专利名称：一种用于预防和治疗阿尔兹海默氏病的具有免疫原性的肽组合物的制作方法
本申请是国际申请号PCT/US02/10293，国际申请日为2002年4月2日，中国申请号为“02810621.0”，发明名称为“一种用于预防和治疗阿尔兹海默氏病的具有免疫原性的肽组合物”的分案申请。
发明领域 本发明涉及一种包含肽免疫原的用于预防和治疗阿尔兹海默氏病的组合物。更具体地，该肽免疫原包含一个主要的功能/调控位点，一个与具有多个二类MHC结合基序的辅助T细胞表位(Th)连接的淀粉样蛋白β(Aβ)肽的N末端片段。该肽免疫原引发针对Aβ肽的主要功能/调控位点的定点免疫反应并产生抗体，所述抗体与在阿尔兹海默氏病患者脑中形成的可溶性Aβ1-42肽及淀粉样蛋白斑高度交叉反应。引发的对可溶性Aβ1-42肽交叉反应的抗体促进原纤维解聚，抑制原纤维聚集，导致“可溶性Aβ衍生的毒素”的免疫中和；而且与淀粉样蛋白斑交叉反应，促进从脑中清除这些斑块。因此，本发明的包含该肽免疫原的组合物可用于预防和治疗阿尔兹海默氏病。
背景技术：
阿尔兹海默氏病(AD)是一种慢性神经变性疾病，其特征表现为患者丧失认知能力并具有严重的行为异常，从而导致患者的最终死亡。目前在美国有250万到400万AD患者，全世界有1700万到2500万AD患者。该病在西方国家已经成为继心脏病、癌症和中风之后第四位导致死亡的疾病。
是一种乙酰胆碱酯酶抑制剂，已被FDA批准用于减缓阿尔兹海默氏病患者的恶化速率。然而，该药仅对限定的时期和某些患者有效。至今还没有明确的治疗或治愈该破坏性疾病。
两种微观的沉淀物即神经原纤维缠结(NFT)和老年淀粉样蛋白斑由Alois Alzheimer鉴定为该病的病理标记。神经原纤维缠结由两条10nm宽称为成对螺旋丝(PHFs)的细丝相互缠绕而成，其主要组成部分是磷酸化的tau蛋白。tau蛋白262位氨基酸丝氨酸的磷酸化是一个关键步骤，导致tau蛋白生理上的功能紊乱。PHFs存在于胞内，并且在许多异常的树突和轴突过程中或组成老年淀粉样蛋白斑外围的神经突中有发现。老年淀粉样蛋白斑由横截面面积高达150μm的紊乱的神经嗜细丝(neurophil filament)和一个淀粉样沉积物的胞外核组成。脑淀粉样蛋白斑在超微结构上不同于PHFs，由4-8nm宽的不成对缠绕在一起的细丝组成。斑核由最初命名为A4的相对分子量(M)约为4,000的肽聚集物组成(Masters等.，Proc Natl Acad Sci USA，1985，82:4245-4249)。
现在被重新命名为淀粉样蛋白β肽(或Aβ1-42)的A4的部分氨基酸序列显示与从阿尔兹海默氏病或唐氏综合症的患者脑血管中分离的淀粉样β蛋白相似(Gl enner和Wong，Biochem Biophys Res Comm，1984；120:885-890；122:1131-1135)。
因许多原因已推测Aβ1-42与AD相关。首先，在外周淀粉样变性病中，如初级轻链疾病或次级AA淀粉样变性，大量的淀粉样蛋白负荷与组织和器官功能紊乱强烈相关。第二，淀粉样蛋白斑的密度与AD中XX痴呆值(premortem dementia score)正相关。第三，Aβ1-42沉淀物是AD和相关疾病，如唐氏综合症中最早出现的神经病理标志物，比NFT的形成早20-30年。第四，β-淀粉样变性对AD和相关疾病是相对特异的。第五，Aβ1-42对神经元有毒性作用(Yankner等.，Science，1990；250:279-282)。最后，在淀粉样前体蛋白(APP)结构基因中的错义突变导致家族性AD的早期发作(Goate等.，Nature，1991；349:704-706；Mullan等.，NatureGenetics，1992；1:345-347)。显然，这样的一个突变造成Aβ1-42的惊人的超量产生(Citron等.，Nature，1992；360:672-674)。
1987年，Kang等(Nature，1987；325:733-737)和其他三个研究组(见1987Anderton的现状文献(status reports)，Nature，1987；325:658-659和Barnes，Science，1987；235:846-847)独立地克隆到编码Aβ1-42的基因。该基因编码695个氨基酸残基的MW约为79,000的蛋白质，该蛋白现在被命名为淀粉样前体蛋白(APP)，并事实上在所有的组织中都有表达。APP至少有五种剪接变异体，其中四种包含β-淀粉样蛋白肽序列。
在家族性形式的AD中已涉及四种基因。其中的三个基因，βAPP，presenilin 1和presenilin 2发生突变时，造成常染色体显性早期形式的AD。第四个基因载脂蛋白E具有天然存在的多态形式，ApoE4，它代表该病发展的一个主要遗传危险因子。可获得的证据支持下述观点几个独特基因的改变可导致Aβ1-42产生和其清除之间的长期不平衡，从而引起前42个残基和随后40个残基肽聚集成细胞毒素斑。已有证据确切表明这些四个基因每个的缺陷通过(1)增加Aβ1-42肽的产生和/或沉淀或(2)通过减少ApoE4从组织中的清除来倾向于产生AD表型(Selkoe，JBiol Chem，1996；271:18295-18298)。
从可获得的数据显示，似乎聚集的而非单体形式的Aβ1-42肽能在体外通过一系列推测的相关机制诱导细胞功能紊乱和死亡。这些包括氧化损伤(Thomas等.，Nature，1996；380:168-171；Behl等.，Cell，1994；77:817-827)，胞内钙稳态改变(Arispe等.，Proc Natl Acad Sci USA，1993；90:567-571)和细胞骨架重组(Busciglio等.，Neuron，1995；14:879-888)。即使级联反应假说仍处在激烈的争论中，对淀粉样蛋白诱导的级联反应的一些基本步骤已形成了足够的认识。
目前正充分开展鉴定可抑制淀粉样蛋白诱导的级联反应的一个或另一个步骤的小分子的药学方法。特别感兴趣的是以下两个方法试图通过降低Aβ1-42肽从神经细胞和神经胶质细胞中的分泌来干扰Aβ1-42肽的聚集，或抑制这些胞外聚集物作用于神经细胞和神经胶质细胞以及它们的产生过程的毒性。第三种方法尝试控制似乎由聚集的Aβ1-42引发的特定炎性反应(包括小胶质细胞性刺激，激活典型的补体级联反应，细胞因子释放和反应性星形细胞增生)，可能证明对阿尔兹海默氏病患者是有利的。
除了上述药学方法对AD进行干涉外，也已尝试进行了免疫干涉。Soloman等(Proc Natl Acad.Sci，1996；93:452-455；Proc Natl Aca.Sci，1997；94:4109-4112)表明直接针对人Aβ1-42肽的N末端区一个位点的三种特异单克隆抗体可以在各种程度上与预先形成的原纤维结合，从而导致它们解聚，并抑制它们的神经毒性作用。而且还发现这些抗体防止纤维性Aβ1-42的形成。Solomon等(WO 01/18169)也尝试制备噬菌体展示的Aβ1-42肽的表位，并通过腹腔注射将噬菌体展示的表位或包含该表位的肽对小鼠给药，以引发针对Aβ1-42肽的抗体。通过大鼠嗜铬细胞瘤(phenochromocytoma)的体外实验表明，以15稀释的抗血清防止Aβ1-42的神经毒性。15和120稀释的抗血清也表明由于广泛破坏纤维形态体外破坏Aβ的纤维结构。然而，在第一次注射中所用的佐剂是弗氏完全佐剂，而第二次注射中所使用的是弗氏不完全佐剂。所用的佐剂完全不适用于人。而且，即使使用这些烈性(harsh)佐剂，所产生的抗体水平依然太低，几乎没有效用。
随后，Schenk等(Nature，1999；400:173-177)表明，在AD小鼠模型中，用Aβ1-42肽免疫抑制淀粉样蛋白斑和相关营养不良神经突的形成。然而，由于Aβ1-42的低免疫原性，所用方法需要配合使用形成烈性损害的佐剂来重复给药抗原，以获得更高水平的抗Aβ1-42斑的抗体，其为影响斑的形成所必需的。另外，需要注意的是，用Aβ1-42免疫可能诱导更多的毒性淀粉样蛋白自身的积累(Araujo，DM & Cotman，CW，Brain Res，1992；569，141-145)。
尽管存在这些缺点，在转基因AD小鼠模型中通过类似的活性免疫所进行的额外的研究已经对AD的免疫预防和免疫治疗方法提供了保证。Janus等(Nature，2000；408:979-982)描述了在AD小鼠模型中Aβ1-42肽免疫降低行为损害和斑。Morgan等(Nature，2000；408:982-985)描述了Aβ1-42肽疫苗在小鼠模型中抑制记忆丧失。
免疫治疗有效性的直接证据来源于对外周给药抗A β肽的抗体，单克隆或多克隆抗体降低了淀粉样蛋白的负荷的观察(WO 99/27944；Bard等.，Nature Medicine，2000；6:916-919)。虽然血清水平相对不多，但这些被动给药的抗体，单克隆抗体3D6(抗Aβ1-5)和10D5(抗Aβ1-12)或多克隆抗Aβ1-42能够进入中枢神经系统。在该处，抗体与斑块结合并诱导对预先存在的淀粉样蛋白斑的清除。Bard等报道，当用PDAPP小鼠(即用由血小板衍生的生长因子启动子启动的APP小基因转基因的小鼠)脑切片或AD患者脑组织进行体内检测时，抗A β肽的抗体启动小神经胶质细胞通过FC受体介导的吞噬作用和随后的肽段降解来清除斑块。该研究证实，在AD小鼠模型中，被动给药抗Aβ1-42肽和Aβ1-42N末端区的抗体降低了斑块沉淀的程度；由定点疫苗引发的单克隆抗体或多克隆抗体能够以治疗相应水平进入CNS。
尽管在AD小鼠模型中有价值的发现免疫干涉，但得到一个适于人的抗AD疫苗还有很长的一段路要走(Chapman，Nature，2000；408:915-916)。在实用型AD疫苗完成前，在设计和配制一个可用于人的免疫原性的组合物所必需的广泛工作中存在主要障碍。需要通过实验数据来进行指导的一些问题是(1)在A β中，抗体识别的特异靶位点是什么？(2)免疫原以何种方式呈现？(3)一个引发治疗水平的抗体的免疫原在完成前，需要包括的其他位点是什么？(4)使用适于人的临床上可接受的佐剂的有效疫苗递送系统是什么？ 已有文献中已公开的和需要进行的工作之间存在一个主要差距。合适的特异靶位点(即多聚Aβ1-42斑或单体可溶性Aβ1-42肽)是什么及该特异位点如何进行加工以用于免疫干涉。尽管在过去的二十年中发表了5,000篇关于Aβ1-42的文献，淀粉样蛋白级联反应假说仍处于热烈的争论中，Aβ1-42以何种形式用于干涉的论题仍存在争议。如Terry及其同事所述，该论题的中心问题是纤维性淀粉样蛋白负荷与神经机能障碍之间联系不大(The Neuropathology of Alzheimer Disease and the Structure Basisof its Alterations，Terry等编辑.，Alzheimer Disease，187-206页，Lippincott Williams和Wilkins，1999)。
在AD患者中，淀粉样蛋白沉淀经常在远离神经元损坏的地方形成。与病理性痴呆最有关系的是丧失突触末端。然而，突触末端的丧失与淀粉样蛋白负荷的相关性很差。如果该病显示与淀粉样蛋白负荷相关性不大，那么Aβ的作用是什么？Klein等的题为“Targeting small A(1-42oligomersthe solution to an Alzheimer’s disease conumdrum？的文章(Trends in Neurosciences，2001；24:219-224)表明原纤维不是Aβ的唯一毒性形式，而且可能不是与Aβ最相关的神经毒素。也称为Aβ1-42衍生的扩散型配体(ADDLs)的小的寡聚体和初原纤维，也可以具有强烈的毒性神经活性。
进行成功免疫干涉的AD疫苗需要设计一个引发定点高亲和力抗体的免疫原，所引发的抗体可以与脑组织中的老年斑结合，从而促进通过神经胶质细胞对这些斑的清除，和免疫中和可溶性A β衍生的毒素。
多年来已经认识到产生高亲和力的抗具有弱免疫原性的位点特异的肽的定点抗体的问题。如WO 99/27944中所证实，免疫学家和疫苗学家经常求助于经典的半抗原[肽]-载体蛋白偶联物的方法。为了开发抗AD的定点疫苗，Frenkel等尝试通过如上所述“EFRH”-噬菌体给药来进行抗Aβ1-42斑的免疫反应(Proc Natl Acad.Sci 2000；97:11455-11459，WO01/18169)。
一些方法使用Aβ1-42肽聚集物或Aβ1-42肽片段-载体蛋白偶联物(WO99/27944)和用丝状噬菌体展示的“EFRH肽”作为试剂来诱导针对患者中淀粉样蛋白沉淀的免疫反应，这些方法是麻烦而且无效的。例如，在第四次用1011噬菌体展示的EFRH表位进行免疫后，在豚鼠免疫血清中>95％的抗体是抗该噬菌体的。仅有一小部分(<5％)抗体是抗可溶性Aβ1-42肽的(Frenkel等.，Vaccine 2001，19:2615-2619，WO 01/18169)。
在EP 526,511和WO 99/27944中描述了更简便的方法，它们公开了给药Aβ1-42肽来治疗那些已确诊的AD患者，及在AD患者中产生“有利的”免疫应答的条件下对患者给药Aβ1-42或其他免疫原。然而，在WO99/27944的综述中表明其中公开的疫苗设计存在主要缺陷。
特别是，问题在于缺少药用和有效的疫苗递送系统。WO99/27944公开了将Aβ1-42或Aβ1-42的活性片段连接到诸如霍乱毒素的载体分子上作为活性疫苗组分。见WO 99/27944第四页。尽管第五页教导了包含免疫原的药物组合物不应该含有弗氏完全佐剂[CFA]，但表明Aβ1-42疫苗在治疗患有AD的转基因小鼠的有效性方面的实例使用了大剂量的在CFA中的聚集的Aβ1-42肽。尽管重复列举了与公开的免疫原性试剂一起使用以增强免疫应答的优选的佐剂，但实验数据表明只有使用CFA/ICFA的制剂才能提供足够高滴度的抗体。见WO 99/27944第25页。在实施例1中，验证了PDAPP小鼠中抗AD的Aβ1-42的预防效果。然而，给药的制剂包括每只小鼠给药100μg乳化在弗氏完全佐剂[CFA]中的聚集的Aβ42(见WO99/27944第34页)，随后多次注射激发剂量的乳化在弗氏不完全佐剂中的相同的Aβ1-42肽。在实施例IX中，对不同佐剂在小鼠中的免疫应答进行了研究。当佐剂MPL，明矾，QS21和CFA/ICFA与据称有效的免疫原AN1792(即聚集的人A β42)一起使用时，对Aβ1-4的抗体水平与接受CFA/ICFA疫苗的小鼠相比在统计学意义水平上降低。见WO 99/27944表9和59-64页。
在使用Aβ1-42肽片段(氨基酸1-5，1-12，13-28和33-42的人A Aβ1-42肽)的情形中，将每个片段连接到作为蛋白载体的羊抗小鼠IgG。在稍后的公开内容中，抗体对Aβ肽片段的功效仅在使用单克隆抗体进行被动免疫时才能表现出来(Bard等.，Nature Medicine 2000；6:916-919)。这些与羊抗小鼠IgG连接的片段的效力还没有表现出来。因此，表现出效力的唯一免疫原是溶于CFA/ICFA中的聚集的Aβ1-42肽。
直到目前，所有表现出效力的疫苗制剂都使用CFA/IFA作为佐剂。至此，针对Aβ1-42的肽免疫原已通过将各种Aβ1-42片段连接到羊抗小鼠免疫球蛋白上，将合成的Aβ13-28通过间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯连接到抗CD3的抗体上，或单独的聚集的Aβ1-42肽来进行制备。这些免疫原，即单独的A β42肽或Aβ1-42肽-载体蛋白偶联物，在第一次免疫时用弗氏完全佐剂乳化，随后在弗氏不完全佐剂中激发(Johnson-Wood等.，Proc Natl Acad Sci USA，1997；94:1550-1555；Seubert等.，Nature，1992；359:325-327；Schenk等.，Nature，1999；400:173-177；Janus等.，Nature 2000；408:979-982；和Morgan等.，Nature，2000；408:982-985)。WO 99/27944中公开的制剂或其他使用CFA和ICFA作为佐剂的制剂导致损害，而且对于用于人类而言过于烈性。因此，在现有技术中所描述的针对AD的疫苗组合物没有一种是适于人的。
综上所述，尽管综述了考虑到Kline的先前公开(EP 526,511)提示Aβ1-42肽治疗AD方面的潜力，但在WO99/27944中并没有真正提供没有问题解决的疫苗制剂以解决这个核心问题。
使用肽-载体蛋白偶联物和Aβ1-42聚集物的另一个不利之处是这些分子非常复杂，难于表征，而且对于生产过程也难于开发有效的质量控制程序。另一个不利之处是当对人体给药时，Aβ1-42或其片段是自身分子。因此，它们在人体内缺少免疫原性或完全不具有免疫原性。这样有必要开发临床上可接受的疫苗制剂来对人给药。
已知混杂的Th表位可用来引发有效的T细胞辅助作用，而且可以与弱免疫原性的B细胞表位结合以提供有效的免疫原。精心设计的混杂的Th/B细胞表位嵌合肽已显示对于在表达多样MHC单元型的遗传上多样的群体的多数成员中引发Th应答和得到的抗体应答是有用的。已知了来源于许多病原体的混杂Th，如麻疹病毒F蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原。表1和2列出了许多已知的混杂Th，它们已显示在产生增强短的具有弱免疫原性的肽—十肽激素LHRH(US 5,759,551，和6,025,468)方面是有效的。
有效的Th表位长度大小约为15-40个氨基酸残基，一般具有共同的结构特征，而且可含有特异的标志序列。例如，Th的共同特征是包含两性螺旋，具有疏水氨基酸残基的α螺旋结构占据螺旋的一面，而带电荷的和极性残基占据外围表面(Cease等.，Proc Natl Acad Sci USA，1987；844249-4253)。表位通常包含附加的一级氨基酸模式，如后面为2-3个疏水残基的Gly或带电荷的残基，然后依次为带电荷的或极性残基。该模式被称为Rothbard序列。Th表位一般遵守1，4，5，8规则，即带正电荷的残基在带电荷的残基后第4，5，和8位是疏水残基。因为所有这些结构都是由共同的疏水性，带电荷和极性氨基酸组成，在单个Th表位中可同时存在每种结构(Partidos等.，J Gen Virol，1991；72:1293)。多数情况下，如果不是所有，混杂的T细胞表位符合上述的至少一个周期。这些特征可以结合到设计理想的人工Th位点中，包括组合的Th表位。关于设计组合的Th位点，对于MHC结合基序而言可变的位点以及优选的氨基酸的列表是可获得的(Meister等.，Vaccine，1995；13:581-591)。另外，对于称为结构合成抗原文库的组合库肽，已公开了一种生产组合Th的方法(Wang等.，WO 95/11998)。因此，1，4，5，8规则可与已知的组合MHC结合基序一同应用以指定组合Th位点中的不变的和简并的位点，和选择适于简并位点的残基以极大地扩大人工Th的免疫应答的范围。见WO 99/66957表2和WO 95/11998。
王等(US 5,759,551)建议使用免疫刺激元件来实现自身蛋白糊精的免疫原性。王等建议给药具有免疫原性的合成糊精肽作为疫苗来治疗非胰岛素依赖的糖尿病(NIDDM)，该病是一种由糊精过量产生引起的淀粉样(amyloidogenic)疾病(见US 5,759,551的19列，9-39行)。糊精是由胰岛中的β细胞产生的37个氨基酸残基的肽激素。糊精的过量产生将导致产生淀粉样疾病的不溶性淀粉样蛋白在胰腺中的沉积。类似于糊精的过量产生，Aβ1-42肽的过量产生将导致在AD患者脑中沉积不溶性淀粉样蛋白。然而，糊精和Aβ1-42肽之间存在有限的序列同源性。糊精32-35的仅一段短序列的氨基酸残基VGSN对应于Aβ24-27。考虑到Soloman等和Schenk等的研究，它们表明序列EFRH是至关重要的，所产生的抗糊精肽的抗体既不与可溶性Aβ1-42肽发生交叉反应，也不促进对脑中的淀粉样蛋白斑进行清除。
本发明的目标是开发一种能够产生抗Aβ1-42肽N末端功能位点并与AD患者脑中老年斑进行高度交叉反应的高水平高亲和力抗体的免疫原。期待通过与Aβ1-42肽和老年斑结合产生的抗体加速从脑中清除这些斑块，促进原纤维解聚，抑制原纤维聚集，和对“可溶性Aβ衍生的毒素”[也称为Aβ衍生的扩散性配体或ADDLs]进行免疫中和。
本发明的另一个目标是开发一种适于人或牲畜的用于预防和治疗阿尔兹海默氏病的疫苗递送载体。
附图简述
图1a，1b，1c，1d，1e和1f是显示使用1:100稀释的免疫和免疫前血清，用抗生物素蛋白-生物素化的抗体复合物(ABC)方法，来自2个AD脑的连续切片的免疫过氧化物酶染色的照片，放大倍数为10X。图1a和1d显示抗体与硫磺素(thioflavine)S阳性血管(标记为″BV″)上老年斑和Aβ斑(均标记为″P″)均有很好的结合。抗体是用在ISA51油包水乳液中制备的Aβ1-28-εK-MVF Th1-16(SEQ ID NO:74)在豚鼠中产生的。图1b和1e所示的是针对CFA/ICFA中的相同肽免疫原产生的抗体的交叉反应。图1c和1f所示的是使用免疫前血清的脑切片。
图2a，2b，2c，2d和2e所示的是使用1:100稀释的免疫和免疫前血清AD脑的连续切片的免疫过氧化物酶染色的照片，放大倍数为40X。图2a和2d所示的是抗体与形成核的斑(P)有强烈的染色反应，该抗体是用配制在ISA51油包水乳液中的Aβ1-28-εK-MVF Th1-16(SEQ ID NO:74)在豚鼠中进行免疫而产生的。图2b是利用CFA/ICFA制剂中相同的免疫原AD猪脑切片的染色模式的照片。抗血清主要与血管(BV)上的斑块进行反应。图2c是用免疫前血清的豚鼠脑切片的照片，显示没有染色。图2e所示的是用Aβ1-28肽单独在CFA/ICFA进行免疫所产生的高免疫血清所得到的脑切片，尽管ELISA中该血清与Aβ1-28强烈反应，但染色反应表现为令人惊讶的弱染色模式。
发明简述 本发明涉及一种包含合成肽的免疫组合物，该合成肽能够诱导抗Aβ肽的主要功能/调控位点并与阿尔兹海默氏病(AD)患者脑中的可溶性Aβ1-42肽和斑块具有高度交叉反应的抗体。当对AD患者或倾向于患AD的人给药时，期望该免疫原性组合物促进脑中淀粉样蛋白斑的清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和，以预防和治疗AD。特别是，本发明的肽免疫原包含连接到选自10—28个氨基酸残基包含Aβ1-42肽(SEQ ID NO65)的EFRH的短N-末端Aβ1-42肽片段上或Aβ1-42肽片段的免疫功能类似物上的选自SEQ ID NOS1-64和它们的免疫功能类似物的Th表位。优选的Aβ1-42肽片段选自SEQ ID NOS66-69或它们的免疫功能类似物。
本发明还提供一种在药用疫苗制剂中包含免疫有效量的肽组合物的免疫原性组合物，所述疫苗制剂包含佐剂或乳化剂，其选自liposyn，皂甙，角鲨烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，Montanide ISA51，ISA35，ISA206和ISA 720以及其他有效的佐剂和乳化剂。
本发明还提供一种通过在足以诱导针对Aβ1-42肽的功能/调控位点的抗体的条件下，对哺乳动物给药一种或多种免疫原性肽一段时间，来诱导脑中淀粉样蛋白斑的加速清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和，以预防和治疗哺乳动物的阿尔兹海默氏病的方法。本发明疫苗的一个典型实例是在疫苗中包含5-1000μg肽免疫原的肽组合物，所述疫苗在药用佐剂和/或载体中被配制为油包水的乳剂。给药疫苗的典型方法是在是0，4和8周间隔的免疫时间，以0.5-2mL每剂量肌肉注射疫苗制剂。
本发明的另一个方面涉及一种由辅助T细胞(Th)表位组成的约30—约60个氨基酸的免疫原性的合成肽，所述表位与每个片段包含Aβ1-42肽的氨基酸残基1的选自10—28个氨基酸的N-末端Aβ1-42肽片段相连接。见SEQ ID NO:65，其中D，天冬氨酸，被指定为氨基酸残基1。优选地，N末端Aβ1-42肽片段选自SEQ ID NOs66-69或Aβ1-42肽N末端片段的肽类似物。任选地，可以包括分离免疫原性结构域的氨基酸间隔臂。如果基本上保留了肽半抗原的免疫反应性，或者产生对N末端Aβ肽片段、可溶性Aβ1-42肽和斑块的免疫反应性，被间隔臂分离的免疫原性结构域元件可以以任何顺序进行共价连接。
影响合成多肽对于N末端Aβ1-42片段免疫原的免疫原性的一个重要因素是通过T辅助细胞表位(Th)将其呈递给免疫系统。通过对于靶Aβ肽而言是外源的、位于单独的Th肽结构域元件上的外源Th表位，最可靠地将这种Th提供给肽免疫原。通过重组DNA表达来产生作为杂合多肽的这类肽免疫原。作为包含适于宿主的来自Aβ肽的靶半抗原B细胞位点和T辅助表位(Th)的合成肽免疫原，它们也可以被更简单和更便宜地提供。除了抗体结合位点，这类肽与辅助T细胞受体和II类MHC分子反应(Babbitt等.，Nature，1985；317:359)，从而刺激针对靶抗体结合位点的紧密的位点特异的抗体反应。以前通过对于聚集的全长Aβ肽而言固有的Th将这种Th提供给可用的Aβ1-42肽免疫原(WO 99/66957；WO1999/27944；Janus等.，2000，Morgan等.，2000)，也可由载体蛋白提供。全合成的肽免疫原与Aβ1-42肽聚集物，载体偶联物和重组多肽相比，具有以下优点，因为为了容易控制质量，对产物进行化学定义。合成的肽免疫原是稳定的。不需要精细的下游加工过程，也不需要精细的制造工具。免疫应答是位点特异的，并且集中在Aβ靶而不是载体。因此，避免了不利的应答如表位抑制。
合成的定位于Aβ肽免疫原的N末端功能位点的免疫原性可通过以下两个方面进行优化(1)将N末端Aβ1-42肽片段与选择的多数种群都有应答反应的外源混杂Th位点结合；(2)将Aβ肽片段与通过组合化学扩大了所有组成成分的Th结合，从而容纳遗传多样的群体的变化的免疫反应性。
已发现，本发明的肽组合物在刺激产生抗Aβ肽主要功能/调控位点的抗体方面是有效的，所述抗体对AD患者脑中的可溶性Aβ1-42和斑块具有交叉反应性。基于在豚鼠和狒狒中获得的免疫原性数据，和获自通过获得的特异免疫血清对存在于人AD脑切片中的淀粉样蛋白斑进行免疫过氧化物酶染色的数据，期待适当配制的本发明的肽免疫原对人体是有效的。值得注意的是从狒狒中获得的数据特别有意义，因为该种属的免疫应答与人的免疫应答十分相似。
发明详述 本发明涉及一种新型的肽组合物，用于产生对Aβ肽主要功能/调控位点特异的高滴度多克隆抗体，该抗体可与阿尔兹海默氏病(AD)患者脑中的可溶性Aβ1-42和斑块具有交叉反应性。用该肽组合物产生的抗体是高度位点特异的，并与Aβ肽和脑中的淀粉样蛋白斑结合。因此，本发明提供了一种用于促进脑中淀粉样蛋白斑的清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和从而预防和治疗AD的有效方法。
选自10到28个氨基酸的N末端Aβ1-42肽片段，其中每个片段包含Aβ1-42肽(SEQ ID NO:65)的EFRH，它们是短的线性肽，其本身没有免疫原性。该短的Aβ1-42肽片段可通过化学偶联一个载体蛋白如钥孔血蓝蛋白(KLH)或通过重组DNA表达与载体多肽如乙肝病毒表面抗原融合而被免疫强化。这类的“A β肽—载体蛋白”疫苗的缺点是所产生的抗体的主要部分是针对载体蛋白的非功能抗体。
本发明的免疫原是完全合成的肽免疫原，包含10到28个氨基酸的Aβ1-42肽N末端片段，每个片段包含共价连接到混杂Th表位的Aβ1-42肽的EFRH，所述表位选自SEQ ID NOs1到64。本发明的免疫原引发产生位点特异的，与Aβ1-42肽及其聚集物结合的，并与脑中淀粉样蛋白斑有交叉反应的抗体，从而促进脑中淀粉样蛋白斑的清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和。因此，本发明的免疫原可用于预防和治疗AD。
本发明中所用的辅助T细胞表位(Th)包含多个II类MHC结合基序。提供了共价连接到N末端Aβ1-42肽片段上的Th的具体实例。用本发明的免疫原肽免疫的动物的抗血清结果表明在遗传上多样的宿主群体中产生了有效的定位A β肽反应抗体。
一般来说，本发明的合成免疫原性肽大约为20—100个氨基酸长，并包含 (i)选自SEQ ID Nos1到64的辅助T细胞(Th)表位； (ii)约10到约28个氨基酸残基的Aβ1-42肽N末端片段，其中每个片段包含Aβ1-42肽的EFRH；和 (iii)任选地，由至少一个氨基酸组成的间隔臂以隔离免疫原性结构域。
优选地，Aβ1-42肽的N末端片段选自SEQ ID NOS66-69和其免疫有效类似物。Th肽共价连接在任选具有间隔臂(如Gly-Gly，ε-N Lys)的Aβ1-42肽的靶N末端片段的N-或C-末端。
本发明的肽免疫原由以下公式之一表示 (A)n-(Aβ1-42肽的N末端片段)-(B)o-(Th)m-X；或 (A)n-(Th)m-(B)o-(Aβ1-42肽的N末端片段)-X； 其中 每个A独立是一种氨基酸； 每个B是选自氨基酸，gly-gly，(α，ε-N)lys，Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO:73)的连接序列； 每个Th包含一个组成辅助T细胞表位的氨基酸序列或其免疫增强类似物或片段； (Aβ1-42肽的N末端片段)是一种合成的肽B细胞靶位点抗原，是约10到约28个氨基酸残基的片段，其中每个片段包含Aβ1-42肽的EFRH或其免疫功能类似物； X是氨基酸的α-COOH或α-CONH2； n是0到约10； m是1到约4；及 o是0到约10。
本发明中的肽免疫原包含约20—约100个氨基酸残基，优选地为约25—约60个氨基酸残基。优选地，(Aβ1-42肽N末端片段)选自SEQ ID Nos66-69，并且优选Th表位选自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。优选地，m＝1，n＝1，和o＝1或2。
当A代表一种氨基酸时，它可以是非天然存在的或天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸包括，但不限于ε-N赖氨酸、β-丙氨酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟基脯氨酸，甲状腺素，γ-氨基丁酸，高丝氨酸，瓜氨酸等。天然存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。当m大于1而且2个或多个A代表氨基酸时，那么每个氨基酸可独立地相同或不同。(A)n可以包括一个间隔臂，如Gly-Gly，ε-N Lys。
B是一个间隔臂，是一种如上所述的可天然存在的或非天然存在的氨基酸。每个B独立相同或不同。B的氨基酸也可在混杂的Th表位和Aβ1-42肽N末端片段(如序列SEQ ID NOs:66-69)或其免疫功能类似物之间提供一个间隔臂，如Gly-Gly，ε-Lys或赖氨酸。此外通过从B细胞表位，即Aβ1-42肽N末端片段或其免疫功能类似物，物理分离Th表位，，Gly-Gly或ε-Lys间隔臂可以打断任何通过Th表位和Aβ1-42肽N末端片段或其免疫功能类似物连接而产生的人工二级结构，从而消除Th和/或B细胞应答的干扰。B的氨基酸也可以形成一个间隔臂，其作为加强Th与Aβ1-42肽N末端片段之间分离的柔性铰链。在免疫球蛋白重链铰链区可发现编码柔性铰链的实例。柔性铰链序列一般都富含脯氨酸。一个特别有用的铰链序列由Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO:77)提供，其中Xaa是任何氨基酸，优选天冬氨酸。B的氨基酸提供的构象隔离可使提呈的肽免疫原与适当的Th细胞和B细胞更有效地相互作用，从而加强对Th表位和抗体引发的表位或它们的免疫功能类似物的免疫应答。
Th是包含Th表位的氨基酸(天然或非天然氨基酸)序列。Th表位可以是连续或不连续的表位。在不连续的Th表位中，并非Th的每个氨基酸都是必须的。Th表位或其类似物或片段能够加强或刺激对Aβ1-42肽N末端片段的免疫应答。免疫显性和混杂的表位与具有广泛趋异的MHC类型的动物和人种群发生高度和广泛的交叉反应(Partidos等.，1991；美国5,759,551)。主题肽的Th表位有约10—约50个氨基酸，优选地约10到约30个氨基酸。当存在多个Th表位(即m≥2)时，每个Th表位可以相同或不同。Th片段包含足以加强或刺激对Aβ1-42肽N末端片段的免疫应答的Th表位的连续部分(contiguous portion)。
本发明的Th表位衍生自外源病原体的那些，包括但不限于列于表1的那些(SEQ ID Nos:1-21)。另外，Th表位包括理想的人工Th和公开于WO 99/66957和列于此处表2的SEQ ID Nos 22-64的人工理想的组合Th。包含组合Th的肽是在一个单独的固相肽合成中用Aβ1-42肽N末端片段，A和B来同时产生的。Th表位也包括其免疫功能类似物，只要基本不改变Th刺激功能，可对1—约10个氨基酸残基进行保守的替代、添加、删除和插入。
在本发明的合成肽中，Th表位通过间隔臂B共价连接到Aβ1-42肽N末端片段或其免疫功能类似物的N末端或C末端。只要可引发对Aβ1-42肽交叉反应的免疫应答，Aβ1-42肽N末端片段的免疫功能类似物可以包含从1到约4个氨基酸残基的保守替代、添加、删除或插入。保守替代、增加和插入可用上述的天然或非天然氨基酸来完成。
本发明优选的肽免疫原是那些包含选自SEQ ID NOs66-69的Aβ1-42肽片段的N末端片段或其免疫功能类似物；间隔臂(如Gly-Gly，ε-Lys)；Th表位，其选自HBsTh(SEQ ID NO:1)；HBcTh(SEQ ID NO:20)；MVF Th(SEQ ID NOS:8，9)；PT Th(SEQ ID NOs:4，5，7)；TT Th(SEQ ID NOs:3，4，6)；CT Th(SEQ ID NOs:12，21)；DT Th(SEQ ID NO:13，14)，MVF Th衍生的人工Th，其选自SEQ ID Nos:38-40，47-51；HBV Th衍生的人工Th，其选自SEQ ID NOS52-54。见表1和2。
包含带有2个或多个Th表位的主题肽免疫原混合物的肽组合物可以在更广泛的群体中增强免疫效率，因而提高对Aβ1-42肽及它们的片段的免疫应答。
本发明的肽免疫原可通过普通熟练技术人员所熟知的化学合成方法来制备。参见，例如Fields等合成肽(Synthetic Peptides)的第三章用户指南(AUser＇s Guide)，Grant编辑，W.H.Freeman & Co.，纽约，1992，77页。因此，用t-Boc或F-moc化学保护α-NH2，利用侧链被保护的氨基酸，在例如Applied Biosystems肽合成仪430A或431型上用自动化的Merrifield固相合成技术合成肽。制备包含Th表位组合库肽的肽构建体可通过在给定的变异位点偶联各种氨基酸混合物来完成。当所需的肽免疫原完全组装后，根据标准程序对树脂进行处理，以从树脂上清除肽，并将氨基酸侧链的功能基团解封闭。通过HPLC纯化游离的肽，并进行生化表征，如通过氨基酸分析或通过测序。肽的纯化和表征方法对本领域的普通技术人员是熟知。
本发明的免疫原也可以通过直接在分枝的多聚-赖氨酰核心树脂上合成所需的肽构建体来制备成分枝的多聚物(Wang，等.，Science，1991；254:285-288)。
备选地，更长的合成肽免疫原可通过众所周知的重组DNA技术进行合成。在众所周知的标准手册中提供了这类技术的详细方案。为了构建编码本发明肽的基因，将氨基酸序列反翻译以获得编码该氨基酸序列的核酸序列，优选用该基因将被表达的生物最偏爱的密码子。然后，典型地通过合成编码该肽和如果需要的任何调控元件的寡核苷酸来制备合成的基因。将合成的基因插入到合适的克隆载体上，并转染宿主细胞。然后在适于选择性表达系统和宿主的合适条件下将该肽进行表达。用标准方法纯化和表征肽。
本发明的肽组合物的效力可通过用包含本发明肽的免疫原性组合物注射动物，如豚鼠来确定。见表4，SEQ ID NOS70-75。对Aβ1-42肽N末端片段和可溶性Aβ1-42肽的体液免疫应答进行了监测。以下的实施例提供了所用流程的详细描述。
本发明的另一个方面提供了在药用递送系统中包含免疫有效量的一个或多个本发明的肽免疫原的肽组合物。因此，利用药用佐剂、载体或其它常规用于疫苗制备的成分，可将该主题肽组合物制备成疫苗。本发明中所应用的成分是佐剂或乳化剂，包括明矾、liposyn、皂苷、角鲨烯、L121、emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)、多乙氧基醚、QS21、Montanide ISA51、ISA35、ISA206和ISA 720及其它有效的佐剂和乳化剂。组合物可以配制成瞬时释放或持久释放形式。组合物也可以配制来诱导系统免疫，如捕获在微颗粒中或与微颗粒共同给药。这类制剂对于本领域的普通技术人员而言是容易获得的。
本发明的免疫原可通过任何常规途径，如皮下、口腔、肌内、胃肠外或肠内途径给药。免疫原可以单剂量或多剂量进行给药。合适的免疫方案对于推移本领域的普通技术人员而言容易确定和实现。
本发明的肽组合物包含有效量的一个或多个本发明的肽免疫原和药用载体。这种合适的剂量单位形式的组合物每千克体重一般包含约0.25μg到500μg免疫原。当以多剂量递送时，有效量可被方便地分为每一剂量单位。例如，起始剂量如每千克体重0.0025-0.5mg；优选每千克体重1-50μg的肽免疫原通过注射进行给药，优选肌内注射，然后进行类似剂量的重复(激发)给药。如在疫苗和治疗领域所公认的，剂量依赖于患者的年龄、体重和一般健康状况。
合成的Aβ1-42肽免疫原的免疫应答可通过捕获在O’Hagan等所描述的类型(Vaccine，1991；9768-771)的可生物降解的微颗粒中或其上进行递送来提高。可将免疫原密封于具有或不具有佐剂的可生物降解的微颗粒中以增强免疫应答，和为了持续或间歇应答和为了口服给药提供控制时间的释放(O’Hagan等.，1991；和，Eldridge等.，1991；28287-294)。
提供的下述实施例是用来阐明本发明。本发明的范围并不限定为所提供的具体的肽免疫原和组合物。实施例阐明了本发明的肽免疫原对于早在最初免疫4周后引发针对Aβ1-10和Aβ1-14片段的定点抗体以及对可溶性Aβ1-42肽有交叉反应的抗体是有用的。
实施例1 合成本发明A β肽免疫原的典型方法 列于表4(SEQ ID NOS:70-76)的肽免疫原是利用Fmoc化学在AppliedBiosystems自动肽合成仪(430，431和433A型)上用Merrifield固相合成技术单个合成的。包含组合库Th即理想的人工Th位点如MvF衍生的Th1-8(SEQ ID NOs:38-40)的肽免疫原的制备可通过在具体设计的特定位点提供化学偶联的所需氨基酸混合物来完成。当完成所需肽的组装后，用三氟乙酸根据标准程序处理树脂以将肽从树脂上清除下来，并对氨基酸侧链的保护基团进行解封闭。清除下来的、提取并洗涤后的肽通过HPLC进行纯化，并通过质谱和反向HPLC表征。
实施例2 评估本发明A β肽的免疫原性 通过以下略述的实验免疫方案和通过确定免疫原性的血清学试验，按照说明在几组豚鼠上评估A β衍生的肽免疫原。
标准实验设计 免疫原(1)单个肽免疫原；或 (2)等摩尔肽免疫原混合物，按照每个实施例的说明。
剂量除非特别说明，每次免疫为0.5ml中100μg，。
途径除非特别说明，肌内， 佐剂除非特别说明，完全弗氏佐剂(CFA)/不完全佐剂(IFA)；或油包水乳剂。在CFA/IFA组中，第0周使用CFA，随后的几周使用IFA。
给药时间表0、3、6周，或者特别说明。
采血时间表0、5、8周，或特别说明。
物种Duncan-Hartley豚鼠或特别说明 试验对每个免疫血清的抗肽活性进行特定的ELISAs检测。固相底物为Aβ肽片段，如Aβ1-14或全长Aβ1-42(SEQ ID NOs67和65)，收集血液，加工成血清，并在用靶肽进行ELISA之前储存。
用包被有作为免疫吸收剂的SEQ ID NOs67或65的Aβ1-42肽片段的96孔平底微滴定平板通过ELISA(酶联免疫吸附测定)来检测所引发的抗体抗Aβ肽及抗可溶性Aβ1-42肽的免疫反应性。等分的(100μL)浓度为5μg/mL的肽免疫原溶液在37℃温育1小时。平板用3％明胶/PBS溶液37℃温育1小时进行封闭。然后将封闭的平板干燥并用于试验。待测免疫血清最初在样品稀释缓冲液进行1:100稀释，随后进行10倍系列稀释，将等分的(100μL)的待测血清加到肽包被的平板上。平板在37℃温育1小时。
平板用0.05％ PBS/吐温
缓冲液洗涤6次。加入100μL适当稀释在结合稀释缓冲液(conjugate dilution buffer)(包含0.5M NaCl和正常羊血清的磷酸盐缓冲液)中的辣根过氧化物酶标记的羊抗物种特异抗体。在如上述洗涤前，将平板在37℃温育1小时。然后加入等分的(100μL)邻-苯二胺底物溶液。显色5-15分钟后加入50μL 2N H2SO4中止酶的显色反应。在平板读数仪上读取每个孔中内容物的A492nm值。根据吸收值的线性回归分析对ELISA滴度进行计算，设定A492nm截断值为0.5。稀释的正常对照样品的值小于0.15，因此严格选择截断值。
实施例3 表征Aβ1-42及其N末端片段相对免疫原性以优化基于定位Aβ1-42肽的合成疫苗的设计 为了设计一个产生高水平高亲和力抗Aβ肽并与AD患者脑中的可溶性Aβ1-42肽和斑块高度交叉反应的抗体的完全合成的疫苗，首先表征Aβ1-42及其N末端片段的相对免疫原性。在第一次研究中，为了测定Aβ1-42肽中各个区段的相对免疫性能，使用适于人使用的温和佐剂—明矾。比较了Aβ1-42肽及其N末端片段，Aβ1-28的相对免疫原性。免疫原性的评估是根据实施例2描述的程序进行的。出人意料地是，Aβ1-28比Aβ1-42肽具有更强的免疫原性，这表明在C末端片段Aβ29-42中存在免疫抑制现象(表5)。
随后，比较了Aβ1-28和Aβ1-42更短的N末端片段——Aβ1-14的免疫原性。为了配制疫苗，使用了适于人使用的更有效的佐剂(Montanide ISA51，Seppic，巴黎，法国)来制备油包水乳剂。基于列于表6中所获得的数据，3个Aβ肽(即Aβ1-14，Aβ1-28和Aβ1-42)的相对免疫原性大小的顺序是Aβ1-28>Aβ1-42>Aβ1-14。令人惊讶的是，丢失Aβ1-42C末端14mer使其免疫原性得到提高而不是降低。抗Aβ的抗体应答主要针对N末端区，特别是Aβ1-14N末端片段，如ELISA数据所示(表6)。然而，Aβ1-28片段从C末端的进一步缩短而形成的Aβ1-14片段降低了免疫原性。
如Solomon报道，短Aβ1-14片段包含主要的功能/调控位点，EFRH，位于Aβ1-42肽的3-6位。通过抗体封闭该表位可以调节聚集以及已形成聚集体的再增溶间的动态平衡(Soloman等.，Proc Natl Acad.Sci，1996；93:452-455；Proc Natl Aca.Sci，1997；94:4109-4112)。多数抗Aβ1-28和Aβ1-42的抗体抗含该表位的Aβ1-42肽的N末端片段(表6)。然而，Aβ1-14片段本身具有弱免疫原性。该实验结果表明在Aβ15-28片段中存在内源的Th表位。该内源Th表位解释了在豚鼠中Aβ1-28和Aβ1-42肽的较低的免疫原性。
在Aβ15-28片段中存在Th表位是理想的。然而，当面对有限的人MHC分子、许多合适剂量和允许用于人的佐剂类型的有限的情况下，能够产生更有效的免疫原作为能成功用于人的疫苗是理想的。因此，我们尝试将一个外源或外部的Th如来源于HBV的Th(SEQ ID NO1)连接到Aβ1-28肽C末端(SEQ ID NO:66)。外源Th表位显著增强Aβ1-28片段的免疫原性，如表6所示。针对所构建的带有Aβ1-28片段的免疫原的抗体应答仍保持针对肽免疫原(SEQ ID NO70)的功能N末端片段，使得该构建体比单独的Aβ1-28片段或Aβ1-42片段是更好的免疫原。该肽免疫原(SEQ ID NO70)表示具有下述分子式的肽免疫原 (A)n(Aβ肽N末端片段)-(B)o-(Th)m 其中 A是α-NH2，带有是Aβ1-42N末端片段的Aβ1-28； B是甘氨酸； Th是来源于外源病原体HBsAg Th(SEQ ID NO1)的辅助T细胞表位，其中n为1，m为1，o为2。
实施例4 AβN末端片段的下限以为了开发针对AD的基于Aβ的合成疫苗 由于包含EFRH残基的主要功能/调控位点位于Aβ1-42肽的3-6位(Soloman等.Proc Natl Acad.Sci，1996；93:452-455；Proc Natl Aca.Sci，1997；94:4109-4112)，所以它对于研究作为Aβ上的最佳的B细胞靶位点的Aβ1-42肽的最短N-末端片段以整合到本发明的合成免疫原中是有用的。
将几个短的无免疫原性的AβN末端片段，A β1-10、A β1-12、Aβ1-14和Aβ1-28每一个整合到用典型的理想人工Th(SEQ ID NO51)所设计的免疫原中。通过ε N-Lys间隔臂进行连接。由于预计短的A β片段的免疫原性低，所以将涉及的构建与强佐剂一起配制。将3个合成的构建体配制在完全和不完全弗氏佐剂中，并基于实施例2中所述的程序检测其免疫原性。如表7所示，所有4个肽免疫原具有高度免疫原性，ELISA Log10滴度从4.3到5.6[即104.3到105.6]，且在初次免疫仅四周后就对全长Aβ1-42肽具有非常高的交叉反应性。更重要的是，发现每个连接到理想人工Th(SEQ ID NO:51)上的与A β1-10，A β1-12和Aβ1-14一样小的片段在与公开的人工Th表位连接后具有高免疫原性(表7)。这些肽免疫原设计为符合以下公式 (A)n-(Aβ肽N末端片段)-(B)o-(Th)m 其中 A是αNH2，其中N末端片段是A β1-10，A β1-12，Aβ1-14或Aβ1-28； B是ε-N赖氨酸，一个间隔臂，通过其ε-氨基基团与下一个氨基酸连接； Th是来源于理想人工Th，MVF Th1-16(SEQ ID NO51)的辅助T细胞表位，其中n为1，m为1，o为1。
发现进一步缩短A β N末端片段的长度至少于10mer时，将导致更有限的因此不理想的免疫原性。似乎小于10个氨基酸的肽对于II类MHC分子的受体识别是有问题的(Immunology，第五版，Roitt等.，编辑，1998，MosbyInternational Ltd.，伦敦，88-89页)。
基于A β的研究，有用的来源于Aβ1-42的B细胞位点的长度为约10—约28个残基。
实施例5 连接在人工Th表位上的合成肽免疫原靶向的定点免疫反应性 将A β肽的无免疫原性的N末端片段如Aβ1-14通过ε N-赖氨酸间隔臂连接到命名为MVF Th 1-16(SEQ ID NO:51)的人工Th肽上，或通过标准化学偶联程序连接到常规的载体蛋白KLH上。根据实施例2中所述的程序，在豚鼠中评估两个免疫原性的构建体对Aβ肽的相对“定位”免疫原性和得到的抗体对其各自载体，人工Th表位或KLH载体蛋白的各自反应活性。单独短的Aβ1-14肽作为对照免疫原，将两个具有免疫原性的构建体在包含佐剂ISA51的油包水乳剂—适于人用的制剂中配制。如表8所示，如同所预料的，N末端Aβ1-14片段本身无免疫原性。发现合成的包含Aβ1-14片段和人工Th(SEQ ID NO73)的免疫原具有高免疫原性，引发抗Aβ1-14的定点抗体。也发现早在初次免疫后4周，抗体对可溶性Aβ1-42肽高度交叉反应(初次免疫后4周和6周的Log10滴度分别为4.094和4.126)。当用MVF Th1-16(SEQ ID NO 51)包被的平板通过ELISA来检测这些Aβ反应性的高滴度免疫血清时，发现它们都是阴性(初次免疫后4周和6周的Log10滴度分别为0.038和0.064)，这表明没有无关抗体产生。如表8所示获得的数据清楚地证实本发明的肽免疫原的高特异定位的性质。
发现具有载体蛋白KLH的免疫原对常规肽—载体蛋白偶联物有高度免疫反应性(如初次免疫后4周和6周的Log10滴度分别为4.903和5.018)。然而，所引发的抗体对可溶性Aβ1-42肽仅有较弱的交叉反应(如初次免疫后4周和6周的Log10滴度分别为3.342和2.736)。大约比SEQ IDNO:73小10X到100X倍。出乎意料的是，本发明的肽免疫原是高度定位和聚焦的。仅产生针对A β肽N末端片段的抗聚集和解聚位点，而不针对无关载体位点的在功能上重要的抗体。
实施例6 评估A β肽免疫原对老年斑的交叉反应性 用具有斑块和缠结的A β患者的脑和包含淀粉样蛋白斑的硫磺素S阳性血管(TSBV)来评估在豚鼠和狒狒中得到的抗A β肽免疫原的免疫血清对多聚老年斑的交叉反应性。通过利用抗生物素蛋白—生物素化的抗体复合物(ABC)方法的免疫过氧化物酶染色，或通过利用罗丹明偶联的物种特异的抗IgG的Fab片段的免疫荧光染色来检测斑块和TSBV反应活性。所有豚鼠血清以1:100稀释度进行检测，通过一些样本来确定滴定终点。所有狒狒血清以1:50稀释度进行检测。免疫和免疫前血清的评估根据Dr.Gaskin所述的规程温和地进行(Gaskin等.，J.Exp Med.165:245，1987)。
图1中，在10X放大倍数下最初检测了2个AD患者脑系列连续切片。切片(a)，(b)和(c)来源于AD脑1，(d)，(e)和(f)来源于AD脑2。从豚鼠中收集免疫前正常血清和初次免疫6周后的免疫血清，通过用免疫过氧化物酶染色对富含斑块和神经纤维缠结(NFT)的AD颞皮层的恒温箱切片进行染色来检测。图1a和1d载玻片所示的第一次研究中所用的免疫血清是从用在ISA51油包水乳剂中制备的Aβ1-28-εK-MvF Th1-16(SEQ IDNO:74)免疫的动物中获得的。结果表明在硫磺素S阳性血管(TSBV)上对老年斑和淀粉样蛋白斑都有显著的结合。图1b和1d载玻片所示的是抗在CFA/ICFA中制备的等价免疫原产生的免疫血清的交叉反应性。出人意料地是，与用ISA51配制的疫苗所获得的结果相反，观察到抗CFA/ICFA疫苗产生的血清在血管(TSBV)中优先与Aβ1-28斑结合。这表明用ISA51配制的疫苗所引发的抗体与在CFA/ICFA中配制的疫苗所产生的抗体不同。而且，用根据本发明配制的疫苗所产生的抗体对脑组织中老年斑有期望的更高的交叉反应性。免疫前血清在相应的连续切片中没有显色反应，如图1c和1f中载玻片所示。
图2a到2e所示的是40X放大倍数下，用免疫前血清和免疫血清以1:100稀释度对AD脑1的系列连续切片进行免疫过氧化物酶染色的照片。从用在ISA51油包水乳剂中制备的Aβ1-28-εK-MVF Th 1-16(Seq ID NO:74)免疫的动物中获得的血清强烈地染色形成核图案的斑块，如图2a和2d载玻片所示。此外，令人惊讶的是，用制备的抗相应CFA/ICFA制剂的免疫血清进行的染色提供了不同的染色图案，如图2b所示，因为主要在血管上与斑有反应性，而不与脑组织中的斑有反应性。免疫前血清不染色切片，如图2c所示。用在CFA/ICFA中的单独的Aβ1-42肽免疫产生的超免疫血清在切片中得到一个令人惊讶的弱染色图案，如图2e所示，尽管其在ELISA检测中与Aβ1-28有强烈反应。
用实施例3、4和5中所述的各种疫苗制剂免疫豚鼠所获得的11种混合(pooled)免疫血清和免疫前血清对AD脑组织进行了类似的免疫染色。这些血清也通过Aβ1-14ELISA评估其对功能位点的抗体反应性，并通过Aβ1-42ELISA评估对可溶性Aβ1-42的抗体反应性(表9)。一般来说，用待测血清进行的所有3次试验是趋于平行的。如表9所示，通过ELISA检测，免疫前血清和抗在ISA51油包水乳剂中单独配制的短肽Aβ1-14产生的血清的抗肽活性低，并且忽略了对斑块的交叉反应性。用在明矾和ISA51中单独配制的Aβ1-28肽和在ISA51中配制的连接到KLH上的Aβ1-14接种动物所获得的血清有适度的反应活性。然而，来自用本发明的合成的Aβ/Th免疫原免疫的动物的血清对功能Aβ1-14位点，可溶性Aβ，AD患者脑组织切片中的斑块和TSBV产生显著的定点反应性。因此，从这些研究所获得的结果证实，包含Aβ1-42N末端片段，氨基酸为1—28到大约1—10，并连接到外源Th表位上的肽免疫原的优异的并且有用的免疫原性。而且，结果表明外源Th表位的存在可以将本发明的肽免疫原的免疫原性提高到一个令人惊讶的程度上。在适于人用的临床上可接受的疫苗制剂中的本发明的肽免疫原产生对AD患者脑组织中的老年斑有交叉反应性的抗体。
实施例7 典型Aβ肽疫苗在狒狒中的免疫反应性作为对AD的免疫治疗效果的预报因子 将在ISA51油包水乳剂中以25μg/0.5mL，100μg/0.5mL和400μg/0.5mL剂量水平配制的典型的合成免疫原Aβ1-28-ε-K-MvF Th1-16(SEQID NO:74)在初次免疫后0、3和6周的时间提供给3只狒狒Y299，X398和X1198。收集免疫前血清和初次免疫后(wpi)5和8周的血清。为了进行比较，第四只狒狒X798以100μg/0.5mL剂量给药在批准用于人的标准佐剂—明矾中配制的游离Aβ1-28和Aβ1-42肽的等摩尔混合物。免疫前血清作为阴性对照。
收集所有4只免疫动物的血清，通过Aβ1-14ELISA评估其对功能位点的抗体反应活性，通过Aβ1-42ELISA评估其对可溶性Aβ1-42的反应活性(在0，5和8wpi收集血清)。通过实施例6中所述的免疫染色方法评估抗血清(仅8wpi)对老年斑和硫磺素S阳性血管中斑块的交叉反应性。代替使用抗狒狒Ig，所用的抗体检测物质是识别所有人同型体并与狒狒IgG有交叉反应的来源于抗人IgG的Fab片段。
所有3次试验中代测血清也具有平行趋势。如表10所示，免疫前血清呈阴性。用来源于用在明矾中配制的Aβ1-28和Aβ1-42接种的动物X798的血清发现适度的ELISA反应性。然而，该血清的反应活性在识别老年斑时很弱。相反，用来自用本发明的典型组合物(SEQ ID NO74)以用ISA51配制的100μg/0.5mL和400μg/0.5mL的剂量免疫的动物最初免疫后8周收集的血清发现对Aβ1-14功能位点、可溶性Aβ1-42及AD患者脑切片中的斑块和TSBV的显著定点反应活性。因此，从该狒狒研究中获得的结果证实本发明的免疫原在适于人的疫苗制剂中的用途。由于狒狒中的免疫应答与人非常类似，与现有技术的肽疫苗相比，免疫原性的提高(对A β功能位点的特异抗体滴度提高10—100X倍)是非常有意义的。
类似地，包含2到3种本发明的合成免疫原的混合物可以以每剂量约25到1000μg配制成疫苗，以在遗传上多样的人群中引发功能抗Aβ1-14的抗体，从而预防和治疗AD。由于在本发明的肽免疫原中存在混杂的Th表位，从而可进行广泛MHC识别，因此期待在人中的广泛免疫原性。
表1 病原体衍生的混杂T辅助细胞表位(Th) a美国5,759,551 bFerrari等.，J Clin Invest，1991；88214 cStagg等.，Immunology，1993；711 表2 人工理想的Th和组合库理想的人工Th a.MVF Th和Th表位衍生自 b.HbsAg Th，原型和衍生物 表3 Aβ1-42肽和它的N-末端片段的氨基酸序列 表4 表5
表6
表7
表8
表9
a系列稀释@1100 表10
序列表
<110>王长怡
<120>作为疫苗用于预防和治疗阿尔兹海默氏病的免疫原性肽组合物
<130>1151-4167
<140>09/865,294
<141>2001-05-25
<160>77
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)
<400>1
<210>2
<211>30
<212>PRT
<213>百日咳杆菌(Bordetella pertussis)
<400>2
<210>3
<211>17
<212>PRT
<213>破伤风杆菌(Clostridium tetani)
<400>3
<210>4
<211>22
<212>PRT
<213>破伤风杆菌(Clostridium tetani)
<400>4
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>百日咳杆菌(Bordetella pertussis)
<400>5
<210>6
<211>27
<212>PRT
<213>破伤风杆菌(Clostridium tetani)
<400>6
<210>7
<211>24
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<213>Pertusaria trachythallina
<400>7
<210>8
<211>15
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<213>麻疹病毒(Measles virus)
<400>8
<210>9
<211>20
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>9
<210>10
<211>17
<212>PRT
<213>破伤风杆菌(Clostridium tetani)
<400>10
<210>11
<211>16
<212>PRT
<213>破伤风杆菌(Clostridium tetani)
<400>11
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<211>25
<213>衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400>12
<210>13
<211>23
<212>PRT
<213>白喉(Diphtheria)
<400>13
<210>14
<211>39
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<213>白喉(Diphtheria)
<400>14
<210>15
<211>21
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<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>15
<210>16
<211>17
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<213>曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)
<400>16
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<211>14
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<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
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<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
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<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
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<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)
<400>20
<210>21
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<213>沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400>21
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<211>15
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<213>麻疹病毒(Measles virus)
<400>22
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<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)
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<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)
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<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
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<213>麻疹病毒(Measles virus)
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<213>麻疹病毒(Measles virus)
<400>72
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<213>麻疹病毒(Measles virus)
<400>73
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<213>麻疹病毒(Measles virus)
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<213>麻疹病毒(Measles virus)
<400>75
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<213>麻疹病毒(Measles virus)
<400>76
<210>77
<211>6
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成的肽接头
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>X＝任何氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X＝任何氨基酸
<400>7权利要求
1.一种长约20—100个氨基酸的肽免疫原，其由下列各项组成
(i)一种选自SEQ ID Nos:52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63或64的辅助T细胞表位；
(ii)Aβ1-42肽SEQ ID NO:65的N末端片段，所述Aβ1-42肽N末端片段由10—28个氨基酸残基组成，其中每个片段包含天冬氨酸；和
(iii)任选地，由至少一种氨基酸组成的间隔臂以隔离免疫原性结构域。
2.权利要求1的肽免疫原，其中所述间隔臂选自一种氨基酸，Gly-Gly，(α，ε-N)-Lys或Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro，其中Xaa表示任何氨基酸。
3.权利要求2的肽免疫原，其中所述间隔臂是Gly-Gly。
4.权利要求2的肽免疫原，其中所述间隔臂是ε-N-Lys。
5.权利要求1的肽免疫原，其中所述Aβ1-42肽的N末端片段选自SEQ ID NOs:66，67，68或69。
6.权利要求2，3或4任一项的肽免疫原，其中所述Aβ1-42肽的N末端片段选自SEQ ID NOs:66，67，68或69。
7.权利要求1的肽免疫原，其中所述辅助T细胞表位选自SEQ ID NOs:52，53或54。
8.权利要求2，3或4任一项的肽免疫原，其中所述辅助T细胞表位选自SEQ ID NOs:52，53或54。
9.权利要求1的肽免疫原，其由SEQ ID NOs:70组成。
10.由下述公式之一表示的肽免疫原
(A)n-(Aβ1-42肽的N-末端片段)-(B)o-(Th)m-X；或
(A)n-(Th)m-(B)o-(Aβ1-42肽的N—末端片段)-X；
其中
每个A独立是一种氨基酸，且(A)n是间隔臂，gly-gly或(ε-N)-Lys；
每个B选自一种氨基酸，gly-gly，(α，ε-N)-Lys，或Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro，其中Xaa表示任何氨基酸，且(B)o是间隔臂，gly-gly或(ε-N)-Lys；
Th选自SEQ ID NOs:52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63或64；
(Aβ1-42肽的N-末端片段)是10—28个氨基酸残基，并且其中每个片段包含Aβ1-42肽的EFRH；
X是一种氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
n是0—10；
m是1—4；和
o是0—10。
11.权利要求10的肽免疫原，其中所述Aβ1-42肽的N-末端片段选自SEQ IDNOs:66，67，68，或69。
12.权利要求10的肽免疫原，其中所述辅助T细胞表位选自SEQ ID NOs:52，53或54。
13.权利要求11的肽免疫原，其中所述辅助T细胞表位选自SEQ ID NOs:52，53或54。
14.一种包含权利要求1-13任一项的肽免疫原和药用佐剂和/或载体的组合物，所述药用佐剂和/或载体选自明矾，liposyn，皂苷，角鲨烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A，聚山梨酯80，QS21，Montanide ISA51，ISA35，ISA206或ISA720。
15.权利要求14的组合物在制备用于预防或治疗阿尔兹海默氏病的疫苗中的应用。
16.权利要求14的组合物在制备用于生产抗Aβ1-42肽的抗体的疫苗中的应用，所述抗体与可溶性Aβ肽和从那里形成的脑组织斑交叉反应。
全文摘要
本发明涉及一种组合物，其包含用于预防和治疗阿尔兹海默氏病的肽免疫原。更具体地，该肽免疫原包含一个主要的功能/调控位点，与具有多个II类MHC结合基序的辅助T细胞表位(Th)连接的淀粉样蛋白β(Aβ)肽的N-末端片段。该肽免疫原引发抗Aβ肽的主要功能/调控位点的定点免疫反应并产生抗体，所述抗体与阿尔兹海默氏病患者脑中形成的可溶性Aβ1-42肽及淀粉样蛋白斑高度交叉反应。所产生的与可溶性Aβ1-42肽交叉反应的抗体促进原纤维解聚并抑制原纤维聚集，导致“可溶性Aβ衍生的毒素”的免疫中和；而且与淀粉样蛋白斑交叉反应，促进从脑中清除这些斑块。因此，本发明的包含该肽免疫原的组合物可用于预防和治疗阿尔兹海默氏病。
文档编号A61K38/00GK101372511SQ20081016927
公开日2009年2月25日 申请日期2002年4月2日 优先权日2001年5月25日
发明者王长怡 申请人:美国联合生物医学公司