专利名称：：蒙古黄芪凝集素的一种新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蒙古黄芪凝集素的一种新用途。
背景技术：
：中草药主要根据其所含有的活性成分入药，为了充分利用资源和探索新的活性成分，近年来，已有许多具有生物活性的物质相继在多种中草药中被发现。分离纯化中草药中的活性蛋白质成分，以期找到更多具有生物活性的蛋白质源，已经成为国内外众多学者的一个重要的研究方向。黄益玲等研究证明，天花粉蛋白能够抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖和诱导其调亡(黄益玲等.天花粉蛋白对人宫颈癌HeLa细胞增殖和细胞调亡的影响.中国药理学通报.2005,21(2):253-254)。黄芪是豆禾斗(Z^gw附/way"e)、虫棠形花亚禾斗(尸a;^7/o"o/(ie"e)、黄芪属(JWrflga/ws丄/"")月莫荚黄芪(J5traga/ws附e附6n3"flcetw卩尸&cA.」5ge.)禾口蒙古黄蔑(JWnaga/wsmew6n3"acews卩尸/sc/2.,6ge.ww.mo"g/zo//cw1s(F/sc/J//s/flo)的f艮。目前，又寸黄度中有效成分的研究主要集中在多糖、皂甙和黄酮等物质，对于黄芪中含量很高的蛋白质组分(15%以上)的研究则报道很少。申请人从蒙古黄蔑中分离得到凝集素(YanArch.Biochem.Bophys.2005,(442):72-81.)，并采用多步离子层析法进行纯化，纯化过程比较复杂且回收率低。ConA-Sepharose4B亲和层析可用于部分凝集素的纯化(AbsarN.,YeasminT.,RazaM.S.,SarkarS.K.,ArisakaF.,Singlesteppurification,characterizationandN-terminalsequencesofamannosespecificlectinfrommulberryseeds,ProteinJ.2005,(24):369-377.罗瑞鸿和李杨瑞.木豆凝聚素对蚜虫的抗性研究.武汉植物学研究.2005,23(3):497-502)，但采用ConA-Sepharose4B亲和层析纯化黄芪凝集素尚未见报道。中国发明专利(申请号200510112084.9)介绍了一种桑寄生凝集素的制备方法，采用琼脂糖亲和柱层析进行纯化。凝集素抗肿瘤生物活性的研究已经引起国内外学者的兴趣，目前已经纯化出许多种植物凝集素、动物凝集素和微生物凝集素，并对其抗肿瘤生物活性进行了一定的研究。目前的研究认为，槲寄生发挥其抗肿瘤活性的主要成分是凝集素和生物碱类，其抗肿瘤作用主要是通过诱导细胞调亡和调节机体免疫功能来实现的(倪曙民.槲寄生凝集素抗肿瘤作用及其机制研究进展.国际肿瘤学杂志.2007,34(3):170-173.傅炜昕，梁再斌，李铁英，索德泰.槲寄生凝集素对肿瘤细胞细胞周期的影响.沈阳药科大学学报.2005,22(1):59-61)。除槲寄生凝集素外，至今已发现有多种植物种属来源的凝集素，如桑寄生凝集素，具有抗肿瘤活性(潘鑫，刘山莉.中药桑寄生凝集素的分离及体外抗肿瘤活性的研究.天然产物研究与开发.2006，18:210-213.)。迄今，尚无关于黄芪凝集素抗肿瘤活性的相关研究报道。
发明内容本发明的目的是提供蒙古黄芪凝集素的一种新用途。本发明所提供的蒙古黄芪凝集素的新用途，是指蒙古黄芪凝集素在抑制肿瘤细胞增殖，特别是抑制宫颈癌HeLa细胞、白血病K562细胞和人骨瘤MG63细胞增殖中的应用。所述蒙古黄芪凝集素，是按照如下方法制备的1)将蒙古黄芪的根粉碎后用现有的方法进行浸提，如采用磷酸缓冲液浸提，分离上清液得到蒙古黄芪粗提液；2)将上述步骤l)得到的粗提液进行盐析，如用硫酸铵进行沉淀，沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，再将溶解液透析，透析后的溶液离心，获得上清液；3)将上述步骤2)获得的上清液用ConA-Sepharose4B亲和层析柱进行层析，再将层析后的溶液透析，透析后的溶液浓縮得到蒙古黄芪凝集素。上述方法中，所述步骤l)中磷酸缓冲液的浓度为0.02—0.1mol/L，pH值为6.2—8.2，pH值优选为7.0—7.5;所述蒙古黄芪与磷酸缓冲液的配比为1g:(4-10)mL;所述浸提的反应条件为4一2(TC搅拌条件下提取3—8h，浸提温度优选为4一1(TC，浸提时间优选为4一6h。所述步骤2)中向粗提液中加入硫酸铵，使其在粗提液中的饱和度为40%—60%;所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01—0.05mol/L，pH值为6.4—8.4，pH值优选为7.0—7.5;所述离心的速度为8000—12000xg。所述步骤3)中层析时，先用如下溶液洗去未结合的蛋白所述溶液的pH值为6.4—8.4，pH值优选为7.0—7.5，所述溶液的溶剂为0.01—0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述溶液的溶质为终浓度为1—5mmol/LCa2+、1—5mmol/LMn2+、l一5mmol/LMg"和0.2—1.0mol/LNaCl;然后用如下溶液洗脱结合的蛋白所述溶液的pH值为6.4—8.4，所述溶液的溶剂为0.01—0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述溶液的溶质为终浓度为1mol/LNaCl和0.4—1mol/L葡萄糖或1mol/LNaCl和0.4—1mol/L甲基-a-D-葡萄糖苷。所述步骤3)中层析时，上样的流速为0.1—0.5mL/min，洗脱结合蛋白时缓冲液的流速为0.2—1.0mL/min;所述透析液的pH值为6.4—8.4，透析液的溶剂为0.01—0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质为终浓度为1—5mmol/LCa2+、l一5mmol/LMn2+、1一5mmol/LMg"和0.2—1.0mol/LNaCl。实验证明，蒙古黄芪凝集素对HeLa细胞系、K562细胞系及MG63细胞系均具有明显的抑制作用，对HeLa细胞的细胞形态、细胞周期和细胞凋亡产生影响，可作为抗癌药物的有效成分。图1为SDS-PAGE检测纯化结果图2为蒙古黄芪凝集素对HeLa细胞、K562细胞和MG63细胞体外增殖的抑制率变化曲线图3为HeLa细胞形态变化图图4为HeLa细胞DAPI染色图图5为蒙古黄芪凝集素作用于HeLa细胞12h和24h后细胞周期的变化图6为蒙古黄芪凝集素作用于HeLa细胞12h、24h和36h后细胞的调亡情况具体实施例方式下述实施例中所述方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所述百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、蒙古黄芪凝集素的制备1、蒙古黄芪粗提液的制备将10g蒙古黄芪的根粉碎成40目的粉末后，加入60mL的50mmol/L、pH7.2的磷酸缓冲液(使蒙古黄芪粉末与磷酸缓冲液的配比为lg:6mL)，4'C条件下搅拌提取4h。将提取液用4层纱布过滤，滤液于4"C条件下10OOOxg离心20min，取上清液，即得到蒙古黄茛粗提液。2、粗提液的盐析及透析在上述步骤1获得的蒙古黄芪粗提液中加入硫酸铵粉末至饱和度为40%—60%，搅拌30min后，12OOOxg离心15min;取沉淀，用20mmol/L、pH7.4的Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，然后在如下溶液中透析过夜所述溶液的溶剂为20mmol/L、pH7.4的Tris-HCl缓冲液，溶质为终浓度为2mmol/LCaCl2、2mmol/L6MnCl2、2腿ol/LMgCl2禾口0.5mol/LNaCl，反应液再10000xg离心15min，取上清液备用。3、ConA-Sepharose4B亲和层析先用pH为7.4的溶液A(溶液A的溶剂为20mmol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质为终浓度为2mmol/LCaCl2、2mmol/LMnCl2、2mmol/LMgCl2和0.5mol/LNaCl)预平衡ConA-Sepharose4B亲和柱，然后将上述步骤2获得的上清液上样于预平衡好的ConA-Sepharose4B亲和层析柱中(1.0x3cm)，上样流速为0.3mL/min。30min后，先用pH为7.4的上述溶液A洗去未结合的蛋白，缓冲液的流速为0.4mL/min，洗脱时间为175min;然后用pH为7.4的溶液B(溶液B的溶剂为20mmol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质为终浓度为lmol/LNaCl和lmol/L葡萄糖)洗脱结合的蛋白，缓冲液的流速为0.5mL/min，洗脱时间为60min;最后将收集的结合的蛋白超滤浓縮(截留分子量10kDa)，即得到蒙古黄芪凝集素。4、SDS-PAGE检测凝集素的纯化效果将上述步骤1得到的蒙古黄芪粗提液、步骤2得到的硫酸铵沉淀溶液和步骤3用ConA-Sepharose4B亲和层析得到的蒙古黄芪凝集素分别进行SDS-PAGE电泳检测，采用12.5%的分离胶、考马斯亮蓝R250染色，纯化结果如图l所示。其中，1为步骤1得到的蒙古黄芪粗提液的SDS-PAGE，2为步骤2得到的硫酸铵沉淀溶液的SDS-PAGE，3为步骤3用ConA-Sepharose4B亲和层析得到的蒙古黄芪凝集素的SDS-PAGE，M为14.4—97.0kDa的蛋白质分子量标准。结果表明，步骤3中获得的蒙古黄芪凝集素的纯度达到电泳纯。5、检测蒙古黄芪凝集素的凝集活性将上述步骤1得到的蒙古黄芪粗提液、步骤2得到的硫酸铵沉淀溶液和步骤3用ConA-Sepharose4B亲和层析得到的蒙古黄芪凝集素分别采用Lowiy方法(Lowryetal.，Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent,J.Biol.Chem.1951,(193):265-275.)，以牛血清蛋白为标准，进行蛋白浓度测定，结果如表1所示。表1纯化步骤总活性总蛋白比活纯化倍数回收率加)(mg)(HU/mg)(%)粗提液800019840.41100硫酸铵沉淀(40-60%)656297.267.51.6782.07ConA-Seph國e4B__17.4222.1_^_48,3在96微孔板上加入50上述各步骤得到的样品，与等体积的生理盐水倍比稀释后分别加入50pL2。/。兔红细胞悬液，振荡摇匀后，室温下放置2h，观察结果。将1个凝集活性单位(HU)定义为样品呈现完全凝集时的最低稀释倍数的倒数，总活性为样品总的凝集活性单位；纯化倍数为样品的比活除以初始粗提液的比活；回收率为样品的总活性除以初始粗提液的总活性。蒙古黄芪凝集素中凝集活性的测定结果如表l所示。实施例2、蒙古黄芪凝集素的制备1、蒙古黄芪粗提液的制备具体制备方法同实施例1步骤1。2、粗提液的盐析及透析具体制备方法同实施例1步骤2。3、ConA-Sepharose4B亲和层析先用pH为7.4的溶液A(溶液A的溶剂为20mmol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质为终浓度为1mmol/LCaCl2、1mmol/LMnCl2、1mmol/LMgCl2和1mol/LNaCl)预平衡ConA-Sepharose4B亲和柱，然后将上述步骤2获得的上清液上样于预平衡好的ConA-Sepharose4B亲和层析柱中(1.0x3cm)，上样流速为0.1mL/min。30min后，先用pH为7.4的上述溶液A洗去未结合的蛋白，缓冲液的流速为0.3mL/min，洗脱时间为210min;然后用pH为7.4的溶液B(溶液B的溶剂为20mmol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质为终浓度为lmol/LNaCl和1mol/L甲基-a-葡萄糖苷)洗脱结合的蛋白，缓冲液的流速为0.5mL/min，洗脱时间为60min;最后将收集的结合的蛋白超滤浓縮(截留分子量10kDa)，即得到蒙古黄疾凝集素。4、SDS-PAGE检测蒙古黄芪凝集素的纯化效果将上述步骤1得到的蒙古黄芪粗提液、步骤2得到的硫酸铵沉淀溶液和步骤3用ConA-Sepharose4B亲和层析得到的蒙古黄芪凝集素分别进行SDS-PAGE电泳检测，采用12.5%的分离胶、考马斯亮蓝R250染色。结果表明，步骤3中获得的蒙古黄芪凝集素的纯度达到电泳纯。5、检测蒙古黄芪凝集素中的凝集活性将上述步骤1得到的蒙古黄芪粗提液、步骤2得到的硫酸铵沉淀溶液和步骤3用ConA-Sepharose4B亲和层析得到的蒙古黄芪凝集素分别采用Lowry方法(Lowryetal.，Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent,J.Biol.Chem.1951,(193):265-275.)，以牛血清蛋白为标准，进行蛋白浓度测定，结果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>42在96微孔板上加入50上述各步骤得到的样品，与等体积的生理盐水倍比稀释后分别加入50pL2。/。兔红细胞悬液，振荡摇匀后，室温下放置2h，观察结果。其中总活性、纯化倍数和回收率的具体计算方法同实施例1。蒙古黄芪凝集素中凝集活性的测定结果如表2所示。实施例3、采用MTT法测定蒙古黄贫凝集素对肿瘤细胞体外增殖的抑制将HeLa细胞、K562细胞和MG63细胞分别接种于含5mL培养液的50mL培养瓶中(HeLa细胞和MG63用DMEM培养液，K562细胞用RPMI1640培养液)，置于37"C、5%(:02的生化培养箱中培养；当细胞进入对数生长期时，将其制成浓度约为lx105个/mL的细胞悬浮液，按照每孔200pL的量加入到96孔板中，置于37°C、5XC02的生化培养箱中培养24h。将上述实施例1获得的蒙古黄甚凝集素分别加入到上述培养有HeLa细胞、K562细胞和MG63细胞的96孔板中，使蒙古黄芪凝集素的终浓度分别为0、2.5、5、10、20、40、60和80pg/mL，每个浓度3个重复；空白对照组加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。分别培养上述细胞48h后，弃掉上清液，每孔加入200nL终浓度为0.5mg/mL的MTT，37。C恒温箱中避光孵育4h;再次弃掉上清液，每孔加入150^L二甲基亚砜(DMSO)，微量振荡器上振荡10min，待晶体完全溶解后，用酶标仪在492nm处检测OD值，计算出细胞生长抑制率。结果如图2所示。细胞生长抑制率的具体计算公式如下细胞生长抑制率(n/。)二(试验组OD492^—对照组OD492咖)/(对照组OD492腦-DMSO的OD492nm)x100%实验设三次重复，结果表明，蒙古黄甚凝集素对HeLa细胞、K562细胞和MG639细胞的增殖都有明显的抑制作用，浓度为80pg/mL的蒙古黄芪凝集素处理48h后，对HeLa细胞、K562细胞和MG63细胞的抑制率最高，对HeLa细胞、K562细胞和MG63细胞的最高抑制率分别为92%、84%和48%。由于蒙古黄芪凝集素对HeLa细胞的最大抑制率最高，因此把HeLa细胞系作为进一步深入研究的细胞系。从图2中可以看出，蒙古黄芪凝集素对HeLa细胞系抑制率变化的曲线表现为剂量依赖性。实施例4、蒙古黄芪凝集素对HeLa细胞形态学变化的影响在光学显微镜(1x10)下观察不同浓度的蒙古黄芪凝集素处理后HeLa细胞的形态学变化，结果如图3所示。其中，图3a为对照组HeLa细胞的生长情况，图3Bb为40吗/mL的蒙古黄芪凝集素处理48h时HeLa细胞的生长情况。结果表明，40pg/mL的蒙古黄芪凝集素处理HeLa细胞48h时，细胞形态就会发生明显变化，细胞从培养板上漂浮并死亡，并且随着蒙古黄芪凝集素浓度的增加这种现象更加明显。实施例5、蒙古黄芪凝集素对HeLa细胞周期变化的影响用PI单染法，通过流式细胞仪用CellQuest软件收集细胞，用modfitLTformac3.0软件进行细胞周期的分析，检测蒙古黄芪凝集素对细胞周期变化的影响，具体过程如下将上述用浓度分别为20pg/mL和40pg/mL的蒙古黄芪凝集素处理12h和24h的HeLa细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，合并培养液和消化液，1200xg离心5min收集细胞(其中含有脱离有丝分裂、调亡和坏死的细胞)，用预冷的PBS(磷酸缓冲盐溶液)重复洗涤上述细胞2次，然后用70。/。的乙醇4X:下固定过夜。固定后，再用预冷的PBS洗涤2次，加入500RNaseA(100|ig/mL)，37。C下水浴30min;离心去除上清液(含RNaseA)，加入300PBS重悬细胞，上流式细胞仪前加入100pL10XPI(终浓度为100pg/mL)溶液，避光反应5min后上流式细胞仪，用CellQuest软件进行细胞的收集，用modfitLTformac3.0软件进行细胞周期的分析。HeLa细胞对蒙古黄芪凝集素的时间依赖性和剂量依赖性的结果如图4所示。其中，图4a为蒙古黄芪凝集素处理12h时的结果，图4b为蒙古黄芪凝集素处理24h时的结果。实验设三次重复，结果表明，蒙古黄芪凝集素处理12h和24h时，HeLa细胞S期的百分率均明显增加，说明蒙古黄芪凝集素处理12h和24h后HeLa细胞发生S期阻滞。浓度分别为20pg/mL和40pg/mL的蒙古黄芪凝集素处理12h时，HeLa细胞S期比对照组增加约为7.5-8%;当处理时间为24h时，HeLa细胞S期的百分数增加到34-39X。同时由图中也可以看出蒙古黄芪凝集素处理后，HeLa细胞Go/Gj期百分率减少。实施例6、蒙古黄芪凝集素对HeLa细胞调亡的影响对40pg/mL的蒙古黄芪凝集素分别处理0、12h、24h和36h后的HeLa细胞进行DAPI染色，荧光倒置显微镜(10X40)下观察细胞核的形态变化，具体的染色方法如下用lxPBS分别洗涤上述蒙古黄芪凝集素处理12h、24h禾口36h的HeLa细胞3次，每次3min，然后于室温下用3.7%的多聚甲醛(PFA/PBS)固定10min，固定后的HeLa细胞再用PBS洗涤3次，每次3min;再用0.1%TritonX-100室温孵育细胞2min，然后用PBS洗3次(每次3min);之后加入浓度为10ng/mL的DAPI染色剂染色，室温避光反应10min;最后用PBS避光洗涤3次，每次3min。荧光倒置显微镜(10X40)下观察细胞核的形态变化，结果如图5所示。其中，图5a为对照组HeLa细胞的DAPI染色结果，图5b为蒙古黄芪凝集素处理12h后HeLa细胞的DAPI染色结果，图5c为蒙古黄芪凝集素处理24h后HeLa细胞的DAPI染色结果，图5d为蒙古黄底凝集素处理36h后HeLa细胞的DAPI染色结果。从图中可以看出，对照组HeLa细胞的细胞核为圆形，蒙古黄芪凝集素处理HeLa细胞后，细胞形态开始出现细胞调亡的特征，细胞核染色质固縮，细胞核呈致密浓度或呈碎块致密染色并出现调亡小体。DAPI染色结果表明，蒙古黄芪凝集素可以使HeLa细胞发生细胞调亡。同时采用AnnexinV-FITC/PI双染法，使用流式细胞仪用CellQuest软件进行细胞调亡的分析，具体方法如下将上述浓度为40pg/mL的蒙古黄芪凝集素处理12h、24h禾卩36h的HeLa细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，合并培养液和消化液，4'C下1200xg离心5min收集细胞，调整细胞浓度至少为1(^个/mL;取lmL细胞，4'C下1200xg离心10min，弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞2次。将细胞悬浮于300pL结合缓冲液中，加入10|iLAnnexinV-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15min或4"C反应30min;上流式细胞仪前5min再加入5pLPI，然后上流式细胞仪，用CellQuest软件进行调亡分析。实验设三次重复，其中一次实验的具体结果如图6所示。图6a为对照组HeLa细胞的流式细胞仪检测结果，图6b为蒙古黄芪凝集素处理12h后HeLa细胞的流式细胞仪检测结果，图6c为蒙古黄芪凝集素处理24h后HeLa细胞的流式细胞仪检测结果，图6d为蒙古黄芪凝集素处理36h后HeLa细胞的流式细胞仪检测结果。其中，右下象限表示中早期的细胞百分率，右上象限表示中晚期的细胞百分率，左下象限表示正常活细胞百分率，左上象限表示操作误差。结果表明，其中一次实验中，对照组HeLa细胞的中早期和中晚期细胞百分率分别为2.42%和8.51%,蒙古黄芪凝集素处理12h后，HeLa细胞的中早期和中晚期细胞百分率分别增加到7.71%和10.61%，蒙古黄芪凝集素处理24h后，HeLa细胞的中早期和中晚期细胞百分率迅速增加到31.39%和40.1%，蒙古黄芪凝集素处理36h后，HeLa细胞的中早期和中晚期细胞百分率迅速增加到17.42%和71.91%。以上结果说明，HeLa细胞调亡对蒙古黄芪凝集素呈现出时间依赖性。权利要求1、蒙古黄芪凝集素在抑制肿瘤细胞生长中的应用；所述蒙古黄芪凝集素是按照如下方法制备的1)将蒙古黄芪的根粉碎后用磷酸缓冲液浸提，分离上清液得到蒙古黄芪粗提液；2)将上述步骤1)得到的粗提液用硫酸铵沉淀，沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解后进行透析，透析后的溶液离心，收集上清液；3)将上述步骤2)获得的上清液用ConA-Sepharose4B亲和层析柱进行层析，再将层析后的溶液透析，透析后的溶液浓缩得到蒙古黄芪凝集素。2、根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述步骤l)中磷酸缓冲液的浓度为0.02—0.1mol/L，pH值为6.2—8.2，pH值优选为7.0-7.5。3、根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述步骤l)中蒙古黄芪的根粉碎后与磷酸缓冲液的配比为lg:(4-10)mL。4、根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述步骤l)中浸提的反应条件为4一2(TC搅拌条件下提取3—8h，优选为4一10。C搅拌条件下提取4一6h。5、根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述步骤2)中向粗提液中加入硫酸铵，使其在粗提液中的饱和度为40%—60%。6、根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述步骤2)中Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01—0.05mol/L，pH值为6.4—8.4，pH值优选为7.0-7.5。7、根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述步骤3)中层析时，先用如下溶液洗去未结合的蛋白所述溶液的pH值为6.4—8.4,pH值优选为7.0-7.5，所述溶液的溶剂为0.01—0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述溶液的溶质为终浓度为1一5mmol/LCa2+、1一5mmol/LMn2+、1一5mmol/LMg"和0.2—1.0mol/LNaCl;然后用如下溶液洗脱结合的蛋白所述溶液的pH值为6.4—8.4，pH值优选为`7.0-7.5，所述溶液的溶剂为0.01—0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述溶液的溶质为终浓度为1mol/LNaCl和0.4—1mol/L葡萄糖或1mol/LNaCl和0.4—1mol/L甲基-a-D-葡萄糖苷。8、根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述层析时上样的流速为0.1—`0.5mL/min，所述洗脱结合蛋白时缓冲液的流速为0.2—1.0mL/min。9、根据权利要求l所述的应用，其特征在于步骤2)和步骤3)透析时，所述透析液的pH值为6.4—8.4，所述透析液的溶剂为0.01—0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述透析液的溶质为终浓度为1—5mmol/LCa2+、1一5mmol/LMn2+、l一5mmol/LMg2+和0.2—1.0mol/LNaCl。10、根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述应用是指蒙古黄丧凝集素在抑制宫颈癌细胞、白血病细胞和人骨瘤细胞增殖中的应用。全文摘要本发明公开了蒙古黄芪凝集素的一种新用途。所述蒙古黄芪凝集素的新用途，是指蒙古黄芪凝集素在抑制肿瘤生长，特别是抑制宫颈癌细胞HeLa、白血病细胞K562和人骨瘤细胞MG63增殖中的应用。所述蒙古黄芪凝集素，是按照如下方法制备的1)将蒙古黄芪的根粉碎后用现有的方法进行浸提，如采用磷酸缓冲液浸提，分离上清液得到蒙古黄芪粗提液；2)将上述步骤1)得到的粗提液盐析，如硫酸铵进行沉淀，沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，再将溶解液透析，透析后的溶液离心，获得上清液；3)将上述步骤2)获得的上清液用ConA-Sepharose4B亲和层析柱进行层析，再将层析后的溶液透析，透析后的溶液浓缩得到蒙古黄芪凝集素。文档编号A61K38/16GK101647998SQ200810118359公开日2010年2月17日申请日期2008年8月14日优先权日2008年8月14日发明者朱利芬,李艳霞,江正强,闫巧娟申请人:中国农业大学