专利名称：人源性亚硝基化的硫氧还蛋白在制备治疗缺血性心脏病药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用重组蛋白质技术及蛋白翻译后修饰技术治疗心血管疾 病领域，更具体地说，涉及人一种已知的源性亚硝基化的硫氧还蛋白
(S-nitrosylatedh隨nThioredoxin, s-hTrx)作为治疗缺血性心脏病药物 的应用。
背景技术：
缺血性心脏病是当今世界威胁人类健康的首敌。随着冠状动脉内溶栓及 冠脉搭桥等内外科治疗手段的广泛应用，继之出现的心肌细胞再灌注损伤日 益受到心脏病学家的高度重视。来自动物实验和临床观察的证据表明，心肌 细胞凋亡和心肌坏死是心肌局部缺血/再灌注(MI/R)损伤后心肌梗塞的主 要原因。由于心肌坏死的不可逆性，应用各种药物和基因治疗手段抑制和预 防心肌凋亡已引起众多学者的关注。
Trx是分子量大约为12kDa的小分子蛋白质，它的氨基酸序列中含有调 节氧化还原活性的二硫键/巯基，该结构位于保守序列:胱氨酸-甘氨酸-脯氨 酸-胱氨酸中，为其活性中心。氧化型Trx) Trx-S2)含有二硫键，还原型 Trx) Trx-) SH) 2)含有巯基。Trx就是通过二硫键和巯基的互换来实现其 氧化还原调节功能的。其在细胞内广泛表达，控制细胞还原/氧化)redox) 状态和细胞增殖/生存。近期的研究结果表明，Trx在多种心血管疾病的发 生与发展中扮演重要角色。Trx能阻止斑块中过氧亚硝酸盐造成的内皮细胞 损伤；血浆中的Trx水平与心肌炎、急性冠脉综合征、扩张型心肌病和心衰 的严重性之间呈负相关。重组人Trx对再灌注诱发的心律失常有保护作用， 减轻内皮细胞、大脑和肾脏的缺血再灌注损伤。目前的研究证据还表明，Trx 可以发生多种蛋白翻译后修饰从而改变其自身的活性。这些结果提示，Trx
可能具有直接的心脏保护作用。亚硝基化是在蛋白质半胱氨酸巯基上加上
NO。基团从而改变蛋白质功能的一种蛋白质翻译后修饰。亚硝基化，硝基化
与磷酸化是目前已经发现的影响蛋白质功能的主要蛋白翻译后修饰形式。亚 硝基化己经被证实可以改变多种凋亡信号转导蛋白的活性。重组人Trx具有 5个半胱氨酸残基，其69位半胱氨酸被证实是发生亚硝基化修饰的主要部 位，并可以增强其心脏保护作用。心肌梗死患者在进行血运重建时产生缺血 /再灌注损伤，给予这类患者补充外源性s-hTrx可能成为一种心肌保护的治 疗手段。
虽然目前临床上可以通过溶栓或介入的方法恢复心肌梗死患者缺血心 肌的血供，但尚未有针对减轻缺血/再灌注损伤的药物应用于临床，因此， 急需开发一类效果可靠、副反应较少、应用简单的药物填补这一领域的空白。
发明内容
本发明的目的在于，提供s-hTrx用于制备治疗缺血性心脏病药物的应 用，特别是在发生心肌梗死后接受血管再通治疗时，通过外源性给药，以减 轻缺血心肌损伤。
申请人研究表明，s-hTrx有很强的生物学活性，给药后反应迅速，生 物利用度好，有着很好的临床应用前景。 申请人:在研究中发现
(1) 在体给予外源性Trx，能够进入缺血心肌，减少缺血再灌注导致 的细胞凋亡和心梗范围，从而发挥显著的心脏保护作用；
(2) 发生于TrxCys-69的巯基亚硝基化，显著加强天然Trx的心脏保
护作用；
(3) Trx发挥其保护作用，至少部分是通过抑制p38-MAPK凋亡信号转 导通路激活，Trx亚硝基化可以增强这一作用；
(4) 外源性给予的s-hTrx，可以作为S—NO的来源，补充缺血再灌注
导致的心肌中巯基亚硝基化蛋白质的减少。
图1显示了给予SwissWebster小鼠外源性Trx腹腔注射，能够进入缺 血/再灌注心肌，采用免疫组织化学法检测心肌细胞中外源性人硫氧还蛋白 (hTix)的分布。在安慰剂治疗的小鼠心肌组织中没有免疫染色反应(1A)。 相反，在hTrx治疗的小鼠心肌中出现明显的强阳性染色(lB)。在非缺血区 虽然也有外源性Trx的存在(1C)，但Trx含量明显少于缺血区(1D)。
图2-4是给予SwissWebster小鼠外源性Trx腹腔注射，可以减少缺血/ 再灌注诱导的心肌细胞凋亡。图2DNA电泳典型结果M表示DNAmarkers， sham为对照组(lane2) ， MI/R为缺血再灌注组)lane3， 4) ， Trx为Trx 治疗组)lane5， 6)。
图3是再灌注前给予SwissWebster小鼠外源性Trx腹腔注射，可以减 少缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡。TUNEL染色典型图示。sham组心肌组 织中没有TUNEL阳性细胞出现(A)。在缺血再灌注组心肌缺血区，可见大 量的TUNEL阳性(红色)细胞核出现)B)。在再灌注前给予Trx治疗，TUNEL 阳性细胞核明显减少)C)。图3中的最下图为再灌注前给予SwissWebster 小鼠外源性Trx腹腔注射，可以减少缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡的直 方图。(凋亡指数二TUNEL阳性细胞数/细胞总数XlOOX )," 尸<0. 0175MI/R+Vehicle组。
图4是再灌注前给予SwissWebster小鼠外源性Trx腹腔注射，可降低 心肌缺血再灌注后caspase _ 3活性的影响。 **P〈0. Olvs. MI/R+Vehicle. N=12-14动物/组。
图5是气相化学发光法检测示不同浓度GSNO (N0°供体)孵育hTrx， hTrx中S-NO浓度呈GSNO浓度依赖性增加(means土SEM， n=3; hTrx: 16. 7|Limol/L)
图6是GSN0孵育hTrx可使其亚硝基化丄anel二GSNO孵育的hTrx; lane2= 天然hTrx; lane3二蛋白分子量marker。其中，上图Nitro-Glo试剂盒 Westernblot法检测亚硝化蛋白表达。下图上图膜用strippingbuffer孵 育后，用抗-hTrx单克隆抗体作为一抗检测hTrx蛋白上样量
图7是再灌注前给予SwissWebster小鼠外源性s-hTrx腹腔注射，可增 强Trx在缺血再灌注心肌细胞凋亡中的保护作用的直方图。 **尸<0. 01 ^sMI/R+Vehicle; **尸<0. 01 ^sMI/R+Trx
图8是再灌注前给予SwissWebster小鼠外源性s-hTrx腹腔注射，可增 强Trx降低缺血再灌注心肌细胞Caspase-3活性的直方图。
图9是再灌注前给予SwissWebster小鼠外源性s-hTrx腹腔注射，可增 强Trx降低缺血再灌注心肌梗死作用的直方图。
上图心脏切片染色典型图，蓝色=非缺血区；红色=缺血区但非梗死区； 白色=缺血且坏死区。下图示坏死区与整个缺血区百分比)means士SEM， 10-12动物/组)。**p<0.01MI/R+Vehicle;據p〈0. Olvs. MI/R+Trx。
图10是再灌注前给予SwissWebster小鼠外源性hTrx及s-hTrx腹腔注 射，可以降低缺血再灌注对p38MAPK激活作用的直方图。
上图Westernblot典型图示磷酸化ATF-2表达
下图密度测定法定量分析示hTrx显著降低p38MAPK活性，亚硝基化 hTrx 进 一 步降低 p38MAPK 活性。**p<0. Olvs. MI/R+vehicle ; **p〈0.01vs.MI/R+hTrx.
图11再灌注前给予SwissWebster小鼠外源性hTrx及s-hTrx腹腔注射， 可增强心肌中亚硝基化蛋白水平的电泳图。
上图Westernblot典型图示Nitroglo试剂盒检测心肌组织中 S-nitrosylated蛋白质的含量。
下图转膜后胶考马斯亮蓝染色示每孔加样量相同)2(^g/lane)。
ShamMI/R)lanesl， 2)， MI/R+vehicle) lanes3， 4)， MI/R+hTrx) lanes5， 6) MI/R+hTrx-SN0) lane7， 8)。
图12是硫氧还蛋白亚硝基化修饰示意图。
以下结合附图和发明人给出的实验及其结果对本发明作进一步的详细 说明。
具体实施方式
1.重组人硫氧还蛋白的制备
用RNeasyminiKit (QIAGEN公司产品，#74104)从人胚肾细胞系) humanembryonickidneycells ，HK293 ) 提取总RNA ，使用 InvitrigenSuperscriptIII试剂盒反转录成cDNA第一链(#18080-51 )，以反转 录后的cDNA为模板，使用人硫氧还蛋白特异引物PCR得到人硫氧还蛋白 全 长 cDNA ( hTrxBamHIF :
5' GACTCCAGCGGATCCGATGGTGAAGCA3' ; hTrxXhoIR5， TTCAGAAAACATGACTCGAGTAATTCATT3 ，)。所得到的 DNA片断经BamHI和Xhol双酶切后联入同样用BamHI和Xhol双酶切得 到的pET45b载体片断，连接产物用热激法转入XL10-GOLD感受态细胞， 所得到的重组表达载体经测序验证后，用热激法转化入BL21 (DE3)原核 表达宿主菌。
含有pET45b-hTrx载体的宿主菌经在LB培养基中37°C ， 200rpm培养过 夜后，以IPTG终浓度为lmM诱导4-5小时；5000g离心收集细菌，按每克 细菌加入4ml裂解液(50mMNaH2PO4， 300mMNaCl， 20mMImidazole)， 将细菌悬浮后，加入Lysozyme至lmg/ml，室温200rmp振荡30min后以超 声波处理(2SX20)。
14000g， 20min, 4。C离心，取上清，上Ni-NTA柱；以>4倍柱床体积的 WashingBuffer (50mMNaH2PO4， 300mMNaCl， 20mMImidazole)洗柱后，
以l-2ml的ElutionBuffer洗脱。Ni-NTA柱按照保养手册清洗或再生，存于 浓度为30%的乙醇中。
洗脱后的蛋白以MilliporecentriconPlus-20浓縮并除去Imidazole (Imidazole对BCA法测定的蛋白浓度有影响)。
蛋白内毒素的去除使用ActiCleanEtox内毒素亲和柱(Sterogene公司产 品)，去除内毒素后的蛋白以LAL (CAMBREX)试剂盒检测内毒素含量。
所得到的人源性亚硝基化的硫氧还蛋白的基因序列与已知的基因序列 完全相符，满足设计要求，其基因序列如下
At ggt gaagcagat c gagagcaagac t gc 1111 caggaagc c 11 ggac gc t gcaggt gat a
2.硫氧还蛋白亚硝基化修饰: 2.1 S-NO含量测定
将2mghTrx溶解于终浓度为1-1000jjmol/L的GSN0溶液中，于37°C下 避光孵育30分。未反应GSNO用超虑法除去并将样品还原后，采用气相化学 发光法测定Trx中S-NO的含量。 2.2亚硝基化Trx蛋白的检测
采用10|imol/L的GSNO溶液按上述方法孵育hTrx并用于治疗，亚硝基 化Trx蛋白的检测采用以亲和素转换为原理的Nitro-Glo试剂盒) PerkinElmer， Boston, MA)，) n=5-7动物/组)。 3.建立动物心肌缺血再灌注模型
成年SwissWebster小鼠先以2%异氟垸麻醉，通过左胸部切口暴露心脏，
以6-0丝线在冠状动脉左前降支根部打一活结阻断血流，缺血30分钟后， 松开活结，再灌注3小时(用于细胞凋亡检测)或24小时(只用于检测心 梗范围)。再灌注前10分钟给予Trx或S-hTrx (2pg/g)腹腔注射。
4. 检测方法
3小时再灌注结束后，利用TUNEL、 DNAladder、 Caspase-3测定心肌细 胞凋亡；利用亲和素转换为原理的Nitro-Glo试剂盒)PerkinElmer， Boston, MA)检测亚硝基化Trx蛋白含量;24小时再灌注结束后，利用伊文思蓝/TTC 双染测定梗死面积。
5. 结果
① 给予SwissWebster小鼠外源性Trx腹腔注射，能够进入缺血/再灌注 心肌，可减少缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡，并减小其梗死范围。
采用免疫组织化学法检测心肌细胞中外源性人硫氧还蛋白(hTRX)的分 布。在PBS治疗的小鼠心肌组织中没有免疫染色反应(图1A)。相反，在 hTrx治疗的小鼠心肌中出现明显的强阳性染色(图1B)。在非缺血区虽然也 有外源性Trx的存在(图1C)，但Trx含量明显少于缺血区(图1D)。
给予SwissWebster小鼠外源性Trx腹腔注射，可以减少缺血/再灌注诱 导的心肌细胞凋亡。DNA电泳梯状带明显减弱(图2) ， TUNEL阳性(红色) 细胞核明显减少)图3)，降低caspase—3的活性(图4)影响。减小其梗 死范围(图9)。
② hTrx可以发生亚硝基化修饰，给予SwissWebster小鼠外源性s-hTrx 腹腔注射，可增强Trx减少心肌缺血/再灌注诱导的凋亡及减小其梗死范围 的作用。
GSN0孵育hTrx可使其亚硝基化(图5、 6)。
再灌注前给予SwissWebster小鼠外源性s-hTrx腹腔注射，与Trx相比 进一步减少在缺血再灌注心肌细胞TUNEL阳性率(图7) ， Caspase-3活性(图8)和心肌梗死范围(图9)。
③再灌注前给予SwissWebster小鼠外源性Trx及s-hTrx腹腔注射，可 以降低缺血再灌注对p38MAPK的激活，增强心肌中亚硝基化蛋白水平。
hTrx显著降低p38MAPK活性，而s-hTrx可进一步降低其活性(图10)， 增强心肌中亚硝基化蛋白水平(图ll)。
硫氧还蛋白亚硝基化修饰示意图参见图12。
综上所述，申请人利用SwissWebster小鼠进行缺血/再灌注模型研究发 现，给予外源性人重组Trx腹腔注射，可减少缺血/再灌注诱导的心肌细胞 凋亡；对Trx进行亚硝基化修饰可增强其抗缺血/再灌注心肌细胞凋亡，此 效应至少部分是通过抑制p38MAPK活性来实现的，有潜在的临床应用价 值。
申请人很多年前就已经认识到，血管开通时的再灌注会对缺血心脏造成 进一步的损伤。然而，目前其机制尚不完全清楚，临床上也尚无对症药物。 申请人:研究发现的亚硝基化的重组人硫氧还蛋白，分子量小，生物利用度好； 相比于动物源性制剂，免疫原性小；腹腔注射，简单方便。因此，它在缺血 性心脏病的治疗方面有着良好的应用前景。
本发明的使用对象是缺血性心脏病患者，特别是进行血运重建的患者。 本发明简单易行，且无特殊禁忌症，可在大医院、小诊所等广泛使用。
人源性亚硝基化的硫氧还蛋白基因序列
A t gg t g犯gcaga t c gagagcaagac t gc 1111 caggaagc c 11 ggac gc t gcaggt gat
gggtgaattttctggagccaataaggaaaagcttgaagccaccattaatgaattagtctaa。
权利要求
1. 人源性亚硝基化的硫氧还蛋白用于制备治疗缺血性心脏病药物的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的人源性亚硝基化的硫 氧还蛋白基因序列如下Atggtg犯gcagatcgagagcaagactgcttttcaggaagccttggacgctgcaggtgatgtgggtgaattttctggagccaataaggaaaagc"ttgaagccacca/ttaatgaattagtctaa。
3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物为腹腔注射 或静脉注射给药制剂。
4. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物用于缺血性 心脏病患者发生心肌梗死后接受血管再通治疗时，通过外源性给药，以减轻 患者缺血再灌注心肌损伤。
全文摘要
本发明公开了一种已知的人源性亚硝基化的硫氧还蛋白用于制备治疗缺血性心脏病药物的应用，该蛋白在体外发生亚硝基化修饰后再腹腔注射给药，其药物活性显著增强。更具体地说是缺血性心脏病患者发生心肌梗死后接受血管再通治疗时的药物应用。
文档编号A61P9/00GK101385849SQ20081015117
公开日2009年3月18日 申请日期2008年9月28日 优先权日2008年9月28日
发明者张荣怀, 王海昌, 凌 陶, 马新亮 申请人:中国人民解放军第四军医大学