番石榴提取物的制作方法

专利名称：番石榴提取物的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及分离和纯化番石榴提取物和相关组合物的方法。
背景技术：
多酚广泛地分布于植物和主要的植物副产品中。超过5000种不同的多酚已被识 别确定，并且自然界中多酚预计的数量很可能超过其化合物的复杂程度。总之，多酚在植物 中以游离态多酚单体被发现(例如黄烷醇类，黄烷酮类，黄酮，花色素类)或者以聚合态单 宁被发现，如可水解单宁，单宁衍生物，或缩合单宁和原花青素。茶，水果和蔬菜的许多健康益处都归因于多酚。例如，绿茶多酚受到重视，不仅是 因为绿茶多酚在预防心脑血管疾病方面的能力，而且是因为其经证实的抗氧化特性，抗诱 变特性，抗癌特性，降血脂作用。文献资料中普遍对茶多酚有很好的描述。据报道，200mL 绿茶含有相当于140mg(-)_表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，65mg(-)_表没食子儿茶素 (EGC)，28mg(-)_表儿茶素没什子酸盐(ECG)和17mg (-)-表儿茶素。高含量的3，4，5_三羟 苯甲酰单元已经被证实与前列腺癌细胞和乳腺癌细胞中诱发的细胞凋亡，以及抑制脂肪酸 合成酶有联系。对肥胖人和遭受糖尿病痛苦的病人的研究显示，高甘油三酯血症与碳水化合物的 摄入有强烈的关系，很可能是由于糖酵解的代谢物经由再次脂肪形成过程，转化为脂肪。肥胖是由能量摄取和消耗之间的一种不平衡的结果所导致。过剩能量被存储在数 量扩大或增加的脂细胞中。此外，肥胖对于各种各样的疾病是一个很强烈的危险因素，诸如 高血压，高血脂，动脉硬化，高血糖和糖尿病。因此，预防肥胖的有效方法是抑制肠内的脂肪 吸收。近些年，人们发现与高血糖有关的有些疾病，特别是诸如I型和II型糖尿病，与二 肽基肽酶IV(DP-IV)的酶活性有关。DP-IV是一种具有766个氨基酸的膜_关联肽酶，其广泛地分布在各种各样的组织 中。DP-IV也以一种在血浆中可溶解的循环形式存在。在人和啮齿动物的血浆中的有效的 DP-IV活性是可检测的。膜关联DP-IV的第一生物学原理涉及细胞内信号传输通道。DP-IV 的第二主要生物活性是其在血浆中的酶机能。DP-IV的2位倾向具有氨基末端的脯氨酸或 丙氨酸的肽酶基质，但也可以在2位裂解具有非优选氨基酸的酶作用物。来自众多实验室 的观测结果描绘了 DP-IV失活调节激素的重要性，诸如作为GLP-I生物活性的一种关键决 定因素的胰高血糖素样肽_1( “GLP-1”)。个别DP-IV抑制剂已经被表征，并且它们看来似乎通过延长血浆中GLP-I和抑胃 肽(“GIP”)的作用，降低了糖尿病性的啮齿动物的血糖。通常这样的抑制剂不是来自天 然来源，并具有某些不必要的副作用。所以，需要一种组合物，其能够帮助减少一种或多种 普遍深入的条件，和/或一种方法，该方法可提供适合的组合物，尤其是来自天然存在的原 料。简要说明
本发明意外地提供了分离和/或纯化具有二肽基肽酶IV (DP-IV)抑制活性的番石 榴提取物。所述的番石榴提取物包括多酚，诸如黄酮醇。如今意外地发现，番石榴甙，黄酮 醇的化学分类的一员，作为一种DP-IV抑制剂是很有效的，因此，由于适合于DP-IV有关疾 病的治疗，本发明再现了这个化合物，也就是本发明所述的提取物。本发明也涉及制备所述番石榴提取物的方法。本发明进一步涉及通过服用治疗有效量的在此所述的番石榴提取物以治疗多种 疾病的方法。本发明也涉及一种药用组合物，其包括本发明所述的番石榴提取物和一种药剂学 上可接受的载体。因此，本发明进一步提供了来自所述番石榴提取物的，在治疗学水平上可生物利 用的多酚衍生物。虽然披露了多种具体方案，但根据下列详细描述内容，其它具体方案对于本领域 技术人员而言将仍是显而易见的。正因是显而易见的，本发明能够在不同方面进行改良变 换，而所有这些并不脱离本发明的主旨与范围。因此，详细说明部分应被视为说明性的而非 限制性的。


图1是合成抑制剂P32/98的剂量/响应抑制曲线。图2是本发明经分离的番石榴提取物的剂量/响应抑制曲线。图3表现了番石榴甙产生了 DP-IV的剂量依赖性抑制。图4表现了番石榴甙产生了 DP-IV的剂量依赖性抑制。图5提供了在经分离的番石榴提取物中发现的主要的槲皮素糖甙。图6表现了不同番石榴提取物成分的DP-IV抑制作用。详细描述葡萄糖诱导的胰岛素分泌是通过许多激素和神经递质进行调节的。具有特定影响 的是两种胃肠激素，胰高血糖素样肽-I(GLP-I)和抑胃肽(GIP)，两者都是促胰岛素分泌助 剂。促胰岛素分泌助剂可以促进胰岛素的合成或表达，或者产生促进胰岛素的合成或表达 的刺激。GLP-I是一种有效的肠促胰岛素分泌助剂，其加强了胰岛素分泌并明显降低了葡 萄糖水平，包括在I型和II型糖尿病中观测到的水平。GLP-I是通过肠L细胞，内分泌胰腺 的α-细胞，和大脑神经细胞中有选择性的组织-专门分裂形成的。GIP是在餐后的十二 指肠和最接近的空肠中合成并被释放的。它的释放依赖个别因素，包括膳食成分和在先存 在的健康状况。它最初是由于它的胃酸抑制特性被发现和命名的。然而，当对这个激素的 研究取得进展之时，更加相关的生理学角色已被阐明。明确地，GIP是一种促胰岛素分泌助 剂，对胰岛素合成和释放有刺激作用。二肽基肽酶IV (DP-IV，又名⑶26)是一种肽链端解酶，其有选择地裂解倒数第二 个N-末端脯氨酸和丙氨酸残基之后的肽。这种酶的内生的底物包括肠促胰岛素，诸如葡萄 糖依赖性促胰岛素分泌多肽，类似GIP和GLP-I。在有DP-IV存在下，这些激素被酶弱化至 非活性形式。GIP和GLP的非活性形式不能诱发胰岛素分泌，从而血糖水平升高，特别是在高血糖状态下。升高的血糖水平与许多不同的病理学相联系，包括糖尿病(1和2型)和糖 尿病并发症。DP-IV也被发现在T-细胞调节免疫反应中发挥作用，例如，在移植中。DP-IV的抑 制已经表现出延长同种心脏移植时间。另外，DP-IV的抑制有助于类风湿性关节炎的抑制。 DP-IV也被认为在HIV渗透进入T-细胞(T-辅助细胞)中具有作用。疾病，其特征表现为高血糖的疾病，包括诸如糖尿病，I和II型。糖尿病通常表现 为，胰腺β-细胞不能产生足量的激素。通常地，这些细胞合成并分泌胰岛素。在I型糖 尿病中，这种不足应归因于自身免疫处理过程对β-细胞的破坏。II型糖尿病主要是由于 β-细胞的不足和外围的胰岛素抗性的组合。糖尿病病人中，β-细胞数量减少，所以，不仅 存在关于β-细胞合成和释放生理学上的胰岛素的能力的关注，而且还有围绕这些产生胰 岛素的胰腺细胞的临界质量的关注。由于这些产生胰岛素的细胞的丧失，存在有一种涉及 胰腺的内分泌功能的菌株，例如，该内分泌功能产生胰岛素。由于胰岛素产量的衰减，起因 于高血糖症的病理过程可能加剧。传统的番石榴提取物，经常只用水或醇与番石榴原料制备得到，包含倍半萜烯，丹 宁，及其他组分，他们与目前公开的活性组分相联合，干扰DP-IV活性的抑制。意外地，本发 明提取工艺所述的分离和纯化，以及组分的浓度，以协同作用的方式，提高了 DP-IV抑制效 果，充分地去除了诸如倍半萜烯和丹宁这样多余的物质。通过术语“充分地去除”或“充分地分离”意指该提取物是通过自始至终详细的工 艺过程之一被纯化的。减弱DP-IV活性的污染物在处理过程期间从浓缩物中被方便地分 离，以提供一种提取组合物，其具有干扰DP-IV活性的番石榴原料的大多数组分。这样的组 分包括倍半萜烯和丹宁。通常，根据提取物的总重量，该浓缩物含有的倍半萜烯或丹宁中的 任何一个或两个小于大约10 %，优选倍半萜烯或丹宁中的任何一个或两个小于大约5 %， 更优选倍半萜烯或丹宁中的任何一个或两个小于大约1%，以及最优选倍半萜烯或丹宁中 的任何一个或两个小于大约0. 5%。因而，本发明提供了一种合成的浓缩物(提取物)，其含有活性组分的特定成分 (标准化的)。就是说，以1克该提取物(干物质)为基础，该提取物含有大约5-25毫克的 槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙，大约30-75毫克的槲皮素己糖甙，大约40-70毫克的甲基槲皮 素己糖甙，大约5-40毫克的异槲皮素甙，大约15-45毫克的桑色素戊糖甙，大约45-80毫克 的番石榴甙，和大约60-95毫克的槲皮素戊糖甙。更准确地说，以1克该提取物为基础，该提取物具有一个标准化成分，大约15-17 毫克槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙，大约50-54毫克的槲皮素己糖甙，大约50-56毫克的甲基 槲皮素己糖甙，大约18-21毫克的异槲皮素甙，大约26-29毫克的桑色素戊糖甙，大约63-68 毫克的番石榴甙和大约75-79毫克的槲皮素戊糖甙。在说明书和权利要求书中，术语"包括"和"包含"是开放式术语并应解释为" 包括，但不限于...“。这些术语包含进一步限制性的术语"实质上由...组成"和" 由...组成〃。必须注意的是，除非上下文以另外方式明确规定，如在这里和附加的权利要求书 中使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数内涵。术语〃 a" (〃 an")、〃一个或多 个〃和"至少一个"在这里也可以互换使用。也要注意的是术语"包含"、“包括"、“以...为特征"和"具有"可以互换使用。除非以另外方式限定，在这里使用的所有技术和学术术语，与本发明所属领域的 普通技术人员的普遍理解一样，具有相同的含义。在这里明确提到的所有出版物和专利，通 过引证的方式，处于全部目的，被合并为一个整体；这些目的包括描述和披露在可能与本发 明有联系的出版物上被报道的化学制品、仪器、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考 文献都将被用作指示所述领域的技术水平。在这里没有任何内容被推论为承认本发明没有 资格预料由于在先发明公开的所述内容。不同来源的番石榴果实是可接受的。虽然不被以下限制，但番石榴原料理论上可 以从诸如 Psidiumcattleianum, Psidium cattleianum ssp. Lucidum, Psidium guajava， Psidium guineense，Psidium littorale，Psidium molle or Psidium schiedeanum 植物 中得到。所述的术语“提取物“意指为从植物来源获得的番石榴提取组合物，比如叶片、嫩 枝、树皮、根、茎、种子、花、浆果、果实，比如，通过本文描述的分离方法。意外地发现，同番石 榴原料本身或冷冻干燥产品相比，番石榴原料的提取物含有提高的重量百分比的多酚，诸 如番石榴甙和槲皮素。理论上，番石榴果实的果肉和果汁可以使用。当使用叶片时，在提取 之前把叶片研磨成粉经常是最佳的。在研磨之前，可选择干燥叶片。番石榴甙被认为是槲皮素-3-0- α -L-arabinopyranoside，槲皮素的阿拉伯糖甙。
番石榴甙具有结构式 在其中，“Ara”是阿拉伯糖(0_ α -L-arabinopyranose)。更准确地说，番石榴甙具 有诸如(Ia)的结构 槲皮素(II)是一种类黄酮，更准确地说是一种黄酮! 槲皮素是许多其它的类黄酮糖甙的糖甙配基形式，诸如柑桔类水果中发现的芸香 甙，番石榴甙和槲皮素甙。因为直接抑制个别炎症的初始过程，槲皮素表现出显著的抗炎活 性。例如，它抑制了组胺和其它过敏/炎症介质的制造和释放。另外，它发挥了有效的抗氧 化活性和维生素C防护作用。槲皮素分别形成了槲皮素糖甙和连有鼠李糖的芸香甙(槲皮素-3-0-鼠李糖苷， IIa)和芸香二糖。 同样，槲皮素形成了带有阿拉伯糖的番石榴甙。在其它方面，结构式II中邻近色 酮羰基的烯醇_羟基可以是0- β -D-吡喃葡萄糖基，0- β -D-吡喃半乳糖基，0- α -L-吡喃 阿拉伯糖基(番石榴甙)或者0-α-L-吡喃鼠李糖糖基。本发明涉及一种经分离的番石榴提取物，其包括与槲皮素相关的黄酮醇糖甙，包 括槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙，槲皮素己糖甙，甲基槲皮素己糖甙，异槲皮素甙，桑色素戊 糖甙，番石榴甙和槲皮素戊糖甙。一方面，以该提取物的总重量为基础，该经分离的番石榴 提取组合物含有至少大约30%重量份的黄酮醇糖甙。另一个方面，该经分离的番石榴提取物中含有大约30%重量份的槲皮素黄酮醇糖 甙，大约95%重量份可归因于槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙，槲皮素己糖甙，甲基槲皮素己糖 甙，异槲皮素甙，桑色素戊糖甙，番石榴甙和槲皮素戊糖甙。因而，利用结构式III
(III)
R依下列各项被定义
槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙包括一个阿拉伯葡萄糖，对于R 槲皮素己糖甙包括一个己糖，对于R 番石榴甙包括一个阿拉伯糖，对于R 槲皮素戊糖甙包括一个戊糖，对于R 其中，术语己糖和戊糖不表示该糖甙的特定立体化学结构[ 例如，槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙具有结构式(IIIa)
槲皮素己糖甙具有结构式(IIIb)
槲皮素戊糖甙具有结构式(IIIc)
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甲基槲皮素己糖甙如结构式IV所表示 在其中，R1是一未定义立体化学结构的己糖，R2，R3，R5或R7中任何一个是一甲基 并且其它是氢原子。因为难以测定R2/R3/R5/R7的哪个羟基被甲基化，所以甲基槲皮素可能是异构体的 混合物。例如，甲基槲皮素己糖甙具有结构式(IVa)，其中R2是一甲基并且其余R基团全部为氢。 异槲皮素甙如结构式V所表示
其中，R是葡萄糖；因此槲皮素-3-0-葡萄糖甙。 异槲皮素甙具有结构式(Va) 桑色素戊糖甙如结构式VI所表示 其中，R是未定义立体化学结构的戊糖。一方面，桑色素戊糖甙可以是(Via) 本发明所述的经分离的番石榴提取物的另一方面，番石榴甙大于提取物的黄酮醇 糖甙的总量的大约5%重量份，并且槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙大于提取物的黄酮醇糖甙的总量的大约10%重量份。本发明所述的经分离的番石榴提取物的另一个方面，以提取物的总重量为准，槲 皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙为大约15-17%重量份，槲皮素己糖甙为大约50-54%重量份，甲 基槲皮素己糖甙为大约50-56%重量份，异槲皮素甙为大约18-21%重量份，桑色素戊糖甙 为大约26-29%重量份，番石榴甙为大约63-68%重量份以及槲皮素戊糖甙为大约75-79%
重量份。另一个方面，槲皮素戊糖甙或桑色素戊糖甙的百分比范围有可能是相反的。该番 石榴提取物通常是由溶剂提取得到，溶剂选自脂族醇，例如，乙醇，甲醇，丙醇，丁醇，依此类 推，丙酮，己烷，氯仿，乙酸乙酯，石油醚，它们的混合物和/或它们与水的混合物。尤其是， 番石榴原料的乙醇萃取物可以通过乙醇或乙醇与水的混合物制备。该醇/水比例可以在大 约99%至大约重量份之间，以其中所有可能的百分比变化。一方面，乙醇/水的比例大 约是80% -20%重量份。一方面，该活性组分的提取是在升高温度条件下进行，就是说，高于室温。通常， 该提取混合物在大约30°C -80°C之间被加热，优选在大约40°C -70°C之间，更优选在大约 450C _65°C之间，也就是，在大约60°C _62°C之间。通常，该提取混合物在必需的温度下加热 大约1-5小时一段时期，优选大约2-4小时，更优选大约2小时。依照本发明，该经分离的番石榴提取物含有至少一种多酚化合物，诸如番石榴甙， 和通常的槲皮素。一方面，本发明所述的经分离的番石榴提取物提供了至少大约30 %，50 %，75 % 或以上，90%或以上，以及甚至95%或以上的多酚。依照本发明应用的提取物可以含有大 约0. 5%重量计或更多的番石榴甙，优选大约10-50%重量份。典型地，该提取物含有大约 2% -4%重量计的番石榴甙。另一个方面，本发明所述的经分离的番石榴提取物可含有槲皮素。低聚态和聚合态多酚差别在于它们的稳定性。在热水中水解至基本结构的多酚， 被称为可水解丹宁。只在强酸存在下水解的多酚，被称为衍生丹宁或缩合丹宁。多酚存在“游离的”(单体的)和“结合的”(低聚态/聚合态)形式。本发明所述的番石榴提取物，相比来自果汁/叶片/茎干等等的番石榴汁或者番 石榴浓缩物，显示了对DP-IV较高的抑制作用。因此，含有增加数量多酚的番石榴提取物， 诸如番石榴甙和槲皮素，被发现具有一种很好的针对DP-IV的抑制活性。如贯穿本说明书 所述，番石榴原料的独特处理方法提供了具有这种特性的独特的番石榴提取物。本发明所 述的经分离的番石榴提取物可以用来治疗包括葡萄糖代谢紊乱在内的疾病，诸如肥胖，高 脂血症，高血压，动脉硬化和多尿症，糖尿病。这些疾病已经被证明与DP-IV的活性有关系。此外，依照本发明使用的番石榴甙和/或番石榴提取物可以用作其它治疗学目 的，例如降低低密度脂蛋白胆固醇，作为抗氧化剂，作为止痛剂，和作为止血剂，例如解除与 妇女月经相联系的疾病。DP-IV是二肽基蛋白酶IV，是一种具有766个氨基酸的膜关联肽酶，其广泛地分布 在许多组织中。作为现有技术，DP-IV在血浆中也作为一种可溶解的循环形式存在。DP-IV同类酶包括那些对胰岛素具有特效的酶。在一典型方法中，本发明的番石榴提取物可以通过大概包含以下步骤的过程工艺分离得到粉碎，例如，将Psidium guajava的叶片粉碎至细粉。叶片可以是新鲜的或是干燥 的。在某些情况下，优选干燥的叶片，因为它们更易于储存。粉末状的番石榴原料然后在高温下用乙醇和水提取。提取溶剂的温度保持在大约 50-80C之间该溶剂可以是乙醇和水的混合物，具有乙醇/水的百分比从大约0% (水)至 大约95%乙醇。通常，提取周期在高温下为大约1小时到5小时之间，溶剂与粉末状的番石 榴原料的比例在大约5至大约10(按重量计)之间。有代表性的，该混合物被过滤以除去 固体。该过滤步骤可以伴随有所属领域内的已知方法，包括重力过滤，使用微孔滤器，膜过 滤或超滤。该固体的提取可以重复若干次，滤液可以合并。最后，滤液在减压下被浓缩直至除 去乙醇产生浓缩物。该浓缩物然后离心除去不溶解杂质，以获得澄清液体。该澄清液体被装入用大孔树脂填充的色谱柱。在某些方面，大孔树脂是疏水的。通 过用水洗涤树脂，杂质被进一步分离。然后，通过用乙醇处理树脂并收集乙醇洗脱液，该活 性组分得以解吸。该洗脱液在减压下被浓缩，以产生所述的番石榴提取物。可选择地，用树脂处理并用水和乙醇洗涤后，收集到的该番石榴提取物，可以用聚 酰胺树脂和水进一步处理，以进一步除去杂质。在减压下浓缩产生了番石榴提取浓缩物。可选择地，该番石榴提取浓缩物可以进一步被纯化，借助于将该浓缩物通过一种 具有大约0. 2-2微米之间孔径的多孔的膜，或借助于超滤。上述一个或多个步骤被排除，重复，或被改变顺序，应该是可以理解的。典型地，该经分离的番石榴提取物借助于不同的方法被浓缩，以提供一种富集活 性组分的溶液，诸如多酚。例如，借助于分子量隔断，超滤可用于除去多余的组分。来自过 滤的保留物可以作为液体储存，或者，例如，然后可进一步被浓缩至粉末，借助于喷雾干燥， 冷冻干燥，气流干燥，流化床干燥，环式干燥，盘式干燥，真空干燥，高频干燥或微波干燥。最 后，该提取物应该包含至少10%按重量计的多酚成分。因此，该提取物包含多酚衍生物和可 选择的其它植物物质，诸如其它类黄酮，糖等等，其提供了具有抑制DP-IV活性的能力。该番石榴提取物可以进一步纯化，通过一种或多种所述领域已知方法，诸如色谱 法，凝胶色谱法，高效液相色谱法，结晶，亲和色谱法，分配色谱法，诸如此类。特定多酚的鉴 定可以通过为本领域技术人员所知的方法实现，包括1H NMR,化学降解，色谱和光谱，尤其 是同核和异核二维NMR技术，用于表征该经分离的多酚化合物。术语“纯化的”或者“分离 的”被用于提及来自如上所述番石榴提取物的一种或多种多酚化合物的纯化和/或分离。再 次应用本领域已知的常规方法，该番石榴提取物的不同组分可被分离成为纯化的物质。本 发明的一个实施例中，通过本领域已知技术，该提取物的多酚被充分地纯化和分离。该纯化 的化合物的纯度按重量计算，通常是至少大约90 %，优选至少大约95 %，最优选至少大约 99%，并且甚至更加优选至少大约99. 9% (例如，大约100% )。因此，本发明进一步提供了可生物利用的，经分离的番石榴提取组合物，其被用于 治疗在此记录的各种各样的痛苦。该番石榴提取物可以通过许多下文论述的方法服用。本发明所述的组合物可以加入不同的食物，饮料，小吃等等。一方面，该组合物可以在食用之前，被喷洒在食品上。如果喷洒在食品上，一种适合的载体，诸如淀粉，蔗糖或乳 糖，可用于帮助分散该番石榴提取物的浓度，使其更容易适用于该食品。本发明所述的组合物也可以在不同的预制食品中，作为添加剂被提供。针对本申 请的该目的，预制食品意指任何天然食品、加工食品、日常饮食或非日常饮食食品，其中已 经添加了本发明所述的组合物。本发明所述的组合物可以直接被合并进入许多预制好的日 常饮食食品，包括但不限于日常饮食饮料、饮食棒和预制好的冰冻食物。此外，本发明所述 的组合物可以被合并进入许多预制好的非日常饮食产品中，包括但不限于糖果，快餐产品， 诸如炸马铃薯片，预制好的肉类产品，乳制品，奶酪，酸奶，运动食品，蛋黄酱，色拉味调料， 面包和任何其它含有脂肪或油的食物。如本说明书中使用的，术语“食品”指的是适于人或 动物消费的任何物质。本发明所述的组合物可以被添加至不同的饮料，诸如果汁、奶昔、乳制品等等。此外，依照本发明所使用的番石榴甙和/或所述的番石榴提取物可以与其它植物 提取物混合，如同，例如，来自苦瓜，桑叶，和大花紫薇叶的提取物。优选的服用方法是口服。本发明所述的组合物可以用适合的载体制成配方，适合 的载体如淀粉、药片中的蔗糖或乳糖、胶囊、溶液、糖浆和乳剂。本发明所述的药片或胶囊可 以用肠溶衣包覆，该肠溶衣溶解于PH值大约为6. 0-7. 0的环境。适合的肠溶衣是醋酸纤维 素，其在小肠溶解但不在胃里溶解。进入软胶囊中的，本发明所述组合物的配方可以通过许多本领域已知方法实现。 所述配方经常包含一种可接受的载体，如油，或其它悬浮剂或乳化剂。适合的可选择的载体包含但不限于，例如，脂肪酸，其来自任何来源的酯和盐，不 受限地包括天然的或合成的油，脂肪，蜡或者它们的组合。此外，所述的脂肪酸可以不受限 地来自非氢化的油，部分氢化的油，完全氢化的油或者它们的组合。非限制性的脂肪酸(他 们的酯和盐)的典型来源包含植物油，鱼油或海洋生物油脂，加拿大低酸菜籽油，植物油， 红花油，葵花油，旱金莲种子油，芥菜籽油，橄榄油，芝麻油，豆油，玉米油，花生油，棉花子 油，米糠油，巴巴苏棕榈果油，棕榈油，低芥酸菜籽油，棕榈仁油，羽扇豆油，椰子油，亚麻籽 油，月见草油，荷荷巴油，小麦胚油，动物脂，牛脂，黄油，鸡油，猪油，乳品乳脂，牛油树脂或 它们的。具体的非限制性典型的鱼油或海洋生物油来源包含甲壳水生动物油，金枪鱼油， 鲭鱼油，鲑鱼油，鲱鱼油，凤尾鱼油，青鱼油，鳟鱼油，沙丁鱼油或者它们的组合。特别地，所 述脂肪酸的来源是鱼油或海洋生物油(DHA或EPA)，豆油或亚麻籽油。另外，或与上述被确 定的载体之一结合，蜂蜡能被用做适合的载体，以及诸如硅石(二氧化硅)的悬浮剂。术语“保健食品”在所述的领域是公认的并被用来描述食物中具体的化合物，其可 以预防疾病或改善不良状况。本发明所述的配方可以进一步包含不同的组分以帮助促使稳定，或者帮助促进本 发明有益组合物的组分的生物利用率，或者作为辅助营养素进入个人的日常饮食。适合的 添加剂可以包含维生素和生物学上可接受的矿物质。维生素的非限制性实例包含维生素A， B族维生素，维生素C，维生素D，维生素E，维生素K和叶酸。矿物质的非限制性实例包含铁， f丐，镁，钾，铜，铬，锌，销，碘，硼，硒，猛，它们的衍生物或者它们的组合。这些维生素和矿物 质可以不受限制地来自于任何来源或者来源的组合。非限制性的B族维生素不受限制地包含硫胺，烟雾胺，吡哆醇，核黄素，氰钴维生素，生物素，泛酸或它们的组合。不同的添加剂可以被合并进入本发明组合物。本发明组合物的可选择的添加剂不 受限制地包含，透明质酸，磷脂，淀粉，糖，脂肪，抗氧化剂，氨基酸，蛋白质，调味品，着色剂， 水解淀粉和它们的衍生物或它们的组合。如本说明书中使用的，术语“抗氧化剂”在本领域中是公知的，指的是那些阻止或 延迟化合物的氧化变质的合成或天然物质。典型的抗氧化剂包含生育酚，类黄酮，儿茶酚， 过氧化物歧化酶，卵磷脂，Y-谷维素；维生素，诸如维生素A、维生素C(抗坏血酸)和维生 素E和β-胡萝卜素；天然组分，诸如在迷迭香和山楂提取物中发现的鼠尾草酚，鼠尾草酸 和迷迭香酚，诸如在葡萄籽或松树皮提取物以及绿茶提取物中发现的原花色素。包含本发明所述的番石榴提取组合物可以通过传统方法制得，如混合，溶解，造 粒，糖衣丸制造，研磨成粉，乳化，制成胶囊，包埋或升华干燥过程。所述组合物可以使用传 统方法配制，利用一种或多种生理学上可接受的载体，稀释剂，赋形剂或辅助剂，以便于将 该番石榴提取组合物制成能被使用的配制品。本发明所述的组合物可以采取适于任何有效服用方式的形式，包括，例如，口服， 口腔用药，内吸收，注射，透过皮肤起作用，直肠吸收，阴道吸收等等，或者适于通过吸入或 者注气服用的形式。内吸收的配方包含那些用于注射给药的设计，例如，皮下注射，静脉注射，肌肉注 射，鞘内注射或腹腔内注射，以及那些设计用于透过皮肤起作用的用药方式，经粘膜吸收， 口服或肺部吸收的用药方式。有效的注射用配制品包含含水媒介或油性媒介中的所述的番石榴提取组合物的 无菌的悬浮液，溶液或乳剂。所述的组合物也可以包含复配助剂，诸如悬浮剂，促稳定剂和/ 或分散剂。所述用于注射的配方可以单位剂量形式存在，例如，安瓿或multidose容器，并 可包含添加的防腐剂。另外，所述注射用配方可以粉末形式提供，用于在使用前和适合的媒介物一起恢 复原状，包括但不限于，无菌无热原的水，缓冲溶液，葡萄糖溶液等等。最后，所述的番石榴 提取组合物可以通过任何的已知的技术被干燥，诸如冻干法，并在使用前恢复原状。对于经粘膜吸收用药，适于透过屏障的渗透剂被用于所述的配方。这样的渗透剂 在所属技术领域中是已知的。对于口服，本发明的组合物可以采取锭剂，片剂或胶囊的形式，例如，通过传统方 法和药学上可接受的赋形剂进行制备，所述的赋形剂诸如粘合剂(例如，预糊化玉米淀粉， 聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；装填物(例如，乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润 滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石或硅石)；分解质(例如，马铃薯淀粉或羟基淀粉乙酸钠)；或者 润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。所述片剂可以通过所属领域众所周知的方法，例如，用 糖，薄膜或肠溶衣包覆。用于口服的液体药剂可以采取例如酏剂，溶液，糖浆或悬浮液的形式，或者它们可 以作为一种干燥的产品存在，在使用前与水或其它适合的媒介物还原配制。这样的液体药 剂可以通过传统方法与药学上可接受的添加剂制备得到，所述的添加剂如悬浮剂(例如， 山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶)；非 水媒介物(例如，杏仁油，油酯，乙醇，或精馏植物油)；以及防腐剂(例如，甲基或丙基P-羟基安息香酸盐或山梨酸)。所述的配制品也可以酌情包含缓冲盐，防腐剂，调味品，着色剂和 甜味剂。用于口服的配制品可以按照众所周知的方式，适当地配制，以实现番石榴提取组 合物的受控释放。对于口腔用药，所述的组合物可以采取片剂或锭剂的形式，以传统方法配制而成。对于直肠和阴道途径的用药，番石榴提取组合物可被配制为溶液(用于保留灌肠 法)，栓剂或膏剂，其含有传统的栓剂基质，诸如可可脂或其它甘油酯。对于鼻部给药或者通过吸入或吹入的给药，所述的番石榴提取组合物可以借助于 适合的抛射剂，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，碳氟化合物，二氧化碳或 其它适合的气体，从密封容器或喷雾器中以气溶胶喷射的形式，被方便地传递。就加压气雾 剂而言，所述的剂量单位，可以通过提供一个阀来决定所释放的计量数量。供吸入器或吹药 器(例如由凝胶组成的胶囊和药盒)用的胶囊和药盒可以复配含有粉末混合物，该粉末混 合物由所述化合物和适合的粉末基料组成，诸如乳糖或淀粉。为了持续传递，所述的番石榴提取组合物可以作为用于植入给药或肌肉注射给药 的储存制品被配制。所述的番石榴提取组合物可以与适合的聚合材料或者疏水材料(例 如，在可接受的油中作为乳剂)或离子交换树脂，或者作为微溶的衍生物，例如，作为一种 微溶的盐，进行配制。另外，作为一种吸盘或膜片制造的透过皮肤起作用的输送系统能被使 用，其缓慢释放所述番石榴提取组合物用于经皮吸收。至此，渗透增强剂可用于促进所述 番石榴提取组合物的皮肤渗透。适合的皮肤膜片被描述在例如美国专利5，407，713 ；美国 专利5，352，456 ；美国专利5，332，213 ；美国专利5，336，168 ；美国专利5，290，561 ；美国专 利5，254，346 ；美国专利5，164，189 ；美国专利5，163，899 ；美国专利5，088，977 ；美国专利 5，087，240 ；美国专利 5，008，110 ；和美国专利 4，921，475。另外，可以采用其它的传递系统。脂质体和乳剂是被熟知的传递载体，其可用于传 递番石榴提取组合物。确定的有机溶剂，诸如二甲亚砜(DMSO)，也可以被采用，虽然通常以 较大的毒性为代价。所述的组合物，如果需要，可以存在于一种包装或者分配器装置中，其可以包含一 种或多种含有所述番石榴提取组合物的单位剂量型式。所述的包装可以，例如，含有金属或 者塑料薄片，诸如泡罩包装。所述的包装或分配器装置可以附有药的服用说明。软凝胶或软胶胶囊可以被制备，例如，不受限制地，通过在适当的媒介物(例如， 米糠油和/或蜂蜡)中分散所述成分，以形成一种高粘度混合物。然后这些混合物与凝 胶一同被做成胶囊，基于软凝胶工业技术人员所知的薄膜应用技术和机械设备。所述胶囊 成型后被干燥至恒重。典型地，所述胶囊的重量大约在100-2500毫克之间，优选在大约 1500-1900毫克之间，更准确地说在大约1500-2000毫克之间。例如，当制备软凝胶壳时，所述的壳可以包含大约20-70%的凝胶，通常还有增塑 剂和大约5-60%按重量计算的山梨醇。所述软胶胶囊的充填料是液体(主要是载体，诸如 米糠油或者小麦胚油和/或蜂蜡，如果需要的话)并可以包含除所述稳定化花色素甙组合 物以外的亲水性的基质。所述亲水性基质，如果存在的话，是具有大约200-1000平均分子 量的聚乙二醇。进一步的组分可选择的是增稠剂和/或乳化剂。在一个实施例中，所述的 亲水性基质包括具有大约200-1000平均分子量的聚乙二醇，5-15%的甘油，和5-15%按重量计算的水。所述聚乙二醇也可以搀杂丙二醇和/或碳酸丙烯。在另外实施例中，所述的软凝胶胶囊是从凝胶、甘油、水和不同添加剂制备得到 的。典型地，所述凝胶的百分比(按重量计算)在大约30-50%之间，优选为大约35-15之 间，更优选大约42%。所述配方包括大约15-25%重量百分数之间的甘油，更优选的在大约 17-23%重量百分数之间，以及最优选的为大约20%重量百分数甘油。所述胶囊的剩余部分典型地是水。该数量在大约2 5-40%重量百分数之间变化， 更优选在30-35%重量百分数之间，最优选为大约35%重量百分数。该胶囊的其他部分通 常可以在大约2-10%重量百分数之间变化，由调味剂、糖、着色剂、等等或它们的组合组成。 在该胶囊加工之后，最终胶囊的含水率经常是在大约5-10重量百分数之间，更具体的在大 约7-12重量百分数，更准确地说在大约9-10重量百分数之间。至于制造，标准软壳胶囊制造技术可用于制备该软壳产品是可预期的。有效的制 造技术的实例是平板法，R. P. Scherer开创的旋转冲模过程工艺，应用Norton胶囊设备的 过程工艺，以及Accogel设备和Lederle开发的过程工艺。这些过程工艺每个都是成熟技 术，并对任何一个希望制备软胶胶囊的人，都可广泛得到。所述乳化剂可用于促进溶解软胶囊内的组分。表面活性剂、乳化剂、或泡腾剂的特 定例子包括D-山梨醇、乙醇、角叉菜胶、聚羧乙烯、羧甲基纤维素钠、瓜耳豆胶、甘油、脂肪 酸甘油酯、胆固醇、白蜂蜡、丁二酸二辛基磺酸钠、蔗糖脂肪酸酯、十八醇、硬脂酸、聚氧乙烯 (40)硬脂酸盐、失水山梨醇倍半油酸酯、鲸蜡醇、明胶、失水山梨醇脂肪酸酯、滑石、失水山 梨醇三油酸酯、石蜡、马铃薯淀粉、羟丙基纤维素、丙二醇、丙二醇脂肪酸酯、果胶、聚氧乙烯 (105)聚氧丙烯(5)乙二醇、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)乙二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油、 聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚山梨酸酯20、聚 山梨酸酯60、聚山梨醇酯80、聚乙二醇400、辛基十二醇肉豆蔻酸酯、甲基纤维素、失水山梨 醇单油酸酯、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单棕榈酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、十二烷基 二甲胺氧化物溶液、十二烷基硫酸钠、聚桂醇、干燥碳酸钠、酒石酸、氢氧化钠、精制大豆卵 磷脂、大豆卵磷脂、碳酸钾、碳酸氢钠、中链甘油三酸酯、柠檬酸酐、棉籽油-大豆油混合物， 和液体石蜡。本发明也提供了已包装制剂，其包括本发明所述组合物以及该产品在适当条件下 的使用说明书。典型情况下，无论其以什么形式，该已包装制剂是用于有使用需要的个体。 典型情况下，其剂量要求为一天大约1到大约4次用量。虽然本发明描述了本发明所述组合物用于治疗不同的症状的软胶囊制剂、使用、 制造和包装，但不应认为其仅限于软胶囊。本发明可吸收的组合物可以以如上所述的传统 的片剂、丸剂、锭剂、酏剂、乳液、硬胶囊、液体、悬浮液等剂型传递。本发明所述的番石榴提取组合物，或者它们的组合物，通常以一定有效剂量用于 完成所述的预期结果，例如以一定有效剂量治疗或者预防与发炎有关的症状。所述的组合 物可以有疗效地服用以实现治疗学目的，或者预防性地实现预防疾病的目的。依据治疗目 的，是指被处理的潜的紊乱的根除或者改善，和/或一个或多个与潜在紊乱有联系的症状 的根除或者改善，以使该病人报告在感受或症状上的改善，尽管该病人仍可能经受该潜在 紊乱的折磨。例如，不仅当该潜在症状被根除或改善时，而且当该病人报告与病痛有关的身 体不适的严重程度或持续时间减小时，本发明组合物的服用，对遭受病痛折磨的病人提供了治疗学的效益。对于预防性用药，该组合物可用于处于发展为前述症状之一的风险中的病人。该组合物服用的剂量将依赖多种因素，包括，例如，接受治疗的特定征兆，给药方式，无论所期望的效果是预防性的还是治疗性的，接受治疗的征兆的严重程度以及病人的 年龄和体重等等。有效剂量的确定处于所属领域技术人员的能力范围之内。番石榴提取组合物的总剂量将代表性地处于0. 0001mg/kg/天或0. OOlmg/kg/天 或0. 01mg/kg/天到100mg/kg/天范围之内，但是，根据其它因素中的组分活性、其生物利用 率、给药方式以及上述讨论过的多种因素，其可以更高或更低。用药剂量和间隔可单独调 整，以使所述化合物的血药浓度足以维持治疗性或预防性效果。例如，根据其他情况中的 给药方式、被治疗的特定适应症和医嘱，所述化合物可以每周服用一次，每周服用数次(例 如，每隔一天)，每日服用一次或每日服用多次。所属领域技术人员不需要非常规实验就可 以优化有效局部用量。下列从1至56连续计数的段落规定本发明的各个方面。在一个实施例中，在起 始段落(1)，本发明提供了一种经分离的番石榴提取物，含有至少大约30%重量份的槲皮 素相关的黄酮醇糖甙，以该提取物总重量计，含有槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙，槲皮素己糖 甙，甲基槲皮素己糖甙，异槲皮素甙，桑色素戊糖甙，和槲皮素戊糖甙。2.段落1所述的经分离的番石榴提取物，其中所述的槲皮素黄酮醇糖甙构成了所 述提取物总重量的95%重量份。3.段落1所述的经分离的番石榴提取物，其中番石榴甙大于该提取物黄酮醇糖甙 的总量的大约5%重量份，槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙大于该提取物黄酮醇糖甙的总量的 大约10%重量份。4. 一种经分离的番石榴提取物，以1克提取物的总重量为准，含有槲皮素-3-阿 拉伯葡萄糖甙为大约15-17毫克，槲皮素己糖甙为大约50-54毫克，甲基槲皮素己糖甙为大 约50-56毫克，异槲皮素甙为大约18-21毫克，桑色素戊糖甙为大约26-29毫克，番石榴甙 为大约63-68毫克以及槲皮素戊糖甙为大约75-79毫克。5. 一种经分离的番石榴提取物的制备方法，包含在升高温度条件下用醇和水提取 番石榴叶和/或番石榴果实，以获得粗提物；将粗提物减压处理以生成含水浓缩物；将浓缩 物离心以分离固体物质；将澄清液柱层析并用水继之以醇洗提该柱，得到流出物；将流出 物减压处理以生成第二个含水浓缩物；将该含水浓缩物通过聚酰胺树脂以除去杂质，然后 用醇解吸活性组分；减压下浓缩该活性组分以生产所述的经分离的提取物。6.根据段落1-5中任何一段所述的经分离的番石榴提取物，其能够抑制DP-IV活 性或抑制与DP-IV相似的酶活性。7. 一种含有段落1-5中任何一段所述的经分离的番石榴提取物的食品或饮料。8. 一种用于生产食品或饮料的方法，其包含将段落1-5中任何一段所述的经分离 的番石榴提取物添加进入食品或饮料。9. 一种饮食方法，包含摄入段落8中叙述的食品，饮料，或者食品和饮料。10. 一种二肽基肽酶IV(DP-IV)抑制剂的制备方法，包含这些步骤在升高温度条 件下用醇和水接触由番石榴叶和/或番石榴果实构成的番石榴原料，以获得粗提物；将粗 提物减压处理以生成含水浓缩物；将浓缩物离心以分离固体物质；将澄清液柱层析并用水继之以醇洗提该柱，得到流出物；将流出物减压处理以生成第二个含水浓缩物；将该含水 浓缩物通过聚酰胺树脂以除去杂质，然后用醇解吸活性组分；减压下浓缩该活性组分以生 成所述的DP-IV抑制剂。11.根据段落10所述的DP-IV抑制剂，其能够抑制DP-IV活性或抑制与DP-IV相 似的酶活性。
12. 一种含有段落10或11中任何一段所述的DP-IV抑制剂的食品或饮料。13. 一种用于生产食品或饮料的方法，其包含将段落10或11中任何一段所述的 DP-IV抑制剂添加进入食品或饮料。14. 一种饮食方法，包含摄入段落13中叙述的食品，饮料，或者食品和饮料。15. 一种制备具有抑制二肽基肽酶IV活性的番石榴提取物的方法，包含这些步 骤在升高温度条件下用醇和水接触由番石榴叶和/或番石榴果实构成的番石榴原 料，以获得粗提物；将粗提物减压处理以生成含水浓缩物；将浓缩物离心以分离固体物质；将澄清液柱层析并用水继之以醇洗提该柱，得到流出物；将流出物减压处理以生成第二个含水浓缩物；将该含水浓缩物通过聚酰胺树脂以除去杂质，然后用醇解吸活性组分；减压下浓 缩该活性组分以生成一种浓缩物。16.段落15所述的方法，其中的番石榴原料是番石榴叶片。17.段落15或16中任何一段所述的方法，其中的醇是乙醇。18.段落15-17中任何一段所述的方法，其中的醇的浓度是大约80%体积比。19.段落15-18中任何一段所述的方法，其中的醇的体积与番石榴原料重量的比 例为大约8 1。20.段落15-19中任何一段所述的方法，其中的番石榴原料来自Psidium cattleianum,Psidium cattleianumssp. Lucidum, Psidium guajava, Psidium guineense, Psidium littorale, Psidium molle or Psidium schiedeanum 中一禾中植物。21.段落15-20中任何一段所述的方法，其中的高温在大约40_70°C之间。22.段落15-21中任何一段所述的方法，其中的疏水柱由交联聚苯乙烯/二乙烯基 苯共聚物组成。23.段落15-22中任何一段所述的方法，其中的醇是乙醇。24.段落15-23中任何一段所述的方法，其中的浓缩物通过膜滤法进一步处理。25.段落15-24中任何一段所述的方法，其中的浓缩物在升高温度条件下用水进 一步提取，以产生水溶液；将该水溶液离心，以提供澄清液；并过滤该澄清液。26.段落25所述的方法，其中的澄清液在减压下被浓缩。27.段落15-26中任何一段所述的提取物。28. 一种治疗葡萄糖代谢紊乱，糖尿病，肥胖，动脉硬化，降低低密度脂蛋白胆固 醇，或解除与女性月经有关的疾病或症状的方法，包括给需要的个体服用治疗有效量的段 落1-27中任何一段所述的组合物的步骤，以使所述的疾病或症状得到治疗。
29. 一种药物，含有段落1-27中任何一段所述的组合物和其在药学上可接受的盐 或酯；以及药学上可接受的载体。30. 一种包装后的药物，适于治疗葡萄糖代谢紊乱，糖尿病，肥胖，动脉硬化，降低 低密度脂蛋白胆固醇，或解除与女性月经有关的疾病或症状，含有段落1-27中任何一段所 述的组合物，和用于治疗所述疾病或症状的用法说明。31. 一种含有槲皮素相关的黄酮醇糖甙的经分离的番石榴提取物，含有槲皮 素-3-阿拉伯葡萄糖甙与番石榴甙。32.段落31所述的经分离的番石榴提取物，进一步含有异槲皮素。

33.段落31所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁被充分去除。34.段落33所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁小于该提取物 总重量的大约5%重量份。35.段落34所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁小于该提取物 总重量的大约重量份。36.段落31所述的经分离的番石榴提取物，其中的槲皮素相关的黄酮醇糖甙构成 了所述提取物总重量的至少30%重量份。37.段落32所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁被充分地去 除。38.段落37所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁小于该提取物 总重量的大约5%重量份。39.段落38所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁小于该提取物 总重量的大约重量份。40.段落32所述的经分离的番石榴提取物，其中的槲皮素相关的黄酮醇糖甙构成 了所述提取物总重量的至少30%重量份。41.段落31所述的经分离的番石榴提取物，进一步包含槲皮素己糖甙，甲基槲皮 素己糖甙，异槲皮素甙，桑色素戊糖甙，或者槲皮素戊糖甙中的至少一种。42.段落41所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁被充分地去 除。43.段落42所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁小于该提取物 总重量的大约5%重量份。44.段落43所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁小于该提取物 总重量的大约重量份。45.段落41所述的经分离的番石榴提取物，其中的槲皮素相关的黄酮醇糖甙构成 了所述提取物总重量的至少30%重量份。46.段落32所述的经分离的番石榴提取物，进一步包含槲皮素己糖甙，甲基槲皮 素己糖甙，异槲皮素甙，桑色素戊糖甙，或者槲皮素戊糖甙中的至少一种。47.段落46所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁被充分地去 除。48.段落47所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁小于该提取物 总重量的大约5%重量份。
49.段落48所述的经分离的番石榴提取物，其中的倍半萜烯和丹宁小于该提取物 总重量的大约重量份。50.段落46所述的经分离的番石榴提取物，其中的槲皮素相关的黄酮醇糖甙构成 了所述提取物总重量的至少30%重量份。51.根据段落1-50 中任何一段所述的经分离的番石榴提取物，其能够抑制DP-IV 活性或抑制与DP-IV相似的酶活性。52.段落28所述的方法，其中所述的组合物进一步包含异槲皮素，槲皮素己糖甙， 甲基槲皮素己糖甙，桑色素戊糖甙，或者槲皮素戊糖甙中的一个或多个。53.段落52所述的方法，其中的倍半萜烯和丹宁从提取物中被充分地去除。54.段落53所述的方法，其中的倍半萜烯和丹宁小于该提取物总重量的大约5%
重量份。55.段落52所述的方法，其中的倍半萜烯和丹宁从提取物中被充分地去除。56.段落55所述的方法，其中的倍半萜烯和丹宁小于该提取物总重量的大约5% 重量份。下列实施例的存在，提供了支持本发明的补充信息，不意谓是对本发明的限制。
实施例实施例1——制备来自Psidium guajava的乙醇提取物的概述-以下工序描述了制备来自Psidiumguajava叶片的提取物的生产过程-将Psidiumguajava的叶片研磨成粉；-用乙醇提取；-将提取液减压浓缩至乙醇蒸发；_通过离心除去不溶性杂质并获得澄清液体；-将澄清液体装入大孔树脂填充的色谱柱，用水进一步除去杂质，然后用乙醇解吸 活性组分，并收集乙醇洗脱液；-干燥乙醇洗脱液，产生Psidiumguajava提取物。提取过程详细描述1.提取粉末状的Psidium guajava叶片在60士2°C下，用80%乙醇提取两次。提 取持续时间为每次2小时。乙醇体积与原料粉末重量的比例为8 1。2.浓缩乙醇/水提取物在60士2°C减压并浓缩直至乙醇被除去，得到含水液体。 真空度为小于-0. 08MPa。3.色谱分离该含水液体被离心，以除去所有的固体。通过离心得到的澄清液体 被装入大孔树脂。用水冲洗树脂。用95%乙醇洗脱活性组分，直至液体澄清并且颜色为淡 黄色。流速被控制为15-20mL/分。收集乙醇部分。4.干燥合并后乙醇部分减压处理，洗脱液被浓缩/干燥。真空度小于-O.OSMPa。 得到粉末。实施例2——Psidium guajava提取物的生产500g研磨后的原料(新鲜的Psidium guajava果实)经称重并被转移至含有 2000mL的80%乙醇的三颈烧瓶中。混合物在60°C被温和地搅拌2小时。过滤提取液。收 集滤液，并在相同条件下，用2000mL80%乙醇再次提取滤渣。再次过滤提取液，并合并两次滤液。合并后的滤液在60°C减压下浓缩，直至没有乙醇剩余。真空度大约为-0. 09MPao无乙醇的浓缩液经离心除去固体颗粒。液体与固体颗粒分离。200mL水被添加至来自离心 分离的颗粒，并再次离心处理混合物。合并两次离心产生的上层清液。该澄清液体被装入 大孔树脂(Amberlite XAD 4型)并首先用SOOmL水以17mL/分的流速冲洗，以洗掉水溶性 组分。该树脂然后用1000mL95%乙醇以8.5mL/分的流速处理，以使活性组分脱附，并收集 2小时内的洗脱液。该洗脱液在60°C减压下浓缩，继之以干燥5小时。得到1. 4gPsidium guajava提取物。通过HPLC，槲皮素含量经测定为0. 10%重量 份，番石榴甙含量经测定为0. 657%重量份。实施例3——Psidium guajava提取物的生产20Kg研磨后的Psidium guajava叶片的粉末被称重并被投入250L蒸煮锅，然后加 入160L80%乙醇，混合物在60C搅拌2小时。过滤混合液并收集滤液。160L80%乙醇被添 加与滤渣混合。混合物在60C提取2小时，过滤，并合并滤液。合并后的滤液在60C减压下 浓缩，直至乙醇残留为痕量。浓缩期间的真空度大约为-0. 09MPao将仍含水的浓缩混合物离心。将得到的上层清液与离心分离期间形成的固体颗粒 分离。将颗粒破碎，添加40L水混合并离心。来自第一次和第二次提取的上层清液被合并。 合并后的液体通过大孔交联树脂(Amberlite XAD 4型)。首先，160L水用来洗涤该吸收后 的树脂，通过该操作去除部分杂质。然后，350L80 %乙醇通过该树脂，将活性组分从树脂中 洗提出来。收集黄褐色液体。该液体在60°C减压下被浓缩。然后，浓缩物在真空干燥机中 干燥5小时。得到1.8Kg Psidium guajava提取物。通过HPLC分析测定，番石榴甙的含量是 12. 44%，带有1.02%槲皮素。(色谱柱C180DS (十八烷基硅烷酯)；流动相甲醇冰 醋酸(32 68，体积比)在360nm波长检测)步骤B 上述产物进一步浓缩。该产物溶解于200L水中。溶液通过聚酰胺树脂进 行分离(聚酰胺6树脂，来自Messrs. Sorbent Technologies, Inc.)首先，40L水用来洗涤 该树脂以除去杂质。然后，60L80%乙醇用来解吸需要的活性组分。收集黄褐色液体作为洗 脱液。该洗脱液在60°C减压在下浓缩，然后在真空干燥机中干燥5小时。得到0. 45Kg Psidium guajava提取物。通过HPLC分析(同上)测定，番石榴甙 的含量是42. 09%，带有0. 96%槲皮素。实施例4——Psidium guajava提取物的DP-IV抑制作用的研究方法通过比色分析法测定DP-IV活性。Gly-Pro-4-NA (G0513, Sigma, St. Louis,MO)，一种 DP-IV (合成的)显色底物，通过 DP-IV被水解为二肽甘氨酸_脯氨酸和4-硝基苯胺，其出现比率在405nm被定量地跟随。400 μ L分析缓冲液(9. 5g HEPES/L蒸馏水，pH值被调节为7. 0，产品号码H4034， Sigma, St. Louis, MO) ,150 μ L人血浆和100 μ L抑制剂溶液(或溶剂)被转移进入光度计 样品池，温和地搅拌并在37°C预培养3分钟。然后开始分析，通过添加70 μ L酶底物溶液 (8. 6mg Gly-Pro-4-NA/10mL分析缓冲液中含有)。记录在405nm处20分钟内的吸收变化。DP-IV活性可以表示为在20分钟内的光密度的线性变化(AAbs/分钟)。
样品制备根据实施 例2得到的Psidium gujava提取物，在45°C，搅拌条件下，溶解于蒸馏 水中，保持24小时。此后，该提取物通过离心分离(15，OOOrpm, 15分钟)，过滤(针筒式滤 器，0.45 μ M)去除杂质，适当被稀释并提交测试分析。该提取物的浓度为5g粉末/IOOmL水。通过向除杂后的提取物添加水制备稀释液。为了对比目的，P32/98 {3N-[ (2S，3S) _2_氨_3_甲基-戊酰基]_1，3_噻唑-半延 胡索酸盐}，一种人工合成酶抑制剂，抑制DP-IV。制备浓度为1. 60mg P32/98/mL分析缓冲液的储备溶液，并用分析缓冲液稀释，以 得到0. 50mg/mL-0. 05mg/mL之间的浓缩溶液。100 μ L的这些溶液作为“抑制剂”溶液，被添
加至试样。在相同测试分析系统中进行比较试验，其在下列“结果”部分进一步描述。数据评估结果以％ -抑制来表示，该抑制来自没有添加抑制剂的样品与添加抑制剂的 样品或Psidium guajava提取物(实施例2)(两者具有不同浓度)的测试结果的比较。试样中的无抑制(0% )表示与没有添加抑制剂的样品相比具有相同的吸收增加。 完全抑制(100% )表示没有明显的吸收增加。全部测试结果为2个样品的平均值。这些重复取样的相对标准偏差总小于7%。结果该分析应用公知的常规程序进行校准该测试分析系统的最佳pH值显示为处于pH值=6.0和？!1值=8.0之间的范围。 32-42°C之间的分析温度范围没有显著影响酶活性。5-10μ g/10mL之间的任何酶底物浓度 产生了最大的酶活性。在选定的酶底物浓度上，吸收的增加显示为线性的，直至45分钟。在 选定的分析条件下，100-200 μ L之间的血浆体积显示吸收增加产生了剂量依赖性的平行移动。在最终的测试分析条件下的重复试验产生小于7%的相对标准偏差。通过公知的非特异性酶抑制剂产生的酶的抑制，和各个溶剂产生的结果显示在表 1中。表1，非特异性酶抑制剂对DP-IV活性的作用 可见，该酶DP-IV没有充分地被选定的非特异性的酶抑制剂所阻塞。明显的抑制 通过有机溶剂实现。由于这些结果，该提取物溶解于水，因为有机溶剂显示出阻塞了该酶活 性；因此那些溶剂的采用将导致无法解释的结果。图1和图2显示了用合成抑制剂P32/98和Psidium guajava提取物进行测试的 结果，横坐标标绘了各个抑制剂浓度，纵坐标标绘了各个观测到的DP-IV的抑制程度。如图1所示，合成抑制剂P32/98产生了一条平滑的剂量/响应抑制曲线。在选定 的测试分析系统中，大约0. IOyg/试样体积的浓度产生了大约50%的DP-IV抑制。如图2所示，Psidium guajava提取物也产生了一条平滑的剂量/响应抑制曲线。 在该选定的测试分析系统中，100-1000 μ g/试样体积之间的浓度产生了大约50%的DP-IV 抑制。因此，Psidium guajava提取物显示出对DP-IV充分的抑制。Psidium guajava和 合成抑制剂P32/98之间在效力上的差异大约等于1000。实施例5——番石榴甙的DP-IV抑制作用的研究除非在下文中以另外方式表明，所应用的原料和方法与实施例4相同。样品制备番石榴甙溶解于HEPES [N- (2_羟乙基)哌嗪-N' _2_乙烷磺酸]缓冲液(20分钟 超声处理，继之以在室温下振荡2小时)，适当稀释并提交测试。通过添加HEPES缓冲液制 备稀释液。测试浓度在70-280 μ g/mL测试试样之间。数据评估结果用活性来表示，其来自阳性对照样品(无抑制剂添加)中得到的测试结 果与以添加不同浓度番石榴甙的样品中得到的结果的比较。试样中100%活性表明，与没有添加抑制剂的样品相比较，具有相同吸收增量。零 活性(0% )表明没有明显的吸收增量。全部测试结果以2个样品的平均值表示。这些重复取样的相对标准偏差总是小于5%。结果如图3和图4所示，番石榴甙产生了一种明确的DP-IV剂量依赖性抑制。在该选 定的测试分析系统中，在140-210 μ g/mL测试试样(100-150 μ g/试样体积)之间的浓度产生了大约50 %的DP-IV抑制。番石榴提取物的测试1.该提取组合物的定量数据分析2g提取物/IOOmL (如实施例2所制备)甲醇/水溶液(甲醇/水，50 50， 体积比)中的槲皮素糖甙组合物。如图5所示，在该提取物中发现了 7个主要的槲皮素糖 甙。这些峰的结构被推荐用质谱研究。为了定量评价，单独的黄酮醇糖甙的峰面积％与相 同样品酸性水解后得到的槲皮素的数量有关系(折算为相应推荐结构中的槲皮素的质量 比例)。下列各项是定量分析用的HPLC条件三元梯度泵被调整到1. OOmL/分钟流动相A 0. 1 %磷酸水溶液流动相B 0. 1 %磷酸乙腈溶液梯度00-15分钟0-8% B ；15-70 分钟8~24% B ；70-85 分钟24-35% B波长360nm温度30°C注射体积25 μ L柱Spheri sorb ODS 250X4. 6mm来自HPLC/MS研究的番石榴提取组合物 整个地，每克番石榴提取物包含313. 8mg黄酮醇糖甙[等于31. 4% (质量比)槲 皮素相关糖甙]。主要化合物番石榴甙的含量是65. 7mg/g提取物[相当于6. 57% (质量 比)]。2.在培养条件下个体的黄酮醇糖甙的稳定性在测试条件下，采用CaCo-2细胞吸收试验，以2g提取物(来自实施例2)/IOOmL
培养介质的浓度，来研究选定的黄酮醇糖甙的稳定性。
可见，全部黄酮醇糖甙在回肠条件下是稳定的。3. CaCo-2细胞中槲皮素糖甙的吸收的研究样品浓度2g番石榴提取物(来自实施例2)/IOOmL培养基培养条件37°C下60分钟(5个平行测定培养)数据评价由HPLC分析培养基(在制备和培养60分钟之后，立即分析)和细胞内 容物得到的，单独的黄酮醇糖甙的峰面积的比例。结果是5个培养的平均值。吸收(存在于培养基中的黄酮醇糖甙的％ ) 可见，黄酮醇糖甙的绝对吸收被判断在2. 3和5. 3%之间。最佳吸收被发现是槲皮 素阿拉伯糖甙，紧接着是槲皮素葡萄糖甙和甲基槲皮素己糖甙。当定量考虑组合物时，槲皮素糖甙的吸收数量合计为12mg/g提取物。CaCo-2细胞的培养CaCo-2细胞在37°C含有5% 二氧化碳和95%空气的环境中，于Dulbeccos' sModified Eagle培养基中培养，该培养基含有20 %胎儿牛血清，1. 2 %非必需氨基酸， 0. 83mM的L-谷酰胺，1. 2%青霉素-链霉素和0. 巯基乙醇。细胞生长在75cm2培养瓶(T75)中，一周后再次培养(每隔一天用PBS缓冲液冲 洗，用胰蛋白酶去除并转移至一个新的培养瓶中)。CaCo-2 试验 为了实验，在37°C并含有5%二氧化碳和95%空气的环境中，以3X 105个细胞每 孔的细胞密度，在6个点板中种入细胞，生长7到8天，直至融合。细胞用PBS缓冲液冲洗 并与黄酮醇一起培养60分钟。在相应的培养时间之后，每孔取900 μ L培养基并与100 μ L蚁酸混合。细胞用PBS 缓冲液冲洗并用ImL的10%蚁酸去除。细胞超声处理3次，每次30秒，离心10分钟并丢弃 颗粒。上层清液用作HPLC分析样品。4.选定的槲皮素糖甙的DP-IV试验与番石榴甙和含有存在于番石榴提取物中的全部黄酮醇糖甙的纯化部分相比，番 石榴提取物(来自实施例2)对于DP-IV抑制的活性。该纯化部分通过HPLC制备，其中包 含活性组分的所有部分被合并然后减压浓缩，以产生纯化的提取物。该纯化的提取物然后 溶解于培养基至一优选的浓度。全部三个样品被调至含有180 μ g番石榴甙/mL测试试样，该浓度表示在人血浆中 抑制了 50% 的 DP-IV。图6表示该实验的结果。180 μ g番石榴甙/mL的测试产生了 50%的DP-IV抑制。该番石榴提取物被调至 含有180 μ g番石榴甙/mL测试试样，然后发现略微超过70%的DP-IV抑制。该番石榴提取 物纯化的部分被调至含有180 μ g番石榴甙/mL测试试样，其含有全部黄酮醇糖甙部分，然 后发现略微超过70%的DP-IV抑制。这些结果表明(a)就DP-IV抑制活性而言，番石榴甙是活性组分之一。(b)存在于番石榴提取物中的其它黄酮醇葡萄糖甙也产生了 DP-IV抑制活性，并 加强了番石榴甙的作用。(c)以番石榴甙内容物为基础，番石榴提取物表现出强于纯番石榴甙50%的作 用，支持了全部黄酮醇糖甙的协同作用的活性。(d)该DP-IV抑制活性显示出存在于黄酮醇糖甙部分。在另一个实验中，该番石榴提取物(Ig含有65. 7mg番石榴甙)被稀释至含有 180 μ g番石榴甙/mL测试分析溶液，用于DP-IV测试。番石榴甙(标准品)的这个浓度显 示出，在选定的测试条件下，抑制了 50%的DP-IV。提取物在这个浓度(2. 7mg/mL测试分析溶液)下的测试产生了 73. 2%的抑制，表 明该提取物含有除番石榴甙之外的协同作用化合物。以这些结果为基础，含有主要槲皮素相关糖甙的色谱馏分，以制备规模进行精馏。 含有主要槲皮素相关糖甙的被收集的部分，被真空(旋转蒸发器)浓缩，并被调至等同于大 约相同数量的槲皮素相关糖甙，作为起始提取物。当槲皮素相关糖甙的纯化部分以其存在 于番石榴提取物中的相同浓度被提交时，DP-IV的抑制结果通过计算为72. 5%。
该黄酮醇糖甙通过制备色谱被分离。在收集含有单独黄酮醇糖甙部分之后，每 个部分被蒸发至干燥。收集干燥残余物并通过色谱法检验纯度。每个单独黄酮醇糖甙在 100-500 μ g黄酮醇糖甙/mL浓度之间，被提交DP-IV测试。根据测试结果，以下估算了对应DP-IV的50%抑制的浓度。 虽然本发明已经以优选实施例为基准进行了描述，但是本领技术人员将认识到产 生于形式和细节上的变化并不离开本发明的主旨和范围。本说明书自始至终引用的所有参 考资料，包括背景技术中的那些参考资料，均以其完整形式合并于此。通过只是运用常规试验方法，那些本领域技术人员将认识到，或能够探知很多等 同于本发明于此明确描述的具体的实施例的内容。这些等同方案被规定包含于下述权利要 求书的范围内。
权利要求
一种含有槲皮素相关的黄酮醇糖甙的经分离的番石榴提取物，含有槲皮素-3-阿拉伯葡萄糖甙与番石榴甙。
2.根据权利要求1所述的经分离的番石榴提取物，进一步包含异槲皮素。
3.根据权利要求1所述的经分离的番石榴提取物，其中倍半萜烯和丹宁被实质上去除。
4.根据权利要求3所述的经分离的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹宁小于5%重量份。
5.根据权利要求4所述的经分离的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹宁小于重量份。
6.根据权利要求1所述的经分离的番石榴提取物，其中所述的提取物包含至少30%重 量份的槲皮素相关的黄酮醇糖甙。
7.根据权利要求2所述的经分离的番石榴提取物，其中倍半萜烯和丹宁被实质上去除。
8.根据权利要求7所述的经分离的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹宁小于5%重量份。
9.根据权利要求8所述的经分离的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹宁小于重量份
10.根据权利要求2所述的经分离的番石榴提取物，其中所述的提取物包含至少30% 重量份的槲皮素相关的黄酮醇糖甙。
11.根据权利要求1所述的经分离的番石榴提取物，进一步包含槲皮素己糖甙，甲基槲 皮素己糖甙，异槲皮素甙，桑色素戊糖甙，或者槲皮素戊糖甙中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的经分离的番石榴提取物，其中倍半萜烯和丹宁被实质上去除。
13.根据权利要求12所述的经分离的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹宁小于5%重量份。
14.根据权利要求13所述的经分离的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹宁小于重量份。
15.根据权利要求11所述的经分离的番石榴提取物，其中所述的提取物包含至少30% 重量份的槲皮素相关的黄酮醇糖甙。
16.根据权利要求2所述的经分离的番石榴提取物，进一步包含槲皮素己糖甙，甲基槲 皮素己糖甙，异槲皮素甙，桑色素戊糖甙，或者槲皮素戊糖甙中的至少一种。
17.根据权利要求16所述的经分离的番石榴提取物，其中倍半萜烯和丹宁被实质上去除。
18.根据权利要求17所述的经分离的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹宁小于5%重量份。
19.根据权利要求18所述的经分离的番石榴提取物，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹宁小于重量份。
20.根据权利要求16所述的经分离的番石榴提取物，其中所述的提取物包含至少30%重量份的槲皮素相关的黄酮醇糖甙。
21.根据权利要求1所述的经分离的番石榴提取物，其具有DP-IV抑制活性或抑制与 DP-IV相似的酶活性。
22.经分离的番石榴提取物的制备方法，包含在升高温度条件下用醇和水提取番石榴 叶和/或番石榴果实，以获得粗提物；将粗提物减压处理以生成含水浓缩物；将浓缩物离心 以分离固体物质；将澄清液柱层析并用水继之以醇洗提该柱，得到流出物；将流出物减压 处理以生成第二个含水浓缩物；将该含水浓缩物通过聚酰胺树脂以除去杂质，然后用醇解 吸活性组分；减压下浓缩该活性组分以生产所述的经分离的提取物。
23.—种二肽基肽酶IV(DP-IV)抑制剂的制备方法，包含在升高温度条件下用醇和水 提取番石榴叶和/或番石榴果实，以获得粗提物；将粗提物减压处理以生成含水浓缩物；将 浓缩物离心以分离固体物质；将澄清液柱层析并用水继之以醇洗提该柱，得到流出物；将 流出物减压处理以生成第二个含水浓缩物；将该含水浓缩物通过聚酰胺树脂以除去杂质， 然后用醇解吸活性组分；减压下浓缩该活性组分以生产所述的DP-IV抑制剂。
24.根据权利要求23所述的DP-IV抑制剂，其具有DP-IV抑制活性或抑制与DP-IV相 似的酶活性。
25.一种制备具有抑制二肽基肽酶IV活性的番石榴提取物的方法，包含这些步骤在 升高温度条件下用醇和水接触由番石榴叶和/或番石榴果实构成的番石榴原料，以获得粗 提物；将粗提物减压处理以生成含水浓缩物；将浓缩物离心以分离固体物质；将澄清液柱 层析并用水继之以醇洗提该柱，得到流出物；将流出物减压处理以生成第二个含水浓缩物； 将该含水浓缩物通过聚酰胺树脂以除去杂质，然后用醇解吸活性组分；减压下浓缩该活性 组分以生成一种浓缩物。
26.根据权利要求25所述的方法，其所述的番石榴原料是来源于选自Psidium cattleianum，Psidiumcattleianum ssp. Lucidum, Psidium guajava，Psidium guineense， Psidium littorale，Psidium molle or Psidiumschiedeanum 的一禾中植物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述的疏水柱由交联聚苯乙烯/二乙烯基苯共 聚物构成。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述的浓缩物通过薄膜过滤做进一步处理。
29.一种治疗葡萄糖代谢紊乱，糖尿病，肥胖，动脉硬化，降低低密度脂蛋白胆固醇，或 解除与女性月经有关的疾病或症状的方法，包括给需要的个体服用治疗有效量的权利要求 1所述的组合物的步骤，以使所述的疾病或症状得到治疗。
30.根据权利要求29所述的方法，其所述组合物进一步包含异槲皮素，槲皮素己糖甙， 甲基槲皮素己糖甙，桑色素戊糖甙，或槲皮素戊糖甙中的一种或多种。
31.根据权利要求29所述的方法，其中倍半萜烯和丹宁从提取物中被实质上去除。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹宁小于5%重量份。
33.根据权利要求30所述的方法，其中倍半萜烯和丹宁从提取物中被实质上去除。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述提取物中的倍半萜烯和丹宁小于5%重量份。
全文摘要
本发明描述了番石榴果实的提取物的制备、分离和应用，其用于治疗与二肽基肽酶IV有关、由二肽基肽酶IV产生或介导的疾病或症状。
文档编号A61P3/10GK101883575SQ200880013754
公开日2010年11月10日 申请日期2008年4月22日 优先权日2007年4月27日
发明者托马斯·爱丁伯格 申请人:欧博康有限公司