专利名称：一种蝎毒提取物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蝎毒提取物及其制备方法，以及在抗血管生成中的应用。
背景技术：
世界上对蝎毒提取物的研究很多，也取得了很多成果，目前已证实蝎毒提取物在临床应 用和基础研究中对多种肿瘤具有确切的抑制作用，蝎毒提取物可通过下调bc1-2表达等机制促 进肿瘤细胞凋亡，及提高机体免疫功能以抗肿瘤。
东亚钳蝎作为一传统中药，在临床常用来治疗心血管疾病和类风湿等免疫性疾病，但目 前并不清楚其有效成分，也没有更详细的药理研究，这使其应用与研究受到了很大的限制。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种从东亚钳蝎中提取的蝎毒提取物，并提供了其制 备方法与应用。
本发明是通过以下技术方案实现的 一种蝎毒提取物的提取方法，包括以下步骤
(1) 用低温电脉冲刺激蝎口尾节得到液态粗毒，与双蒸水混匀，按体积比液态粗毒双
蒸水=1: 1.5 1: 2，然后5000 6000转/分离心20 30分钟，低温真空冷冻干燥后得到蝎
毒冻干粉。
(2) 将上述蝎毒冻干粉用水稀释为浓度lg/40ml、 PH7. 0 7. 6的蝎毒液，然后5000 6000转/分离心20 30分钟，取上清液11000 13000转/分离心20 30分钟，取上清液。
(3) 将上述上清液分别用孔径0.4511111及0.2211111的微孔滤膜过滤一遍，收集滤液，放入 冷冻槽冷冻12 36小时，温度一60 —89°C,再将冷冻槽放入冻干机真空干燥48 72h，收 取冻干粉。
(4) SephadexG-50层析层析柱用葡聚糖凝胶G—50填充，小牛血清50mg/20ml前导 吸附；取经微孔滤膜过滤后的冻干粉洗脱，紫外分光光度仪检测，吸收波长280nm,收集蝎 毒III一IV蛋白峰，操作温度为5'C。
(5) 阳离子交换树脂层析层析柱用阳离子交换树脂填充，将经G-50收集的蝎毒III一 IV上柱，流速0.5ml/分钟，梯度洗脱，紫外分光光度仪检测，吸收波长280mn，收集蛋白峰， 操作温度为5'C。
(6) 将步骤(5)中得到的含有蝎毒多肽提取物的滤液置入冷冻槽冷冻24小时温度一70°C，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥，收集冻干粉。
所述蝎为马氏钳蝎，马氏钳蝎又称为东亚钳蝎，多产于山东。 一种蝎毒提取物，是用上述方法制备的。 所述蝎毒提取物在抗血管生成中的应用。 所述蝎毒提取物在抑制肝癌细胞再增值中的应用。
本发明的蝎毒提取物为从东亚钳蝎中提取的多肽，为含50 60氨基酸的多肽混合物，纯 度89. W，分子量6000 7000道尔顿，耐热，pH稳定，在高效液相色谱显示有4个峰，主峰 占总面积的41.4%。
经试验证明，本发明的蝎毒提取物具有确切的抑制新生血管生成作用，包括抑制鸡胚尿 囊膜新生血管生成、抑制人脐静脉内皮细胞增殖及抑制肿瘤内新生血管生成。
多种疾病存在异常新生血管生成，如类风湿关节炎患者滑膜中血管生成增加，lfiL管增生是 造成滑膜炎,血管翳生长，骨和软骨破坏及骨赘形成的原因。因此抑制新生血管生成,是治疗类 风湿关节炎的新方法；使用本发明的蝎毒提取物可有效抑制血管内皮生长因子，从而抑制滑 膜内新生血管生成。肿瘤细胞生长依赖血管提供所需的氧气和营养物质，化疗期间肿瘤细胞 再增殖过程的加速更需要充足的血供，单独使用或在化疗期间联合应用本发明的蝎毒提取物， 可有效抑制肿瘤内新生血管生成，若联合应用化疗药物，如制成含有适量药用辅料的口服剂 型或注射剂型，抗肿瘤效果更佳。
本发明的蝎毒提取物还有确切的抑制肝癌细胞再增值的作用。化疗后残存肿瘤细胞再增 殖过程加速，是肿瘤细胞产生耐药性的重要原因之一，因此抑制肿瘤细胞在化疗间期再增殖 加速对肿瘤治疗有重要意义。实验证实，本发明的蝎毒提取物对多种肿瘤细胞具有杀伤作用。
本发明成功地从东亚钳蝎中提取出了其抑制血管生成和抑制肝癌细胞再增值的有效成 分，为以后进一步的研究和应用提供了基础。
图l是蝎毒提取物对人脐静脉内皮细胞的作用示意图2是蝎毒提取物对鸡胚尿囊膜新生血管生成抑制示意图；其中，l为对照组鸡胚尿囊膜， 2为0. 5呢蝎毒提取物干预组，3为0.8mg蝎毒提取物干预组。
图3是单独和联合化疗应用蝎毒提取物对肿瘤内新生血管的抑制作用示意图；其中，l为 荷瘤对照组，2为单纯蝎毒提取物干预组，3为蝎毒提取物联合化疗干预组。
图4是蝎毒提取物抑制人脐静脉内皮细胞机制示意图；其中，l为对照组bax表达，2为蝎 毒提取物组bax表达，3为对照组bc1-2表达，4为蝎毒提取物组bcl-2表达。
图5是蝎毒提取物抑制肿瘤内新生血管的机制示意图，其中，1、 2、 3分别是对照组、单 纯蝎毒提取物组和蝎毒提取物联合化疗组肿瘤组织PDGF表达，4、 5、 6分别是对照组、单纯蝎 毒提取物组和蝎毒提取物联合化疗组肿瘤组织VEGF表达。
图6为试验例6中培养三周后各组肿瘤体积示意图7为试验例6中培养三周后各组抑瘤率示意图8为试验例6中培养三周后各组H22肿瘤中PCNA的表达(X200);其中，3a、 3b、 3c为模型 组第l、 2、 3周；3d为实验组第3周；3e为PESV治疗组第3周；3f为荷瘤对照组第3周。
图9为试验例6中培养三周后各组H22肿瘤组织PCNA表达的灰度分析；其中，**第2周与模型 组对比，代0.01; A第3周，与模型组对比，代O. 01;
图10为试验例6中培养三周后各组vegf表达(X100);其中，6A、 6B、 6C为模型组第1、 2、 3周；6D为实验组第3周；6E为PESV组第3周；6F为荷瘤对照组第3周。
图11为试验例6中培养三周后各组H22肿瘤组织VEGF表达的灰度分析；其中，*第2周与模型 组对照，代0.05; **第2周与模型组对照，代0.01; A第3周与模型组对照，代0.01; A模型组 与第3周对照，代0.05。
图12为试验例6中培养三周后各组PDGF表达(X100);其中，8A、 8B、 8C为模型组第1、 2、 3周；8D为实验组第3周；8E为PESV组第3周；8F为荷瘤对照组第3周.
图13为试验例6中培养三周后各组H22肿瘤组织PDGF表达的灰度分析；其中，*3周与模型组 对照，代0.05; **3周与模型组对照，代O.Ol。
具体实施例方式
下面结合附图、实施例、试验例对本发明作进一步的说明。
实施例l:从东亚钳蝎中提取蝎毒提取物，步骤如下
(1) 用低温电脉冲刺激蝎口尾节得到液态粗毒，与双蒸水混匀，按体积比液态粗毒双
蒸水=1: 2，然后5000转/分离心30分钟，低温真空冷冻干燥后得到蝎毒冻干粉。
(2) 将上述蝎毒冻干粉用水稀释为浓度lg/40ml、 PH7. 4的蝎毒液，然后5000转/分离 心30分钟，取上清液12000转/分离心30分钟，取上清液。
(3) 将上述上清液分别用孔径0.45um及0.22um的微孔滤膜过滤一遍，收集滤液，放入 冷冻槽冷冻24小时，温度一79。C，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥72h，收取冻干粉。
(4) SephadexG-50层析层析柱用葡聚糖凝胶G—50填充，小牛血清50mg/20ml前导 吸附；取经微孔滤膜过滤后的冻干粉400mg加PH(PH7.4,0.1M)洗脱36小时，紫外分光光度 仪(吸收波长280nm)检测，收集蝎毒III一IV蛋白峰，操作温度为5'C。
(5) 阳离子交换树脂(SPSepharose Fast Flow)层析层析柱用阳离子交换树脂填充， 将经G-50收集的蝎毒m —IV200ml上柱，流速0.5ml/分钟，梯度洗脱48小时，紫外分光光 度仪检测，吸收波长280nm，收集蛋白峰，操作温度为5'C。
(6) 将步骤(5)中得到的含有蝎毒多肽提取物的滤液置入冷冻槽冷冻24小时温度一70 °C,再将冷冻槽放入冻干机真空干燥72小时，收集冻干粉。
实施例2:从东亚钳蝎中提取蝎毒提取物，步骤如下
(1) 用低温电脉冲刺激蝎口尾节得到液态粗毒，与双蒸水混匀，按体积比液态粗毒双
蒸水=1: 1.5，然后5000转/分离心30分钟，低温真空冷冻干燥后得到蝎毒冻干粉。
(2) 将上述蝎毒冻干粉用水稀释为浓度lg/40ml、 PH7.6的蝎毒液，然后5000转/分离 心30分钟，取上清液11000转/分离心30分钟，取上清液。
(3) 将上述上清液分别用孔径0.45um及0.22um的微孔滤膜过滤一遍，收集滤液，放入 冷冻槽冷冻12小时，温度—89°C，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥56h，收取冻干粉。
(4) Sephadex G-50层析层析柱用葡聚糖凝胶G—50填充，小牛血清50mg/20ml前导 吸附；取经微孔滤膜过滤后的冻干粉400mg加PH(PH7.4,0.1M)洗脱36小时，紫外分光光度 仪(吸收波长280nm)检测，收集蝎毒III一IV蛋白峰，操作温度为5'C。
(5) 阳离子交换树脂(SPSepharose Fast Flow)层析层析柱用阳离子交换树脂填充， 将经G-50收集的蝎毒III一IV200ml上柱，流速0.5ml/分钟，梯度洗脱48小时，紫外分光光 度仪检测，吸收波长280nm，收集蛋白峰，操作温度为5"C。
(6) 将歩骤(5)中得到的含有蝎毒多肽提取物的滤液置入冷冻槽冷冻24小时温度一70 'C，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥72小时，收集冻千粉。
实施例3:从东亚钳蝎中提取蝎毒提取物，步骤如下
(1) 用低温电脉冲刺激蝎口尾节得到液态粗毒，与双蒸水混匀，按休积比液态粗毒双
蒸水=1: 22，然后6000转/分离心20分钟，低温真空冷冻干燥后得到蝎毒冻干粉。
(2) 将上述蝎毒冻干粉用水稀释为浓度lg/40ml、 PH7.0的蝎毒液，然后6000转/分离 心20分钟，取上清液13000转/分离心20分钟，取上清液。
(3) 将上述上清液分别用孔径0.45um及0.22um的微孔滤膜过滤一遍，收集滤液，放入 冷冻槽冷冻36小时，温度一60'C，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥48h，收取冻干粉。
(4) Sephadex G-50层析层析柱用葡聚糖凝胶G—50填充，小牛血清50mg/20ml前导 吸附；取经微孔滤膜过滤后的冻干粉400mg加PH(PH7.4，0.1M)洗脱36小时，紫外分光光度 仪(吸收波长280nm)检测，收集蝎毒III一IV蛋白峰，操作温度为5'C。
(5) 阳离子交换树脂(SPSepharose Fast Flow)层析层析柱用阳离子交换树脂填充， 将经G-50收集的蝎毒III-IV200ml上柱，流速0.5ml/分钟，梯度洗脱48小时，紫外分光光 度仪检测，吸收波长280nm,收集蛋白峰，操作温度为5'C。
(6) 将步骤(5)中得到的含有蝎毒多肽提取物的滤液置入冷冻槽冷冻24小时温度一70 'C，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥72小时，收集冻干粉。
试验例1:本发明的蝎毒提取物对HUVEC和MDA-MB-231细胞增值活性的影响 将lxl05HUVEC人脐静脉内皮细胞加入到96孔板中培养，培养液为体积分数为10%小牛血 清的画EM培养液，培养条件37。C， 5%C02;培养24小时更换为无血清培养液。处理组加入不 同浓度的蝎毒提取物(4 20ug/ml)，对照组加入等量生理盐水。作用8小时中止作用，继 续培养24小时，用BrdU掺入的ELISA法检测细胞增殖活性，即细胞固定、变性、抗BrdU酶 标抗体作用后底物显色，读取D，值。结果如图1所示，发现蝎毒提取物在8-20吗/ml范 围明显抑制HUVEC的增殖活性，而且这种抑制作用表现为细胞类型的特异性，因为各试验浓度 的PESV对乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖活性无明显影响。
试验例2:本发明的蝎毒提取物对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的影响 将鸡胚孵育于37.5°C, 60%相对湿度下5山无菌条件下暴露鸡胚尿囊膜。按实验设计随 即分为3组，每组20只，分别将吸附有5^1生理盐水，0. 5mg和0. 8rag PESV的玻璃纤维滤 纸覆盖在CAM上，作用72 h后去除纤维玻璃滤纸，取出尿囊膜，用10%甲醛固定，移至玻片 上，在解剖显微镜下观察新生血管生成情况，计算血管生成抑制率。结果如图2所示，发现 血管生理盐水处理组鸡胚尿囊膜血管生成旺盛，分支明显，血管密度大，管径粗；而PESV处 理组血管密度稀疏，管径细，分支少。0.5mg和0.8rag PESV处理组血管分支点数分别为 12. 52±2. 90和20. 42±4. 10，明显低于生理盐水组；0. 5mg和0. 8mg处理组PESV血管生成抑 制率分别为85. 0%和75%，明显高于生理盐水对照组20%， P〈0. 01。
试验例3:单独和联合化疗应用蝎毒提取物对肿瘤内新生血管的抑制作用.-Balb/c小鼠右腋皮下种植1 X 106个仏2小鼠肝癌肿瘤细胞，荷瘤对照组给予生理盐水灌胃， 单纯蝎毒提取物组给予蝎毒提取物，剂量为40mg/kg,联合化疗组，蝎毒提取物灌胃+5-氟尿 嘧啶腹腔注射，注射量为注射浓度20mg/kg。实验共进行3周。取各组肿瘤组织，以免疫组 织化学方法检测肿瘤组织M因子-微血管密度(雨D)，结果如图3所示，对照组MVD为25.2 ±2.86，单纯蝎毒提取物组为19.8±2.38,联合组为11. 8± 1. 92，蝎毒提取物显著抑制肿瘤 内新生血管形成，联合化疗抑制更为显著。
试验例4:蝎毒提取物抑制人脐静脉内皮细胞机制的研究 人脐静脉内皮细胞按lxl(f浓度接种于12孔板培养12小时，进行细胞爬片，处理组加入 PESV10ug/ml，对照组加入等量生理盐水。作用48小时，固定后，检测凋亡相关基因Bcl-2 和Bax的表达变化。结果如图4所示，发现免疫组化显示PESV作用人脐静脉内皮细胞48h后， Bax表达增加，Bcl-2表达降低。
试验例5:蝎毒提取物抑制肿瘤内新生血管机制的研究
动物实验同试验例3，以免疫组织化学方法检测肿瘤组织(血小板衍生生长因子)PDGF 和(血管内皮生长因子)VEGF表达。结果如图5所示，蝎毒提取物显著降低肿瘤组织VEGF 和PDGF表达。
综上所述，本发明的蝎毒提取物具有明显的抗血管生成作用，并藉此抑制肿瘤的生长， 说明本发明的蝎毒提取物含有抗血管生成活性分子，可用于恶性肿瘤的临床治疗。
以上试验例中，抗体VEGF， bFGF (SantaCmz， USA)， facto广Vl (Dako， USA), Bcl-2， Bax (北京中山生物试剂公司)。BrdU EL ISA检测试剂盒Am ersham Pharmaci公司产品。
试验例6:蝎毒提取物抑制肝癌H22细胞化疗期间再增殖实验研究
1、材料和方法
丄.1材料
1. 1. 1瘤种和动物H22小鼠肝癌腹水瘤种由山东省医科院药物所惠赠，腹水瘤种每7d传1 次，第2代用于实验。动物采用Balb/c小鼠，体重18g 20g，雄性，购自山东大学医学院 动物中心。
1.1.2药品、试剂和仪器蝎毒提取物为按照实施例l的方法提取的；5-FU，购自天津金 耀氨基酸有限公司，产品批号0612022。 PCNA、 VEGF和CD105 —抗，购自北京中杉金桥生 物技术有限公司。德国leicaDM4000B光学显微镜。德国leica公司Qwin V3图像分析软件。
1.2方法
1.2.1模型建立、分组和干预方法无菌抽取7d小鼠腹腔肿瘤细胞，加入生理盐水调整 肿瘤细胞密度至4X10、m1—'后，于每只小鼠的右腋下注射0.2ml肿瘤细胞悬液(第0天)， 5天后，将小鼠成瘤之小鼠随机分为荷瘤对照组、模型组、实验组和单纯PESV组，每组至少 9只，分组当天为第5天。模型组，以5-Fu腹腔注射对小鼠进行化疗建立再增殖模型，注射 浓度20mg，kg—'，注射时间第5、 12、 19天，并以生理盐水进行灌胃，注射量10 mg kg—1， 注射时间第8、 9、 10、 16、 17、 18、 23、 24、 25天。实验组，5-Fu用法同模型组。以PESV 进行干预，干预方法PESV生理盐水稀释，灌胃，剂量为40 mg kg—'，时间第8、 9、 10、 16、 17、 18、 23、 24、 25天。单纯PESV组，只对荷瘤小鼠进行PESV灌胃，PESV干预方法同
同实验组用法。荷瘤对照组，只对荷瘤小鼠进行生理盐水灌胃，灌胃方法同模型组。
1.2.2计算抑瘤率和体积测量于第12、 19、 26天每组各随机处死小鼠3只。取肿瘤组 织，称重，以中性福尔马林固定。抑瘤率计算抑瘤率(Inhibitory Rate,工R) 二荷瘤对照 组瘤重(第n'周)-实验组瘤重(第n周)/荷瘤对照组瘤重(第n周)。每周测两次肿瘤体积， 测量肿瘤长径(A)和短径(B)，按以下公式计算肿瘤体积(V^AB2/2，并计算每周每组平 均增加的肿瘤体积。
1. 2. 3 1肿瘤组织PCNA的检测采用免疫组化S-P法检测和MVD表达。3XHA消除内源 性过氧化物酶活性，热修复后，分别加入一抗，工作浓度为1: 100， 4'C过夜,DAB显色，显 微镜下观察结果。利用双盲法测定PDGF染色强度，每张切片选取5个视野(X200)进行光 学灰度值分析，数值在0 255之间，染色越强，灰度值越低，取其平均值即为该片的灰度值。
1. 2. 4统计学处理应用SPSS 11. 0软件进行统计分析。计量资料采用AN0VA方法检测， 关联分析采用Pearson分析，显著性水平a 〈0. 05。
2、 结果
2.1 PESV对H22再增殖模型小鼠肿瘤体积的影响模型组肿瘤体积在第1周内增加了 174 % (从86. 9咖3到238. 7mm3)，在第2周增加了 91% (从238. 7腿3到458. 3 mm3)，第3周 增加了 122% (从458. 3隱3到1022咖3)。模型组肿瘤增长以"加快一缓慢一加快"的规律 随化疗周期进展而发展。单纯PESV组在3周内肿瘤体积增加的百分比依次是196% (从77. 2 隱3到228. 6 mm3)、 22% (从228. 6隨3到279. 1隱3)、 65% (从279. 1腿3到463 ram3)， 规律为"加快一非常缓慢一缓慢"。在第19和26天(分别是第2和3周末)，单纯PESV组肿 瘤的生长得到有效的抑制，如图6所示。
2.2PESV对^肿瘤抑瘤率的影响模型组肿瘤抑瘤率在第i、 2、 3周分别是37%、 47%、 38%，模型组在第二周肿瘤抑瘤率最高，但是在第三周，肿瘤抑瘤率显著降低。实验组在3 周内肿瘤在第l、 2、 3周抑瘤率分别是45%、 54%、 57%,抑瘤率逐渐升高。与模型组相比， 实验组肿瘤的生长得到有效的抑制，如图7所示。
2. 3 PESV对&2肿瘤组织PCNA表达的影响见图8和图9 (灰度值分析)，模型组和PESV 组PCNA表达水平由高到低依次皆是第1周>第3周>第2周。模型组肿瘤组织第1周和第2周 存在显著性差异(P<0. 01)。表明5-Fu在第2周对H22肿瘤细胞产生明显杀伤和抑制作用。 在第3周，表达水平上调(与第2周存在显著差异，P〈0.01)，表明在第3周化疗后肿瘤细胞 增殖加速。在第2周，PESV组与模型组存在显著性差异(P<0.01)，表明PESV加强5-Fu抗 肿瘤作用。第3周，模型组表达水平高于PESV组(P<0. 01)，表明PESV抑制了化疗后肿瘤增
殖加速。
2. 4 PESV对^肿瘤组织PDGF表达的影响模型组和实验组VEGF表达水平由高到低依次 皆是第1周〉第3周〉第2周。与模型组相比，荷瘤对照组在第2周存在显著差异(代O.Ol)， 显示5-Fu具有一定抑制VEGF分泌作用。与模型组相比，实验组在第2周和第3周皆存在显 著性差异(代O. 01)，证明联合5-Fu， PESV进一步下调VEGF表达。相关分析显示，VEGF表 达水平与CD105-MVD存在正相关(尸0.669)，见图10和图11 (灰度值分析)，而模型组PDGF 表达则逐渐下降，实验组PDGF表达则在第三周升高(P<0.05)。见图12、图13。
3、 讨论
本实验采用5-Fu干预H22皮下荷瘤小鼠。研究发现，模型组虽无体积暂时性縮小，但在 第2周出现体积增加缓慢现象，在第3周又出现迅速增加。类同Ta皿ock教授提出的再增殖 加速模型，证明5-Fu干预H22皮下荷瘤小鼠模型存在再增殖加速现象。同时发现实验组在第 2周，实验组肿瘤体积显著小于模型组，说明PESV加强了 5-Fu抗肿瘤作用，在第3周实验 组同样显著小于模型组，说明PESV有效抑制了化疗后出现的第3周增殖加速现象。免疫组织 化学检测PCNA观察处于增殖期的肿瘤细胞显示，模型组在第2周表达水平比第1周低，第3 周显著高于第2周，表明在第2周处于增殖的细胞减少，但是第3周模型组处于增殖的肿瘤 细胞又迅速增加。结合肿瘤体积变化和PCNA表达差异，证明化疗后肿瘤再增殖加速现象。
文中所指PESV为本发明的蝎毒提取物。
权利要求
1.一种蝎毒提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤(1)用低温电脉冲刺激蝎口尾节得到液态粗毒，与双蒸水混匀，按体积比液态粗毒双蒸水＝11.5～12，然后5000～6000转/分离心20～30分钟，低温真空冷冻干燥后得到蝎毒冻干粉；(2)将上述蝎毒冻干粉用水稀释为浓度1g/40ml、PH7.0～7.6的蝎毒液，然后5000～6000转/分离心20～30分钟，取上清液11000～13000转/分离心20～30分钟，取上清液；(3)将上述上清液分别用孔径0.45um及0.22um的微孔滤膜过滤一遍，收集滤液，放入冷冻槽冷冻12～36小时，温度—60～—89℃，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥48～72h，收取冻干粉；(4)Sephadex G-50层析层析柱用葡聚糖凝胶G—50填充，小牛血清50mg/20ml前导吸附；取经微孔滤膜过滤后的冻干粉洗脱，紫外分光光度仪检测，吸收波长280nm，收集蝎毒III—IV蛋白峰，操作温度为5℃；(5)阳离子交换树脂层析层析柱用阳离子交换树脂填充，将经G-50收集的蝎毒III—IV上柱，流速0.5ml/分钟，梯度洗脱，紫外分光光度仪检测，吸收波长280nm，收集蛋白峰，操作温度为5℃；(6)将步骤(5)中得到的含有蝎毒多肽提取物的滤液置入冷冻槽冷冻24小时温度—70℃，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥，收集冻干粉。
2. —种根据权利要求l所述方法制备的蝎毒提取物。
3. 权利要求3所述蝎毒提取物在抗血管生成中的应用。
4. 权利要求3所述蝎毒提取物在抑制肝癌细胞再增值中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种从东亚钳蝎中提取的蝎毒提取物，其制备方法为取蝎毒冻干粉溶解，离心，0.45μm及0.22μm的微孔滤膜过滤，冻干，葡聚糖凝胶，收集蝎毒III-IV蛋白峰，再进行阳离子交换层析，紫外分光光度仪检测，收集蛋白峰，即为本发明的蝎毒提取物。经试验证明，本发明的蝎毒提取物具有确切的抑制新生血管生成作用和抑制肝癌细胞再增值作用。本发明成功地从东亚钳蝎中提取出了其抑制血管生成和抑制肝癌细胞再增值的有效成分，为以后进一步的研究和应用提供了基础。
文档编号A61P35/00GK101366733SQ200810157559
公开日2009年2月18日 申请日期2008年10月7日 优先权日2008年10月7日
发明者张月英, 张维东, 燕 王, 王兆朋, 王朝霞, 青 贾 申请人:山东省医学科学院基础医学研究所