胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表达载体的构建、筛选及其用途的制作方法

专利名称：：胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表达载体的构建、筛选及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及表达a-1，3/4-岩藻糖基转移酶(a1,3/4-fucosyltransferase,FUT3)基因的胃癌的基因治疗药物，具体涉及耙向胃癌FUT3基因的miRNAs表达载体的构建、筛选及其用途，属于生物医药
技术领域：
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背景技术：
：FUT3基因编码的FUT3酶是岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase，FUTs)家族成员之一，因其既有。1，4-岩藻糖基转移酶活性，又有(！1，3-岩藻糖基转移酶活性，所以又称a1,3/4-岩藻糖基转移酶。它不仅参与路易斯(Lewis)血型抗原I型(包括LewisA和LewisB)和II型(包括LewisX和、LewisY)的生物合成，而且也与唾液酸化的Lewis抗原(SialylLewisA和SialylLewisX，即SLea和SLex)的合成密切相关。SLea和SLex在许多肿瘤细胞表面表达量异常升高，是血管内皮细胞(E)表面或血小板(P)表面选凝素(selectin)的配体；SLea和SLex抗原作为肿瘤相关抗原，它们在肿瘤细胞上的表达水平还与肿瘤转移相关。大多数肿瘤患者血清和肿瘤组织中岩藻糖基转移酶的活力大大增强，特别表现在肺癌、胃癌、卵巢癌中。肿瘤患者血清中岩藻糖基转移酶的活力水平与癌症的进程及病灶的大小有关。近年来，有学者致力于改变岩藻糖基转移酶的活性进而影响Lewis抗原的表达，去影响恶性肿瘤细胞的黏附等恶性行为的研究。通过应用分化诱导剂改变肝癌细胞中FUT7的表达，下调SLeX的表达，从而抑制其转移潜能(LiuF，QiHL,ZhangY，etal.Transfectionofthec-erbB2/neugeneupregulatestheexpressionofsialyLewisX，alpha1,3-fucosyltransferaseVD,andmetastaticpotentialinahumanh印atocarcinomacellline.EurJBiochem，2001Jun;268(12):3501-12)。Weston等通过针对FUT3的反义核酸来阻断al,3-岩藻糖基转移酶基因表达，抑制肝癌细胞的黏附和迁移(WestonBW，HillerKM,MaybenJP,ManousosGA,BendtKM，LiuR，CusackJCJr.ExpressionofHumanalpha(l，3)-fucosyltransferaseantisensesequencesinhibitsselectin-mediatedadhesionandlivermetastasisofcoloncarcinomacells.CancerRes.1999May1;59(9):2127-35.)。美国Scripps研究所的华裔科学家王启辉(Chi-HueyWong),首先应用3种不同的糖基转移酶，酶促合成了SLeX，为抗肿瘤药物的研制提供了新途径。以上研究提示，抑制Lewis基因表达的药物和方法将会影响肿瘤细胞的增殖，从而达到抗肿瘤治疗的目的。基因封闭技术是基因治疗研究的重点和热点之一，它包括反义寡核苷酸、反义RNA、核酶、RNA干扰等。miRNA是新兴的RNAi技术，是含量丰富的非编码小RNA(21-25个核苷酸)，由Dicer酶切割内源性表达的短发夹结构謂A(hairpinRNA,hpRNA)形成。miRNA可以与蛋白因子形成RISC蛋白复合物，可以结合并切割特异的m認A而引发RNA沉默。miRNA是一项快速、高效和便于操作的使靶基因失活的新技术，为将来可控地打开或关闭某一特定基因奠定了基础，同时还为疾病治疗开辟了新途径。raiRNA是近几年发现的一种内源性的非编码的单链RNA，其长度为21-25nt。在进化上具有高度的保守性。这些小的调控RNA通过两种作用方式发挥其生物功能当它们与靶mRNA完全或几乎完全配对时，可以引起靶mRNA的剪切反应即RNA干扰作用；在不完全配对的时候，可以引起靶mRNA的翻译抑制，在基因调控中扮演着重要的角色。更重要的是，由于miRNA可以通过含有polll启动子的载体表达，因而可以具有高度组织特异性，这是其较之siRNA优越之处。在体内或体外转录miRNA,使之表达可以更好地发挥特定miRNA的作用。正是基于这一想法，ZENG等(ZengY,CaiX，CullenBR.UseofRNApolymeraseIItotranscribeartificialmicroRNAs[J].MethodsEnzymol,2005，392:371-380.)根据miRNA230前体设计合成靶向荧光素酶(Luc)的miRNA，并使其在哺乳动物细胞中特异性表达。在此基础上Frank等(StegmeierF,HuG，RicklesRJ，etal.AlentiviralmicroRNAbasedsystemforsingle2copypolymerase112regulatedRNAinterferenceinmammaliancells[J].ProcNatlAcadSciUSA，2005，102(37):13212-13217)构建了能在哺乳动物细胞中表达miRNA的pPRIME载体，用此表达载体将靶向Rb的miRNA导入细胞中，发现Rb的mRNA和蛋白表达均受到抑制。这些研究为miRNA在基因治疗中的应用提供了良好基础。目前miRNA已经成为重要的实验工具。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表达载体构建、筛选及其用途的方法。本发明以利用RNA干涉技术为主，针对FUT3基因的不同靶序列，构建了两个能在哺乳动物细胞中表达miRNA的表达质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-FUT3_miRl/2，以下简称FUT3-miRNA1/2。其示意图谱见图l，能高效的特异性的抑制FUT3基因表达，可用于制备治疗FUT3基因调控的Lewis抗原相关性胃癌的基因药物。本发明的技术方案如下耙向FUT3基因的miRNAs表达载体，其特征是，以pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector为载体，针对FUT3基因编码区中、上游的两段序列，在可较高表达Lewis血型抗原的的胃腺癌细胞系KATO-III中发挥RNA干扰作用。这两段FUT3特异性RNA干涉靶序列分别为①5'—AACTGCAGCAGGAATCCAGGT—3，，起始于1660位；②5'—AACCCATACAGTGAATCCATT—3'，起始于596位，是用于由FUT3基因调控的路易斯(Lewis)抗原相关性胃癌的治疗性物质，由以下方法制得(1)RNA干涉耙序列的选择及插入序列的设计与合成选择FUT3基因编码区的两段序列①5'—AACTGCAGCAGGAATCCAGGT—3，、②5'_AACCCATACAGTGAATCCATT—3'，设计并分别体外合成两段互补的寡核苷酸序列，序列如下①RJT3寡核苷酸序列1:正义链5'-tgctGACCTGGATTCCTGCTGCAGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACTGCAGGGAATCCAGGT-3'反义链5'-cctgACCTGGATTCCCTGCAGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACTGCAGCAGGAATCCAGGTC-3'②FUT3寡核苷酸序列2:正义链反义链5'-cctgAATGGATTCACTATGGGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACCCATACAGTGAATCCATTC-3'(2)合成的寡核苷酸分别与线性载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-raiR脂AiExpressionVector连接、转化、扩增及质粒的提取。首先将步骤(1)合成的两段寡核苷酸等量混匀，95'C作用4分钟后慢慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector质粒载体连接，最后转化到0neShotTOP10大肠杆菌，经壮观霉素(Spectinomycin)筛选，并用x-gal和IPTG(异丙基硫代一B—D一半乳糖苷)进行蓝白斑筛选，挑选耐药菌落大量培养。用质粒提试剂盒提取纯化质粒DNA;质粒的提取纯化按照试剂盒说明书进行操作。(3)质粒的鉴定将步骤(2)提取的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳，应用引物EmGFPForwardsequencingprimer禾口miRNAreversesequencingprimer进行PCR鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，送联合基因上海联众基因研究院进行插入片断测序。本发明的胃癌靶向FUT3基因的有效miRNAs表达载体在制备治疗分泌FUT3酶的胃癌的基因药物中的应用。为了对FUT3基因miRNAs表达质粒对FUT3基因的抑制效果及对胃癌细胞的抑制作用进行鉴定，脂质体转染细胞，提取总RNA，免疫细胞化学法和流式细胞仪检测法测定抑制FUT3后对Lewis抗原水平表达的影响，RT—PCR法测定对FUT3基因表达的抑制作用，MTT法检测抑制FUT3基因后对肿瘤细胞生长的影响及AnnexinV/PI双染色法检测抑制FUT3基因后肿瘤细胞凋亡情况。本发明的针对FUT3基因构建的2种miRNAs表达质粒是可用于FUT3调控Lewis抗原相关胃癌的治疗物质，其中FUT3-miRNA2抑制胃癌细胞生长并能诱导肿瘤细胞凋亡的效率较高，可用于进一步研究FUT3基因的功能及在实验动物体内进行基因治疗研究。本发明的胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表达载体的制备方法和生物学活性的鉴定主要包括如下内容一、质粒的制备，包括RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成，将上述合成的寡核苷酸分别与线性载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector连接、转化、扩增及质粒DNA的提取，质粒的鉴定。二、质粒生物学活性的鉴定，包括质粒的转染、脂质体转染效率的计算、RT—PCR检测FUT3基因的表达、免疫细胞化学法、流式细胞仪检测法测定抑制FUT3后对Lewis抗原水平表达的影响、MTT法检测抑制FUT3基因后肿瘤细胞生长情况及A皿exinV/PI双染色法检测抑制FUT3基因后肿瘤细胞凋亡情况。下面详细说明本发明制备方法中各步骤的具体操作方法1.RNA干涉耙序列的选择及插入模板的设计与合成沿mRNA序列寻找连续两个AA及后面的19个核苷酸，通过同源性比较，选择与其他任何基因无同源性的序列即作为潜在的niiRNA耙位点(耙位点不含有3个以上的相同序列，GC含量在30°/一50%左右)。按照载体试剂盒说明，针对FUT3基因的编码序列，为找到具有最佳沉默效果的靶位点，选取两段靶序列，分别从中上游选择2个符合条件的靶位点，分别为①FUT3-11660AACTGCAGCAGGAATCCAGGT②FUT3-2596AACCCATACAGTGAATCCATT设计并合成两段互补的寡核苷酸序列，每一正向单链寡核苷酸内，21nt的寡核苷酸以正反向组合，以GTTTTGGCCACTGACTGAC为发夹环序列间隔，使寡核苷酸形成发夹结构，每对寡核苷酸的核心序列反向互补；每对寡核苷酸两端分别带有与线性化载体(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRR脂ExpressionVector)上的miRflankingregion相互补的位点，这是连接线性化载体所必需的。按以上所述，两个靶序列设计后的寡核苷酸序列如前所述。2.合成的寡核苷酸分别与线性载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector连接、转化、扩增及质粒的提取。首先将合成的两段寡核苷酸等量混匀，95'C作用4分钟后慢慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pcDNAiM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector质粒载体连接，最后转化到OneShotTOP10大肠杆菌，经壮观霉素(Spectinomycin)筛选，并用x-gal和IPTG(异丙基硫代—B—D—半乳糖苷)进行蓝白斑筛选，挑选耐药菌落大量培养。质粒的提取纯化按照试剂盒说明书进行操作。连接反应体系双寡核苷酸(实验组/对照组，10nM)4ylpcDNA6.2-GW/EmGFP-miRVector2ii15Xligationbuffer4p_lDNase/RNase-freewater9jxlT4DNA连接酶(lu/ul)_LLl总体系20y13.质粒的鉴定质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳，应用引物EmGFPForwardsequencingprimer和miRNAreversesequencingprimer进行PCR鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，送联合基因上海联众基因研究院进行插入片断测序。上述方法所构建的质粒生物学活性鉴定方法如下1.胃癌细胞培养及质粒的转染KAT0-m细胞培养在含10^胎牛血清的DMEM中，置于37。C，5%0)2培养箱中。转染前24小时，将肿瘤细胞接种在6孔培养板上，每孔约5X105个细胞，使每孔细胞饱和度在转染前达到90%以上，铺板时不使用含抗生素的培养液。种板后24小时，取质粒5ul加入95u1无血清DMEM，轻轻混匀制成100ul溶液，按FuGENEHD转染试剂(Irwitrogen)说明书方法进行瞬时转染。剂量配比在其建议范围内选择设计，按照脂质体与质粒配比分五组，分别为空白对照组，4ul:2ug组，6yl:2ug组，8ul:2yg组，IOpl:2ng组，分别制备脂质体/质粒转染复合物6孔板中加入100iil转染复合物，来回移动培养板，使转染复合物与细胞充分接触。于37'C培养6h后，补加新鲜的含10%胎牛血清的DMEM，继续孵育。在转染后48h于流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达。2.总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的半定量RT-PCR检测(1)提取总RNA取转染后的胃癌细胞KAT0-in，用PBS漂洗2次，按106-107个细胞加lmlTrizol(Jnvitrogen)裂解细胞，裂解液转至l.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200u1氯仿，剧烈振荡30秒，12000转/分4。C离心5分钟，小心取上清移至l.5ml大小RNase-free的Ep管，加入与上清等体积的异丙醇，室温放置5分钟后12000转/分4'C离心5分钟，小心弃上清，70%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀2次，室温下自然晾干，用ddH20(含l^DEPC)溶解，下续反应。(2)cDNA的合成和PCR反应使用Takara公司的RT-PCR试剂盒，先按50。C30min，99。C5min,5。C5min的步骤分别合成cDNA，反应总体系为10iU，包括MgCl22ul，10XRTBufferlwl，dNTPs混合物lyl，RNaseInhibitor0.25n1，AMVReverseTranscriptase0.5ii1,OligodT-AdaptorPrimer0.5y1，RNA4.8ii1;然后取cDNA1iil在PCR仪(PE5700)中进行扩增，反应条件为94。C2min—个循环，94°C30sec，56°C30sec，72°Clmin共30个循环，反应总体系为20til，包括5XPCRbuffer5y1，灭菌蒸馏水9.875yl，TaKaRaExTaqHS酶0.125ul,FUT3上、下游引物各lul，内参GAPDH上、下游引物各lwl，cDNA1Ul。PC財广增产物经2X琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物序列下表。目的基因PCR引物序列及扩增片段长度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.蛋白水平验证SLea抗原表达的变化(1)免疫细胞化学法检测细胞SL^表达免疫细胞化学法的主要原理是利用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体(或抗原)，对细胞内的相应抗原(或抗体)进行定性、定位或定量检测，经过化学呈色反应之后，用显微镜进行观察，从而在抗原抗体结合部位确定细胞结构的化学成分或化学性质。我们应用高度灵敏的SP(Str印tavidinPeroxidase,过氧化物酶标记的链霉素)免疫细胞化学方法对转染质粒48h后的KAT0-III中SLea抗原表达水平进行检测。先将KATO-III以约5X10s个/ni1的细胞密度接种在6孔板内，37°C，5。％C02下生长24小时后进行转染，转染后48小时在室温下用免疫细胞化学试剂盒(中杉金桥)进行实验。(2)流式细胞仪检测细胞SLe"抗原表达将对数期生长的细胞接种于6孔板内，37°C5%的二氧化碳孵箱培养2处，用脂质体转染细胞继续培育48h后，收获细胞用PBS洗两遍,加破膜剂与固定剂500wl，室温孵育10分钟，PBS洗2次，加一抗5"l室温孵育30分钟.PBS洗2次，加二抗O.2ul低速混匀，室温避光20分钟，PBS洗2次，上机检测.4.细胞的增殖活性变化我们采用的是MTT比色法来测定细胞活力，此法原理是MTT易被水溶解，透过细胞膜而进入细胞内，活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不溶于水的蓝紫色甲脂(Formazam)结晶颗粒，此结晶可被酸性异丙醇，SDS，DMS0等有机溶剂溶解，依颜色深浅可通过分光光度计测定出各吸光度值，由于结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成比例，因此吸光度(A)值的大小可反映活细胞的数量及活性，而死亡细胞没有线粒体脱氢酶活性，与MTT不起反应。将KAT0-m细胞接种于96孔培养板中，细胞终密度约为2X104/ml，体积100ul，接种后24小时进行转染。分别培养0h，24h，48h，72h后每孔加入100ylMTT液(5mg/ml)，继续培养4h后，小心弃去上清液，加入100yl画S0液，震荡，待蓝紫色溶解后，在全自动酶标仪上测定各孔A492。抑制率=(1-实验组A值平均值/对照组A值平均值)X100%。每个时间点测定3孔求平均值，以时间为横轴，以抑制率为纵轴绘制曲线。5.细胞凋亡水平的变化在转染48h后，按以下步骤应用AnnexinV-FITC和PI双染色法检测该肿瘤细胞被抑制后的凋亡情况先用胰酶消化下待测细胞，用4C预冷的PBS洗细胞两次，用250ix11X结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1X107ml;取100u1的细胞悬液加入一个5ml流式管中，加入5ii1AnnexinV-FITC禾n10u120ug/ml的PI溶液；混匀后于室温避光孵育15分钟；在反应管中加400UlPBS，上流式细胞仪(FACSCalibur)分析。所构建质粒及生物活性的鉴定结果如下-1.质粒DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图2示，与Marker的条带比较可见质粒DNA位于6557bp和4361bp之间，已知构建好的质粒大小约为5763bp左右。2.紫外分光光度计检测结果如下表所示各质粒浓度如下；各质粒的A260/A280比值均在1.80左右，结合琼脂糖凝胶电泳结果，确认所提质粒纯度较高，可以用于后续试验。紫外分光光度计检测所提质粒DNA的浓度和多隨<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.PCR鉴定结果应用弓l物EmGFPForwardsequencingprimer禾卩mi腿reversesequencingprimer进行PCR鉴定(见图3)。4.测序结果通过测序(图4)验证了插入序列与我们合成的寡核苷酸序列完全符合，说明我们成功构建了FUT3-miRNA1/2。5.转染率计算结果在转染后48h于流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达。结果显示以脂质体/质粒载体为8wl:2ug转染效果最好(见图5所示转染率为53.83%)，且脂质体对细胞的毒性较小，为质粒和转染剂的合适比例。当脂质体体积更大时(10y1:2pg),转染率没有显著增加。6.RT-PCR结果转染后48小时，RT-PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示，各组均可见FUT3基因的特异性条带(337bp)和内参GAPDH主带(500bp)，与空白对照和空载体对照的条带比较可发现FUT3-miRNAl和FUT3-miRNA2的FUT3条带亮度都有所减弱，其中以FUT3-miRNA2更为明显，说明该质粒抑制FUT3的效率较高。7.免疫细胞化学法检测FUT3-miRNA干扰质粒对SLea表达水平的影响转染后48小时，免疫细胞化学染色观察，空白对照组和空载体对照组的KATOin细胞膜表面的SLea表达较多，多数细胞均有棕黄色颗粒沉着，黄色颗粒沉着代表SLea抗原表达阳性，分布较为广泛、均匀；转染后的实验组KATOm细胞膜表面上仅见少量的棕黄色颗粒沉着，与空白对照组和空载体对照组相比，SLea表达呈明显的低表达(见图7)。8.流式细胞仪检测FUT3-miRNA干扰质粒对SLea表达水平的影响转染后48小时，空白对照组和空载体对照组KATOIII细胞膜表面SLea表达比例分别为52.99%和43.25%，FUT3-miRNAl组为36.56%，FUT3-miRNA2组为25.10%(见图8)，分析表明经转染48小时后实验组细胞膜表面的SLea表达水平与空白对照组和空载体对照组相比均有降低，说明两种miRNA质粒均能降低KATOIII细胞膜表面的SLea表达水平。9.细胞的增殖活性变化(MTT法)结果转染后分别在0h、24h、48h、72h测定各孔A492每个时间点测定3孔求平均值，计算抑制率，抑制率^1-实验组A值平均值/对照组A值平均值)X100。/。，以时间为横轴，以抑制率为纵轴绘制曲线(图9)。可见FUT3-miRNAl/2均能抑制细胞增值，且FUT3-miRNA2抑制率较高。10.流式凋亡结果转染后48h，AnnexinV/PI双染色法检测KAT0III凋亡结果如图10。实验组的KATOIII细胞均出现细胞凋亡现象，FUT3-miRNAl组的细胞凋亡率为(30.ll士O.56)%，FUT3-miRNA2组为(43.83±0.47)%，凋亡细胞中AnnexinV+ZPI+细胞占较高比例，提示部分细胞发生晚期凋亡，而空白对照组和空载体组的细胞凋亡率仅为(4.99±0.07)%和(7.99±3.76)%，与空白对照组和空载体组相比，实验各组的细胞凋亡率显著升高(p<0.01)。由此可见，miRNA质粒载体能够诱导KATOIII细胞发生细胞凋亡现象。本发明的优良效果如下本申请发明人在近几年国内外RNA干涉研究的工作基础上，针对FUT3基因，利用RNA干扰技术结合基因重组技术成功构建了CMV启动子驱动的2种niiRNAs表达质粒，并通过在胃癌细胞株KAT0III中表达FUT3特异性miRNAs分子，特异性的抑制了FUT3基因的表达，并筛选出抑制率最高的一种miRNA表达质粒，以达到特异性、有效阻断FUT3表达及治疗胃癌的目的。/.本发明构建的2种FUT3特异性miRNAs表达质粒可有效抑制FUT3基因的表达。主要有如下优点①本质粒可在大肠杆菌oneshotT0P10中大量扩增，即可不断获得表达miRNAs的载体；②针对FUT3编码区中、上游分别设计了RNA干扰的靶位点，从而找到了对FUT3基因抑制效率较高的位点；③安全性高，无插入突变危险，亦无免疫毒性反应。么本发明构建、筛选的上特异性miRNAs表达质粒针对FUT3基因，抑制效果明显。本发明针对FUT3基因的miRNAs表达质粒是可用于FUT3相关胃癌的治疗物质，能显著抑制肿瘤细胞生长并能诱导其凋亡，可进一步研究FUT3基因的功能及在实验动物体内进行基因治疗。J.本发明所采用的miRNA技术能够在mRNA和蛋白水平上干扰基因的表达。miRNA是近几年发现的一种内源性的非编码的单链RNA，其长度为21-25nt。在进化上具有高度的保守性，能够通过与耙mRNA特异性的碱基互补配对，引起耙mRNA的降解或者抑制其翻译，在基因调控中扮演着重要的角色。本研究所构建的质粒miRRNAi表达载体采用CMV启动子，能够促进目的基因的表达和转录。该质粒首先通过体内转录的方式合成一个约70nt的具有茎-环结构的miRNA前体(pre-miRNA)，在特异性核酸内切酶Dicer的作用下，生成发夹状的单链miRNA分子，能与靶序列特异性的结合，从而降解靶mRNA，阻止其蛋白翻译，即RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。miRNA还可通过与耙mRNA的3，-UTR区不完全配对结合来抑制mRNA的翻译，进一步影响其蛋白水平的表达。图1FUT3-miRNA1/2载体图谱。图2质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图①A-HindIIIdigestDNAMarker;②阳性对照；③FUT3-miRNAl;④FUT3-miRNA2;⑤空白对照。图3PCR鉴定图①DL2000DNAMarker;②阳性对照；③FUT3-miRNAl;④FUT3-miRNA2;⑤阴性对照。图4插入片段的基因测序图A:质粒FUT3-miRNAl测序图；B:质粒FUT3-miRNA2测序图。图5流式细胞仪检测转染率A:阴性对照B:转染后的实验组(脂质体/质粒载体为8yl:2ug)。图6RT-PCR产物图①空白对照；②空载体对照；③FUT3-miRNAl;FUT3-miRNA2。图7转染后48h免疫细胞化学法检测KAT0III细胞表面SLea表达A:空载体对照；B:实验组。图8流式细胞仪检测KAT0III细胞表面SLea表达A:空白对照；B:空载体对照；C:FUT3-miRNAl;D:FUT3-miRNA2。图9MTT法测定转染不同质粒后对KATOIII生长的抑制。图10转染后48h，AnnexinV/PI双染色法检测KATOIII凋亡情况。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不仅限于此。一、主要试剂1.载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector购自invitrogen公司(Catalogno:K4936-00)。2.工程菌T0P10购自于invitrogen公司(Catalogno:C4040-03)。3.T4连接酶购于invitrogen公司(Catalogno:K4936-00);质粒的提取和纯化试剂盒(QIApr印SpinMiniprepKit)购自于QIAGEN公司(CatNo:27104);Spectinomycin抗生素购自于Sigma公司(Catalogno:S4014)。4.FUT3特异性PCR引物合成、FUT3特异性miRNA寡核苷酸链合成和DNA序列测定(上海英骏生物工程技术服务有限公司)5.转染试剂FuGENEHDTransfectionReagent(Cat.No.04709705001，Roche)6.TRzolReagent(Cat.No.15596-026，Invitrogen)RT-PCR试剂盒RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0(CodeNo.DRR019A，Takara)7.羊抗鼠荧光二抗R-PE(CatalogNo:1031-09s，SouthernBiotech)8.Mouseanti-sialyllewisa(KM231,IgGl)单抗(CatalogNo.MAB2095,CHEMICON)9.免疫组化染色试剂盒MouseSPKit(目录号SP-9002,北京中杉金桥生物技术公司)10.浓縮型DAB显色试剂盒(目录号ZLI-9032，北京中杉金桥生物技术公司)11.凋亡试剂AnnexinVRPEKit(目录号LHK601，晶美生物工程有限公司)12.预染蛋白marker(目录号SM0671，Fermentas)13.Westernblot检测试剂盒(目录号54—11一50，KPL)二、主要仪器1.紫夕卜分光光度计(GeneQuantPro):AmershamBiosciences2.凝胶成像系统(ChemilmagerTM4400):AlphaI画tech3.生物安全柜(Hfsafel200):上海力申科学仪器公司4.二氧化碳培养箱(HF90):上海力申科学仪器公司5.荧光显微镜(ECLIPSETE2000-S):Nikon6.CCD(penguinl50CL):美国pixera公司7.台式冷冻离心机(TGL-16G):上海安亭科学仪器厂8.PCR仪(PE5700):ABI9.全自动化学发光免疫分析仪(AbbottAXSYMSYSTEM):美国雅培公司10.流式细胞仪(FACSCalibur):BECT0NDICKINSON11.荧光光谱仪(VARIANCARYEclipse):美国VARIAN公司12.全自动酶标仪(MultiskanMk3):ThermoLabsystems三、质粒的制备方法及其生物学活性鉴定1.RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成1.1选择靶序列选取两段靶序列，这两段序列分别为①AACTGCAGCAGGAATCCAGGT，起始于1660位;②AACCCATACAGTGAATCCATT，起始于596位。另外阳性对照(miR-lacpositivedscontrololigo)，阴性对照(超纯水代替寡核苷酸)己由载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRExpressionVector试剂盒同时提供。1.2设计寡核苷酸每一正向单链寡核苷酸内，21nt的寡核苷酸以正反向组合，中间以GTTTTGGCCACTGACTGAC的发夹环序列间隔，使寡核苷酸内部可形成发夹结构，每对寡核苷酸的核心序列反向互补，每对寡核苷酸的两端分别带有与线性化载体上的miRflankingregion相匹配的位点，这是连接线性载体所必需的。中间发夹环部位可有效的生成发夹结构。按照以上所述，两个靶序列设计后的寡核苷酸序列如下-①FUT3寡核苷酸序列1:正义链反义链②FUT3寡核苷酸序列2:正义链反义链5'-cctgAATGGATTCACTATGGGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACCCATACAGTGAATCCATTC-3'2.构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-FUT3-miRRNAi真核表达载体2.l退火用高压去离子水重悬FUT3的寡核苷酸干粉至浓度为200uM，上下游序列按下列反应体系以l:l混合，95'C水浴4分钟，室温孵育反应5-IO分钟。上游链(200uM)5u1下游链(200uM)110XoligoAnnealingBuffer2u1DNase/RNase-freewater_8y1总体积20li12.2连接将退火产物(浓度50uM)用DNase/RNase-freewater做100倍稀释，稀释至浓度为500nM，彻底混匀，再继续用DNase/RNase-freewater和10XoligoAnnealingBuffer做50倍稀释至浓度为10nM，彻底混匀。-2(TC保存。将稀释好的FUT3双寡核苷酸1/2分别与pcDNA6,2-GW/EmGFP-miRVector(载体图谱见图l)，用T4DNA连接酶连接，同时载体试剂盒中提供的阳性对照(miR-lacZpositivedscontrololigo)和阴性对照(超纯水代替寡核苷酸)。室温孵育5分钟后将反应体系放冰上，准备做转化。余下的-2(TC保存。连接反应体系双寡核苷酸(实验组/对照组，10nM)4ylpcDNA6.2-GW/EmGFP-miRVector2y15Xligationbuffer4iilDNase/RNase-freewater9u1T4DNA连接酶(ltt1)_Uil总体系20ul2.3转化①取感受态细胞(TOP10chemicallycompetentE.colicells)6管(50yl/每EP管)，冰上融化10min.②分别加入各连接产物3u1混匀，冰上放置30min,每隔5min轻轻摇动EP管。③42'C水浴中放置30秒，勿晃动。迅速取出置于冰中，静置2min.每管加入250y1的37。C预热的S0C培养基，37。C振摇(约225转)1小时左右。⑤取不同体积菌液(50u1-200p1)涂布于含有壮观霉素(终浓度为50ug/ml)的LB平板上，37°。培养12-16小时。2.4阳性重组子小量扩增与分离纯化①挑选上述含壮观霉素的LB平板中的单个克隆，种在4ml含壮观霉素(终浓度为50ug/ml)的LB液中，37'C振摇(约170转)14-16小时。每组都分别挑选5个克隆。②实验组各取lml菌液送上海英俊生物工程技术服务有限公司进行插入片段测序。另用甘油保存余下菌液，置-80。C保存备用。③取出测序正确的菌种，划线接种在含壮观霉素的LB平板上，37'C孵育14-16小时。挑单个菌落接种在4ml含壮观霉素的LB液体培养基中，37'C振摇(约170转)14-16小时。质粒的小量提取取3ml菌液按QIApr印SpinMinipr印Kit(QIAGEN)说明书提取质粒。1)收集菌液与离心管中，室温下10000rpm离心5min;收集菌体，重悬于250"1的细胞悬浮液P1;2)加入250u1碱裂解液P2,盖紧管口，颠倒旋转离心管4-6次以混匀，室温静置5min;3)加入350iil缓冲液N3，立即温和颠倒离心管510次，室温下13000rpm离心IOmin;4)将上清液小心移入吸附柱，室温下IOOOOrpm离心1min，倒掉收集管的液体，将吸附柱放于同一收集管中；5)在吸附柱中加入750u1洗涤液PE，室温10000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，重复洗涤一遍；6)倒掉收集管中液体，讲吸附柱放入同一收集管中。室温IOOOOrpm离心1min，去除残留洗液；7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附模中央加入50Ul洗脱液EB，静置lmin，室温离心lmin;8)质粒保存在一70'C3.质粒DNA的检测3.1琼脂凝胶电泳分析配制0.8%琼脂糖凝胶(含O.5ug/ml溴化乙锭)，取lul质粒DNA进行电泳，检测提取的质粒DNA。3.2应用弓l物EmGFPForwardsequencingprimer禾口miRNAreversesequencingprimer进行PCR鉴定。PCR的反应体系如下Mg2'1.5ulTag酶0.1u110Xbuffer2uldNTP0.4n1引物lulDNA菌液1u1^_14tU总体系20u1反应条件94°C4min;94°C30sec，55°C30sec，72°C30sec，35个循环；72°C3min3.3紫外分光光度计分析取lul质粒DNA用69ul超纯水稀释，在自动紫外分光光度计下检测A260nm和A280nm处的吸光值，以测定质粒DNA的浓度和纯度。4.胃癌细胞培养及质粒的转染KATO-III细胞培养在含10^胎牛血清的DMEM中，置于37。C，5%(]02培养箱中。转染前24小时，将肿瘤细胞接种在6孔培养板上，每孔约5X105个细胞，使每孔细胞饱和度在转染前达到90%以上，铺板时不使用含抗生素的培养液。种板后24小时，取质粒5ul加入95n1无血清DMEM，轻轻混匀制成100ul溶液，按FuGENEHD转染试剂(Invitrogen)说明书方法进行瞬时转染。剂量配比在其建议范围内选择设计，按照脂质体与质粒配比分五组，分别为空白对照组，4"1:2wg组，6iil:2iig组，8"l:2Ug组，10IX1:2ug组，分别制备脂质体/质粒转染复合物6孔板中加入100ul转染复合物，来回移动培养板，使转染复合物与细胞充分接触。于37'C培养6h后，补加新鲜的含10%胎牛血清的DMEM，继续孵育。在转染后48h于流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达。5.总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的半定量RT-PCR检测5.1提取总RNA取转染后的胃癌细胞KATO-m，用PBS漂洗2次，按106—107个细胞加lmlTrizol(Invitrogen)裂解细胞，裂解液转至l.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200u1氯仿，剧烈振荡30秒，12000转/分4。C离心5分钟，小心取上清移至l.5ml大小RNase-free的Ep管，加入与上清等体积的异丙醇，室温放置5分钟后12000转/分4'C离心5分钟，小心弃上清，70%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀2次，室温下自然晾干，用ddH20(含l^DEPC)溶解，下续反应。5.2cDNA的合成和PCR反应使用Takara公司的RT-PCR试剂盒，先按50。C30min，99。C5rain,5。C5min的步骤分别合成cDNA，反应总体系为10ul，包括MgCl22wl，10XRTBuffer1u1，dNTPs混合物1u1，RNaseInhibitor0.25u1，AMVReverseTranscriptase0.5u1，OligodT-AdaptorPrimer0.5u1，RNA4.8u1;然后取cDNA1yl在PCR仪(PE5700)中进行扩增，反应条件为94。C2min—个循环，94°C30sec，56°C30sec，72°Clmin共30个循环，反应总体系为20nl，包括5XPCRbuffer5ix1，灭菌蒸馏水9.875nl,TaKaRaExTaqHS酶0.125pl，FUT3上、下游引物各lul,内参GAPDH上、下游引物各lul，cDNA1ul。PCR扩增产物经2X琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物序列下表。目的基因PCR引物序列及扩增片段长度<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>_I下坊字5'caccagtggatgcagggat3'___6.蛋白水平验证SLea抗原表达的变化6.1免疫细胞化学法检测细胞S1^抗原表达免疫细胞化学法的主要原理是利用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体(或抗原)，对细胞内的相应抗原(或抗体)进行定性、定位或定量检测，经过化学呈色反应之后，用显微镜进行观察，从而在抗原抗体结合部位确定细胞结构的化学成分或化学性质。我们应用高度灵敏的SP(Str印tavidinPeroxidase,过氧化物酶标记的链霉素)免疫细胞化学方法对转染质粒48h后的KAT0-III中Lewis抗原表达水平进行检测。先将KATO-III以约5X105个/ml的细胞密度接种在6孔板内，37°C，5%0)2下生长24h后进行转染，转染后48h在室温下用免疫细胞化学试剂盒(中杉金桥)进行实验。6.2流式细胞仪检测细胞SLea抗原表达将对数期生长的细胞接种于6孔板内，37。C5%的二氧化碳孵箱培养24h，用脂质体转染细胞继续培育48h后，收获细胞用PBS洗两遍，加破膜剂与固定剂500u1,室温孵育10分钟，PBS洗2次，加一抗5Pl室温孵育30分钟.PBS洗2次，加二抗O.2ul低速混匀，室温避光20分钟，PBS洗2次，上机检测.7.细胞的增殖活性变化我们采用的是MTT比色法来测定细胞活力，此法原理是MTT易被水溶解，透过细胞膜而进入细胞内，活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不溶于水的蓝紫色甲脂(Formazam)结晶颗粒，此结晶可被酸性异丙醇，SDS，DMSO等有机溶剂溶解，依颜色深浅可通过分光光度计测定出各吸光度值，由于结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成比例，因此吸光度(A)值的大小可反映活细胞的数量及活性，而死亡细胞没有线粒体脱氢酶活性，与MTT不起反应。将KATO-III细胞接种于96孔培养板中，细胞终密度约为2X104/ml，体积lOOul,接种后24小时进行转染。分别培养0h，24h，48h，72h后每孔加入100ii1MTT液(5mg/ml)，继续培养4h后，小心弃去上清液，加入100ul匿S0液，震荡，待蓝紫色溶解后，在全自动酶标仪上测定各孔A492。抑制率=(1-实验组八值平均值/对照组A值平均值)X100y。。每个时间点测定3孔求平均值，以时间为横轴，以抑制率为纵轴绘制曲线。8.细胞凋亡水平的变化在转染48h后，按以下步骤应用AnnexinV-FITC和PI双染色法检测该肿瘤细胞被抑制后的凋亡情况先用胰酶消化下待测细胞，用4'C预冷的PBS洗细胞两次，用250yIIX结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1X107ml;取100ul的细胞悬液加入一个5ml流式管中，加入5u1AnnexinV-FITC禾n10ul20yg/ral的PI溶液；混匀后于室温避光孵育15分钟；在反应管中加400ulPBS，上流式细胞仪(FACSCalibur)分析。四、结果1.质粒DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图2示，与Marker的条带比较可见质粒DNA位于6557bp和4361bp之间，已知构建好的质粒大小约为5763bp左右。2.紫外分光光度计检测结果如下表所示各质粒浓度如下；各质粒的A260/A280比值均在1.80左右，结合琼脂糖凝胶电泳结果，确认所提质粒纯度较高，可以用于后续试验。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3.PCR鉴定结果应用弓l物EmGFPForwardsequencingpriraer禾口miRNAreversesequencingprimer进行PCR鉴定(见图3)。4.测序结果通过测序(图4)验证了插入序列与我们合成的寡核苷酸序列完全符合，说明我们成功构建了FUT3-miRNA1/2。5.转染率计算结果在转染后48h于流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达。结果显示以脂质体/质粒载体为8ul:2yg转染效果最好(见图5所示转染率为53.83%)，且脂质体对细胞的毒性较小，为质粒和转染剂的合适比例。当脂质体体积更大时(10ul:g)，转染率没有显著增加(图略)。6.RT-PCR结果转染后48小时，RT-PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示，各组均可见FUT3基因的特异性条带(337bp)和内参GAPDH主带(500bp)，与空白对照和空载体对照的条带比较可发现FUT3-miRNAl和FUT3iiRNA2的FUT3条带亮度都有所减弱，其中以FUT3-miRNA2更为明显，说明该质粒抑制FUT3的效率较高。7.免疫细胞化学法检测FUT3-miRNA干扰质粒对SLea表达水平的影响转染后48小时，免疫细胞化学染色观察，空白对照组和空载体对照组的KATOIII细胞膜SLea表面的表达较多，多数细胞均有棕黄色颗粒沉着，黄色颗粒沉着代表SLea抗原表达阳性，分布较为广泛、均匀；转染后的实验组KATOIII细胞膜表面上仅见少量的棕黄色颗粒沉着，与空白对照组和空载体对照组相比，SLea表达呈明显的低表达(见图7)。8.流式细胞仪检测FUT3-miRNA干扰质粒对SLea表达水平的影响转染后48小时，空白对照组和空载体对照组KAT0III细胞膜表面SLea表达比例分别为52.99%和43.25%，FUT3-miRNAl组为36.56%，FUT3-miRNA2组为25.10%(见图8)，分析表明经转染48小时后实验组细胞膜表面的SLea表达水平与空白对照组和空载体对照组相比均有降低，说明两种miRNA质粒均能降低KATOIII细胞膜表面的SLea表达水平。9.细胞的增殖活性变化(MTT法)结果转染后分别在0h、24h、48h、72h测定各孔A492每个时间点测定3孔求平均值，计算抑制率，抑制率=(1-实验组A值平均值/对照组A值平均值)X10(F。，以时间为横轴，以抑制率为纵轴绘制曲线(如图9)。可见FUT3-miRNA1/2均能抑制细胞增值，且FUT3-miRNA2抑制率较高。10.流式凋亡结果转染后48h，AnnexinV/PI双染色法检测KAT0III凋亡结果如图10。实验组的KATOm细胞均出现细胞凋亡现象，FUT3-miRNAl组的细胞凋亡率为(30.11±0.56)%，FUT3-miRNA2组为(43.83±0.47)%，凋亡细胞中Annexin丫+/1+细胞占较高比例，提示部分细胞发生晚期凋亡，而空白对照组和空载体组的细胞凋亡率仅为(4.99±0.07)%和(7.99±3.76)%，与空白对照组和空载体组相比，实验各组的细胞凋亡率显著升高(p〈0.Ql)。由此可见，miRNA质粒载体能够诱导KATOIII细胞发生细胞凋亡现象。序列表〈110>汪运山，济南市第四人民医院〈120>胃癌靶向RJT3基因的miRNAs表达载体的构建、筛选及其用途<歸6<170>PatentIn3.1<210〉1<211>21〈212〉DNA5'—AACTGCAGCAGGAATCCAGGT—3，21〈210〉2〈211>21<212〉DNA5'—AACCCATACAGTGAATCCATT—3'21〈210〉3<211〉64〈212〉DNA<210〉4〈211>64〈212〉腿5'-cctgACCTGGATTCCCTGCAGTTGTCAGTCAGTGGCCMAACMCTGCAGCAGGAATCCAGGTC-3'64〈210〉5<211>64<212〉DNA5'-tgctGAATGGATTCACTGTATGGGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACCCATAGTGMTCCATT-3'64<210〉6<211>64〈212〉画5'-cctgAATGGATTCACTATGGGTTGTCAGTCAGTGGCCMAACMCCCATACAGTGAATCCATTC-3'6权利要求1.靶向FUT3基因的miRNAs表达载体，其特征是，以pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector为载体，针对人α-1，3/4-岩藻糖基转移酶(FUT3)基因编码区中、上游的两段序列，在较高表达路易斯(Lewis)血型抗原的胃癌细胞系KATO-III中发挥RNA干扰作用，这两段FUT3特异性RNA干涉靶序列分别为①5’-AACTGCAGCAGGAATCCAGGT-3’，起始于1660位；②5’-AACCCATACAGTGAATCCATT-3’，起始于596位，是用于由FUT3基因调控的Lewis抗原相关性胃癌的治疗性物质，由以下方法制得(1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成选择FUT3基因编码区的两段序列①5’-AACTGCAGCAGGAATCCAGGT-3’、②5’-AACCCATACAGTGAATCCATT-3’，设计并分别体外合成两段互补的寡核苷酸序列，序列如下①FUT3寡核苷酸序列1正义链5’-tgctGACCTGGATTCCTGCTGCAGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACTGCAGGGAATCCAGGT-3’反义链5’-cctgACCTGGATTCCCTGCAGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACTGCAGCAGGAATCCAGGTC-3’②FUT3寡核苷酸序列2正义链5’-tgctGAATGGATTCACTGTATGGGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACCCATAGTGAATCCATT-3’反义链5’-cctgAATGGATTCACTATGGGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACCCATACAGTGAATCCATTC-3’(2)将上述合成的寡核苷酸分别与线性载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector连接、转化、扩增及质粒的提取将步骤(1)合成的两段寡核苷酸等量混匀，95℃作用4分钟后慢慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector质粒载体连接，最后转化到OneShotTOP10大肠杆菌，经壮观霉素(Spectinomycin)筛选，并用x-gal和IPTG(异丙基硫代-B-D-半乳糖苷)进行蓝白斑筛选，挑选耐药菌落大量培养，用质粒提试剂盒提取纯化质粒DNA；(3)质粒的鉴定将步骤(2)提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用引物EmGFPForwardsequencingprimer和miRNAreversesequencingprimer进行PCR鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector质粒中。2.权利要求1的靶向FUT3基因的miRNAs表达载体在制备治疗分泌FUT3酶的胃癌的基因药物中的应用。全文摘要本发明涉及胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表达载体的构建、筛选及其用途，以pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector为载体，针对FUT3基因编码区中、上游的两段序列，在可较高表达Lewis血型抗原的胃腺癌细胞系KATO-III中发挥RNA干扰作用。这两段FUT3特异性RNA干涉靶序列分别为①5’-AACTGCAGCAGGAATCCAGGT-3’，起始于1660位；②5’-AACCCATACAGTGAATCCATT-3’，起始于596位，是用于由FUT3基因调控的路易斯(Lewis)抗原相关性胃癌的治疗性物质。文档编号A61P35/00GK101338321SQ200810138989公开日2009年1月7日申请日期2008年8月18日优先权日2008年8月18日发明者宋玉和,岳庆祝,汪运山,辛永红,郏雁飞,燕郑申请人:汪运山;济南市第四人民医院