予足以治 疗或预防所述癌症的剂量的抗雌激素药。
6. 权利要求4的应用,其中所述抗雌激素药选自他莫昔芬、 雷洛昔芬、芳香酶抑制剂和雌激素受体负调节剂。
7. 权利要求4的应用,其中所述生物样品包括选自以下的材料: 血液、血清、血浆、尿、乳头吸出物、脑脊髓液、肝、肾、乳腺、骨、 脑、结肠、肺、睾丸或卵巢。
8. 权利要求4的应用,其中所述患者已经被诊断为癌症。
9. 权利要求4的应用,其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、 肾癌、骨癌、胰癌、睾丸癌、肝癌、脑癌、结肠癌、肺癌和皮肤癌。
全文摘要
诊断致瘤力和确定癌症患者是否抵抗抗雌激素疗法的药理作用的方法和试剂盒。PCDGF(GP88)生长因子水平增加指示致瘤力以及对抗雌激素疗法的药理作用的抗性。本发明的方法和试剂盒用于评价来自患者的生物样品的致瘤力以及确定所述患者是否是抗雌激素(包括他莫昔芬)疗法的对象。
文档编号A61K38/00GK101584862SQ20081009288
公开日2009年11月25日 申请日期2002年6月14日 优先权日2001年6月15日
发明者G·塞尔雷罗 申请人:A&D药品公司
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