专利名称：一种人类同种异体细胞提取液及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人类同种异体细胞提取液，属于细胞生物学、分子生物学、免疫学与人体保健领域。
背景技术：
人体由各个系统组成，系统由各种组织组成，组织则由各种细胞 组成。有生命的机体内各个细胞时时刻刻都在进行着新陈代谢，并保 持正常的自我稳态调节功能才能维持正常的内环境并抵抗来自外界 的各种致病因子的侵袭而不产生疾病。而细胞进行新陈代谢并保持自 我稳态需要消耗各种能源物质。如核酸、氨基酸、微量元素、酶类、 免疫蛋白、各种细胞生长因子、多型胶原成分等。
我们通过严格的流程选取人类同种异体组织细胞，通过严格的流 程选取人类同种异体组织细胞，经体外细胞培养，成为含有多种生物 学活性成分的细胞。采用超低温萃取技术分离出细胞液，对细胞液中 的细胞进行物理破壁处理后，将细胞的胞浆和细胞核中的核酸、多种 短肽、多肽细胞因子、多种氨基酸、微量元素等释放到细胞液中，使 细胞液中富含核酸、氨基酸、天然免疫蛋白、细胞生长因子群、多型 胶原成分等。可将其制备成具有细胞生物学活性功能的制剂，作用于 人体后可提高机体细胞代谢功能、增强机体免疫力，并可改善皮肤弹
性与光泽等功效。通过各项安全性检测未见毒副作用。
核酸、氨基酸和微量元素等合成蛋白质的基本物质，可提高细胞 质量，使酶系统保持像正常的催化功能；天然免疫蛋白可以抵御和修 复机体自身和自然界对机体细胞的损伤；具有刺激细胞生长作用的细 胞生长因子群(包括转化生长因子-P、表皮细胞生长因子、血管内皮 细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子等)，对机体 细胞(含干细胞)的增殖与分化和新陈代谢、提高新生细胞所占比例、 替代更新原有的因衰老或病理性等因素所造成组织细胞的衰退和老 化等具有关键作用。由于机体细胞的新陈代谢被细胞因子群调控至最 佳状态，机体细胞保持水分的能力也大大增强。多型胶原成分，可促 进真皮层内纤维母细胞增殖、成纤维母细胞合成和分泌更多胶原蛋 白，修复老化受损的胶原纤维与弹性纤维，还原肌肤弹性，使皮肤均 匀紧致。在细胞因子群调控下，诱导皮肤真皮组织内间充质干细胞定 向增殖分化为成纤维细胞，成纤维细胞的数量大大增加进而成源源 不断分泌自体胶原蛋白。这种自体成纤维细胞在真皮下合成和分泌的 自体胶原蛋白能更好地与机体组织融合，使胶原蛋白重新支撑起皮 肤，真皮层厚度和密度增加，进而消除皱纹，使老化的皮肤重新恢复 弹性与光泽。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种用于人体保 健和美容的人类同种异体细胞提取液。
本发明的另一个目的是提供上述细胞提取液在制备用于提高机
体细胞代谢功能或增强机体免疫力的药物或保健品中的应用。 一种人类同种异体细胞提取液，由如下步骤制备而成
(1) 选取健康产妇新鲜胎盘、脐带及其他同种异体组织；
(2) 将原料剪碎放置于容器中，用去热原水将剪碎组织清洗，
沥干；
(3) 加入注射用水，开启匀浆机以8000 10000转/分的转速匀
浆；
(4) 将匀浆液分装到血袋中，封口，将分装得到血袋经平衡后， 置于离心机内2500 3000转/分离心，取上清液；
(5) 将上清液经50kD的中空纤维柱超滤，滤出液用50kD的中 空纤维柱再次超滤，收获滤液，即为原液；
(6) 除菌，灭活病毒。
本发明制得的人类同种异体细胞提取液含有核酸、氨基酸、天然 免疫蛋白、细胞生长因子群、多型胶原成分等的细胞液。该细胞液能 提高机体细胞代谢功能和增强机体免疫力。可制成注射针剂、涂剂、 膏剂、霜剂或粉剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果 本发明通过严格的流程选取人类同种异体组织细胞，经体外细 胞培养，成为含有多种生物学活性成分的细胞。采用超低温萃取技术 分离出细胞液，对细胞液中的细胞进行物理破壁处理后，将细胞的胞 浆和细胞核中的核酸、多种短肽、多肽细胞因子、多种氨基酸、微量 元素等释放到细胞液中，使细胞液中富含核酸、氨基酸、天然免疫蛋
白、细胞生长因子群、多型胶原成分等。制得的细胞液可开发成具有
细胞生物学活性功能的制剂，作用于人体后可提高机体细胞代谢功
能、增强机体免疫力，并可改善皮肤弹性与光泽等功效。通过各项安
全性检测未见毒副作用。
具体实施例方式
实施例1
1. 从事细胞提取液生产人员应具备医学或生物学知识，且上岗前 手过严格操作培训。
2. 生产环境分离室洁净度要求为整体万级，局部百级。
3. 生产设备高速匀浆机、离心机(5810R)、水浴箱、干燥箱、封盖 机(置于车间内)、超净台、血液分离夹、高频电耦封口机、澄明度
检测台、电子称、PH计、冰箱、冰柜、真空泵、超净工作台。
4. 生产用具量筒、烧杯、镊子(大，中，小号)，剪刀两把、止血
钳、不锈钢托盘、微量移液器(1000ul， 100ul， 10ul)、 30KD超滤管、 酒精灯、封口膜、打火机、西林瓶、瓶塞、瓶盖、酒精喷壶500ml、 废液缸、普通天平。
5. 易耗品75%酒精、针式过滤器、无菌副压抽滤瓶、注射器(50ml、 20ml)、去离子水、注射用水、微量移液器吸嘴(1000ul、 200 ul、 10 ul)、 45ml无菌无热原离心管、200ml血袋、医用纱布、鲎试剂及检 测用水、病毒检测试剂(HBs、抗-HCV、抗-HIVl/2、梅毒检测试剂)、 棉签、84消毒液、生理盐水、无菌无热原不锈钢盆。生产用源符合 饮用水标准;纯化水及注射用水符合现行《中国药典》标准。
6. 原材料的购买、运输、接收、储存及质量控制
符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的 要求。
6.1选取健康产妇新鲜胎盘、脐带及其他同种异体组织。凡患有肝炎、 恶性肿瘤、免疫缺陷病、艾滋病、各种传染病、人工流产、死胎、各 种畸形儿之胎盘及脐带等组织不得使用；肉眼检测外观不正常或有腐 臭变质的胎盘、脐带等组织不得使用。
6.2胎盘娩出后，立即由接生人员用无菌操作放入灭菌容器(食品级 塑料袋)内，并立即冷藏(10。C以下)，在收集运输过程中也应冷藏。收 集的胎盘学逐支用国家药品管理当局批准的试剂盒进行抗-HBs、抗 -HBc等项检测。
6.3 HBV标志物阴性胎盘，再进行抗-HCV、抗-HIV-l/HIV-2和梅毒
检测，阴性者为合格胎盘。
6.4检出合格的胎盘应于-2(TC冻存,并在胎盘娩出后6个月内投入生产。
7. 制备流程
按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。 7.1将生产设备放置于车间的适当位置，检查所有生产设备的运行情 况，填写报告；
7.2器械和设备的清洁及无热原处理
7.3将2000ml烧杯1个、500m 14个按清洗操作规程洗净后用锡箔纸 封口放置于干燥箱内250°C加热1小时，待冷却后取出并置于超净台
内紫外消毒备用。
将高速匀浆机转子、剪刀用1 %的84消毒液浸泡1小时后，用无热原水清洗5遍并置于超净台内紫外消毒备用。
7.4将高速匀浆机用75°/。酒精擦拭消毒置于超净台内消毒。
7.5将用200倍稀释的84消毒液浸泡12小时的超滤管(30kd)用去离子水清洗5遍，再用注射用水清洗5遍，置于超净台内沥干备用。
7.6西林瓶及瓶塞、瓶盖的处理按照相应清洗操作规程严格执行。
7.7将微量移液器吸嘴(1000 ul、 200 ul、 10ul)、棉签、医用纱布1包、镊子(大，中，小各两把)，剪刀两把、止血钳10把、不锈钢托盘3个高压灭菌121 °C， 30分钟，烘干备用。
7.8开启车间紫外灯消毒1小时。
7.9将原料放置于4 'C解冻12小时，使用无热原锡箔纸称取对应重 量的原料，用剪刀剪碎组织至每块大小为2x2x2cm3，将剪碎组织 放置于500ml烧杯中。用去热原水将剪碎组织清洗3次，每次用水量 为剪碎组织的3倍，洗后沥干。
7.10在沥干后的组织中加入1.5倍于组织的注射用水，开启匀浆机以 8000 10000转/分的转速匀浆2分钟。
7.11将匀浆液用50ml注射器分装到200ml血袋中，高频电耦封口机 封口。
(以上操作均在超净台内无菌操作) 7.12将分装得到的200ml血袋经平衡后，置于离心机内2500 3000 转/分离心30分钟，并于血液分离夹上操作并取上清液；将上清液经
50kD的中空纤维柱超滤，滤出液用50kD的中空纤维柱再次超滤， 收获滤液，即为原液。
7.13将超滤管置入45ml离心管内，于超净台内将收集的离心上清液 加入超滤管中，每管不超过5ml离心，3000转/分离心15分钟； 7.14取出超滤液置于45ml无热原离心管内，经0.22|im微孔滤膜过 滤除菌2次；
(以上细胞液提取工作均置于冰袋之上进行低温操作) 7.15进行60'C水浴加温10小时灭活病毒10小时。 8.体外细胞培养 8.1体外培养环境
工作环境要求清洁、空气干燥和无烟尘。 8丄1无菌培养室的空气等彻底消毒，所有操作均要严格实行无菌 操作，各种物品拿入操作台前应消毒，用洒精擦表面，用前于紫外线 照；操作者洗手、泡手，酒精擦手，打开培养管前须在火焰上烙烧一 下瓶口以使灰尘固定，操作时须将瓶、管斜放，吸管注入液体应避免 和瓶口接触，操作时禁止讲话。
8丄2温度组织培养的最适温度为35-37。C，偏离这一温度范围，细 胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。培养细胞对低温 的耐受力比高温强。温度增加2-3"C对细胞产生不良影响，使之在24 小时死亡，温度在43"C以上，细胞大多被杀灭，而低温对细胞影响 较小，细胞置于25-35'C时，细胞仍能生存和生长，但速度缓慢，放 在4'C数小时之后，再置37'C培养，细胞仍能继续生长。
8丄3.气体所需的气体主要有02和C02。 02参与三羧酸循环产生能 量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。C02既是细胞代谢产物也是
细胞所需成分。它主要与维持培养液pH值有直接关系。 8丄4pH值多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4，偏离此范围对细胞可 产生有害的影响。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐缓冲对。 8丄5.培养器皿的处理大多数细胞属于贴壁依赖性细胞或培养物。 玻璃器皿须用清洁液浸泡1至7天，清水冲洗20次后再用蒸馏水过 洗2次，烤干备用。用前160'C高温消毒2小时后使用。 8.2传代细胞的静置培养
每天要仔细观察细胞的生长情况来决定是否要换液或传代。用倒 置显微镜对活细胞形态、胞桨和胞膜进行观察。生长状态良好的细胞 透明度大，细胞内颗粒少，看不见空泡，胞膜清晰，折光性强。培养 上清液清晰透明，看不见悬浮的细胞和碎片。细胞机能不良时，胞质 中常出现空泡，脂滴和其它颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态 可变得不规则，甚至失去原有的特点。只有状态良好的细胞才能用来 做实验。 一般在细胞接种或传代后，每天或至多间隔l-2天，应观察 细胞形态、细胞生长、培养液PH值和污染与否等，随时掌握细胞动 态变化，以便于做换液或传代处理。如发现异常情况，及时采取措施。 正常情况下，培养液呈桃红色，用一般温箱培养时，随细胞生长时间 的延长，二氧化碳积累增多，由于培养基内有PH指示剂的存在，其 颜色可间接反映细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较 好；呈淡黄色则可能是培养时间过长，营养不足，死亡细胞过多；呈
紫红色则可能是细胞生长状态不好或已死亡。
8.3培养细胞的保存和复苏 8.3.1影响冻存细胞活性的因素
S.3丄l细胞冻存保护剂常用的有二甲基亚砜(DMSO)和甘油，常 用的浓度为5%-10% (90%小牛血清)。DMSO对二倍体细胞的毒性 较甘油小。
8.3.1.2细胞悬液的冻结速度慢冻时冰冻在细胞外形成，因此不致损 害细胞。多数细胞以每分钟下降rC的速度，降至-2(TC冻结。均可获
得满意效果。
8.3丄3保存温度液氮罐，可达到-196'C，此时所有的物理化学活动 均降至最低限度，以保证细胞长期保存。
8.3丄4复苏急速融化复苏可防止损害细胞。冻结细胞从液氮中取出 后，应立即放入37。C 43。C的水浴中，30秒至一分钟内融化。 8.3.2.冻存与复苏方法
8.3.2.1细胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用冻存液稀至2 5X106/ml。 8.3.2.2分装于2ml冻存管中，装量lml，封口，作好标记，用几层纱 布扎好。
8.3.2.3冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程，以rC/min的速度 降温， 一般挂在液氮上空8小时后，投入液氮贮存罐中长期保存。 8.3.2.4为使冻存的细胞复苏，将冻存管置于37。C 43。C水浴中，充 分摇动使其急速融化，30秒至1分钟内完成。
8.3.2.5细胞悬液低速离心，去除上清中的保护添加剂，加入原来使用
的生长液，置37'C培养。 8.4.试剂
8.4.1将1640溶于新蒸的三次蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，过滤除 菌即可。
8.4.2小牛血清用前56°CX30分钟灭活(破坏补体)分装置-2(TC保存备用。
8.4.3青链双抗液将100万单位的青霉素钠盐和硫酸链霉素用高压2 次后的三蒸水100ml充分溶解，分装冻存于-20。C，使用前融化，每 100ml生长液中加lml，即使用终浓度为含RS 100pg/ml。(注P.S
不能冻融多次，应少量分装， 一次用完)。
8.4.4使用NaHC03液调整pH值，常用浓度为5 6%，配制用三蒸 水溶解后过滤除菌或高压灭菌，分装4'C保存。 8.4.5胰蛋白酶:在pH 8.0，温度37"C时作用力最强。 8.4.6 EDTA液
8.4.7细胞冻存液小牛血清90%与二甲基亚砜(DMSO) 10%混合; -2(TC冰箱保存备用。或小牛血清30%， 1640培养液60%， DMSO10c/o 混合;-2(TC冰箱保存备用。 10.检测
按2000年版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行. 10.1无菌实验按2002年版规程通则《生物制品无菌试验规程》A 项进行；
10.2内毒素检测按2002年版规程通则《生物制品细菌内毒素试验
规程》进行。滴度应低于l: 500;细胞内毒素含量应不高于5EU/ml; 10.3病毒检测各项指标为阴性；
10.4热原质试验按2002年版规程通则《生物制品热原质试验规程》 进行；
10.5异常毒性试验按2002年版规程通则《生物制品异常毒性试验 规程》进行.
10.6指纹图谱检测SDA-PAGE法分析应出现3条主要带；66kd 23kd 10kd
10.7蛋白检测应在lg/L左右；
10.8 PH:为6.7 7.3;
10.9多肽含量用BCA法测定，应不低于1.0mg/ml; 10.10核酸含量应不低于800pg/ml
10.11颜色应为无色或微黄澄明液体，不应有异物、浑浊或沉淀。
11. 分批
按2002年版规程通则《生物制品分批规程》进行。
12. 分装
按2002年版规程通则《生物制品分装规程》进行。 12.1将经检测合格原液调整至相应浓度后，使用0.22um过滤器连续 过滤2次并将滤液置于45ml离心管；
12.2使用1000ul微量移液器，吸取滤液分装至西林瓶，每瓶2.2ml， 加盖胶塞及铝塑；
(以上分装过程须在超净台内进行)
12.3将加盖胶塞及铝塑盖的西林瓶置于封盖机上封口。
13. 规格每支装量2ml不等。多肽含量应不少于2mg/支。
14. 入库经澄明度检测合格后，贴好标签放置于2t:-8t:的条件下保
存，做好相关记录。
15. 保存、运输及有效期2.8'C避光保存及运输,自胎盘投料之日起有 效期为2年.
16. 注射用针剂的使用
16.1准备好一次性塑料注射器(5ml规格，配备相应针头)，
16.2核对好注射剂名称、型号，核查被注射者的姓名及适用指证，用 注射器抽吸注射剂5ml。
16.3嘱被注射者取卧位或坐位,嘱病人静止不动，肌肉放松。注射部 位常取一侧臀部外上1/4区(在骶骨尖处引一水平线，再以髂后上棘 与脊柱距离之中点作一垂直线与水平线相交，将臀部分为4个区)。 取消毒医用棉球蘸取适量酒精(浓度75%)，先后由该注射点为圆心 逐渐向外周旋转擦拭，使用四根以上酒精棉球重复以上消毒过程。
16.4左手拇指与食指绷紧注射部位皮肤，右手持注射器使针头与皮肤 垂直，迅速刺入肌层，针头刺入深度约2-3CM(根据不同部位及病人 胖痩而定，针头不能全部刺入)。然后左手拇指与食指固定针头，右手 回抽注射器内栓。若回抽有一定阻力且无回血，即可将药液缓慢推入 (为小儿注射推药要稍迅速)；若有回血，可将针头拔出少许再行试 抽。推药完毕迅速拔出针头，以无菌干棉球按压针眼片刻，不要立即
用手按揉。
17.皮肤外用涂剂及液体的使用
17.1晨起后或晚睡前取适量温水(37t:左右)湿润皮肤1-2分钟，滴 取洁面乳液适量至手心揉匀，轻轻揉搓面部或其他皮肤部位约3分钟 后，取适量温水(37"C左右)清洗洁面乳揉搓的部位。
17.2晨起后用洁面乳清洁面部后，分别取活肤日霜、去铍霜、美白 霜等各适量，均匀轻轻涂抹至面部或其他皮肤部位；或单独应用以上 皮肤外用涂剂。
17.3晚睡前用洁面乳清洁面部后，取活肤乳液适量，均匀轻轻涂抹 至面部或其他皮肤部位。
17.4晨起后或晚睡前用洁面乳清洁面部后，分别用活肤液配备的取 液管(侧面撕开铝盖后取下密封胶塞，套上取液管)取活肤液lml 均匀涂抹面部,轻微按摩至充分吸收。2-3分钟后再次热敷1分钟，取 活肤液lml均匀涂抹面部肌肤，轻微按摩3分钟，使其充分吸收。每 支在打开瓶盖后未一次性使用完毕，扣严胶塞后置4'C至8"C冷藏箱 保存，每支储存不超过24小时。每使用14ml (7支)后，间隔3天 再次使用活肤液。取液管用后请用清水冲洗干净放置盒内备用。
权利要求
1. 一种人类同种异体细胞提取液，其特征在于由如下步骤制备而成(1)选取健康产妇新鲜胎盘、脐带及其他同种异体组织；(2)将原料剪碎放置于容器中，用去热原水将剪碎组织清洗，沥干；(3)加入注射用水，开启匀浆机以8000～10000转/分的转速匀浆；(4)将匀浆液分装到血袋中，封口，将分装得到血袋经平衡后，置于离心机内2500～3000转/分离心，取上清液；(5)将上清液经50kD的中空纤维柱超滤，滤出液用50kD的中空纤维柱再次超滤，收获滤液，即为原液；(6)除菌，灭活病毒。
2. 权利要求1所述细胞提取液在制备用于提高机体细胞代谢功能 或增强机体免疫力的药物或保健品中的应用。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物的剂型为注射
全文摘要
本发明公开了一种人类同种异体细胞提取液及其应用。本发明通过严格的流程选取人类同种异体组织细胞，经体外细胞培养，成为含有多种生物学活性成分的细胞。采用超低温萃取技术分离出细胞液，对细胞液中的细胞进行物理破壁处理后，将细胞的胞浆和细胞核中的核酸、多种短肽、多肽细胞因子、多种氨基酸、微量元素等释放到细胞液中，使细胞液中富含核酸、氨基酸、天然免疫蛋白、细胞生长因子群、多型胶原成分等。制得的细胞液可开发成具有细胞生物学活性功能的制剂，作用于人体后可提高机体细胞代谢功能、增强机体免疫力，并可改善皮肤弹性与光泽等功效。通过各项安全性检测未见毒副作用。
文档编号A61K35/48GK101380332SQ20081021179
公开日2009年3月11日 申请日期2008年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者敏 陆 申请人:浙江金时代生物技术有限公司