一种抑制靶基因表达的组合物的制作方法

专利名称：一种抑制靶基因表达的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，更具体地涉及一种抑制靶基因表达的组合物。
背景技术：
RNA干扰(RNAinterference, RNAi)是由双链RNA (double-stranded RNA， dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应基因的表达或使该基因沉默的 过程。RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默 (gene silencing),是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默 (post-transcriptional gene silencing, PTGS)。 RNAi最早是由Fire禾口 Mello 在Caenorhabditis elegans中阐明的(A. Fire, S. Xu, M. K. Montgomery, S. A. Kostas, S. E. Driver, C. C. Mello, Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans， Nature. 391 (1998) 806-811.)，在大多数真核生物体内，RNAi是一种用于RNA引导式地调节基 因表达的保守机制，其中，用双链核糖核苷酸(dsRNA)抑制具有互补核苷酸 序列的特定基因的表达。Elbashir等表明，21-核苷酸siRNA双链体特异性地 抑制几种哺乳动物细胞系中的同源和异源基因的表达(S. M. Elbashir， J. Harborth, W. Lendeckel， A. Yalcin, K. Weber, T. Tuschl, Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature. 411 (2001) 494-498.)。 RNAi的激发基因敲低技术是一种广泛地用于 模型生物体和人细胞中的基因筛选的方法(M. Boutros, J. Ahringer, The art and design of genetic screens: RNA interference, Nat Rev Genet. 9 (2008) 554-566.)。 RNA干扰通过真核细胞中的高通量功能损失筛选而使基因功能 领域重新活跃起来(C. J. Echeverri, N. Perrimon, High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide, Nat Rev Genet. 7 (2006) 373-384.)。与传统的基因筛选相比，RNAi筛选主要具有两点优势，即，可以立刻知道所有鉴定的基因的序列，并且由于无需恢复突变体而更容易鉴定致死突变(M. Boutros， J. Ahringer, The art and design of genetic screens: RNAinterference, Nat Rev Genet. 9 (2008) 554-566.)。许多科学家已经改进了siRNA的设计规则(P. Jia, T. Shi， Y. Cai, Y. Li, Demonstration of two novelmethods for predicting functional siRNA efficiency, BMC Bioinformatics. 7(2006) 271.; C. K6berle, S. H. Kaufmann, V. Patzel, Selecting effective siRNAsbased on guide RNA structure, Nat Protoc. 1 (2006) 1832-1839.)，但是，与无脊椎动物中的RNAi筛选相比，siRNA (小分子干扰RNA)在哺乳动物中通常存在效能较低和大量脱靶的问题。大规模RNAi筛选实验中，假阳性率和假阴性率仍然很高。目前，减少脱靶的最有效且最简单的方法是在最低浓度下"[吏用siRNA (S. E. Martin, N. J. Caplen, Applications of RNA interference inmammalian systems, Annu Rev Genomics Hum Genet. 8 (2007) 81-108.)。但是，在通常的实验中，最低的可能浓度将降低效能并且影响功能损失筛选的结果。
此外，人们还开发出许多含有siRNA的抑制靶基因表达的组合物作为药物，这些药物一般含有能够特异性地抑制靶基因表达的siRNA，但是如上所述，siRNA在哺乳动物中通常存在效能较低和大量脱靶的问题，因此，不能有效地抑制靶基因的表达。

发明内容
本发明的目的是为了克服siRNA的效能较低的缺点，提供一种能够有效地提高siRNA的效能的抑制靶基因表达的组合物。
本发明的发明人发现氟喹诺酮能够作为RNAi增强子，提高相同浓度下的RNAi效能。本发明提供了一种抑制靶基因表达的组合物，该组合物含有能够特异性
地抑制耙基因表达的siRNA作为活性成分，其中，该组合物还含有氟喹诺酮，所述siRNA和氟喹诺酮的摩尔比为1: 5xl(^至l: lx107。
本发明提供的抑制靶基因表达的组合物siRNA和氟喹诺酮，氟喹诺酮能够提高siRNA的效能，如图3所示，依诺沙星的5(P/。有效浓度(EC50)为约30pM，因此本发明提供的组合物能够更有效地抑制耙基因的表达。并且，与单独使用siRNA相比，本发明的组合物可以在较低的siRNA浓度下就能实现所需的抑制效果，因此可以减少脱靶。而且，在有效浓度范围内，氟喹诺酮不会对细胞和生物体的正常功能造成影响，因此本发明的组合物是安全的。


图1为表示氟喹诺酮对siRNA的活性的影响的图表；图2为表示依诺沙星的浓度与siRNA的活性提高之间的关系的图表；图3为表示单独的依诺沙星对萤火虫荧光素酶的影响的图表；图4为表示依诺沙星和诺氟沙星在不同的siRNA浓度下与siRNA的活性提高之间的关系的曲线图5为表示依诺沙星的几种作用浓度的图表。
具体实施例方式
本发明提供的抑制靶基因表达的组合物含有能够特异性地抑制靶基因表达的siRNA作为活性成分，其中，该组合物还含有氟喹诺酮，所述siRNA和氟喹诺酮的摩尔比可以为1: 5xl(^至l: lxl07。
所述siRNA和氟喹诺酮的摩尔比优选为1: lxl()S至l: lxl06。所述氟喹诺酮可以常规的各种用作抗菌药物的氟喹诺酮类化合物，优选
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情况下，所述氟喹诺酮选自巴洛沙星、氟罗沙星、帕珠沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星和普卢利沙星中的一种或几种。巴洛沙星如式(A)所示
式(A)
氟罗沙星如式(B)所示:
式(C)
氧氟沙星如式(D)所示:式(D)<formula>formula see original document page 7</formula>
诺氟沙星如式(E)所示:式(E)<formula>formula see original document page 7</formula>
依诺沙星如式(F)所示:
式(F)<formula>formula see original document page 7</formula>
普卢利沙星如式(G)所示:
式(G)<formula>formula see original document page 7</formula>
更优选的情况下，所述氟喹诺酮为依诺沙星和/或诺氟沙星。
本发明对所述siRNA没有特别的限定，可以为现有的各种能够特异性地抑制靶基因表达的siRNA，可以根据所要抑制的靶基因的种类选择合适的siRNA。
siRNA的一个具体的例子为具有如下核苷酸序列或者对该核苷酸序列进行化学修饰所得到的核苷酸序列正义链5,-CCCUAUUCUCCUUCUUCGCTT-3， 反义链5 ，-GCGAAGAAGGAGAAUAGGGTT陽3 ，。
所述化学修饰可以为如下修饰中的至少一种
(1) 对所述siRNA的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
(2) 对所述siRNA的核苷酸序列中核糖的2，-OH的修饰；
(3) 对所述siRNA的核苷酸序列中碱基的修饰。 所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对
磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式l所示；和硼垸化磷 酸盐修饰，如式2所示。两种修饰都能稳定siRNA结构，保持碱基配对的高 特异性和高亲和力。
(1) (2)<formula>formula see original document page 8</formula>
所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2'-OH的修饰，g卩，在核糖的羟基位
置引入某些取代基，例如，2'-氟代修饰，如式3所示；2'-氧甲基修饰，如 式4所示；2，-氧亚乙基甲氧基修饰，如式5所示；2，4，-二硝基苯酚修饰，如 式6所示；锁核酸(LNA)，如式7所示；2'-氨基修饰，如式8所示；2'-脱氧 修饰，如式9所示。所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5'-溴尿嘧啶修饰， 如式10所示；5'-碘尿嘧啶修饰，如式ll所示；N3-甲基脲嘧啶修饰，如式
12所示；2，6 —二氨基嘌呤修饰，如式13所示。<formula>formula see original document page 10</formula>
这些修饰可以增加所述siRNA的生物可利用性，提高与靶序列的亲和 性，增强在细胞内抵抗核酸酶水解的能力。
本发明所提供的组合物可以用作药物，也可以用于RNAi筛选，尤其适 用于大规模RNAi筛选。RNAi筛选的方法巳为本领域技术人员所公知。
本领域技术人员可以理解，所述siRNA和氟喹诺酮可以同时一起施用， 也可以单独地分别施用，例如，先施用siRNA，然后再施用氟喹诺酮。
当本发明所提供的组合物可以用作药物时，还可以含有药学上可接受的 载体。所述药学上可接受的载体的种类和含量已为本领域技术人员所公知。
下面通过实施例来更详细的描述本发明。
在以下实施例中-
巴洛沙星、氟罗沙星、帕珠沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星和普卢利沙星均购自北京世纪迈劲生物科技有限公司。
siRNA双螺旋体(duplex)由上海吉玛(GenePharma)公司合成，其中， 正义链的核苷酸序列为5'-CCCUAUUCUCCUUCUUCGCTT-3， 反义链的核苷酸序列为5'-GCGAAGAAGGAGAAUAGGGTT-3， 荧光素酶质粒为两种荧光素酶质粒，即萤火虫荧光素酶(firefly luciferase) pGL3-Rosa和Renilla荧光素酶pRL-TK。
实施例1
该实施例用于测定单独的siRNA的活性和siRNA与氟喹诺酮的组合的 活性。
(1) 细胞培养和转染
将人胚胎肾细胞(HEK-293)在37'C和5% (302的条件下在补充有10%胎 牛血清(FBS)、 100U/mL青霉素、100|ig/mL链霉素和4mM L-谷氨酸的 DMEM/HIGH GLUCOSE (GIBICO)中培养。细胞维持在指数增长。通过报导 的改进的方案(S. M. Elbashir， J. Harborth， W. Lendeckel, A. Yalcin, K. Weber, T. Tuschl， Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature. 411 (2001) 494-498.)，对两种荧光素酶质粒进行转 染。转染后，将细胞接种到24孔板中(0.5ml培养基/孔)，以达到转染时的汇 合度(约50%)。培养24小时后，在转染前将培养基更换为OPTIMEM 1 (GIBICO) (0.5ml/孔)。利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen， USA),以0.17% 的最终浓度(总转染体积为0.6ml)用质粒/siRNA双螺旋体对细胞进行共转 染。对于每孔，O.l吗pGL3-Rosa和0.05吗pRL-TK转染到HEK-293细胞中。 四小时后，在转染介质中加入培养基(lmL)。
(2) 用化学药品进行处理
转染12小时后，分别用巴洛沙星、氟罗沙星、帕珠沙星、氧氟沙星、
ii诺氟沙星、依诺沙星和普卢利沙星以50pM的最终浓度对细胞处理36小时。 (3)双重荧光素酶报告基因分析
转染48小时后，根据Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega， USA)的使用说明，收获细胞，并使用被动裂解缓冲液(PLB)进行裂解(100p1/ 孔)。使用Safire2 Microplate Reader (Tecan, Switzerland)测定样品的荧光素酶 活性。结果如图l所示。
在图1中，对应于各种化学药品，左边的柱条表示在不用化学药品处理 时的萤火虫荧光素酶的活性，右边的柱条表示在用化学药品处理时的萤火虫 荧光素酶的活性，可以看出，用化学药品处理后荧光素酶活性降低，说明 RNAi效能提高。其中，siRNA的最终浓度为8.4X10—1()M，各化学药品的最 终浓度为50pM。
实施例2
该实施例是为了说明依诺沙星的浓度与siRNA的活性提高之间的关系。 利用不同浓度的依诺沙星，按照与实施例1相同的方法培养并转染
HEK-293,然后测定荧光素酶的活性。由100pM依诺沙星产生的siRNA的
活性提高率设定为100°%。
从图2可以看出，依诺沙星的50"/。有效浓度(EC50)为约30|aM。
实施例3
该实施例用于测定单独的依诺沙星对萤火虫荧光素酶的影响。 按照与实施例1相同的方法培养并转染HEK-293,不同的是只用质粒而 不用siRNA。
然后按照与实施例1相同的方法，用不同浓度的依诺沙星对细胞进行处 理，并测定荧光素酶的活性。由依诺沙星产生的抑制效果表示为荧光素酶报告基因与荧光素酶对照基因之间的标准化的比例。荧光素酶对照基因是指没
有用所述化学药品处理的样品。结果如图3所示。
从图3可以看出，只有在120pM和150|aM，依诺沙星才抑制荧光素酶 的活性，在低于120pM的浓度下对荧光素酶的活性没有影响。而如实施例2 的测定结果，依诺沙星的50。/。有效浓度(EC50)仅为约30|iM，因此在有效浓 度范围内，依诺沙星不会对细胞的正常功能造成影响。
实施例4
该实施例用于说明依诺沙星和诺氟沙星在不同的siRNA浓度下与 siRNA的活性提高之间的关系。
分别利用50pM的依诺沙星和诺氟沙星以及不同浓度的siRNA，按照与 实施例1相同的方法培养并转染HEK-293，然后测定荧光素酶的活性。由 50|aM依诺沙星或诺氟沙星产生的RNA敲低的提高率按照下式计算得到
RNA敲低的提高率(％) 二 (荧光素酶对照基因的活性一荧光素酶报 告基因的活性)/荧光素酶对照基因的活性X100X
其中，荧光素酶对照基因是指没有用所述化学药品处理的样品。
结果如图4所示。
从图4所示的结果可以看出，在各种siRNA浓度下，依诺沙星或诺氟 沙星都能够提高siRNA的活性。
实施例5
该实施例5用于依诺沙星的几种作用浓度。
如图5所示，RNA正C50表示依诺沙星的50。/。有效浓度(EC5。)。RNAimax 表示不影响萤火虫荧光素酶的依诺沙星的最高浓度。t叩IC50是指依诺沙星 对人巨噬细胞的异构酶II的50。X的抑制浓度(T. M. Cortdzar， G. H. Coombs, J.Walker, Leishmania panamensis: comparative inhibition of nuclear DNA topoisomerase II enzymes from promastigotes and human macrophages reveals anti-parasite selectivity of fluoroquinolones, flavonoids and pentamidine, Exp Parasitol. 116 (2007) 475-482.)。
从图5可以看出，RNA正C50低于RNAimax ，并且远低于topIC50， 进一步验证了在有效浓度范围内，依诺沙星不会对细胞的正常功能造成影 响。
1权利要求
1、一种抑制靶基因表达的组合物，该组合物含有能够特异性地抑制靶基因表达的siRNA作为活性成分，其特征在于，该组合物还含有氟喹诺酮，所述siRNA和氟喹诺酮的摩尔比为1∶5×102至1∶1×107。
2、 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述siRNA和氟喹诺酮的摩尔比为1: lxl()3至1: lx106。
3、 根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述氟喹诺酮选自巴洛 沙星、氟罗沙星、帕珠沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星和普卢利沙星 中的一种或几种。
4、 根据权利要求3所述的组合物，其中，所述氟喹诺酮为依诺沙星和/ 或诺氟沙星。
全文摘要
一种抑制靶基因表达的组合物含有能够特异性地抑制靶基因表达的siRNA作为活性成分，其中，该组合物还含有氟喹诺酮，所述siRNA和氟喹诺酮的摩尔比为1∶5×10²至1∶1×10⁷。本发明提供的抑制靶基因表达的组合物siRNA和氟喹诺酮，氟喹诺酮能够提高siRNA的效能，如图3所示，依诺沙星的50％有效浓度(EC50)为约30μM，因此本发明提供的组合物能够更有效地抑制靶基因的表达。并且，与单独使用siRNA相比，本发明的组合物可以在较低的siRNA浓度下就能实现所需的抑制效果，因此可以减少脱靶。而且，在有效浓度范围内，氟喹诺酮不会对细胞和生物体的正常功能造成影响，因此本发明的组合物是安全的。
文档编号A61K31/7105GK101658527SQ200810210898
公开日2010年3月3日 申请日期2008年8月25日 优先权日2008年8月25日
发明者真 席, 张强哲, 张彩红 申请人:南开大学