专利名称：一种木脂素类化合物及其制备方法、鉴定方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及木脂素类化合物，更具体地说，本发明涉及一种从五味子 中分离出的新颖的木脂素类化合物。同时，本发明还涉及所述化合物的鉴 定方法、制备方法及其在药物制备中的应用。
背景技术：
五味子科(5fe/H'^m/raeeae)植物全世界共有50种，分布于亚洲东南部和 北美东南部。我国约29种，主产于西南部和中南部。五味子科包括两个属， 即五味子属(5fe/H'^w/ra)和南五味子属(《^&Mra)。中国药典中记载的五味子 和南五味子分别为五味子属的五味子《S. c/^era&(rwrcz.)万m7/.和华中五味 子5". ^;^wa"f/;era7 e;^ W附h.的果实，是传统的滋补强壮药，具收敛固 涩、益气生津,补益宁心之功效。本草考证，五味子始载于《神农本草经》 列为上品。《图经本草》记载"五味皮肉甘甜，核中辛苦，都有咸味，此 则五味俱也。"故名五味子， 一直沿用至今。木脂素是五味子科植物中的主 要生物活性成分，结构类型多，立体化学复杂。
迄今为止从该科植物中分离得到的木脂素有近200个，根据骨架类型 可分为五大类I .联苯环辛烯类(dibenzocyclooctadinenes)， II.螺苯并呋喃型 联苯环辛烯类(spirobenzofliranoid dibenzocyclooctadienes) ， III.芳基四氢萘类 (aryltetralins) ， IV. 二芳基丁烷类 (diaiylbutanes) ， V.四氩吹喃类 (tetrahydroforans)。它们大多具有抑制中枢神经，降低血清转氨酶，抗癌， 抗HIV，抗胃溃疡，抗过氧化等作用。而近年来开发新药的一个主要的途 径就是从传统药物中寻找活性成分，并根据它们的结构进行人工合成或以 此为先导物合成一系列衍生物，从中找出有效的药物。治疗肝炎药物联苯 双酯就是在研究五味子有效成分化学结构基础上，进行人工合成中产生的。 然而传统的分离方法有出层析法、后来发展到釆用柱层析和中压液相色谱结合的方法，它们存在者消耗试剂量大，很难提纯化合物，消耗时间长等 缺点，并且这些方法很难分离出新化合物，就算发现了效率也是非常低。 这是本技术领域中一个长期存在的技术难题。
发明内容
本发明目的是针对现有技术的不足，提供一种木脂素类新的化合物。 本发明另一个目的在于提供所述新化合物的制备方法与其化学结构的鉴定 方法。同时，本发明目的还在于对所述化合物的药物活性进行研究，以期
寻找抗肿瘤或抗HIV活性强的化合物。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
A.本发明提供了一种新的木脂素类化合物，该化合物用下述通式(I ) 表不
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(I)
其中1，2，3，4,5,6,7,8,9，10，11，12，13,14，15，16,17,18分别表示C1,C2， C3，C4，C5， C6,C7，C5， C8,C9，C10, C11，C12，C13， C14，C15， C16，C17,C18 。
B.本发明提供了一种所述化合物的制备方法，该方法包括下述步骤 l.以鹤庆狭叶五味子(S. w&o"/a"a )为原料，将五味子果实粉末用 乙酸乙酯浸提三次，每次5天，期间每隔3小时超声一次， 一次l小时；合并提取液减压蒸馏至浸膏，浸膏用它体积的 一半的氯仿溶解与硅胶拌样，
搅拌均匀后将溶剂挥干，碾磨均匀；
2. 用硅胶干法填充层析柱，用氯仿:丙酮(1:0~0:1)梯度洗脱，收集 各部份洗脱液；
3. 将洗脱液用高效液相色谱法分离纯化，根据紫外检测器谱峰收集目
标级分；
4. 目标级分浓缩干燥后即可得到所需的化合物单体。
其中，在步骤(2)中所用的硅胶规格是200~300目；步骤(3)中的 洗脱液选择9:1和8:2部分。
C.本发明提供了一种对所述化合物的结构进行鉴定的方法，该方法包 括以下步骤
1. 本发明制备得到的白色粉末，["]^-5.44。 ， EIMS显示分子离子峰 m/z404结合NMR谱，确定分子式为C22H2807，并经髙分辨ESIMS谱([M+Na]+， m/z427)证实不饱和度为9;
2. HPLC-UV在240.8具有联苯环辛烯木脂素的特征吸收，IR (KBr) 光谱显示存在羟基(3347cm")，芳环和双键(1640， 1600， 1500cm" )， 'H 和"CNMR谱说明分子中有两个苯环，4个甲氧基(Sc135.9， 135.8, 135.6， 135.4), 2个甲基(5h0.73, 3H， d, 1.38,3H, s), —个季碳(Sc 72.8), 一个次甲基(5C41.79)，两个亚甲基(Sc39.2， 34.2)和两个羟基;
3. 与已知的木脂素类化合物波谱数据比较确定该化合物为联苯环辛烯 木脂素，经HMBC谱H-17与C-6、 C-7和C-8相关，H-18与C-7、 C-8 和C-9相关，两个羟基氢分别与C- 11、 C誦12、 C-13和C-6、 C-7、 C-8 相关说明两个甲基分别位于G-7、 C-8上，两个羟基分别位于C-12、 C-7 上；
4. CD谱在250nrn处有很强的负Cotton效应，结合ROESY和COSY
确定化合物的联苯为M螺旋，即构型为S构型，此化命物与已知化合物gomisinJ相似，但是此化合物C-l和C-3上的取代基刚好与gomisinJ相反， 并且此化合物C-7上还有一个羟基。
综合上述分析，确定了新化合物的结构为通式(I )所示，经文献检 索证实该化合物为一种新化合物。
D.本发明提供了所述新化合物的抗HIV活性实验
本发明对新化合物做了 HIV感染细胞的保护作用试验将8x 105/mL MT4细胞50pL/孔接种到含有100inL/孔倍比稀释化合物的96孔细胞培养板 上，培养板的一半孔加入50pL的HIV-l腦稀释(M.ai.0.006)，另 一半孔加 入50nL培养基。每个浓度梯度2个重复孔，同时设置不含化合物的对照 孔和空白对照孔，37。C,5。/。C02培养，第三天每孔补加100]LiL新鲜培养基， 第五天或第六天釆用MTT比色法检测细胞存活率。ELx800ELISA仪测定 OD值，测定波长为595nm,参考波长为630 nm。按Reed&Muench法计 算出化合物抑制病毒的50%有效浓度(EC5o)， 50%抑制细胞生长浓度 (CC5Q)及抗HIV-l活性的治疗指数TI值(Therapeutic index),结果如表 l所示。实验结果表明，本发明提供的新化合物显示出较显著的抗HIV活 性，其选择指数有值得深入研究的价值，有可能成为抗艾滋病的后选药物 或后选药物的先导化合物，预示了良好的药用前景。
表l.本发明的化合物抗HIV活性试验结果
毒性(CC50)
合胞体抑制(EC50) (ng/mL) TI 感染细胞的保护
(ng/mL)
样品名
EC50
12 1 2 12 CC50(吗/mL) TI
(jig/mL )
新化合物A >200>200 7.28 6.84 >29,24 >200 15.2 >13.16
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:本发明提出了一种髙效的分离方法。此法至今尚未见到有关报道。本 发明提供的方法步骤简单、效率高、直观、重现性好、出新率高。高效液
相色谱分析表明，采用该方法制备的木脂素类新化合物纯度高达99%以上。
图l为本发明的工艺流程示意图2为本发明粗提物的HPLC图3为经高效液相色谱法纯化后的HPLC图4为新化合物的ESIMS图5为新化合物的1HNMR图6为新化合物的"CNMR图7为新化合物HMBC图8为新化合物的COSY图9为新化合物的ROESY图。
具体实施例方式
通过下面给出的具体实施例，可以进一步清楚地了解本发明。但它们 并不是对本发明保护范围的限定。 实施例1
——鹤庆狭叶五味子(S. w&o"/a"a )的提取和粗分离 将鹤庆狭叶五味子SM;z7Mw/awa的果实干燥、粉碎过80目筛，用十倍 于其体积的乙酸乙酯浸泡提取三次，.每次5天，期间每隔3小时超声一次， 一次1小时，合并提取液减压蒸馏浓缩至浸膏，浸膏用它体积一半的氯仿 溶解与硅胶拌样，搅拌均匀后将溶剂挥干，碾磨均匀；用硅胶干法填充层 析柱，用氯仿:丙酮为1:0洗脱，收集洗脱液,将洗脱液部分减压蒸馏浓缩近 干，用适量的甲醇溶解，过0.45pm滤头到进样瓶中，用75%的甲醇划段，收集每一段，浓缩干燥，重复上述操作，降低甲醇比例直到将每个峰分开， 即可得到各化合物单体。
实施例2
重复实施例l，用氯仿:丙酮(9:1和8:2)洗脱，收集各部分洗脱液，将洗 脱液部分减压蒸馏浓缩近干，用适量的甲醇溶解，过0.45pm滤头到进样 瓶中，用75%的甲醇划段，收集每一段，浓缩干燥，重复上述操作，降低 甲醇比例直到将每个峰分幵，即可得到新化合物单体。(见图2)。
实施例3
重复实施例1，用氯仿:丙酮(分别为7:3， 6:4， 5:5, 4:6, 3:7, 2:8， 1:9， 0:1)洗脱，收集各部分洗脱液，将洗脱液部分减压蒸馏浓缩近干，用 适量的甲醇溶解，过0.45]um滤头到进样瓶中，用75°/。的甲醇划段，收集 每一段，浓缩干燥，重复上述搡作，降低甲醇比例直到将每个峰分开，即 可得到各化合物单体，但不是本专利所述的新化合物。
实施例4
重复实施例1,改变乙酸乙酯的体积，提取次数，天数，超声时间， 结果同样得到相同的化合物单体(李蓉涛等釆用常规方法从小花五味子中 分离出43个化合物，其中4个新化合物，出新率近10%,而本法分离鹤 庆五味子，分离出40个化合物，其中20个新化合物，出新率为50% )。
实施例5
以鹤庆狭叶五味子(5: w&o"&"a )为原料，将五味子果实粉末用乙
酸乙酯浸提三次，每次5天，期间每隔3小时超声一次， 一次l小时； 合并提取液减压蒸馏至浸膏，浸膏用它体积的一半的氯仿溶解与硅胶拌样， 搅拌均匀后将溶剂挥干，碾磨均匀。用硅胶干法填充层析柱，用氯仿:丙酮 (9: l和8: 2)洗脱，收集各部份洗脱液。将洗脱液用高效液相色谱法分 离纯化，根据紫外检测器谱峰收集目标级分；目标级分浓缩干燥后即可得 到所需的化合物单体。实施例6
实施例3中所述的高效液相色谱法所用的流动相为以甲醇和水的混合 物为流动相。 实施例7
当两个化合物分离度不好时可以调节甲醇和水的比例，具体方法为 从甲醇含量80%-50%不断变化，寻找能够将化合物分开的最佳比例，甲醇 比例的变化必然要影响出峰时间，甲醇比例越低出峰时间越长，为了节约
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p、j ipj , 个久h/j wv ^nn正ii —j不/n -tt-为;izti卞口v刀/z: 、"i升厂/i卞j "手山兀厂乂i而文 的时间t和第一个峰和最后一个峰之间相隔的时间z3t，通过实践未出峰前 进样的次数n- (t-Jt) /Jt)。每隔(Jt-lmin)进一次样，这样便可以节 约因降低甲醇比例而延长的时间)。 实施例8
实施例3所述的高效液相色谱色谱法所用的半制备柱为Agilent ZORBAX-C18 (9.4x250nm、 5pm)。 实施例9
实施例6所i的高效液相色谱色谱法所用的半制备柱并不仅限于这一 个厂家，同样适用于其他的不同厂家的半制备柱。 实施例10
实施例3所述的高效液相色谱色谱法所用的检测波长采用三波长 (210nm、 254nm、 300nm)，如果三个波长下的吸收峰相似、对称性相似， 线条平滑便可判定已经分纯。
权利要求
1. 下述通式(I)化合物其中1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18分别表示C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C5，C8，C9，C10，C11，C12，C13，C14，C15，C16，C17，C18。
2. 权利要求1化合物的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤: (1)以鹤庆狭叶五味子(S. w/to)"/a"a )为原料，将五味子果实粉末用乙酸乙酯浸提三次，每次5天，期间每隔3小时超声一次， 一次l小时； 合并提取液减压蒸馏至浸膏，浸膏用它体积的一半的氯仿溶解与硅胶拌样， 搅拌均匀后将溶剂挥干，碾磨均匀；(2) 用硅胶干法填充层析柱，用氯仿:丙酮(1:0~0:1)梯度洗脱，收 集各部份洗脱液；(3) 将洗脱液用高效液相色谱法分离纯化，根据紫外检测器谱峰收集目标级分；(4) '目标级分浓缩干燥后，得到所需的化合物单体。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于在步骤(2)中所用 的硅胶规格是200 ~ 300目。
4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中的洗脱 液选择9:1和8:2部分。
5. —种对权利要求1化合物的结构进行鉴定的方法，该方法包括以下(1) 本发明制备得到的白色粉末，[°^-5.44° , EIMS显示分子离子 峰m/z 404结合NMR谱，确定分子式为C22H2807，并经高分辨ESIMS谱([M+Na]+， m/z427)证实不饱和度为9;(2) HPLC-UV在240.8具有联苯环辛烯木脂素的特征吸收，IR(KBr) 光谱显示存在羟基(3347cm")，芳环和双键(1640， 1600， 1500cm" )， & 和"CNMR谱说明分子中有两个苯环，4个甲氧基(Sc 135.9， 135.8， 135.6, 135.4), 2个甲基(Sh0.73， 3H, d， 1.38，3H, s), —个季碳(Sc 72.8), 一个次甲基(5C41.79),两个亚甲基(Sc39.2， 34.2)和两个羟基；(3) 与已知的木脂素类化合物波谱数据比较确定该化合物为联苯环辛 烯木脂素，经HMBC谱H-17与C-6、 C-7和C-8相关，H-18与C-7、 C-8 和C-9相关，两个羟基氩分别与C- 11、 C- 12、 C-13和C-6、 C-7、 C-8 相关说明两个甲基分别位于C-7、 C-8上，两个羟基分别位于C-12、 C-7 上；(4) CD谱在250nrn处有很强的负Cotton效应，结合ROESY和COSY 确定化合物的联苯为M螺旋，即构型为S构型，此化合物与已知化合物 gomisin J相似，但是此化合物C-l和C-3上的取代基刚好与gomisin J相反， 并且此化合物C-7上还有一个羟基，据此，确定化合物的结构为通式(I ) 所示。
6. 权利要求1所述化合物在制备抗HIV活性的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及新颖的通式(I)的木脂素类化合物，其中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18分别表C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C5，C8，C9，C10，C11，C12，C13，C14，C15，C16，C17，C18。本发明还涉及从五味子中分离出新颖的木脂素类化合物的制备方法和鉴定方法。同时，本发明还涉及该化合物在制备抗HIV活性的药物中的应用。
文档编号A61P31/00GK101429107SQ200810233600
公开日2009年5月13日 申请日期2008年11月18日 优先权日2008年11月18日
发明者李干鹏, 杨海英, 范逸平, 董秀华 申请人:云南民族大学