专利名称：：靶向肺癌的肽及其应用的制作方法靶向肺癌的肽及其应用优先权本申请要求2007年2月13日提交的美国临时申请60/900，973、2007年2月14日提交的美国临时申请60/901，085、以及2007年4月13日提交的美国申请11/783，927的优先权，这些申请都全文引入本文作为参考。
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：肺癌是全世界与癌症有关的死亡率的主要原因。晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的5年存活率不到15%。缺乏肿瘤特异性仍然是化疗中的主要问题，化疗的副作用妨碍了运送的药物剂量达到消除大部分癌细胞所需的水平。而配体介导的靶向疗法使得化疗具有更好的肿瘤特异性和更低的毒性，也许可以用于开发新的癌症疗法。尽管制药业已成功发现了多种新的细胞毒性药物具有潜在的癌症治疗效果，这种危及生命的疾病每年仍夺去全球7百万以上的人的生命，而且这个数字还在上升(Mantyh，2006)。大多数常规化疗药物的临床应用常常因不能将足够浓度的治疗药物运送到肿瘤靶组织、或因对正常器官的严重有害毒副作用而受到限制。因此开发可用于对肿瘤定向输送药物、并因此改进所运载药物的治疗指数的新的微生物载体技术显得尤为重要。噬菌体展示是一种选择技术，其中肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白作为融合体形式进行表达，从而将该融合肽或蛋白展示在病毒体的表面。被噬菌体展示的随机肽文库提供了以下机会对B细胞表位(D'Melloetal.，1997；Fuetal.，1997；ScottandSmith,1990；ffuetal.,2001；ffuetal.,2003)以及蛋白-蛋白接触(Atwelletal.，1997;Bottgeretal.，1996；Nordetal.，1997；Smithetal.，1999)进行定位作图，选择与受体结合的生物活性肽(Koivunenetal.，1999；Lietal.，1995Brightonetal.，1996)或蛋白(Bottgeretal.，1996；Castanoetal.，1995；DeLeoetal.，1995；Kraftetal.，1999；Pasqualinietal.，1995)，寻找疾病特异性抗原模拟物(Folgorietal.，1994；Liuetal.,2004；Prezzietal.，1996)，以及确定细胞特异性(Barryetal.,1996；Leeetal.,2004；Mazzucchellietal.，1999)和器官特异性(Arapetal.,1998；EsslerandRuoslahti,2002；Pasqualinietal.,1995；PasqualiniandRuoslahti,1996)月太。有人提议用脂质体作为癌症化疗的药物载体(Gregoriadisetal.，1974)。自此，对脂质体的兴趣增加，脂质体系统如今被当作药物载体而被深度研究。在用脂质体向癌组织特异性运送药物方面，有三个基本要求(i)血液循环时间要长，(ii)肿瘤部位积累的量要大，(iii)要能控制药物的释放和肿瘤细胞对药物的摄取，这种释放动态谱要与该药物的药代动力学特征相吻合。最初，对脂质体药物运送系统的研究遭遇被网状内皮系统(reticuloendothelialsystem,RES)极快速清除的问题。人们认识到，颗粒大小、表面电荷(Weinstein，1984)、以及脂质体组成都对清除谱有强烈影响(例如，掺入磷脂酰肌醇或单唾液酸神经节苷脂延长了脂质体在血液中循环的时间)(AllenandChonn,1987；GabizonandPapahadjopoulos,1988;Senior,1987)该摄入可能可以通过“秘密(stealth)”脂质体来规避，这里提到的“秘密”脂质体经渗漏的毛细血管而优先退出循环系统、且预计在表现出深度新血管化的肿瘤中累积导致高浓度并增强抗肿瘤活性(Wuetal.，1993)。然而，脂质体是唯一被充分认识的成功的药物运送候选者，这还是因为发现脂质体外覆合成聚合物聚乙二醇(PEG)后显著增加血液中半衰期(Allenetal.,1991；BlumeandCevc,1990；Klibanovetal.，1990；Papahadjopoulosetal.，1991；Senioretal.，1991)。PEG化的脂质体由于高度水化、且受保护的脂质体表面而具有较长的循环时间，这抑制了对脂质体进行的蛋白吸收和调理作用(WoodleandLasic，1992)。解决了快速调理和清除的问题后，脂质体在血液中的半衰期最长达到72小时(Drummondetal.，1999)，接下来要解决的问题是，通过主动导向，使脂质体在肿瘤中积累。使用靶向性脂质体有可能显著增强肿瘤靶点处的药物释放、并增加疗效(Leeetal.，2004；Parketal.，2002)。药物运送研究领域已成功构建了循环时间较长的脂质体，它们在肿瘤组织中积累，在没有主动触发机制的情况下，通过被动扩散而将内含的药物渗出到肿瘤组织中。使用能在患病组织特异性地释放药物的位点特异性触发剂是一种增加药物在肿瘤靶点处的生物利用度的方法。另一种优化药物的生物利用度的方法是，通过主动导向，使脂质体的累积程度达到较高水平。此外，将主动导向与主动触发联用，很可能导致药物在肿瘤靶点处的特异性释放显著增强(Leeetal.，2004；Parketal.,2002)使用单克隆抗体靶向癌症的一个主要限制是，抗体分子相对较大，分子量(MW)为150,000。此分子到达供血不足的较大肿瘤实体内部有困难(Dvoraketal.,1991Jain,1997；Shockleyetal.，1991)。为克服该问题，一些研究者目前正在开发抗肿瘤的单链Fv(scFv)抗体，它们分子量较小，只有MW25，000(AdamsandSchier,1999；Halletal.，1998；Wongetal.，2001)。单克隆抗体疗法的另一主要问题是，抗体分子被非特异地摄入网状内皮系统如肝、脾脏、和骨髓中。放射性标记的或与毒素偶联的抗体受剂量限制的毒性作用是肝脏和骨髓的毒性(Neumeisteretal.,2001；Thomasetal.，1995)。与此相比，肽可以被认为比单克隆抗体分子小，它们通常不结合网状内皮系统(Ainaetal.，2005)。它们的化学性质稳定，相对较容易生产。此外，合成的短肽能有效穿透组织、以及它们被癌细胞选择性结合和内化的能力，使得它们成为运送治疗药物如细胞毒药物、寡核苷酸、毒素、以及放射活性分子的理想候选者。与病毒运送载体和单克隆抗体不同，肽几乎不被免疫系统注意，预计引起的副作用最小或甚至没有副作用(LevyandHyman，2005)。因此，目前急需鉴定靶向性配体、并开发由配体靶向的脂质体。我们相信，有前途的NSCLC新疗法需要靶向肿瘤的高特异性、小毒性方法。在此，我们描述了对一些肽的分离和鉴定，所述肽包括SP5-2，它能特异性结合一些NSCLC细胞系和肺癌患者的活检标本。当与含有长春瑞宾(vinorelbine)或多柔比星(doxorubicin)的脂质体偶联时，这种靶向性肽SP5-2在SCID小鼠中提高这些药物抗人类肺癌异种移植物的治疗指数。我们的结果表明，这种靶向性肽，以及我们的研究中鉴定的其它肽，都极有可能在临床治疗肺癌方面成为药物运送物。针对特异性靶组织筛选噬菌体展示文库因此也就成为鉴定靶向药物、基因运送载体或其它治疗药物所用的肽序列的直接、快速方法。发明概述本发明涉及多方面，包括以下单独各项或它们的联合本发明提供了多核苷酸及其变体，包括SEQIDNO1,SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7,SEQIDNO-.9,SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO17，和SEQIDNO:190本发明提供了肽及其变体，包括SEQIDN0:2，SEQIDNO:4，SEQIDN0:6，SEQIDNO:8,SEQIDNO:10，SEQIDNO-.12,SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，和SEQIDNO:20。在一个实施方案中，所述肽包含SEQIDNO:2，或其变体。在另一个实施方案中，所述肽包含SEQIDN0:2。在另一个实施方案中，所述肽包含融合蛋白。在另一个实施方案中，所述肽包含一或多个标记。所述标记可包括FITC，生物素，以及放射性同位素。在另一个实施方案中，所述肽与一或多种药物偶联。所述药物可包括多柔比星，长春瑞宾，寡核苷酸，毒素，抗-VEGF适体(aptamer)，以及放射活性分子。本发明提供了与本发明的肽结合的抗体或其变体，所述肽包括SEQIDN02,SEQIDNO:4,SEQIDN0:6，SEQIDN0:8，SEQIDNO10,SEQIDN012,SEQIDNO14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18，和SEQIDNO:20。本发明提供了包含一或多种本发明肽的脂质体，包括含有SEQIDNO2,SEQIDNO4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO-.12,SEQIDNO:14，SEQIDNO=16,SEQIDN0:18，或SEQIDNO:20的肽。在一个实施方案中，所述脂质体包含含SEQIDNO:2的肽，或其变体。在另一个实施方案中，所述脂质体包含含SEQIDNO:2的肽。所述脂质体可包含一或多种药物。所述药物可包括多柔比星，长春瑞宾，寡核苷酸，毒素，抗-VEGF适体，以及放射活性分子。在一个实施方案中，所述药物是多柔比星。在另一个实施方案中，所述药物是长春瑞宾。多柔比星的量可以是约110-130yg/iimol磷脂。在一个实施方案中，所述脂质体直径约65-75nm。在另一个实施方案中，每个脂质体中的肽分子数为约300-500。所述脂质体可包含可药用载体。本发明提供了治疗癌症的方法，包括使受试者与脂质体接触，所述脂质体含有一或多种化疗药，并含有选自下组的肽或其变体SEQIDNO2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10，SEQIDNO-.12,SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO18，和SEQIDN0:20。所述化疗药可选自多柔比星，长春瑞宾，寡核苷酸，毒素，以及放射活性分子。在一个实施方案中，所述化疗药是多柔比星。在另一个实施方案中，所述化疗药是长春瑞宾。在一个实施方案中，癌症是选自NSCLC和SCLC的肺癌。本发明提供了检测标本中癌细胞的方法，包括将标本与权利要求2的肽在允许该肽与该标本中的癌细胞结合的条件下接触，并用权利要求8的抗体检测所述多肽与所述标本中的癌细胞的结合。在一个实施方案中，所述肽是含有表位的融合蛋白，该融合蛋白用针对该融合蛋白的表位的抗体来检测。在另一个实施方案中，所述肽带有标记，通过该标记可以检测所述肽。在一个实施方案中，所述标记包括FITC。在另一个实施方案中，所述标记包括生物素。本发明提供了鉴定与本发明肽结合的生物分子的方法，包括将细胞提取物与本发明肽在允许形成包含所述肽与靶蛋白在内的复合物的条件下接触，和分析所述复合物以鉴定所述靶蛋白。本发明提供了多核苷酸，其与权利要求1的多核苷酸或其变体的互补体在严谨条件下杂交。本发明提供了含有权利要求1的多核苷酸的载体。本发明提供了宿主细胞，其含有包含权利要求1的多核苷酸的载体。本发明提供了多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与权利要求1的多核苷酸或其变体的互补体在严谨条件下杂交。图表的说明图的简要说明图1.用体外噬菌体展示技术分离NSCLC细胞特异性噬菌体。图2.鉴定与NSCLC细胞结合的特异性噬菌体克隆。(A)观察CL1-5和PC13肺癌细胞中PC5-2的结合。比例尺10iim。(B)PC5-2显示与CL1-5细胞结合、并被SP5-2合成肽抑制。比例尺10ym。(C)经流式细胞术测量PC5-2与CL1-5细胞表面的结合谱。图3.靶向性肽与NSCLC细胞和人肺癌活检标本结合的活性。(A)FITC_标记的SP5-2结合五种NSCLC细胞系但不结合正常上皮细胞(NNM)。比例尺10ym。(B)FITC-标记的SP5-2结合NSCLC细胞系。(C)PC5-2和SP5-2结合肺癌患者的肺腺癌活检标本。比例尺25ym。图4.验证PC5-2在体内的肿瘤归巢能力。(A)回收肿瘤中的PC5-2，与脑、肺和心脏的结果进行比较。(B)PC5-2对肿瘤组织的靶向性被SP5-2竞争性抑制，但不被对照肽抑制。(C)PC5-2在CL1-5衍生的异种移植物中的定位。比例尺25iim。图5.用SP5-2-Lipo-Vin和SP5-2-Lipo_Dox治疗携有人肺癌异种移植物的SCID小鼠。(A)经SP5-2-Lipo-Vin治疗的小鼠肿瘤大小的改变。(B)接受治疗的小鼠的体重变化。(C)经SP5-2-Lipo-Vin治疗的小鼠的存活曲线。(D)经SP5-2-Lipo_Dox治疗的小鼠肿瘤大小的变化。表的说明表1提供从NSCLC异种移植物选出的噬菌体所展示的肽序列。发明详述肺癌是发达国家最常见的恶性肿瘤，在发展中国家也是日益突出的问题(Boyleetal.，2000)。肺癌主要有两类小细胞肺癌(SCLC)和非-小细胞肺癌(NSCLC)。其中，NSCLC占约80%，SCLC接近20%(Schiller，2001)。来自AmericanCancerSociety的数据表明，NSCLC患者的5年存活率不到15%。已证实NSCLC特别难治(Fryetal.，1999；Ihde,1992)。肺部恶性肿瘤在全世界引起超过1百万例死亡，现已变成大流行病(Jemaletal.，2002)。肺癌是致命的疾病，因为很难诊断，也缺乏有效疗法。外科手术是推荐的治疗措施，化疗和放疗则可以作为治疗策略的一个组成部分用以治愈局部的晚期疾病或作为转移性肿瘤的治标性疗法(Thongprasertetal.，1999)。然而，缺乏细胞毒性药物特异性和最终产生毒性副作用(尤其当给予高剂量时)常常限制了这种治疗形式的应用。因此，非常需要了解造成预后差的分子变化，并运用该信息改进诊断和对患者的管理，本领域也需要更有效的癌症治疗。癌症疗法的主要目标是彻底根除癌细胞但使正常组织免于伤害。要实现该目标，需要在恶病质部位选择性靶向癌细胞。抗癌药物的选择性毒性可通过增加该药物抵达患病组织的剂量、或通过降低该药物抵达正常组织的剂量来实现，理想的情况是两者都能实现。因此，有人研究抗癌药物经配体介导的靶向性(Allen，2002)。配体靶向疗法的基本原理是，将化疗药运送到癌细胞或与癌有关的内皮细胞、成纤维细胞和淋巴细胞。通过将与仅在靶细胞上特有表达或过表达而不在正常组织中如此表达的抗原、或受体、或其它分子结合的分子与药物相连，可以增强对癌细胞及其微环境的选择性靴向(AllenandCullis,2004；Arapetal.，1998;HuandKavanagh,2003；RosenkildeandSchwartz，2004)。该策略允许将药物特异性运送到癌细胞、并增加抗癌治疗的疗效(AllenandCullis,2004；Arapetal.,1998；HuandKavanagh,2003；RosenkildeandSchwartz,2004)。细胞毒药物，如环膦酰胺(cyclophosphamide)、多柔比星、顺钼(cisplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、长春瑞宾、以及其它众多此类药物，都已用于治疗多种癌症，因为它们的致死性在连续增殖的细胞中是最高的，而多种常见肿瘤中的细胞都活跃地进行分裂。一般最易受细胞毒效应攻击的正常组织包括那些频繁分裂的组织如骨髓、胃肠道上皮内衬、和毛囊(HerbstandSandler，2004)。众所周知，化疗可延长NSCLC患者的存活期。近期报道的晚期NSCLC化疗临床试验使用了1990年代开发出的药物如紫杉醇、多西紫^(docetaxel)(gemcitabine)、i王g貞、禾口(irinotecan)(Lynchetal.，2004)。相应地，目前对老年晚期NSCLC患者的标准化疗是用长春瑞宾进行单一药物化疗(Kellyetal.，2001)。长春瑞宾是一种干扰微管装配的长春花生物碱(vincaalkaloid)。据认为，长春瑞宾的抗肿瘤活性主要归因于其在有丝分裂中期与微管蛋白相互作用而抑制分裂(Ramalingam，2005)。尽管细胞毒化疗对一些癌症的治疗有主要影响，其对大多数实体肿瘤的效力是有限的(Parkinetal.，2001)。我们用噬菌体展示技术鉴定能特异性结合NSCLC细胞系的噬菌体克隆。这些肽也根据它们归入或靶向癌细胞的能力来描述。术语“归巢(home)”、“归入(homing)”或“靶向(target，targeting)”可互换使用。在第五轮生物淘选(biopanning)中，选出的噬菌体克隆的结合活性比第一轮生物淘选的提高40倍。在CL1-5细胞上用ELISA筛选特异性结合的噬菌体，结果发现有一个被称为PC5-2的噬菌体克隆是最高产的(多达所选噬菌体的90%)结合CL1-5细胞的噬菌体(表1)。免疫组化研究进一步证实，PC5-2对NSCLC细胞有特异性结合活性(图2A)。为验证PC5-2展示的肽能特异性结合NSCLC细胞，我们用其同类(cognate)合成肽SP5-2来竞争细胞表面相同的PC5-2结合位点。荧光染色和流式细胞术分析显示，SP5-2能抑制PC5-2与NSCLC细胞的结合(图2B和图2C)。这些结果表明，PC5-2通过其展示的肽而不是通过噬菌体颗粒上的其它部分来与癌细胞相互作用。为检验有多少NSCLC细胞系表达能被SP5-2识别的靶分子，我们合成了FITC-标记的SP5-2，以鉴定其结合特性。通过用免疫荧光染色和流式细胞术分析5种不同类型的NSCLC细胞系，我们确定，这些细胞系的细胞表面与SP5-2结合的程度差别很大(图3A和B)。很明显，这5种NSCLC细胞系的浆膜(plasmamembrane)表达能被SP5-2识别的未知分子。当我们测量SP5-2与NSCLC细胞系的结合比时，SP5-2在每一细胞系中可检测到20.1%-45.8%的NSCLC细胞(图3B)。为检验SP5-2是否有作为NSCLC诊断和治疗的药物运送剂的潜力，我们合成了生物素_标记的PC5-2，用它通过免疫组化来检测肺癌患者的肺腺癌活检标本。PC5-2和生物素_标记的SP5-2能检测NSCLC活检标本(图3C)。来自10位患者的肺腺癌有50%(5/10)表达能被所述肽检测到的靶分子。为检验PC5-2归入肿瘤的能力，我们用携有人肺癌异种移植物的小鼠作为模型。体内归巢实验显示，PC5-2对肿瘤组织有较高亲和力，但未发现该噬菌体特异性结合正常器官如肺、心脏和脑(图4A)。当进行肽竞争抑制试验时，PC5-2与肿瘤组织结合的活性被合成肽SP5-2抑制(图4B)。这些结果提示，该合成肽能特异性结合与相应噬菌体相同的结合位点。为鉴定归巢噬菌体在肿瘤实体和正常器官中的位置，将PC5-2静脉(i.v.)注射到携有肺癌的SCID小鼠中，然后在组织切片上用抗-M13单克隆抗体对这些噬菌体进行定位。PC5-2免疫组化定位证实，这些噬菌体位于肿瘤组织中，不在脑、肺、以及心脏组织中(图4C)，这进一步支持我们的结论，即PC5-2能特异性结合异种移植的肿瘤细胞而不是正常组织和细胞。我们的结果表明，PC5-2，以及其它通过生物淘选分离到的肽，能用作配体靶向疗法的药物运送剂或用作肺癌或其它癌症的诊断剂。为开发配体靶向疗法，我们制备了与SP5-2相连的脂质体，它们携有化疗药长春瑞宾(SP5-2-Lipo-Vin)或多柔比星(SP5-2-Lipo_Dox)。在携有NSCLC异种移植物的SCID小鼠中，SP5-2-Lipo-Vin显示治疗效力提高，对这些动物不具有特异性副作用(图5A和B)，且未发现器官毒性的组织学证据。比较SP5-2-Lipo-Vin和Lipo-Vin对肿瘤生长的影响，我们发现，治疗后第42天时肿瘤大小有明显差异(P<0.05)，但Lipo-Vin治疗也能部分地抑制肿瘤生长(图5A)。Lipo-Vin的这种部分抑制作用可归因于肿瘤组织中“渗漏(leaky)”微脉管系统所致的脂质体非特异性吸附的累积、以及支持该肿瘤区域的淋巴系统的受损(Huangetal.，1992Jain,1996；MatsumuraandMaeda,1986)。该效应常被称作增强的透性和滞留效应(MatsumuraandMaeda，1986)。被动靶向脂质体Lipo-Vin可用于治疗癌症，但它可因配体靶向疗法可能导致的更高、且更具选择性的抗癌活性而被增强，这有时称为'主动'靶向。此外，为增强抗肿瘤效力，SP5-2-Lipo-Vin的副作用也比Lipo-Vin降低(图5B)。我们比较了分别用SP5-2-Lipo-Vin、Lipo-Vin和PBS溶液治疗后的动物存活率，对动物进行了102天的观察。SP5-2-Lipo-Vin治疗组有80%存活率，Lipo-Vin治疗组仅有40%存活率，PBS治疗组的荷瘤小鼠无一存活(0%存活率)(图5C)。这些现象提示，将Lipo-Vin与SP5-2肽偶联，可以在携有NSCLC异种移植物的SCID小鼠中，更有效抑制肿瘤生长并显著延长寿命。SP5-2肽不仅增强所述药物抗SCID小鼠中NSCLC异种移植物的效力，还降低其毒性。经Lipo-Vin治疗的小鼠的体重变化比经SP5-2-Lipo-Vin和PBS治疗的小鼠减少60%(图5B)。SP5-2-Lipo-Vin的治疗指数增加表明该靶向药物运送系统对NSCLC的显著临床潜力(图5)。这些结果表明，我们的肿瘤特异性归巢肽不仅能作为靶向疗法的治疗剂，还可以作为靶向NSCLC肿瘤组织的分子工具用作成像探针。这种靶配体还可用于鉴定NSCLC浆膜表面的靶蛋白或其它分子。总之，通过用噬菌体展示的肽文库筛选NSCLC细胞，我们鉴定出一些新肽，包括SP5-2，它们能在体外和体内与NSCLC细胞表面特异性结合。这些靶向肽可以与包含长春瑞宾、多柔比星或其它试剂的脂质体相连，使治疗效力和存活率增加而无系统性副作用。SP5-2肽看来是给NSCLC细胞运送药物的优秀试剂，而且在NSCLC治疗中具有很强的作为药物运送系统的临床潜力。参考文献Adams，G.P.，andSchier，R.(1999).Generatingimprovedsingle-chainFvmoleculesfortumortargeting.Journalofimmunologicalmethods231,249-260.Aina，0.H.，Marik，J.，Liu,R.，Lan，D.H.，andLam,K.S.(2005).Identificationofnoveltargetingpeptidesforhumanovariancancercellsusing“one-beadone-compound“combinatoriallibraries.Molecularcancertherapeutics4，806-813.Allen，T.M.(2002).Ligand-targetedtherapeuticsinanticancertherapy.Naturereviews2,750-763.Allen，T.M.，andChonn，A.(1987).Largeunilamellarliposomeswithlowuptakeintothereticuloendothelialsystem.FEBSletters223,42-46.Allen，T.M.,andCullis，P.R.(2004).Drugdeliverysystems:enteringthemainstream.Science303，1818-1822.Allen，T.M.，Hansen，C.，Martin，F.，Redemann，C.，andYau-Young,A.(1991).Liposomescontainingsyntheticlipidderivativesofpoly(ethyleneglycol)showprolongedcirculationhalf-livesinvivo.Biochimicaetbiophysicaacta1066，29-36.Arap，W.，Pasqualini，R.，andRu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培养的细胞，细胞上清液，和细胞裂解物。它还包括器官或组织培养物衍生的液体，组织活检样品，肿瘤活检样品，便样(stoolsample)，和从生理组织抽取的液体，以及从实体组织剥离的细胞，组织切片，以及细胞裂解物。该定义涵盖了获取后经任何方式操作过的样品，如用试剂处理过，经溶解，经富集某些成分如多核苷酸或多肽。该术语还包括患者样品的衍生物和分级分离物(fraction)。患者样品可用于诊断、预后、或其它监控分析。所述标本可来自人类患者或非人哺乳动物。本文中“治疗(Treatment)“包括在哺乳动物(包括人)中对疾病施用或应用任何治疗法(remedies)，包括抑制该疾病，阻止其发展，或缓解该疾病，例如，通过引起消退，或者恢复或修补损失、丢失或缺陷的功能；或对低效的过程进行刺激。该术语包括获得所需药理效应和/或生理效应，其涵盖对哺乳动物(包括人)病理紊乱的任何治疗。所述效应可以是预防性的，即完全或部分地防止疾病或其症状，和/或可以是治疗性的，即部分或完全地治愈疾病和/或引起该疾病的负面影响。因此，本发明提供了治疗和预防两者。其包括(1)在可能对该疾病易感、但尚未有症状的受试者中防止疾病发生或复发，(2)抑制该疾病，如阻止其发展，(3)终止该疾病或至少终止与其有关的症状，使该宿主不再遭受疾病或其症状的折磨，如引起该疾病或其症状的消退，例如，通过恢复或修补损失、丢失或缺陷的功能，或者对低效的过程进行刺激，或者(4)缓解、减轻、改善该疾病或与其有关的症状，这里的改善用其广义的含义，是指至少将参数(如炎症、疼痛、和/或肿瘤大小)的数量级降低。“可药用载体"是指任何传统形式的无毒性固体、半固体或液体填充物、稀释剂、封装材料(encapsulatingmaterial)、配药助剂(formulationauxiliary),或赋形剂(excipient)0可药用载体在所用剂型(dosage)和浓度对受者无毒性，并能与配制剂中的其它成分相容。“药物组合物"在本文指混合物，其通常含有本领域常规的、适于为治疗、诊断、或预防目的而对受试者施用的载体如可药用载体或赋形剂。它可包括细胞培养物，其中在细胞或培养基中存在多肽或多核苷酸。例如，口服组合物可形成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂(sustainedreleaseformulation)、漱口水(oralrinse)，或粉剂。丨‘疾病〃是指任何需要或希望医疗干预(medicalintervention)的疾病、感染、紊乱、或症状。所述医疗干预可包括治疗、诊断、和/或预防。“癌症"是指任何异常的细胞生长或组织生长，例如，肿瘤，不管它是恶性的、前恶性的、或非恶性的。其特征在于细胞增殖失控，可能侵入或不侵入周围组织，并因此可能转移或不转移到新的机体部位。癌症涵盖癌(carcinomas)，这是上皮细胞的癌症；癌包括鳞状细胞癌，腺癌，黑素瘤，和肝细胞瘤(h印atomas)。癌症还涵盖肉瘤(sarcomas)，这是间质来源(mesenchymalorigin)的肿瘤；肉瘤包括骨源性肉瘤(osteogenicsarcomas)，白血病，和淋巴瘤。癌症可涉及一或多种成瘤细胞类型。术语癌症包括肺癌，结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，和口腔癌。细胞系可用的细胞系包括人肺鳞状细胞癌系A549，高转移人肺腺癌系CL1-5，人肺腺癌系H23，人肺大细胞癌系H460，人肺癌系PC13，人鼻咽癌系NPC-TW01，人口腔鳞状细胞癌系SAS，人胰腺癌PaCa，人正常鼻粘膜上皮NNM，和成纤维细胞。A549、H23、H460、PC13、PaCa、和SAS都可从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)获得。CL1-5禾口NPC-TW01细胞系分别由(Chuetal.，1997)禾口(Linetal.，1990)创建。肽的制备本发明的肽可用本领域已知方法表达。基于细胞的方法和无细胞的方法都适于制备本发明的肽。基于细胞的方法一般涉及在体外将核酸构建体引入宿主细胞，在适于表达的条件下培养该宿主细胞，然后从培养基和/或从该宿主细胞(例如，通过破坏该宿主细胞)收获所述肽。本发明还提供了用无细胞的体外转录/翻译方法制备肽的方法，这些方法都是本领域熟知的。合适的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，包括，例如，细菌，酵母，真菌，植物，昆虫，和哺乳动物的细胞。通常，可以将修饰的或未修饰的异源肽以其原本的形式表达(如上述)，或作为融合蛋白进行表达，而且不仅可包括分泌信号，还可包括分泌前导序列。本发明的分泌前导序列可将一些蛋白引导至ER。ER将膜结合蛋白与其它蛋白分开。蛋白一旦到达ER，可进一步被引导至高尔基体，以便分配至小泡(vesicle)；包括分泌泡；浆膜，溶酶体，以及其它细胞o此外，可在所述肽上添加肽组分(moieties)和/或纯化标签。这类区域可在最终制得所述多肽之前除去。给多肽添加肽组分以造成分泌或排泄、提高稳定性、和促进纯化等等，都是本领域熟悉并且常规的技术。合适的纯化标签包括，例如，V5，聚组氨酸，亲和素(avidin)，以及生物素。肽与生物素之类的化合物的偶联可用本领域熟知的技术实现(Hermansoned.(1996)BioconjugateTechniques；AcademicPress)。也可以用本令页域已知技术，将肽与放射性同位素、毒素、酶、荧光标记、胶体金、核酸、长春瑞宾、以及多柔比星偶联(Hermansoned.(1996)BioconjugateTechniques；AcademicPress；Stefanoetal.(2006)Aconjugateofdoxorubicinwithlactosaminatedalbuminenhancesthedrugconcentrationsinalltheformsofrathepatocellularcarcinomasindependentlyoftheirdifferentiationgrade.LiverInt.26726-33)。毒素本领域已知的那些。KreitmanandPastan,Immunotoxinsinthetreatmentofhematologicmalignancies.CurrDrugTargets.71301-11(2006)。适用于本发明的融合配对物包括，例如，胎球蛋白(fetuin)，人血清清蛋白，Fc，和/或它们的一或多种片段。本发明还提供了偶联的蛋白，如聚乙二醇偶联物。本发明的肽还可用本领域已知技术进行化学合成(例如，参见Hunkapilleretal.,Nature,310105111(1984)；Granted.(1992)SyntheticP印tides，AUsersGuide,ff.H.FreemanandCo.；美国专利6，974，884))。例如，与多肽片段对应的多肽可用肽合成仪合成，或用本领域已知的固相方法合成。此外，需要时，可将非典型氨基酸或氨基酸的化学类似物作为取代或添加而引入多肽序列。非典型氨基酸包括但不限于，常见氨基酸的D-异构体，2，4_二氨基丁酸，a_氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e_Ahx，6-氨基己酸，Aib，2_氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸(sarcosine)，瓜氨酸(citrulline)，同瓜氨酸，半胱磺酸(cysteicacid)，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，b-丙氨酸，氟-氨基酸，设计者氨基酸如b-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，和普通的氨基酸类似物。此外，所述氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)形。本发明的多肽可用标准方法从化学合成和重组细胞培养中回收并纯化，所述方法包括但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水相互作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和凝集素(lectin)层析。最优选，用高效液相层析(“HPLC")进行纯化。当多肽在分离和/或纯化过程中变性时，可以用熟知的蛋白再折叠技术来再生活性构象。本发明的肽或肽模拟物可以用广泛多种亲水聚合物中的一或多种进行修饰或与其共价结合，以提高该肽的溶解度和循环半衰期。适于与肽结合的非蛋白性质的亲水聚合物包括但不限于，聚烷基醚如聚乙二醇和聚丙二醇，聚乳酸，聚乙醇酸，聚氧烯(polyoxyalkene)，聚乙烯醇(polyvinylalcohol)，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素和纤维素衍生物，葡聚糖(dextran)，和葡聚糖衍生物。一般的，这类亲水聚合物平均分子量为约500-100，000道尔顿，约2，000-40,000道尔顿，或约5，000-20,000道尔顿。肽可以用这类聚合物衍生化，或与这类聚合物偶联，所用方法参见(Zallipsky，S.(1995)BioconjugateChem.,6150-165；Monfardini,C.,etal.(1995)BioconjugateChem.662-69；美国专利4，640，835；4，496，689；4，301，144；4，670，417；4，791，192，4，179，337，或TO95/34326)。脂质体的制备本领域已知多种制备脂质体的方法，其中一些可参见LichtenbergandBarenholz,MethodsofBiochemicalAnalysis,Volume33,337—462(1988)。小单层月旨质体(Smallunilamellarvesicles，SUV，大小<lOOnm)可联用前人记载(Tsengetal.，1999)的薄膜水合(thin-filmhydration)和反复挤压(r印eatedextrusion)的标准方法来制备。那些特别涉及脂质体封装DNA的制备方法，以及直接应用脂质体介导转染的方法，已由HugandSleightetal(1991)描述。脂质体制备方法也可参见美国专利6，355，267和6，663，885。特别有用的脂质体可通过用含有磷脂酰胆碱、胆固醇、和PEG化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物进行反向蒸发(reverse-phaseevaporation)来创建。挤压脂质体，使其穿过指定孔径的滤器，可产生具有所需直径的脂质体。脂质体也可以从市场上购买，来源例如台湾台北的台湾脂质体公司(TaiwanLiposomeCompany)。其它可购买到的脂质体包括TLC-D99，Lipo-Dox，Doxil,DaunoXome,AmBisome,ABELCET,transfectace(DDAB/D0PE)，禾口D0TAP/D0PE以及Lipofectin。本发明的脂质体最主要从磷脂制得，但也可以用具有相似分子形状和尺度、且既有亲水组分又有疏水组分的其它分子。为了本发明的目的，所有这类合适的能形成脂质体的分子在本文中都称为脂质。一或多种天然和/或合成的脂质化合物可以用于制备脂质体。脂质体根据所选的亲水基团的不同，可以为阴离子型、阳离子型、或为中性。例如，当采用带有磷酸根或硫酸根的化合物时，所得脂质体为阴离子型。当采用含氨基的脂质时，所述脂质体带有正电荷，为阳离子脂质体。适于形成本发明所用原始脂质体的代表性磷脂或脂质化合物包括但不限于，磷脂相关物质如磷脂酰胆碱(卵磷脂)，溶血卵磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)，心磷脂，磷脂酸(phosphatidicacid),脑苷脂(cerebrosides)、双十六烷基磷酸(dicetylphosphate)，磷脂酰胆碱，和二棕榈酰-磷脂酰甘油(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol).其它含有非磷基团的脂质包括但不限于，硬脂酰基胺(stearylamine)，十二烷基胺(dodecylamine)，十六碳烷基胺(hexadecyl-amine)，乙酰基棕榈酸酯(acetylpalmitate)，甘油蓖麻醇酸酯(glycerolricinoleate)，十六碳烷基硬脂酸酯(hexadecylsterate)，异丙基肉豆蔻酸酯(isopropylmyristate)，两性丙烯酸聚合物(amphotericacrylicpolymers)，脂肪酸，脂肪酸酰胺(fattyacidamides)，胆固醇，胆固醇酯，甘油二酯(diacylglycerol)，二酰基甘油琥珀酸酉旨(diacylglycerolsuccinate)，等等。用于本发明的脂质体制剂包括阳离子型(带正电)，阴离子型(带负电)，以及中性的制剂。脂质体主动装载(Remoteloading)化合物利用了跨膜梯度的形成(CehandLasic，1995)。该方法包括，将需要装载到脂质体中的化合物、硼酸化合物与悬浮脂质体一起保温，从而使该化合物在脂质体中积累(CehB.andLasicD.D.，1995；U.S.PatentNo.6，051,251)。磷酸分析(phosphateassay)可用于确定脂质体浓度。一种磷酸分析基于钼酸盐(molybdate)与孔雀绿染料(malachitegreendye)的相互作用。主要原理涉及无机磷酸与钼酸盐反应，形成无色非还原型钼酸磷复合物，该复合物在酸性条件下还原，变成蓝色复合物。钼酸磷当与孔雀绿复合时，色度增强20或30倍。终产物为还原型绿色可溶性复合物，通过620nm处的吸收值测量，其直接反映溶液中无机磷酸的水平。在一些实施方案中，脂质体与可药用载体、赋形剂、和稀释剂一起配制。这类可药用载体、赋形剂和稀释剂有广泛多种是本领域已知的，包括列在USPpharmaceuticalexcipientslisting(可药用赋形剂列表)中的那些。USPandNFExcipients,ListedbyCategories,p.2404-2406,USP24NF19,UnitedStatesPharmacopeialConventionInc.，Rockville,Md.(ISBN1-889788-03-1)可药用赋形剂，如载剂(vehicle),助剂(adjuvant)，载体(carrier)，或稀释剂都是公众很容易获得的。而且，可药用辅助物质，如PH调节和缓冲剂，渗透压调节剂，稳定剂，增湿剂等等，都是公众很容易获得的。合适的载体包括但不限于，水(water)，葡萄糖(dextrose)，甘油，盐水，乙醇，以及它们的组合。载体可包含额外的试剂如增湿或乳化剂，PH缓冲剂，或增强该配制剂效果的助剂。表面局部型载体(Topicalcarriers)包括液体石蜡(liquidpetroleum),异丙基棕榈酸酯，聚乙二醇，乙醇(95%)，聚氧乙烯单月桂酸酯(polyoxyethylenemonolaurate)(5%)水溶液，或十二烷基硫酸钠(5%)水溶液。其它物质如抗氧化剂，保湿剂(humectant)，粘度稳定剂(viscositystabilizer)，和类似的试剂可以根据需要添加。透皮增强剂如氮酮(Azone)也可以包括在内。在药物剂型(pharmaceuticaldosageform)中，本发明的组合物可以以它们的可药用盐形式施用，或者它们也可以单独施用或与其它药物活性化合物适当关联来用、以及与其它药物活性化合物组合施用。主题组合物按照可能施用的模式进行配制。治疗方法本发明含有治疗药物的肽或脂质体可以对需要治疗的受试者施用，方式是系统性注射如静脉注射；或在相关部位注射或施用，如直接向肿瘤中注射，或当所述部位在外科手术中暴露时直接施用在该部位；或表面局部施用，如当疾病位于皮肤上时。本发明的肽或脂质体可以作为单一疗法来用。或者，本发明的肽或脂质体可以与治疗癌症的标准化疗或放疗方案组合施用。本发明的肽可以用于将抗体靶向需要治疗的癌细胞。在一个实施方案中，对需要治疗的受试者施用本发明的肽，接着施用与该肽特异性结合的抗体。被靶向的抗体可以介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用或补体依赖性细胞毒作用，或者可以改变目标分子的根本功能(underlyingfunction)。这类抗体可以以抗体偶联物的形式来用，以便直接将有治疗效果的试剂运送至目标组织。这类试剂包括放射性核素、毒素、化疗药、和抗血管新生化合物。可以采用多种方式来用药，包括经口(oral)，面颊(buccal)，鼻(nasal)，直肠(rectal),φ(parenteral),Mfix.(intraperitoneal),f^J(intradermal),(transdermal)，T"(subcutaneous)，(intravenous)，l/Jc内(intra-arterial)，心内(intracardiac)，心室内(intraventricular)，卢页内(intracranial)，气管内(intratracheal)，和鞘内(intrathecal)用药等，或通过植入或吸入方式来用药。因此，本发明的组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂(tablet)、胶囊剂(capsule)、粉剂(powder)、粒剂(granule)、膏剂(ointment)、溶液、栓剂(suppositories)、注射剂、吸入剂、和气雾剂(aerosol)。以下方法和赋形剂仅为举例说明，无论如何都不能视为限制。合适的赋形剂载剂例如是，水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等，以及它们的组合。此外，需要时，载剂可含有小量辅助物质如增湿或如乳化剂或PH缓冲剂。制备这类药剂形式(dosageform)的真正方法是本领域技术人员已知或显而易见的。在任何时候，将要施用的组合物或配制剂都可以包含所述试剂，且其量足以在所治受试者中实现所需状态。本发明的脂质体或肽可以配制成注射制剂，方法是，将它们溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂中，所述溶剂如植物油或其它类似的油，合成的脂肪酸甘油酯，高级脂肪酸的酯或丙二醇；需要时，可含有常规添加剂如增溶剂，等渗剂，悬浮剂，乳化剂，稳定剂，和保存剂。其它口服或非胃肠道运送的配制剂也可以用，象本领域常规的那样。本发明的脂质体或肽可包含广泛多种已用于治疗癌症和抑制血管新生的药物中的一或多种，包括但不限于，长春瑞宾，顺钼，吉西他宾，紫杉醇，依托泊苷(etoposide)，Novantrone(米托蒽醌)，放线菌素D，喜树碱(camptothecin)(或其水溶性衍生物)，氨甲蝶呤，丝裂霉素(例如，丝裂霉素C)，达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)，环膦酰胺，和抗-瘤形成抗生素(anti-neoplasticantibiotics)如多柔比星禾口道诺霄素(daunomycin),或其它，例如DeVitaetal.，2001中所述。脂质体或肽可包含细胞毒药物、寡核苷酸、毒素、和放射活性分子。脂质体或肽还可包含(Ngetal.2006)中所述化合物如抗-VEGF适体。癌症疗法中用的药物可对癌细胞有细胞毒作用或细胞抑制作用(cytostaticeffect)，或者可以减少恶性细胞的增生。癌症治疗中用的药物也可以是肽。本发明的脂质体或肽可以与放疗联用。本发明的脂质体或肽施用时可以辅以(DeVita,etal.,(2001))中所述的治疗方法。在那些由本发明的脂质体或肽与第二种抗癌剂赋予抵抗癌细胞的协同效应的联用中，所述第二种试剂的剂量(dosage)可以比其单独施用时的标准剂量减少。增加癌细胞敏感性的方法包括，将本发明的脂质体或肽与有效增加癌细胞敏感性的量的化疗抗癌药共同施用。这种共同施用可以是同时施用或者不同时施用。本发明的脂质体或肽可以在治疗方案实施过程中与其它多种治疗剂一起施用。在一个实施方案中，将本发明的脂质体或肽和其它多种治疗剂先后施用。可以由医师根据诸如患者疾病性质和患者情况等因素来选择合适的时间过程(timecourse)。诊断方法对疾病特异性生物标志物的检测提供了有效的筛选策略。早期检测不仅实现早期诊断，而且在癌症的情况中，可以提供筛选多形性(polymorphism)以及检测术后残余肿瘤细胞和良性转移(occultmetastases)的能力，后者是肿瘤复发的早期指标。对疾病特异性生物标志物的早期检测因此可以在诊断前、治疗期间、以及好转期(inremission)改善患者的存活。本发明的肽可以用于疾病的诊断或预后。所述肽可以作为诊断剂用于多方面，包括但不限于ELISA、Western印迹、荧光、免疫荧光、免疫组化、或放射自显影。本发明的抗体也可以与本发明的肽组合用于检测癌症。在一些实施方案中，所述试验是结合试验，其检测抗体与结合至癌细胞的本发明肽的结合。所述多肽或抗体可以是固相化的，所述多肽和/或抗体可以带有能被检测的标记。例如，所述抗体可以被直接标记或被带有标记的第二抗体标记。这就是说，适用于抗体的可检测标记包括直接标记和间接标记，直接标记是对抗目标蛋白的抗体进行标记，间接标记是对识别该抗目标蛋白之抗体的抗体进行标记。在另一个实施方案中，所述肽包含标记(label)，该肽与组织的结合通过分析该标记的存在来检测。筛诜方法本发明提供了鉴定与本发明的肽结合的生物配体的方法。在一个方法中，本发明的肽可作为"诱饵蛋白"用于双杂交试验(two-hybridassay)或三方杂交试验(three-hybridassay)(参见例如，美国专利5，283，317；Zervosetal.(1993)Cell72223-232；Maduraetal.(1993)J.Biol.Chem.268:12046_12054；Barteletal.(1993)Biotechniques14920-924；Iwabuchietal.(1993)Oncogene81693-1696；andSuteretal.(2006)Biotechniques40:625-44)以鉴定其它与本发明肽结合或相互作用的蛋白。在另一方法中，本发明的肽与细胞提取物一起保温，由此鉴定出与本发明肽结合的分子。在一个方法中，本发明的肽被固定在固体支持物如HPLC柱上，在有利于本发明的肽与靶分子结合的条件下，使细胞提取物暴露于被固定的肽。洗脱并用标准技术如质谱鉴定所结合的分子。靶蛋白的亲和纯化从肺癌细胞提取蛋白，采用裂解缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.4,150mMNaCl,30ug/mlDNase,1%NonidetP-40，和蛋白抑制剂(Completetabs；RocheMolecularBiochemicals)4°C作用30min。将蛋白裂解物在15，000Xg离心20min，清除残渣。所述裂解物先在含有对照肽的1-ml柱上进行预清除(precleare)，将过柱液直接加载至第二个1-ml柱，其是固定了SP5-52或SP5-2肽的亲和柱。洗柱并进行洗脱。分离的蛋白的纯度通过SDS-PAGE(8%聚丙烯酰胺)监控，用银染色来观察。从凝胶上切取所需蛋白带，以备用胰蛋白酶进行胶内消化(in-geldigestion)。所得多肽进一步用质谱进行分析。实施例这些实施例只为举例说明本发明，不应被理解为以任何形式限制本发明，它们还描述和详细说明了上文所述本发明的各个方面和实施方式。实施例1.通过噬菌体展示进行生物淘选A549，CL1-5，H23，和H460细胞都在补加了2g碳酸氢盐，40mg/L卡那霉素，2mML_谷氨酰胺，和10%胎牛血清的RPMI1640中37°C、潮湿的95%空气和5%C02(v/v)气氛中培养。NPC-TW01，PC13，SAS，PaCa，NNM，和成纤维细胞都在含3.7g碳酸氢盐，40mg/L卡那霉素，2mML-谷氨酰胺，和10%胎牛血清的DMEM中、且37°C、潮湿的90%空气和10%C02(v/v)气氛中培养。NSCLC细胞CL1-5用不含血清的RPMI洗涤，然后用封闭缓冲液(不含血清、含BSA的RPMI)在4°C封闭30分钟。将细胞与经UV处理而灭活的对照辅助噬菌体(无插入子的噬菌体)在4°C保温lh。抑制非特异性结合后，添加噬菌体展示肽文库(NewEnglandBioLabs，MA，USA)，4°C保温lh。结合的噬菌体用裂解缓冲液(150mMNaCl,50mMTris-HClpH8.0,ImMEDTApH7.5，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS)在冰上洗脱。该洗脱的噬菌体集合物经扩增后，在大肠杆菌(Escherichiacoli)ER2738培养物(NewEnglandBioLabs,MA,USA)中确定滴度。用回收的噬菌体作为后续多轮淘选的起始物(input)。第5轮选择后洗脱的噬菌体在LB/IPTG/X-Gal平板上确定滴度。为确定噬菌体的滴度，在5mlLB中接种ER2738单菌落，保温振荡培养直至对数期中期(0D·0.5)。一旦培养物达到对数期中期，取200μ1培养物分散至多个微量离心管，其中每管加一种稀释物10μ1，然后将这些离心管快速涡旋，室温保温5分钟。感染的细胞一个个地转移至含有AgaroseTop(CambrexBioScienceRockland,Inc.,ME,USA)的培养管中，迅速混合，并马上倾入预热的LB/IPTG/X-Gal平板中。在96孔ELISA板(Falcon，CA，USA)上分别接种癌细胞和对照细胞。将细胞用不含血清的DMEM洗涤后，用封闭缓冲液封闭。将单个的噬菌体颗粒加至包被了细胞的板中，4°C保温2h，再与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的小鼠抗-M13单克隆抗体(Pharmacia，Sweden)保温，然后与该过氧化物酶的底物二氢氯酸邻苯二胺(0PD;Sigma，Germany)保温。该反应用微滴板读取仪在490nm读取结果。选出的噬菌体克隆进一步用DNA测序进行分析。纯化的噬菌体的DNA序列按照双脱氧核苷酸链终止法用自动DNA测序仪(ABIPRISM377,Perkin-Elmer,CA,USA)确定。测序用对应于PlII基因序列的引物5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3‘[SEQIDNO:21]进行。将噬菌体展示肽序列翻译出，用GeneticsComputerGroup(GCG)程序进行比对。经4轮生物淘选，从NSCLC细胞CL1-5洗脱的噬菌体的滴度比第1轮增加30倍，到第5轮增加至40倍(图1)。随机选取第3-5轮生物淘选富集的噬菌体进行测序。我们还对具有较高的CL1-5结合活性的噬菌体克隆进行了测序。噬菌体PC3-1，PC4-1，PC4-5，PC5-2和PC5-4展示共有基元色氨酸(W)-苏氨酸(T)/酪氨酸(Y)-酪氨酸(Y)(表1)。有趣的是，PC5-2出现在第3轮(PC3-1)、第4轮(PC4-1)、以及第5轮(PC5-2)生物淘选中。PC5-2在各轮生物淘选中的频率从第3轮的20%(1/5)增加到第5轮的90%(27/30)(表1)。我们的后续研究集中在肽TDSILRSYDffTY(SP5-2)上。实施例2.用免疫组化鉴定与癌细胞结合的噬菌体为研究PC5-2是否特异性结合NSCLC细胞，我们用免疫组化定位不同类型细胞中的噬菌体颗粒。将所有癌细胞系，NNM和成纤维细胞铺在盖玻片上，长至约80%铺满。将这些盖玻片与封闭缓冲液一起保温，用过氧化氢加0.1%NaN3处理，以封闭内源过氧化物酶活性，然后与每种选出的噬菌体4°C保温lh。盖玻片洗后，与HRP-标记的小鼠抗-M13单克隆抗体4°C保温lh。将玻片(slide)用3%甲醛固定lOmin，加过氧化物酶底物，用50%甘油的PBS液封藏。结果显示，PC5-2与NSCLC细胞系包括CL1-5和PC13特异性结合(图2A，箭头)。不展示该肽的对照辅助噬菌体不与CL1-5细胞结合。PC5-2也不能与其它癌细胞系如口腔24癌细胞(SAS)和鼻咽癌细胞(NPC-TW01)结合或与鼻粘膜的正常上皮细胞(NNM)结合(图2A)。比例尺10iim。为研究该合成肽与选出的噬菌体克隆是否竞争相同的结合位点，用免疫荧光染色法进行肽竞争抑制试验。合成目标肽10511^5￥011￥(55-2)[5￡0IDNO:2]和对照肽(RLLDTNRPLLPY)[SEQIDN0:22]，用Invitrogene，Inc.(CA，USA)的反相高效液相层析纯化至纯度>95%。由该公司将这些肽与FITC或生物素偶联，具体是将FITC或生物素添加到肽的NH2末端。CL1-5细胞在盖玻片上培养过夜，然后与经UV处理灭活的对照噬菌体在封闭液中预保温，以封闭非特异性结合。将噬菌体与不同浓度的合成肽混合，与细胞在4°C保温lh。这些玻片再与小鼠抗-M13单克隆抗体(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)保温，之后与FITC标记的山羊抗小鼠抗体(JacksonImmunoResearch)保温。玻片洗后，用封固剂(Vector,CA,USA)封固。然后在Leica多用途显微镜(Universalmicroscope)下对玻片进行检查。图像用SimplePCI(C-IMAGING,PA,USA)软件合并。结果显示，CL1-5细胞与PC5-2噬菌体结合的活性被SP5-2合成肽以剂量依赖方式抑制。27ug/mlSP5-2能彻底抑制PC5-2结合活性(图2B)，对照肽无此效果。在该试验中，对照噬菌体不能结合CL1-5细胞，PC5-2不能结合NPC-TW01(图2B)。比例尺:10umo此外，为研究CL1-5细胞表面表达的靶分子，我们用流式细胞术测量了PC5-2结合细胞。肺癌细胞系和其它癌细胞系培养过夜后，在含50mMEDTA的PBS中悬浮，用封闭缓冲液4°C封闭30分钟。细胞用流过缓冲液(flowbuffer,PBS含胎牛血清)洗2次，与噬菌体或FITC标记肽一起保温。为进行肽竞争抑制试验，将噬菌体与不同浓度的合成肽混合，将混合物与细胞一起保温。用冷的流过缓冲液洗2次后，结合噬菌体的细胞与抗-M13单克隆抗体4°C保温lh，再用FITC偶联山羊抗小鼠IgG抗体处理。将细胞用冷的流过缓冲液洗2次后，加载至流式细胞仪(BectonDickinson)。结果显示，42.6%的CL1-5细胞能被PC5-2结合(图2C，c)，结合的噬菌体被SP5-2肽彻底抑制(图2C，d)。PC5-2不结合SAS或正常上皮细胞(NNM)(图2C，e和f)。在该试验中，PC5-2也不结合NPC-TW01(图2C，b)。这些结果表明，部分CL1-5细胞表达能被PC5-2上展示的肽配体识别的未知蛋白或其它分子。实施例3.目标肽与NSCLC细胞和肺癌活检标本结合为确定展示在PC5-2上的肽序列确实与NSCLC细胞相互作用，我们用FITC-标记的SP5-2肽代替PC5-2噬菌体，进行用免疫荧光染色法实施的肽结合试验。结果显示，FITC-标记的SP5-2特异性结合不同NSCLC细胞系，包括CL1-5，H460,A549，PC13和H23，但不结合正常上皮细胞(NNM)。FITC标记的对照肽未显示这类结合活性(图3A)。比例尺10um。为进一步确认FITC-标记的SP5-2能结合这些NSCLC细胞系，我们还用流式细胞术测量了被SP5-2结合的细胞。样品按实施例2所述来制备。流式细胞术测量的直方图显示与各种NSCLC细胞系结合的FITC-标记的SP5-2(蓝)以及作为本底的FITC-标记的对照肽(红)。CL1-5，H460,A549,PC13和H23的结合活性比分别为43%，45.8%，44.3%，20.和44%(图3B)。这些结果表明，PC5-2和SP5-2能靶向NSCLC细胞。为进一步鉴别这种靶向性配体是否对人肺癌活检标本有亲和力，我们用免疫组化测试了PC5-2和SP5-2与肺癌患者肺腺癌的反应性。制备人肺腺癌切片，将其在封闭缓冲液中保温30min，再用3%过氧化氢加0.1%NaN3的甲醇液处理，以封闭内源过氧化物酶活性，然后与噬菌体克隆或经生物素标记的肽一起保温。PC5-2用HRP偶联抗-M13抗体以常规免疫组化染色来检测。结果揭示，PC5-2和生物素-标记的SP5-2能识别NSCLC活检标本中的肿瘤细胞(图3C，a和b，箭头)。而对照噬菌体以及经生物素标记的对照肽不能结合NSCLC活检标本(图3C，c和d)。这些数据表明，SP5-2识别NSCLC细胞系以及肺癌患者癌细胞表面表达的未知分子。比例尺25iim。实施例4.验证PC5-2的体内肿瘤归巢能力为研究PC5-2的体内靶向能力，将噬菌体注射至携有CL1-5衍生肿瘤的小鼠的尾静脉，灌注后进行回收。SCID小鼠背外侧(dorsolateralflank)皮下注射1X107癌细胞。携有同样大小的肺癌衍生肿瘤(肿瘤大小约500mm3)的小鼠从尾静脉注射靶向性噬菌体或对照噬菌体。注射完8分钟后，小鼠用二乙醚处理使其进入深度麻醉。然后给小鼠灌注50mlPBS以洗去未结合的噬菌体。取出对照器官(脑、心脏和肺)以及肿瘤实体，称重，用冷PBS-PI(蛋白酶抑制剂混合物片剂；Roche，Germany)洗3次。将器官和肿瘤样品勻浆。之后，添加0.5mlER2738细菌37°C保温30分钟，以便挽救(rescue)与肿瘤实体或对照器官结合的噬菌体。在有lmg/LIPTG/X-Gal存在时，在琼脂平板上对洗脱的噬菌体颗粒进行滴定。在肽竞争抑制试验中，将噬菌体与100yg合成肽一起注射。我们还用到对照肽。器官和肿瘤实体在Bouin液中固定2h，再将样品包埋在石蜡块中。将石蜡切片脱蜡，再水化，用M13单克隆抗体如上述进行免疫染色。我们测定了肿瘤实体和正常对照器官(脑、肺和心脏)中的噬菌体滴度。结果显示，PC5-2向肿瘤实体特异性归巢，其归巢浓度比向对照器官(包括脑、心脏和肺)归巢的浓度高4-13倍(图4A)。对照辅助噬菌体不显示对肿瘤组织的任何特异性靶向性(图4A)。PC5-2的肿瘤归巢能力进一步通过肽竞争抑制试验来验证，在该试验中，合成肽SP5-2与PC5-2共同注射显著抑制了从肿瘤实体回收噬菌体(图4B)。100微克SP5-2抑制92%的PC5-2与肿瘤实体结合，但相同浓度的对照肽(Con-P)无此抑制效果(图4B)。PC5-2的组织分布也通过免疫染色来研究。携有NSCLC异种移植物的SCID小鼠静脉注射PC5-2，取出该异种移植物和对照器官，固定后，定位噬菌体结合位点。结果显示，PC5-2定位在肿瘤组织中(图4C，d)。在高倍放大下，抗噬菌体的免疫反应性可见于肿瘤细胞的胞浆膜，并向周围胞质中扩散(图4C，e)。正常器官如脑、心脏、以及肺组织上无反应产物(图4C，a-c)，对照噬菌体处理过的肿瘤组织上也无反应产物(图4C，i)。在体内归巢试验中，PC5-2特异性靶向NSCLC异种移植物的能力被合成肽SP5-2抑制(图4C，j)。比例尺25ym。实施例5.用SP5-2-Lipo-Vin和SP5-2-Lipo-DoX治疗携有人肺癌异种移植物的SCID小鼠目前对老龄晚期NSCLC患者的标准化疗方法是用长春瑞宾进行单药化疗(Kellyetal.，2001)。为确定是否肺癌归巢肽SP5-2能用于改进该癌症治疗的化疗效果，我们将该肽与含长春瑞宾的脂质体偶联(SP5-2-Lipo-Vin)。将肽以11.5的摩尔比偶联至NHS-PEG-DSPE[N-羟基琥珀酰亚氨基-羰基-聚乙二醇(PEG；平均分子量3000)衍生的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(NOFCorporation，Tokyo,Japan)]。该偶联利用该肽N端的唯一游离氨基来进行，以产生肽基-PEG-DSPE。完成该反应，通过定量剩余氨基来证实反应的完成。氨基用TNBS(三硝基苯磺酸)试剂(HabeebAFSA,1966)来测量。由DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、胆固醇、PEG-DSPE组成的脂质体在硫酸铵溶液(250mM(NH4)2S04，pH=5.0，530m0s)中55°C水化，用高压挤压设备(LipexBiomembranes，Vancouver,BC,Canada)在60°C挤压穿过孔径为0.1Pm禾P0.05iim的聚碳酸酯滤膜(Costar,Cambridge,MA,USA)；将抗癌药长春瑞宾或多柔比星用主动装载法包裹在这些脂质体中，浓度为lmg药/lOymol磷脂。脂质体的终浓度用磷酸分析确定。将lml酸性异丙醇(81mMHC1)添加到0.2ml经稀释、并装载了药物的脂质体中，包裹到所述脂质体内的多柔比星的量用荧光分光光度计(HitachiF-4500,Hitachi,Ltd,东京，日本)以470nm的激发光波长和582nm的发射光波长来测定。囊的大小用超微粒子分析仪(submicronparticleanalyzer)(型号Mplus;CoulterElectronics,Hialeah,FL,USA)ilil云力H^Ht身寸(dynamiclaserscattering)HiJ胃。将肽基-PEG-DSPE与预制的脂质体在脂质双层的转变温度(transitiontemperature)以上的温度共保温之后，使肽基-PEG-DSPE转移至所述脂质体(Zalipskyetal.，1997)。每个脂质体有300-500个肽分子，按文献所述算得(Kirpotinetal.，1997)。4-6周龄小鼠背外侧皮下(s.c.)注射人NSCLC癌细胞。具有同样大小(约50100mm3)的肿瘤的小鼠随机分配至不同治疗组，用含长春瑞宾的SP5-2偶联脂质体(SP5-2-Lipo-Vin)或含多柔比星的SP5-2偶联脂质体(SP5-2-Lipo_Dox)、以及Lipo-Vin或Lipo-Dox通过尾静脉进行治疗。这些小鼠用所述药物治疗8次(lmg/kg，一周两次)。每周两次用测径器(calipers)测量小鼠体重和肿瘤大小。肿瘤体积用等式长X(宽)2X0.52来计算。肿瘤体积均值的差异用方差分析(AN0VA)进行评价。携有同样大小的NSCLC异种移植物(100mm3)的SCID小鼠，以长春瑞宾总量为48mg/kg(12次，2mg/kg,一周两次)的水平，分别用SP5-2-Lipo-Vin、Lipo-Vin和PBS通过静脉注射进行治疗。结果发现，接受SP5-2-Lipo-Vin的荷瘤小鼠组(图5A，组a)肿瘤大小显著小于Lipo-Vin组和PBS组(图5A，组b和组c)(P<0.005)。Lipo-Vin(LV)组的肿瘤增大，比SP5-2-Lipo-Vin(SP5-2-LV)组的大6.75倍。对照PBS组小鼠的肿瘤增大，比SP5-2-Lipo-Vin组的大25倍(n=6；*P<0.01)(图5A)。为评估化疗药可能引起的副作用，每周两次给小鼠称重。数据显示，SP5-2-Lipo-Vin治疗组的体重变化(增加1.37g)与PBS组的体重变化(增加1.33g)相似。但Lipo-Vin治疗组的体重增长较小(仅增加0.58g)(n=6；*p<0.05)(图5B)。为进一步确定靶向性脂质体的疗效，我们比较了分别经SP5-2-Lipo-Vin、Lipo-Vin或PBS治疗102天后的动物存活率。PBS治疗组的所有动物都死亡(存活率0%)。Lipo-Vin治疗组死3只(存活率40%)，SP5-2-Lipo-Vin治疗组的存活率显著增加，当试验在第102天终止时，其存活率达到80%(n=5；图5C)。为测试是否SP5-2能增加肺癌治疗力，我们将这种靶向性配体与另一种抗癌药多柔比星相连(SP5-2-Lipo-DoX)，用于治疗另一种NSCLC，即H460。多柔比星是最常用的抗癌药之一。已知这种化疗药除了对癌细胞有细胞毒作用以外，还具有抗血管新生活性(Arapetal.，1998)。数据显示，SP5-2-Lipo_Dox(SP5-2-LD)也比Lipo-Dox(LD)疗效好(n=6*p27<0.05)(图5D)。与PBS治疗组小鼠相比，靶向性脂质体SP5-2-Lipo-Dox显著抑制H460衍生肿瘤的生长(图5D)。这些结果表明，将Lipo-Vin或Lipo-Dox与靶向性配体SP5-2偶联增强了这些药物在动物模型中抑制人肺癌异种移植物的效力。表1.a噬菌体展示的共有氨基酸序列用粗体显示。PC3-UPC4-1和PC5-2展示相同的氨基酸序列。PC4-5和PC5-4展示相同的氨基酸序列。权利要求多核苷酸或其变体，选自SEQIDNO1，SEQIDNO3，SEQIDNO5，SEQIDNO7，SEQIDNO9，SEQIDNO11，SEQIDNO13，SEQIDNO15，SEQIDNO17，和SEQIDNO19。2.肽或其变体，选自SEQIDNO:2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10,SEQIDNO-.12,SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，和SEQIDNO:20。3.权利要求2的肽，其中所述肽包含SEQIDNO:2，或其变体。4.权利要求3的肽，其中所述肽包含SEQIDNO:2。5.融合肽，含有第一肽且该第一肽与第二肽融合，其中所述第一肽包含权利要求2的肽。6.权利要求3的融合肽，其中所述第二肽含有表位。7.权利要求2的肽，其中所述肽包含一或多种标记。8.权利要求7的肽，其中所述标记选自FITC，生物素，以及放射性同位素。9.权利要求2的肽，其中所述肽与一或多种选自下组的药物偶联多柔比星，长春瑞宾，寡核苷酸，毒素，抗-VEGF适体，以及放射活性分子。10.抗体，其与权利要求2的肽结合。11.脂质体，其含有至少一种按照权利要求2所述的肽。12.权利要求11的脂质体，其中所述肽包含SEQIDNO:2，或其变体。13.权利要求12的脂质体，其中所述肽包含SEQIDN0:2。14.权利要求11的脂质体，其中所述脂质体还包含至少一种选自下组的药物多柔比星，长春瑞宾，寡核苷酸，毒素，抗-VEGF适体，以及放射活性分子。15.权利要求14的脂质体，其中所述药物包含多柔比星。16.权利要求14的脂质体，其中所述药物包含长春瑞宾。17.权利要求14的脂质体，其中所述脂质体包含可药用载体。18.治疗哺乳动物的疾病的方法，包括给需要治疗的哺乳动物施用有效量的权利要求9所述肽。19.权利要求18的方法，其中所述哺乳动物是人。20.治疗哺乳动物的癌症的方法，包括给需要治疗的哺乳动物施用脂质体，所述脂质体包含一或多种化疗药物以及一或多种含权利要求2所述肽的多肽或其变体。21.权利要求20的方法，其中所述哺乳动物是人。22.权利要求20的方法，其中所述肽包含SEQIDNO:2，或其变体。23.权利要求22的方法，其中所述肽包含SEQIDNO:2。24.权利要求20的方法，其中所述化疗药物选自多柔比星，长春瑞宾，寡核苷酸，毒素，以及抗-VEGF适体，以及放射活性分子。25.权利要求24的方法，其中所述化疗药物是多柔比星。26.权利要求24的方法，其中所述化疗药物是长春瑞宾。27.权利要求20的方法，其中所述癌症是选自NSCLC和SCLC的肺癌。28.29.检测标本中的癌细胞的方法，包括a)在允许权利要求2的肽与所述标本中的癌细胞结合的条件下，将所述标本与权利要求2的肽接触；以及b)用权利要求10的抗体检测所述肽与所述标本中的所述癌细胞的结合。30.检测标本中的癌细胞的方法，包括a)在允许权利要求6的融合肽与所述标本中的癌细胞结合的条件下，将所述标本与权利要求6的融合肽接触；以及b)用特异于所述融合肽的表位的抗体检测所述融合肽与所述标本的结合。31.检测标本中的癌细胞的方法，包括a)在允许权利要求7的肽与所述标本中的癌细胞结合的条件下，将所述标本与权利要求7的肽接触；以及b)检测所述肽的标记。32.鉴定与权利要求2的肽结合的生物分子的方法，包括a)在允许形成含权利要求2所述肽以及配体的复合物的条件下，将细胞提取物与权利要求2的肽接触；以及b)分析该复合物，以便鉴定该配体。33.多核苷酸，其在严谨条件下与权利要求1所述多核苷酸或其变体的互补体杂交。34.载体，其含有权利要求1的多核苷酸。35.宿主细胞，其含有权利要求34的载体。36.肽，其由权利要求33的多核苷酸编码。全文摘要本发明提供核酸、肽、和抗体用于诊断和治疗。所述肽靶向肺癌，可通过噬菌体展示技术来鉴定。靶向性噬菌体PC5-2以及合成肽SP5-2都能识别肺癌患者的人肺肿瘤标本。在携带NSCLC异种移植物的SCID小鼠中，该靶向性噬菌体能特异性靶向肿瘤实体。当所述肽与含有抗癌药物长春瑞宾或多柔比星的脂质体偶联时，改进了这些药物抗人肺癌症异种移植物的效力，增加了存活率，减少了药物毒性。文档编号A61K9/127GK101878023SQ200880011890公开日2010年11月3日申请日期2008年2月12日优先权日2007年2月13日发明者吴汉忠,张德宽,林钦塘申请人:中央研究院;台湾大学