专利名称：调节血管生成和癌细胞增殖的方法
调节血管生成和癌细胞增殖的方法
技术领域：
本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2004/037754，国际申请日为 2004年11月12日，进入中国国家阶段的申请号为"200480033521. 1"， 发明名称为"调节血管生成和癌细胞增殖的方法"的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用 本申请要求2003年11月14日提交的美国临时申请60/520,172的权益， 在此完整引入以供参考。
关于联邦资助的研究或开发的声明 本发明在美国政府通过以下代理机构授予的基金NIH EY014385和 HL036279的支持下完成。美国政府对本发明享有特定的权利。
背景技术：
得自花生四烯酸代谢作用的产物参与调节血管和细胞生长。当花生四烯酸 的代谢由细胞色素P450催化时，主要的产物是区域和立体特异性的环氧二十 碳三烯酸(EET)、它们相应的二羟基二十碳三烯酸(DHET)和20-羟基二十碳三 烯酸(20-HETE)。细胞色素P450也可将花生四烯酸代谢为16-、 17-、 18-和 19-HETE。在CYP450的所有同种型中，参与花生四烯酸co-羟化为20-HETE 的主要的酶是CYP450 4A (CYP4A)和CYP450 4F (CYP4F)家族(Roman RJ.， 尸/z戸o/.细82:131-185， 2002)。
生理血管生成是涉及细胞、胞外基质分子与细胞迁移、增殖和内皮细胞的 管分化中积累的可溶性因子之间相互作用的复杂过程。血管生成的过程与已经 存在的血管有关，它长出毛细管枝芽以产生新血管(HanahanD等，Sc〖wce 277:48-50， 1997)。几种细胞因子和生长因子，例如内皮细胞生长因子(VEGF)、 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)已公认可在体外和 体内调节血管生成，在这些因子中，VEGF认为是最有效的血管生成诱导 物(FerraraN， J尸/z"/。/Ce〃尸/zyw'o/ 280: C1358-C1366， 2001)。近来的 研究进一步支持了 VEGF在骨骼肌中作为重要的血管生成调节物的作用， 因为用VEGF-中和抗体处理阻断了针对电刺激和锻炼的血管生成应答 (Amaral SL等，M/cro"ycw/a"o" 8: 57-67， 2001;和Amaral SL等，爿w J P/z"/o/i/eflWC7rc尸/ywW281: H1163-H1169， 2001)。
花生四烯酸的环氧合酶(Epoxygenase)代谢物参与培养细胞中的内皮细胞 迁移和管形成(Natarajan R等，爿m J P/z;w'o/ i/eaW Oc尸/z"zW 273: H2224-H2231， 1997; Natarajan R等，/Voc淑"ca"c/园90: 4947-4951， 1993;和RiederMJ等，M/③丽c Ae"9: 180-189， 1995)。近来的一项研究 提供了大鼠提睾肌中细胞色素P450A(CYP450)(o-羟化酶在骨骼肌细胞和小动 脉中表达的证据(Kunert MP等，J尸/ jw'o/ T/eaW Oc尸/yw'o/ 280: H1840-H1845， 2001)。 20-HETE显示在大脑和肾循环的小动脉的生肌活化中 起作用(Harder DR等，J ^wc 34: 237-243， 1997; Harder DR等，爿cto 尸/z"〖。/ Scam/ 168: 543-549， 2000;禾卩Ma YH等，爿m J尸/z"/。/ i egw/ /"&gr Cowp P/2"/0/ 267: R579陽R589， 1994)。 Frisbee等04m /尸/z;^W T/eaW Oc 尸—'o/ 280: H1066-H1074， 2001)禾口 Kunert等(M.c画,簡/a"o" 8: 435-443， 2001)证实20-HETE导致针对骨骼肌抵抗小动脉中透壁压力升高和P02的血管 收縮应答。
近来的研究也表明去甲肾上腺素和血管紧张素II(ANG II)刺激20-HETE 在血管平滑肌细胞中合成与释放(Muthalif MM等， / 5/o/ C/zew 271: 30149-30157， 1996)，并且细胞色素P-450抑制剂阻断MAPK系统活化与去 甲肾上腺素和ANG II对培养的血管平滑肌(对M)细胞的促有丝分裂作用。有 证据表明20-HETE作为ANG II的血管收縮作用的二级信使(Alonso-Garcia M 等，爿m J尸/z"/。/ i egw/ /"&gr Cow; 尸&wW 283: R60-R68, 2002)并且局部 肾素—血管紧张素系统在电刺激诱导的血管生成中起重要作用(Amaral SL等，M/c腦.腦/fl"o" 8: 57-67， 2001)。然而，20-HETE在肌肉的电刺激后 介导Ang II的血管生成作用中的角色尚不清楚。
20-HETE也涉及在促进培养的各种类型正常细胞生长中起作用。例如， 20-HETE增加VSM细胞(Muthalif等，外—画'ow 36: 604-609， 2000;和 Uddin等，Z/，eWe"w'o" 31: 242-247， 1998)和近端小管肾上皮细胞(Lin等，
尸tyWo/. 269: F806-F816， 1995)中的胸苷掺入。体外这两种细胞类型中， EGF的促有丝分裂作用与20-HETE生产增加有关(Muthalif MM等，尸roc. iVa" 爿cw/. 1998， 95:12701-12706;禾PLinF等，」m //^"/o/ 1995，
269:F806-16)。阻断20-HETE的形成降低了对血清、去甲肾上腺素和EGF的 生长应答(LinF等，JmJ尸/^w'o/ 1995， 269:F806-16; Roman RJ，i ev 2002， 82:131-85; SacerdotiD等，尸簡一Wz7w 。
一WMWw 2003， 72:51-71; Zhao X和Imig JD， C^r Z>wg Tl^eto6 2003 ， 4:73-84)。在各种细 胞类型中，几种信号转导途径可能与20-HETE对细胞生长的刺激有关(Muthalif MM等，iV"". Jcat/. L^4 1998， 95:12701-12706; UddinMR等， //，W國.o" 31: 242-247， 1998; Harder DR等，JJ^wc i ^ 34: 237-243， 1997; Lange等，C/zew 272: 27345-27352， 1997; Lin等，J尸/^w'o/i e"a/ 尸—W269: F806-F816， 1995;禾口 Sun等，//，W函ow 33: 414-418， 1999)。 Muthalif等报道了血管平滑肌中通过NE和血管紧张素II活化MAPK取决 于20-HETE的形成，它是在经钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II刺激cPLA2 后产生的。Ras/MAPK途径经20-HETE的活化，放大了 cPLA2活性并通过 正反馈机理额外释放花生四烯酸。Muthalif等提出该机理可能在调控其它参 与细胞增殖和生长的细胞信号传递分子中起作用(Muthalif MM等， 淑/.园1998， 95:12701-12706)。
虽然花生四烯酸代谢物的生产由剌激血管生成的生长因子改变并且有证 据表明20-HETE在体外促进一些类型的正常细胞生长中起作用，但在本申请 所述工作之前没有证据表明20-HETE直接参与体内血管生成，也没有证据表 明20-HETE在癌细胞增殖和癌性肿瘤生长中起作用。
6发明概述
本发明一方面涉及将足够降低组织中血管生成的量的20-HETE合成抑制 剂或20-HETE拮抗剂给予人或非人哺乳动物，来减少人或非人哺乳动物组织 中血管生成的方法。
本发明的另一方面涉及通过充分增加组织中20-HETE活性从而诱导和促 进组织中血管生成，来诱导和促进人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。
本发明还有另一方面涉及使癌症或肿瘤细胞与选自20-HETE合成抑制剂 或20-HETE拮抗剂的药物接触来抑制癌症或肿瘤细胞增殖的方法，该药物的 量足够抑制癌症或肿瘤细胞增殖。
附图的几种视角的简述
图1显示了代表性反向HPLC色谱，说明胫骨前(TA)肌样品中荧光标记的 20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE)的分离。WIT-002, 20-5(Z),14(Z)-羟基二十 碳二烯酸用作内标。
图2显示用选择性细胞色素尸-450A (CYP4A)抑制剂[,羟基-;V'-(4-丁基 -2-甲基苯酚)-甲脒(HET0016)]处理对大鼠尿中20-HETE水平的作用。数值 是用载体(卵磷脂)处理的5只大鼠和用HET0016处理的5只大鼠的平均值± SE。 *尸<0.05对卵磷脂。
图3显示7天刺激方案后用选择性CYP4A抑制剂(HET0016)处理对大鼠 肌肉中20-HETE形成的作用。PBS，磷酸缓冲盐。数值是用卵磷脂处理的5只 大鼠和用HET0016处理的5只大鼠的平均值±SE。 *尸< 0.05对未刺激侧。
图4显示7天电刺激方案后对照大鼠(11 = 4)、用选择性CYP4A抑制剂(卵 磷脂配制的HET0016， 2mgkg"天—1， w = 4)处理的和用非选择性CYP4A抑 制剂[PBS配制的1-氨基苯并三唑(ABT)， 50mgkg—'天—1， " = 4]处理的大 鼠的指长伸肌(EDL)和TA肌肉的血管密度变化。数值是平均值± SE。显著性 <0.05对未刺激侧。
图5显示7天电刺激方案后，用卵磷脂、HET0016 (卵磷脂配制，2 mg kg" 天—"和ABT(PBS配制，50mgkg"天"，"=4)处理大鼠的未刺激(U)或电刺激(S)的TA肌肉中血管VEGF的表达。每份样品加样为50(ig总蛋白。由于大 量表达VEGF，用C6肿瘤细胞作为阳性对照。显示了 7天电刺激方案后在对 照组(n = 5)和用选择性CYP4A抑制剂HET0016 (" = 7)处理组中VEGF蛋白 质的定量密度显像测定。数值是平均值iSE。 *尸<0.05对未刺激侧。
图6显示7天刺激方案后，用VEGF-中和抗体(PBS配制的VEGF Ab; 0.6 mg/100g体重，腹膜内(ip))处理对大鼠肌肉中20-HETE形成的作用。数 值是用PBS(对照)处理的5只大鼠和用VEGF Ab处理的4只大鼠的平均值± SE。数值表达为在C6肿瘤细胞标准中观察到的VEGF表达的百分比。*尸< 0.05对未刺激侧。
图7显示HET0016对培养的人血管内皮细胞(HUVEC)中VEGF的增殖性 应答的作用。HUVEC单独与250 ng/ml VEGF或在存在10 (iM HET0016时 孵育，24小时后测定细胞增殖。HET0016消除了对VEGF的增殖性应答(n =3，每次实验一式三份)，但未改变HUVEC的基础增殖率(未显示)。*/7< 0.05，对照对VEGF; ; <0.05， VEGF对VEGF + HET0016。
图8A和8B显示HET0016对体内VEGF引发的血管生成应答的作用。用 大鼠角膜袋(cornea pocket)血管生成试验检测新血管形成的改变。将单独含有 VEGF(250 ng/小球)或含有VEGF和HET0016 (20 (ig)的小球植入大鼠角膜的 基质。7天后处死大鼠并使用India墨水使新血管形成显现。通过追踪血管并 使用图像分析软件以获得视野中所有血管长度的数值来定量估计血管生成应 答。图8A显示了小球植入物区域中代表性的角膜载玻片(flatmount)。图8B显 示了以平均值土SEM表示的所有实验的总血管长度。(p<0.001， VEGF对 VEGF + HET0016)。
图9A和9B显示HET0016对体内bFGF引发的血管生成应答的作用。单 独含有bFGF(250 ng/小球)或含有bFGF和HET0016 (20 (ig)的小球植入大鼠 角膜的基质。图9A显示了代表性的角膜载玻片。图9B显示了图8所示血管 生成应答的变化。("=6; / < 0.001， bFGF对bFGF + HET0016)。
图10A和10B显示HET0016对体内EGF引发的血管生成应答的作用。 单独含有EGF(250 ng/小球)或含有EGF和HET0016 (20 pg)的小球植入大鼠
8角膜的基质。图IOA显示了代表性的角膜载玻片，图10B显示了血管生成应
答的变化。("=7; p< 0.001， EGF对EGF + HET0016)。
图11A和11B显示了化学性质和机理不同的20-HETE形成抑制剂，二溴 十二碳烯基甲磺酰亚胺(DDMS，也称为7V-甲基磺酰基-12, 12-二溴十二垸基 -ll-烯酰胺)对体内VEGF的血管生成应答的作用。单独含有VEGF(250 ng/小 球)或含有VEGF和DDMS(IO (ig)的小球植入大鼠角膜的基质。图11A显示 了代表性的例子，图IIB显示了血管生成应答的变化。("=6; ; < 0.001， VEGF对VEGF + DDMS)。
图12显示20-羟基二十碳-6(Z)， 15(Z)-二烯酸(WIT003)， 一种具有有效 激动活性的20-HETE的更稳定类似物对培养的HUVEC增殖的作用。HUVEC 单独与40 pM棕榈酸(无活性脂肪酸对照)或乙醇(载体对照)孵育。二者无 差别，因此合并该两组的对照数据。在实验组中，细胞与1 )iM WIT003孵 育48小时并测定增殖。WIT003提高HUVEC的增殖("=3，每次实验一式 三份；*; <0.05禾[]#p<0.01，对照对WIT003)。
图13A和13B显示20-HETE类似物WIT003在体内大鼠角膜袋中的血管 生成作用。含有20 pg WIT003的小球植入大鼠角膜的基质。7天后处死大 鼠并检测新血管形成。图13A显示了代表性的载玻片。图13B显示对 WIT003的血管生成应答("=6; /7<0.01，对照对WIT003)。
图14A和14B显示HET0016在体内对U251癌细胞的血管生成应答的作 用。通过以低密度将单细胞悬浮液接种于0.8%琼脂层上产生人成胶质细胞瘤 癌细胞系U251的球状体。总共5-8个球状体(每个约200 pm)插入刻入双眼的 角膜袋中。含有20pgHET0016或载体(乙醇)的小球置于球状体附近。植入 癌细胞2周后处死大鼠并检测新血管形成应答。图14A显示了在连续实验 中所有大鼠的球状体/小球植入物区域的角膜。图14B显示了血管生成应答 的变化("=8; p<0.01，对照球状体对球状体+HET0016)。
图15显示了 20-HETE合成抑制剂，HET0016对体外生长的人U251成胶 质细胞瘤癌细胞的生长模式和细胞周期特性的作用。A幅涂布相同数量的
U251细胞(0.75 X 10,铺板并在接触各种浓度的HET0016之前血清禁食1天，每24小时进行细胞计数；B幅在对照培养物和用10 pM HET0016 处理的培养物中评估掺入DNA的[3司胸苷。[3司胸苷掺入数据计算为 d.p.m./l(^个细胞并相对于EtOH对照定标；C幅U251细胞铺板，并用 EtOH配制的10 )iMHET0016或单用EtOH(对照)处理。用碘化丙锭(细胞增 殖标记)染色细胞并通过FACS分析染色细胞的总DNA含量来确定它们的 细胞周期分布。处于细胞周期的各种阶段的细胞百分比示于每幅图中。每 幅图显示了一式三份进行的3到4个独立实验的平均值±SD。 C幅显示了 3个独立实验的代表性实验。箭头表示当HET0016加入培养物使的时间0 点。
图16显示HET0016抑制EGF刺激培养物中U251癌细胞增殖和生长的作 用。血清禁食U251细胞，然后用200 ng/ml EGF、 10 jiM HET0016或二者处 理。48小时后评估细胞增殖。
图17比较了 HET0016对HUVEC、初级角化细胞和U251生长的作用。 HUVEC、初级人角化细胞和人U251成胶质细胞瘤癌细胞接种于96-孔板并用 HET0016处理48小时。HET0016对正常的HUVEC或角化细胞无作用，而抑 制约50%U251癌细胞增殖。(图中)给出了一式三份进行的3个独立实验的平均 值士SD。 ***表示各自对照值的；？<0.001。
图18显示DDMS对生长于培养物中的人U251成胶质细胞瘤细胞增殖的 作用。用DDMS(化学性质和机理与HET0016极为不同的第二种CYP4A和 20-HETE合成抑制剂)处理U251细胞。DDMS以浓度依赖性方式抑制U251 细胞的增殖。(图中)给出了一式三份进行的3个独立实验的平均值±SD。
图19显示WIT003， 一种具有促效剂性能的20-HETE的稳定类似物对 人U251成胶质细胞瘤癌细胞体外增殖的作用。在加入0.1 和1 faM的 WIT003或已知对这些用于比较的细胞的增殖产生接近最大刺激的不同浓 度EGF之前U251培养物血清禁食1天。结果显示1 pM WIT003促进U251 的生长与200 ng/ml EGF的相当。48小时后进行细胞计数并依照在单用载 体(EtOH)处理的对照培养物中观察到的数值定标。(图中)给出了一式三份进 行的3个独立实验的平均值± SD。 *; <0.05; **; <0.01; ***p<0.001。
10图20显示加入20-HETE促效剂(agonist)WIT003可从20-HETE合成抑 制剂HET0016的抗增殖作用中拯救U251细胞。培养物血清禁食并单用10 pM HET0016或与联用1 ^MWIT003处理。处理48小时后通过细胞计数来评估 细胞增殖。(图中)给出了一式三份进行的3个独立实验的平均值±SD。
图21显示HET0016对9L胶质肉瘤细胞体外增殖的作用。A幅相同数 量的9L细胞(0.75 X 104)铺板，并在接触各种浓度的HET0016之前血清禁 食1天，每24小时进行细胞计数；B幅在用10 ^MHET0016处理的培养 物中评估掺入DNA的[3司胸苷。[3闭胸苷掺入数据计算为d.p.m./l(^个细胞 并对EtOH对照定标。A-B幅图中的数据是一式三份进行的3个独立实验的 平均值± SD。
图22显示DDMS对9L胶质肉瘤细胞体外增殖的作用。相同数量的9L 细胞(0.75 X 104)铺板并在接触各种浓度的DDMS或载体之前血清禁食1 天，24和48小时后进行细胞计数。(图中)给出了一式三份进行的3个独立实 验的平均值±SD。
图23显示了 HET0016对EGF-剌激9L增殖的作用。9L培养物经血清禁 食，然后单用200 ng/ml EGF或用EGF和10 |uM HET0016处理。。24和48 小时后评估细胞增殖。
图24显示20-HETE促效剂WIT003对HET0019对体外生长9L胶质肉瘤 细胞的抗增殖作用的作用。A幅培养物血清禁食并用0.1 ^M或1 pM WIT003 处理。48小时后评估细胞数目。数据表示为对照。/。。B幅单用10 HET0016 或联用1 WIT003处理9L细胞。处理24小时和48小时后通过计数细 胞来评估细胞增殖。数据表示为抑制％。给出了一式三份进行的3个独立实 验的平均值士SD。
图25显示HET0016在体内对9L胶质肉瘤肿瘤生长的作用。9L细胞 (1 X 104)注射入大鼠的大脑。经过2天确定有肿瘤后，用卵磷脂(载体)或 HET0016 (10 mg/kg/天)处理大鼠15天。A幅显示了注射卵磷脂(载体)的 对照大鼠的大脑组织。B幅显示了 15天后用HET0016处理的大鼠的大 脑组织。显示的图片是在5只对照动物和5只HET0016处理的动物中观察到的代表性图像。
图26显示HET0016慢性处理在体内对9L肿瘤生长的作用。A幅给出了 用载体或HET0016处理的大鼠中沿着肿瘤中点的HE切片。B幅比较了在连续 切片中用AIS图像分析系统软件检测的对照和HET1006大鼠的肿瘤体积。(图 中)给出了每组5只大鼠的平均值±SE。
发明详述
本文公开了可通过调节20-HETE的活性来调控血管生成。本文还公开了 可通过20-HETE及其促效剂来刺激以及通过20-HETE合成抑制剂和拮抗剂来 抑制癌症和肿瘤细胞增殖。
本发明使用大鼠骨骼肌和大鼠角膜作为例子证实了用至少3种化学性质 和机理不同的20-HETE合成抑制剂阻断20-HETE合成可降低各种生长因子诱 导的血管生长。与该观察结果一致的是，本发明人也证实给予20-HETE促效 剂可模拟生长因子诱导新血管生长的作用。这些发现提供了新的策略，从而通 过阻断血管生成来治疗或预防异常或过度的血管生长相关疾病和病症，以及通 过诱导和促进血管生成来治疗或预防与血管生长不足或血管衰退相关的疾病 或病症。
本发明人使用人胶质瘤和大鼠胶质肉瘤癌细胞作为例子，显示了不同类型 的化学性质和机理的20-HETE合成抑制剂在体外和体内均抑制癌细胞增殖并 且该抑制作用可为20-HETE促效剂逆转。本发明人还发现20-HETE抑制剂不 影响正常细胞的基础增殖。然而，用各种生长因子(EGF、 bFGF和VEGF)异 常刺激正常的人血管内皮细胞生长后，20-HETE抑制剂阻断这些细胞的异常增 殖。这些发现为癌症治疗(包括辅助治疗)和预防提供新的策略。
20-HETE的活性与合成在哺乳动物中十分保守。例如，迄今为止研究的 所有哺乳动物物种均表达CYP4A和CYP4F家族的酶并且20-HETE由白血球 产生，存在于血管中(Roman RJ.，尸/z;^W. i ev. 82:131-85， 2002)。因此，下 文实施例使用大鼠、大鼠细胞和人细胞所示的观察结果可应用于所有哺乳动 物，例如人、犬、大鼠、小鼠和家兔。本发明一方面涉及通过充分抑制组织中20-HETE活性从而减少人或非人 哺乳动物组织中血管生成的方法。
在一个实施方案中，本发明的方法用于减少生长因子诱导的血管生成。技 术人员熟悉这种生长因子。例子包括，但不限于酪氨酸激酶依赖性生长因子， 例如VEGF、 bFGF、 EGF;胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF-1)和PDGF; 与G蛋白偶联的受体，例如肾上腺素能(受体)、胆碱能(受体)、催产素、内 皮肽、血管紧张素、血管舒缓激肽、组胺、凝血酶和许多其它受体。
在另一个实施方案中，本发明方法用于减少肿瘤或癌细胞分泌的生长因子 诱导的血管生成。在还有另一个实施方案中，本发明方法用于减少非肌肉组织 (例如眼睛的非肌肉组织)中的血管生成(例如，新生儿与高浓度的氧接触后， 受伤和炎症后以及在糖尿病(患者)中)。在还有另一个实施方案中，本发明方 法用于减少处于炎症，例如哮喘、类风湿性关节炎、骨关节炎、皮肤感染和损 伤、以及肺纤维化中的非肌肉组织的血管生成。
抑制人或非人哺乳动物的组织中20-HETE活性的一种合适的方法是给予 人或非人哺乳动物以足够降低该组织中血管生成的量的20-HETE合成抑制剂。 术语"20-HETE合成抑制剂"指参与将花生四烯酸转化为20-HETE的酶的抑 制剂。这种酶是已知的并且包括CYP4A和CYP4F家族的酶，例如CYP4A11、 CYP4F2禾卩CYP4F3 (Christmas P等，《/.肠/. C/z医，276: 38166-38172,2001)。
本领域已知许多类型的20-HETE合成抑制剂，它们均可用于本发明的方 法。这些抑制剂包括以下文献公开的U.S. 20040110830; WO0236108; WO0132164; Nakamum T等，A.oorg Med C7zew. 12:6209-6219; 2004; Nakamura T等，5z》org MW C7zew 14:5305-5308， 2004; Nakamura T 等，Med C/zem14:333-336， 2004; Nakamura T等，JMedC/zem. 46:5416-5427， 2003; SatoM等，5z'oorg Mec/CTzew11:2993-2995， 2001; MiyataN等，J尸Aamwco/. 133:325-329， 2001; XuF等，/尸/zflrwaco/五x; T7ze广308:887-895， 2004; XuF等，J尸/z"/。/i eg"〃Wegr Com/ 尸/z;^'o/ 28:R710-720, 2002; RomanRJ.，尸/z;^Wi ev. 82:131-185， 2002，所有这些 文献全文纳入本文作为参考。这些抑制剂的例子包括N-羟基-N-(4- 丁基-2-甲基苯酚)-甲脒 (HET0016)、 N-(3-氯-4-吗啉-4-基)苯基-N'-羟基亚氨甲酰胺(TS-0U)、 二溴十 二碳烯基甲磺酰亚胺(DDMS)、 l-氨基苯并三唑(ABT，得自Sigma Chemical Corp., St. Louis， MO)、 17-十八炔酸(17-ODYA)、咪康唑(得自Sigma Chemical Corp,， St. Louis, MO)、酮康唑、氟康唑和硫酸10十一炔酯(IO-SUYS)。 HET0016、TS陽011和DDMS是20-HETE的特异性抑制剂，17陽ODYA、 l-ABT 和咪康唑是特异性较低的抑制齐IJ(W00236108)。 HET0016、 l-ABT和 17-ODYA显示能在体内降低20-HETE水平(WO0236108; Dos Santos EA等， 」w J尸/zjwo/ i egw/ /Wegr Com; 287:R58-68， 2004; Hoagland KM等， 外戸/師'cw 42:669-673， 2003; Cambj-Sap丽r L等，34:1269-1275， 2003;禾H Hoagland KM等，//"eWe""ow 41:697-702， 2003)。 WOO 132164 公开了一种合成HET0016的方法。还描述了合成具有抑制20-HETE合成的 类似性能的大量HET0016类似物的方法(Nakamura T等，Me" CTzem. 12:6209-6219， 2004; NakamuraT等，M^/C/zem Ze". 14:5305-5308， 2004; NakamuraT等，历離gMedCAem丄机14:333-336， 2004; Nakamura T等，JMec/C/zem. 46:5416-5427， 2003;和Sato M等，历oc^gMed C/ em Z^". 11:2993-2995， 2001)。 17-ODYA、 ABT和咪康唑得自Sigma Chemical Corp., St. Louis， MO。用于本发明目的的优选抑制剂包括HET0016、 TS-011和 D函S。
U.S. 20040110830公开了能抑制从花生四烯酸合成20-HETE的羟基甲 脒，所有这些衍生物可用于本发明。
由于当抗体施用入动物身体后一般能阻断靶蛋白的功能，抗20-HETE合 成酶的抗体(单克隆或多克隆)也可用作20-HETE合成抑制剂(Dahly， A丄， /^S￡SJ. 14:A133， 2000; Dahly， A丄，乂 Jw. Soc. A^7A卬/0gy 11:332A， 2000)。CYP4A和CYP4F家族的所有已知成员的DNA和蛋白质氨基酸序列 均得到公布并且可用。因此，技术人员可制造包括20-HETE合成酶的人源 化抗体的抗体。例如，已制造了抗CYP4A1和CYP4A10的抗体，并且这些 抗体显示能抑制CYP4A1和CYP4A10的酶活性(Amet， Y,等，肠c/zem
14尸/zflrmaco/. 54(8): 947-952， 1997; Amet， Y.等，尸/zarmaco/. 53(6): 765-771， 1997; Amet， Y.等，J/co/zo/CY,".22(2): 455-462， 1998)。 某些这种抗体也可购得(例如，抗-CYP4Al得自Gentest Corp.， Woburn， Massachusetts) o
抑制人或非人哺乳动物组织中20-HETE活性的另一种合适的方法是给予 人或非人哺乳动物以足够降低组织中血管生成的量的20-HETE拮抗剂。可用 所有已知的20-HETE拮抗剂。这些拮抗剂包括公开于以下文献的美国专利 号6,395,781; YuM等，￡wr J泡画co/. 486:297-306， 2004; YuM等，
Med C/ 麼11:2803-2821 ， 2003;和Alonso-Galicia M等，」w J尸/z戸W. 277:F790-796， 1999;所有这些文献全文纳入作为参考。例子包括19羟基 十九烷酸、20羟基二十碳-5(Z),14(Z), 二烯酸和N-甲磺酰基-20-羟基二十 碳-5(Z)，14(Z)-二烯酰胺。
可通过本发明的方法治疗或预防异常和过度的血管生长相关疾病和病症。 "治疗疾病"指某种疾病发生后降低其严重性或使得某疾病的症状消失。"预 防疾病"指防止疾病发展或在疾病开始时降低其严重性。可治疗或预防的疾病 和病症的例子包括，但不限于癌症(例如，脑癌和其它实体组织肿瘤)、置于高 氧孵育箱中新生儿的角膜血管化与受伤或感染后眼睛、皮肤或其它器官的血管 化。除了作为受伤或感染的结果的血管化以外，也可治疗或预防其它眼病，例 如不受控制的血管生成导致的新血管眼病。在该例子中，应该注意的是视网膜 和脉络膜循环的病理性血管生成是许多眼病的严重后果。视网膜新血管化发生 于糖尿病性视网膜病变、镰状红细胞性视网膜病变、视网膜静脉阻塞和早熟 性视网膜病变(ROP)。中枢视网膜静脉或其一条支脉的阻塞可导致视力迅速 降低并伴有视网膜新血管生成的后遗症。在前缺血性视神经病中衍生于脉 络膜系统，供应视神经的血管可被阻断。产生自脉络膜毛细管的新血管导 致在年龄相关的黄斑变性和基质黄斑疾病中脉络膜新血管化的发生。
不适当的血管生成还涉及动脉粥样硬化症和再狭窄、先天肺纤维化、急性 成人呼吸窘迫综合征和哮喘中的有害重塑。此外，血管生成与关节炎症，例如 类风湿性关节炎相关。所有这些疾病可用本发明的方法治疗或预防。除了上述疾病和病症之外，其它可治疗或预防的疾病和病症包括(但不限于)表1所列的
(Ca薩liet P，淑匿MeW"力e 9:653-660，2003;禾卩Carmeliet P，J /"^tz. Md 255:538-561， 2004， 二者均全文纳入作为参考)。有关这些疾病的其它信息 见Storgard CM等，103:47-54 (1999)与Greene AS和Amaral SL， //，e"e似4:56-62 (2002)，所有这些文献全文纳入本文作为参考。
表l-以异常或过度的血管生成为特征或由其导致的疾病
器官 小鼠或人的疾病
许多器官 癌症(癌基因的激活；肿瘤抑制基因的丧失)；感染
性疾病(病原体表达血管生成基因，诱导血管生成 进程或转化EC);自身免疫疾病(肥大细胞和其它白 细胞的激活)
血管 血管畸形(Tie-2突变)；迪乔治综合征(低VEGF和
神经毡蛋白-1表达)；HHT(内皮糖蛋白或ALK-1突 变)；海绵状血管瘤(Cx37和Cx40丧失)；动脉粥样 硬化症；移植动脉病
脂肪组织 肥胖症(脂肪饮食诱导的血管生成；血管生成抑制
剂导致的体重降低)
皮肤 银屑病、疣、过敏性皮炎、伤疤瘢痕瘤、化脓性肉
芽肿、起泡性疾病(blistering disease)、 AIDS患者中
的卡波西肉瘤
眼 持续增生性玻璃体综合征(Ang-2或VEGF丧失)；
糖尿病性视网膜病变；早熟性视网膜病变；脉络膜 新血管化(TIMP-3突变)
肺 原发性肺动脉高压种系BMPR-2突变；体细胞EC突变)；哮喘；鼻息肉
肠 炎性肠病和牙周病、腹水、腹膜粘连
生殖系统 子宫内膜异位症、子宫出血、卵巢囊肿、卵巢刺激
过度
骨骼，关节 关节炎、滑膜炎、骨髓炎、骨赘形成_
本发明的另一方面涉及将足够降低组织中血管生成的量的HET0016或 DDMS给予哺乳动物来减少人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。
本发明的另一方面涉及将足够降低组织中血管生成的量的TS-011给予哺 乳动物来降低人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。
本发明的另一方面涉及通过充分增加组织中20-HETE活性从而诱导和促 进血管生成来诱导和促进人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。在一个实 施方案中，该方法用于诱导和促进非肌肉组织中的血管生成。
增加人或非人哺乳动物组织中20-HETE活性的一种合适的方法是给予人 或非人哺乳动物以足够诱导和促进组织中血管生成的量的20-HETE或其促效 剂之一。可用所有己知的20-HETE促效剂。这些促效剂包括公开于以下文献 的美国专利号6,395,781; YuM等，￡w J泡画co/. 486:297-306， 2004; 和Alonso-GaliciaM等，J尸/^wW. 277:F790-796， 1999。例子包括20羟 基二十烷酸、20羟基二十碳-6(2),150二烯酸( 1丁003)和^甲磺酰基-20-羟基二十碳-6(Z),15(Z)-二烯酰胺。
可由本文提供的方法预防或治疗血管生成不足或血管退化相关的疾病或 病症。例如，可预防或治疗与糖尿病和缺血性心脏病相关的周围血管疾病。治 疗性血管生成有助于降低患周围血管疾病患者对截肢的需要，在心脏血管成形 术的情况中，该疗法可提高心脏病发作后的存活率并可提高或者甚至替代旁路 手术。类似地，给予20-HETE或其促效剂来增加血管生成可减轻缺血性中风 后和大脑区域血管化降低相关病症(例如，阿尔茨海默病)中的细胞死亡和神经 缺陷。其它可预防或治疗的疾病和病症包括(但不限于)下表2所列的(Carmeliet
17P， 《/ M /. 255:538-561， 2004)。
表2-血管生成不足或血管退化为特征或导致的疾病
器官 小鼠或人的疾病 血管生成机理
神经系统 阿尔茨海默病 通过淀粉样-卩的EC毒性导致血管
收縮、微血管退化和大脑血管病
肌萎縮性侧索硬化症；VEGF生产不足导致灌流和神经保糖尿病性神经病变护受损，从而造成运动神经元或轴
突退化
中风
存活率与大脑血管生成相关；动脉病导致的中风(Notch-3突变)
血管
动脉粥样硬化症 特征为侧血管生长受损
高血压
由于血管舒张或血管生成受损导致微血管稀疏化
糖尿病
特征为局部缺血肢的侧面生长和血管生成受损，但随周细胞减少视网膜新血管化提高
再狭窄
老年人动脉受伤后再内皮化受损
胃或口腔溃疡 由于病原体产生血管生成抑制剂
导致愈合滞后
克罗恩病
特征为粘膜局部缺血
皮肤
脱发
血管生成抑制剂导致头发生长迟皮肤紫癜、毛细管扩张
和静脉湖(venous lake)
形成
由于EC端粒变短造成血管数量和成熟(SMC减少)的年龄依赖性降低
生殖系统
先兆子痫
由于通过可溶性Flt-1除去VEGF
造成EC功能障碍从而导致器官衰竭、血栓形成和高血压
肺
月经过多(子宫出血)
新生儿呼吸窘迫
由于Ang-1产量低造成SMC-不良血管易碎
由于HIF-2a和VEGF产量降低导
致早熟小鼠的肺成熟不完全且表
面活性剂生产不足
肺部纤维化、肺气肿基于VEGF抑制的蜂窝状EC凋亡
冃
肾病
由于TSP-1产生导致年龄血管的血管丧失
骨骼 骨质疏松症、骨折愈合受影响
VEGF驱动血管生成的年龄依赖性减少导致骨形成受损；血管生成抑制剂阻止骨折愈合
本发明的另一方面涉及通过给予哺乳动物以足够诱导或促进组织中血管生成的量的20羟基二十碳-6(Z),15(Z)-二烯酸来诱导和促进人或非人哺乳动物组织中血管生成的方法。
本发明另一方面涉及通过使肿瘤或癌细胞与选自20-HETE合成抑制剂或20-HETE拮抗剂的药物接触来抑制肿瘤或癌细胞增殖的方法，所述药物的量足够抑制肿瘤或癌细胞增殖。在一个实施方案中，该药物给予患癌症或肿瘤的人或非人哺乳动物以治疗癌症或肿瘤。在另一个实施方案中，给予该药物以预防癌症或肿瘤发生。
19已知癌细胞能产生造成它们异常生长的自分泌生长因子。在以下实施例
中，本发明人证实20-HETE在介导响应生长因子的细胞促有丝分裂应答中起作用。不想受限于任何理论，本发明人相信20-HETE合成抑制剂和20-HETE拮抗剂通过抑制生长因子的信号转导途径来抑制癌症或肿瘤细胞增殖。此外，以上癌症或肿瘤细胞生长也取决于生长因子的分泌来剌激血管生成并向肿瘤供血。本公开内容证实20-HETE的合成与作用抑制剂在至少两种不同的体内模型系统中阻止生长因子诱导的血管生成。因此，可进一步推理通过20-HETE合成抑制剂和拮抗剂对肿瘤诱导的血管生成的这种抑制作用也有助于它们的体内抗癌症活性。在一优选的实施方案中，20-HETE合成抑制剂和20-HETE拮抗剂用于预防或治疗神经胶质细胞来源(神经胶质瘤)和星形细胞来源(星形细胞瘤)的脑癌以及上皮组织(恶性肿瘤)的癌症，例如某些类型的肠癌、乳腺癌(例如，导管乳腺癌)、皮肤癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、结肠癌和卵巢癌。在一更优选的实施方案中，预防或治疗乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、皮肤癌和胰腺癌的胶质瘤和恶性肿瘤。合适且优选的20-HETE合成抑制剂和20-HETE拮抗剂如上所述。
本发明的另一方面涉及通过使肿瘤或癌细胞与HET0016或DDMS接触来抑制肿瘤或癌细胞增殖的方法，其中HET0016或DDMS的量足够抑制肿瘤或癌细胞增殖。在一个实施方案中，HET0016或DDMS给予患癌症或肿瘤的人或非人哺乳动物以治疗癌症或肿瘤。在另一个实施方案中，给予HET0016或DDMS以预防癌症或肿瘤发生。
本发明的另一方面涉及通过使肿瘤或癌细胞与TS-011接触来抑制肿瘤或癌细胞增殖的方法，其中TS-011的量足够抑制肿瘤或癌细胞增殖。在一个实施方案中，TS-011给予患癌症或肿瘤的人或非人哺乳动物以治疗癌症或肿瘤。在另一个实施方案中，给予TS-011S以预防癌症或肿瘤发生。
就本发明的具体应用而言，例如预防或治疗具体的疾病或病症，技术人员易于确定特定给药途径的某种20-HETE合成抑制剂或20-HETE促效剂或拮抗剂的最优剂量。本发明不受限于特定的给药途径。合适的给药途径包括(但不限于)口服、静脉内、皮下、肌肉内和注射入特定的器官或组织。基于以下非限制性实施例可更完全地理解本发明。
实施例1
通过20-HETE调节骨骼肌血管生成本实施例证实20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE)对骨骼肌中电刺激诱导的血管生成是重要的。刺激大鼠的胫骨前肌肉和指长伸肌7天。电刺激显著增加了肌肉中20-HETE形成和血管生成，它被N-羟基-N'-(4-丁基-2-甲基苯酚)甲脒(HET0016)或l-氨基苯并三唑(ABT)的慢性处理阻断。用HET0016或AB丁慢性处理未阻断VEGF蛋白质在两种肌肉中表达的增加。为分析VEGF对20-HETE形成的作用，用VEGF中和抗体(VEGF Ab)处理其它大鼠。VEGF Ab阻断刺激诱导的20-HETE形成。这些结果证明20-HETE与血管生成的下游信号传递途径(VEGF的下游)有关。材料与方法
动激》/辨手术所有方案得到Wisconsin医学院的动物实验管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of the Medical College ofWisconsin)的批准。大鼠安置于Wisconsin医学院的动物研究中心(AnimalResource Center of the Medical College of Wisconsin)并随意给予食物和水。通过肌肉内注射开他敏(100 mg/kg)和乙酰丙嗪(2 mg/kg)的混合物麻醉7-8周龄的32只雄性Sprague-Dawley大鼠。在胸腰部以上进行皮下切割并植入以前设计并证实对慢性研究有效的小型电池驱动的刺激器(Linderman JR等，M/cm">cw/a//(^ 7: 119-128， 2000)，适当固定。在覆盖右后肢膝关节(在腓总神经的区域之上)侧面的皮肤与筋膜中切另一个开口。 一对电极在皮肤下从刺激器引出并固定于接近腓总神经的包围膝盖的肌肉上(Ma YH等J/wJ尸/y^0/CompP/z>^/o/267: R579-R589, 1994)。用生物相容的丙烯酸粘固剂(Loctite; Rocky Hill， CT)局部固定而远端用细缝合线(规格5-0， Ethicon;Somerville， NJ)固定电极。缝合两处切口的皮肤，并且第二天允许大鼠在刺激时期开始之前恢复。
实發方,与教织劍备24小时恢复期后，使用小的手提式磁铁瞬间闭合
21磁性弹簧开关来激活植入的刺激器。刺激器通过以0.3-ms持续时间的方波脉 冲、10-Hz频率和3-V电位刺激腓总神经从而在小腿肌肉中产生电诱导的肌肉 收縮(Linderman JR等，M/c腦.簡/Wo" 7: 119-128， 2000)。指长伸肌(EDL) 和胫前(TA)肌肉于每天早上9点自动收縮并持续8h/天，连续7天。在刺激期 结束时，以过量的戊巴比妥钠(IOO mg/kg ip)无痛处死大鼠，收集EDL和TA 肌肉以进行前述分析(Greene AS等，//，W腦'o" 15: 779-783， 1990;和 Parmentier JH等，Z/，eWe肌'cw 37: 623-629， 2001)。
大鼠分为4组。为评价20-HETE在VEGF蛋白表达和骨骼肌血管生成中 的作用，组1的9只大鼠在电刺激期间每天接受腹膜内注射有效和选择性的 CYP4A酶抑制齐!j[N-羟基-N'-(4-丁基-2-甲基苯酚)甲脒(HET0016)， Taisho Pharmaceutical (Miyata N等，￡r/尸/u^maco/ 133: 925-929， 2001)]两次，每 次注射的剂量为1 mg/kg。该剂量是基于以前研究结果选择的(KehlF等，
CVc尸/z"/o/ 282: H1556-H1565， 2002)。在该项研究中，10 mg/kg静脉内的剂量在多个小时期间产生的血浆浓度远超过(高10 倍)HET0016在血浆中的有效抑制浓度。
为比较HET0016与更常用，但特异性较低的抑制剂的作用，在电刺激期 间用l-氨基苯并三唑(ABT;组2)以50mg'kg十天-'腹膜内(ip)的剂量处理4 只大鼠。
为确定VEGF对电刺激诱导的血管生成的作用，组3的6只大鼠在电刺激 期间以3 mg/kg ip注射单克隆VEGF-中和抗体(Texas Biotechnology; Houston, TX)来处理。VEGF-中和抗体的给药方案是Zheng W等，(C/rc 85: 192-198， 1999)的改进方案，该剂量是基于我们以前研究的结果(Amaral SL 等，M/croc/rcw/a"o" 8: 57-67， 2001)。刺激时期开始后，大鼠在第3、 5和7 天接受腹膜内注射(0.6 mg/100 g)。
组4的大鼠用HET0016的载体卵磷脂(n = 9)或用用于VEGF抗体的盐 水，PBS (n = 4)处理。由于在用每种载体处理的大鼠中获得的结果无明显差异， 合并这些组的结果。
M-iffi7E ^^,1#^/激在电刺激的最后一天，大鼠置于有效分开尿液和食物的代谢笼中。就在开始收集尿液之前取走食物以免污染尿样，并将24-小时对照和处理的尿液样品收集入包裹有冰的玻璃瓶中。使用前述的荧光
HPLC测定(Maier KG等，J尸—'o/ Oc尸—'o/ 279: H863-H871 ，
2000)来检测尿液样品中20-HETE的浓度。加入25 ng内标[20-5(Z)，14(Z)-羟 基二十碳二烯酸(WIT-002)， Taisho Pharmaceutical; Saitama， Japan]后，用 甲酸将样品酸化至pH 4，用1 ml乙酸乙酯提取并用氩气干燥有机相。样品重 新溶解于1 ml的20%乙腈并上样于Sep-Pak Vac柱(Waters; Milford， MA)。 用1 ml的30%乙腈洗涤柱两次，用400 pi的90%乙腈洗脱含有HETE和 EET的部分。样品稀释于水中，上Sep-Pak Vac柱，用500 pi乙酸乙酯洗 脱然后干燥。脂质部分用含有36.4mM三氟甲磺酸2-(2,3-萘亚氨基)乙酯的 20 ^乙腈标记。加入N,N-二异丙基乙胺(IO M!)以催化反应。使用Sep-Pak Vac提取(Maier KG等，爿m J尸/z"/。/ 尸/z"/oZ 279: H863-H871 ，
2000)除去过量的染料，在氩气环境中干燥样品，悬浮于lOOpl甲醇并通过 使用荧光检测器(型号L-7480; Hitachi, Naperville, IL)的反向HPLC(Waters) 分析。通过比较20-HETE峰面积与内标的峰面积确定样品中20-HETE的量。
教织汰桌浙i,麥度游,漆,分桥取下经刺激的和对侧的肌肉，称 重并在生理盐溶液中清洗。从TA肌肉向头的部分取300-mg样品并冷冻于 液氮用于Western印迹(IOO mg)和HPLC (200 mg)分析，分别检测VEGF蛋 白表达和20-HETE形成。剩余的TA和EDL肌肉轻轻地固定于0.25%福尔 马林溶液过夜。用手动切片机通过固定肌腱并平行于肌肉纤维的纵向切片 将肌肉切为约100 pm厚。每只动物制备两个EDL肌肉切片和3个TA肌 肉切片。这些切片浸于25 pg/ml罗丹明标记的Griffonia simplicifolia I (GS-I) 卵磷脂(Sigma; St. Louis， MO (Greene AS等，//>^eWe"w'o" 15: 779-783， 1990))溶液中2小时。接触GS-I卵磷脂2小时后立即在生理溶液中漂洗肌 肉。15和30分钟后重复该清洗过程，并将肌肉在生理盐水溶液中漂洗12 小时(过夜，4°C)。第二天，切片用含有甲苯和丙烯酸树脂的水溶性封固培 养基(SP ACCU-MOUNT 280， Baxter Scientific)封固于显微镜载玻片上。
如前所述，标记的切片使用反射照明的影像荧光显微镜系统(Olympus，1.6 cm工作距离和0.4数值的口径)目测 (Parmentier JH等，i/，eWera/o" 37: 623-629， 2001)。在本项研究中，分别 选择10-15和20-25个代表性视野来研究每个EDL和TA肌肉切片。每个 视野转化为数字化图像(DT2801 Data Translation; Marlboro, MA)并以分辨 率为512 X 512像素的8-位/像素图像文件保存。扫描的组织化学切片的 形态计量分析如前所述进行(Parmentier JH等，37: 623-629， 2001)。以前已证实血管-网格交叉(Vessel-grid intersection)可精确且定量地 估计血管密度(Parmentier JH等，/fy; eWe"w'ow 37: 623-629， 2001)。
W^Wem伊_^分,"检,/ 蚤^游存玄匀浆100-mg TA肌肉样
品，蛋白质悬浮于钾缓冲液中(lOmM)。在12%变性的聚丙烯酰胺凝胶上从 TA和己知高水平表达VEGF的肿瘤细胞系(C6，美国模式培养物保藏所， 107-CCL)分离5微克蛋白质(由蛋白质测定试剂盒测定，Bio-Rad; Hercules, CA)。将凝胶转移至在稀释于Tris-缓冲盐水(50 mM Tris和750 mM NaCl， pH 8)的5%脱脂奶粉和0.08%吐温20(Bio-Rad)中封闭过夜的硝酸纤维素膜 上。印迹然后与来源于人VEGF序列的肽的多克隆抗体(1:1，000稀释，克隆 G143-850， Pharmingen)于室温孵育2小时。洗涤印迹，然后以1:1,000稀释 度与山羊抗-小鼠二抗于室温孵育1小时，再经SuperSignal West Dura化学 荧光底物(Pierce; Rockford， IL)检测系统(检测)。膜对X-射线胶巻(Fuji Medical; Stamford, CT)曝光15-30秒并用Kodak M35 X-Omat处理器显影。 为定量分析VEGF，薄膜总是曝光一段时间以保证所有信号在膜检测的线 性范围内。使用形态计量成像系统(Metamorph， Universal Imaging; West Chester, PA)定量VEGF区带强度并将数值表示为(36肿瘤细胞标准物的百 分比。
^f检,/20-//五7E游巡^劍吝欽100-200 mg冷冻的TA肌肉在含有1 ml 酸化水和由Taisho Pharmaceutical合成并惠赠的50 )til内标，WIT-002的溶 液中匀浆。向混合物中加入乙酸乙酯(3 ml， Fisher Scientific; Pittsburgh, PA)
并小心搅拌。匀浆的组织然后以3,000转/分钟离心2分钟。使用玻璃巴斯德 移液管移去上层并转移至无菌的玻璃小瓶，样品在氮气环境中干燥并保存于
24-8(TC。
#^标记浙20-//￡7^游资^检簾如前所述检测20-HETE(Ma YH等， Jm J尸/z",'o/ i egw/ /Wegr Comp 267: R579-R589， 1994)。提取样品
并在氩气环境中干燥，将其重悬于含有36.4 mM 2-(2,3-萘亚氨基)乙基三氟 甲磺酸酯的20 pl乙腈中，并加入N,N-二异丙基乙胺(10)Ld)作为催化剂。样 品于室温反应30分钟，在氩气环境中干燥，重悬于1 ml的40。/。乙腈-水， 上Sep-Pak Vac柱。用6ml的50%乙腈-水溶液洗涤柱以除去未反应的染料， 500 fil乙酸乙酯洗脱，氩气环境中干燥并重悬于100 pl的HPLC流动相中[甲 醇-水-乙酸，82:18:0.1 (体积/体积)]。25卞1等份衍生的样品在4.6 X 250-mm Symmetry C18反向HPLC柱(Waters)上使用甲醇-水-乙酸，82:18:0.1 (体积/ 体积)作为流动相以1.3 ml/分钟的流速等度分离。使用串联的荧光检测器(型 号L-7480， Hitachi; Naperville， IL)以中等增益灵敏度检测荧光强度。通过 比较20-HETE峰面积和内标(WIT-002)的峰面积确定样品中20-HETE的量。
^^为^^^统^:就每份肌肉而言，所有选择的视野(每份EDL肌肉是 10-15次扫描X 2片；每份TA肌肉是20-25次扫描X 3片)的血管计数 取单个血管密度的平均值。血管密度表示为每个显微镜视野(0.224 mm"的血管 -网格交叉的平均数。就每个实验组而言，将受刺激肌肉的检测到的血管密度 和20-HETE形成与其未刺激的对应部分以及年龄匹配的对照相比较。所有数 值表示为平均值± SE。使用具有一个因子(刺激)的重复测量值的双因子 ANOVA(药物X刺激)评估同一动物中检测值差异的显著性。使用事后测 试(post hoc test)(Tukey's)进一步调查显著的差异。
结果
为评估阻断CYP4A酶的作用，我们检测了用HET0016处理7天的大鼠中 的尿液20-HETE排泄。图1给出了阐述20-HETE分离的代表性HPLC色谱。 如图1所示，在非常接近20-HETE处有其它峰。基于标准品的共迁移，我们 鉴定了色谱图中前一个峰是19-HETE， 20-HETE后一个峰是18-HETE。下一 个峰是16-HETE，其后是15-HETE。如材料与方法所述，为分析每个峰的面积， 我们通过去褶合方法(Hitachi软件)扣除了肩峰。如图2所示，与用卵磷脂处理的对照组相比，用HET0016慢性处理显著 降低了(36%)24-小时的尿液20-HETE排泄(尸< 0.05)。
如图3所示，7天的电刺激显著增加骨骼肌中20-HETE形成(未刺激和刺 激的肌肉分别是从69.52 ± 31.3到177.58 ± 54.4 ng/g肌肉，P < 0.05)。用 HET0016处理7天未改变骨骼肌中20-HETE的基础形成量(处理和对照的分别 是110.26 ± 28.36和69.52 ± 31.3 ng/g肌肉，尸> 0.05;图3);然而，用HET0016 慢性处理完全阻断了由电刺激诱导的骨骼肌中20-HETE形成的增加(未刺激和 刺激侧分别是从110.26 ±28.3到102.1 ±22.3 ng/g肌肉；图3)。
如前所示，电刺激导致用卵磷脂处理的对照组中血管密度增加(EDL和TA 的血管交叉数量分别是从107.0 ± 1.6到121.0 ± 4.5和从100.4 ± 8.4到132.0 士9.9，尸<0.05)。如图4所示，用HET0016慢性处理完全阻断了 7天电刺 激诱导的骨骼肌中血管密度的增加(EDL和TA的血管交叉数量分别是从 116.0 ± 1.0到118.0 ± 10.1和从105.7 ± 4.9到110.5 ± 1.1)。使用ABT慢性 抑制20-HETE形成也减缓了电刺激诱导的骨骼肌中血管密度的增加(EDL 和TA的血管交叉数量分别是从111 ± 7.4到121 ± 4.35和从99.7 ± 4.72到 119.5 ±4.51)。
由于VEGF显示在骨骼肌血管生成中起重要作用，我们进行了 Western 印迹分析以确认HE丁0016或ABT对VEGF蛋白表达的作用。图5显示了 Western印迹分析的定量光密度测定，用于比较7天刺激后所有用HET0016 处理的动物或对照组中VEGF蛋白表达响应。如图5所示，在对照组中，电刺 激显著增加了 VEGF蛋白水平(尸< 0.05)。为比较HET0016和另一种CYP4A 抑制剂的作用，我们在电刺激期间用ABT处理动物组7天，结果示于图5。 HET0016或ABT对基线VEGF表达均无任何作用。HET0016或ABT未阻断 电刺激诱导VEGF蛋白表达的增加。
在一个补充实验中，用VEGF-中和抗体或PBS(对照)处理大鼠来分析 VEGF对20-HETE形成的作用。如图6所示，用VEGF抗体处理完全阻断了 由于7天电刺激诱导的20-HETE形成的增加。实施例2
通过20-HETE调节大鼠角膜中生长因子诱导的血管生成 CYP4A酶将花生四烯酸代谢为20-HETE。在该实施例中，我们证实 20-HETE在体外的内皮细胞中体外是促有丝分裂的，体内是血管生成性的。我 们还证实高选择性的CYP4A酶抑制剂HET0016阻断VEGF在内皮细胞中的促 有丝分裂活性。DDMS是CYP4A的另一种选择性抑制剂。我们证实HET0016 和DDMS抑制体内VEGF的血管生成响应。我们还证实HET0016阻断bFGF 和EGF的血管生成响应。我们也证实HET0016降低U251， 一种人成胶质细 胞瘤细胞系诱导的血管生成。 材料与方法 微
如MiyataN等，(Br J Pharmacol 2001 ， 133:325-9)禾口 SatoM等，(Bioorg Med Chem Lett 2001， 1 l:2993-5)所述(全文纳入作为参考)合成HET0016 [N-羟基-N'-(4-丁基-2甲基苯基)甲脒]，并由Taisho Pharmaceuticals Corp (Satiama， Japan)提供。CYP4A抑制剂DDMS和稳定的20-HETE促效剂， WIT003[20-羟基二十碳-6(Z)，15(Z)-二烯酸]由德克萨斯大学西南医学中心 (University of Texas Southwestern Medical Center)的JR Falck博士合成 (Capdevila JH禾口 Falck JR， Prostaglandins Other Lipid Mediat 2002， 68-69:325-44)并且在以前使用过(Alonso-Galicia M等，Am J Physiol 1999， 277:F790-6; WangMH等，J Pharmacol Exp Ther 1998， 284:966-73;禾口 Yu M等，Eur J Pharmacol 2004， 486:297-306)。 VEGF、 bFGF禾口 EGF购自R&D Systems (Minneapolis, MN)，NCC型Hydron得自Interferon(New Brunswick, NJ)。 PCR引物由Qiagen (Valencia, CA)合成。人血管内皮细胞(HUVEC)和 相关的培养试剂购自Cambrex (Walkerville， MD)。所有其它的培养试剂购 自Invitrogen (Carlsbad, CA)。棕榈酸和所有其它的试剂购自Sigma Chemical Corp (St. Louis, MO)。
动激
使用体重200-225 g、 7-8周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA)进行实验。大鼠安置于12小时/12小时白天 /夜晚循环环境中，供给食物并随意饮水。所有方法符合在眼科和视觉研究 中使用动物的ARVO声明。使用动物得到亨利福特健康系统(Henry Ford Health System)的动物实验管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)， Detroit, MI的批准。
冊rac潸遊始
HUVEC以1 X 104细胞/孔接种于96-孔板。培养物生长过夜，然后 单独接触10 fiM HET0016、 1 |iM WIT003或250 ng/ml VEGF或联合 HET0016或WIT003共同接触。HET0016和WIT003均溶解于乙醇。有机 溶剂浓度切勿超过总培养物体积的0.1%。 24小时后，使用CellTiter96 AQueous One试剂(Promega， Madison, WI)， 一种用于测定增殖的存活细 胞数量的可靠比色方法来检测细胞增殖。20 pi Aqueous One试剂加入每孔 的100pl培养基中。板在增湿孵育箱中于37r孵育2小时。使用96- L Bio Kinetics Reader EL340(Bio-TEK， Winooski， VT)记录490 nm的吸光度。数 据表示受处理的培养物与对照细胞相比吸光度变化百分数。进行了 3个不 同的实验，并且每点均进行一式三份的测定。
雄资逾散劇定
(i)制备缓释聚合物通过制备1:1的120/。聚合物(Hydron聚羟基乙基甲 基丙烯酸酯)乙醇溶液和含有生长因子的盐水的混合物来制备缓释聚合物小 球。生长因子bFGF、 VEGF禾n EGF以浓度125 ng l溶解。HET0016和 WIT003(YuM等，Eur J Pharmacol 2004， 486:297-306)以浓度为10 ng/pl溶 解于乙醇，DDMS以浓度为5 Mg l溶解于乙醇。向每个小球加入2pl的这 些溶液。因此，含有250 ng单一生长因子的小球随机植入右眼或左眼。另 一只眼睛中植入同一剂量的含有生长因子+11￡丁0016的小球。在一些大鼠 中，小球含有单一的VEGF和VEGF + DDMS。在一只眼睛内植入20 jig 稳定的20-HETE促效剂类似物WIT003以确定它是否诱导血管生成。由于 乙醇是HET0016、 DDMS和WIT003的载体，加入乙醇作为所有其它小球 的对照。9 ^的1:1 Hydron/处理混合物置于1.5-cm杆的末端。每个小球含有250 ng其各自的生长因子。就bFGF而言，我们使用硫糖铝来稳定并维 持该生长因子缓释(VolkinDB等，Biochim Biophys Acta 1993， 1203:18-26)。 小球干燥l小时后，可立即用于植入大鼠的角膜。
(ii) 小球植入用开他敏(80 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)经IM麻醉大鼠。 眼睛用0.5。/。丙氧苯卡因(Ophthetic， Alcon， TX)局部麻醉并用珠宝镊子使眼 球突出。使用手术显微镜在平行于插入侧向直肌的方向用手术刀 (Bard-Parker # 11; Becton Dickinson, Franklin Lake, NY)进行约1.5mm长 的中心基质内线形角膜切开术。约1.5 mm宽、5 mm长的弯曲虹膜刮刀(No. 10093-13， Fine Science Tools, Belmont, CA)插入切口的边缘下并将其朝眼 睛的颞颥角膜缘(temporal limbus)小心地推过基质。角膜缘和袋之间的距离 维持于1.0 ± 0.1 mm。小球伸到袋的颞颥(temporal)末端。抗生素软膏(红霉 素)涂在眼睛的前表面。
(iii) U251人胶质瘤细胞球状体U251人胶质瘤细胞由Stephen Brown博 士(辐射肿瘤学部门，Henry Ford Health System, Detroit, MI)馈赠。细胞维 持于补加了 10%热灭活的胎牛血清、青霉素(10 IU/ml)、链霉素(IO (ig/ml) 和10。/。非必需氨基酸的DMEM (Invitrogen)中并于37。C生长在含有5。/。 C02. 的增湿孵育箱中。按照Carlsson和Yuhas(Carlsson J禾口 Yuhas JM， Recent Results Cancer Res 1984， 95:1-23)的改进方法获得U251球状体。简言之，通 过在一层0.8%Noble琼脂(Difco， Livonia, MI)上接种单细胞悬浮液(5 X 106 个细胞)来制备肿瘤细胞球状体。细胞生长2-3天直至球状体形成。选择直径 相似的球状体，然后转移到细胞培养皿上并用PBS洗涤以除去痕量的血清。使 用安装了标尺的解剖显微镜测量球状体直径。5-8个直径约200 |im的球状体吸 入装有钝头27规格针头的注射器并插入角膜袋。在该实验中， 一只眼睛含有 球状体和含有乙醇(HET0016溶剂)的小球，而另一只眼睛接受球状体和含有 20 (ig HET0016的小球。
(iv) 定量角膜新血管化小球植入7天后，大鼠如前述用开他敏和甲苯噻 嗪深度麻醉杀死。左心室插入导管并用20-25 ml盐水经作心室灌注动物，然后 用20-25 ml India墨水(防水的绘图墨水，Sanford， Bellwood， IL)灌注。目艮
29睛作朝向标记、摘下并置于4%福尔马林中24小时。将角膜与周围的眼球 和其下的虹膜切开，对切并松散地安放于两块玻璃载玻片之间从而轻柔地
铺平角膜。使用装了 CCD影像照相机的Nikon Diaphot Epi-fluor 2显微镜显 微检查这些平坦的固定物，使用计算机数字化图像并保存。
通过比较对照和实验眼睛中总的血管长度测定新血管化。通过追踪角膜缘 到小球的每根血管来确定血管长度。总长度是以像素计的这些值的和，并使用 常规图像分析软件(SigmaScanPro， SPSS, Chicago, IL)确定。
教
在所有情况中，两只眼睛均植入小球。 一只眼睛作为对照，另一只是实验 组。研究了下列组。 组l.对照
仅含有2pl乙醇的小球植入大鼠角膜。在一些实验中，我们测试了小球中 仅存在脂肪酸所导致的非特异性作用。在这些实验中，小球含有40pg棕榈酸 ("=4)。在仅用乙醇处理和用含有棕榈酸的乙醇处理的眼睛之间VEGF的血管 生成响应没有差异。
组2.CYP4A抑制剂HET0016的作用
对照对20吗HET0016或10 |ug DDMS.基于下述的剂量-应答研究选 择这些剂量("=6)。包括该组是为确定抑制剂是否具有任何明显的毒性或促 血管生成作用。在一些大鼠中也测试了 DDMS(10 pg/小球)的作用。
组3. HET0016抑制VEGF血管生成应答的剂量应答
a. VEGF对VEGF + 5吗HET0016 (n = 4)
b VEGF对VEGF + 20 ngHET0016(n = 4)
c. VEGF X寸VEGF + 40(igHET0016(n = 4)
组4.HET0016的抗血管生成作用.
在这些大鼠中，我们测试了 HET0016在VEGF、 bFGF和EGF的新血管 化应答中的作用。
a. VEGF对VEGF + 20 HET0016 (n = 6)
b. bFGF对bFGF + 20 pgHET0016 (n = 6)c. EGF对EGF + 20 fig HET0016 (n = 8)。 组5.第二种CYP4A抑制剂的抗血管生成作用.
在这些大鼠中，我们测试了 DDMS对VEGF的新血管化应答的作用。 VEGF对VEGF+10 pgDDMS (n-7)。该剂量在导向性实验后选择， 表明20 |ag HET0016是有效的。
组6.20-HETE的促血管生成作用.
在这些大鼠中，我们测试了稳定的20-HETE类似物WIT003是否是血管 生成性的。
对照对20 pg WIT003 (n = 7) 组7.HET0016的抗血管生成作用
在这些大鼠中，我们研究了 HET0016对癌症诱导的血管生成应答的作用。 就这些实验而言，我们使用已知为血管生成性的人成胶质细胞瘤癌细胞系 U251(HsuSC等，Cancer Res 1996， 56:5684-91)。球状体和含有HET0016的 小球一起植入同一角膜袋。植入球状体14天后评估血管生成应答。
U251细胞球状体对U251球状体+20 pgHET0016 0 = 8)。
扇赝C1T"/威眉表逸
(i) mRNA提取和cDNA合成使用RT-PCR检测新血管化期间角膜中 CYP4A1 mRNA的表达。快速取下角膜并在液氮中快速冷冻。稍后融化角膜 并在TRIzol中匀浆。按照生产商的方案(Invitrogen)从TRIzo1中提取总RNA。 使用260/280 nm吸光度之比评价RNA的质量。只有1.8-2.0范围内的样品 可用。使用FirstStrand synthesis kit (Invitrogen)逆转录总共1-3 pg mRNA。 Uig cDNA通过PCR扩增。
(ii) PCR分析我们使用以下特异性CYP4A1 mRNA弓l物扩增CYP4A1 mRNA:有义TTCCAGGTTTGCACCAGACTCT (SEQ ID NO:l)和反义 TTCCTCGCTCCTCCTGAGAAG (SEQ ID NO:2)。扩增的卩-肌动蛋白用作内 标。使用Applied Biosystems (Foster City， CA)的引物表达软件设计引物。 CYP4A1的mRNA序列得自GeneBank(登录号NM—175837),大鼠(3-肌动蛋 白的登录号是NM—031144。用于扩增CYP4A1和(3-肌动蛋白的PCR条件包括预循环95°C3分钟， 其后是由95°C 45秒，57°C1分钟和72°C1分钟组成的35轮循环，然后是 72。C10分钟的最终延伸。PCR产物经10%丙烯酰胺凝胶电泳并通过溴化乙 锭显像。使用合适的对照来保证扩增的样品不含基因组DNA。
统z^学分添
通过配对t-测试确定大鼠中对照和实验眼睛的差异的统计学意义。通过 ANOVA，然后事后测试确定各组之间应答的差异。；？<0.05认为是显著的。
结果
VEGF对HUVEC生长的作用示于图7。 VEGF刺激这些细胞增殖，而该 应答在同时用HET0016处理的培养物中被消除。HET0016未改变HUVEC的 基础增殖速率(未显示)。
我们接着使用大鼠角膜袋血管生成测定研究了 HET0016在体内对VEGF 的血管生成应答的作用。单用HET0016或DDMS都不能引发异于使用盐水的 应答(图8B和IIB)。为确定HET0016的最佳剂量，我们进行了剂量-应答硏究， 其中将同时含有不同剂量的HET0016和VEGF的小球植入角膜。剂量为20 jug 和40 ^g/小球的HET0016几乎完全消除了 VEGF的血管生成应答。5 pg HET0016使VEGF的血管生成应答降低约50%。由于所有化合物具有相当 的分子量和溶解性，我们选择每个小球20 pg的HET0016或其它相关化合 物。在一些实验中我们使用棕榈酸作为脂肪酸非特异性作用的对照。棕榈 酸本身无作用并且显示不能影响VEGF或其它所研究的血管生成因子的血 管生成应答(未显示)。
小球中含有VEGF导致显著的新血管化应答，该应答可被HET0016消除。 图8A显示单用VEGF和用VEGF + HET0016处理的代表性角膜显微照片， 而图8B是以图示形式显示的结果。在其它实验中，我们检查了阻断CYP4A 活性对其它生长因子的血管生成应答的作用。我们研究了 HET0016的抗血管 生成作用是否仅限于VEGF或也可抑制bFGF禾P EGF的应答。小球中含有 HET0016极大降低了 bFGF (图9A和9B)和EGF(图10A和IOB)的血管生成 应答。
32这些数据提示CYP4A活性是血管生成生长因子引发血管生成应答所需
的。为巩固该观点，我们测试了 CYP4A的化学性质相异的抑制剂，DDMS在 大鼠角膜袋血管生成试验中是否也抑制VEGF的血管生成应答。这些实验的结 果示于图IIA和IIB，并且表明DDMS也完全抑制VEGF的血管生成应答。
由于CYP4A是从花生四烯酸合成20-HETE的co-羟化酶，HET0016可 能通过抑制20-HETE合成来起作用。为确定20-HETE是否有助于CYP4A 抑制剂的抗血管生成活性，我们测试了稳定的20-HETE类似物WIT003在 体外对HUVEC增殖和在体内对新血管生长的作用。WIT003增加 HUVEC(图12)的增殖速率并且在大鼠角膜袋血管生成测定中诱导血管生成 应答(图13A和13B)。
我们也研究了 HET0016是否抑制肿瘤细胞诱导的血管生成。植入角膜 袋的人成胶质细胞瘤细胞系U251的三维球状体在两周后导致显著的血管 生成。在存在HET0016时，角膜的新血管化显著受抑制(p < 0.01)(图14A 和14B)。
评价CYP4A mRNA在大鼠角膜中表达的实验的结果显示在对照角膜 中检测到预期大小的区带。在VEGF-处理的角膜中无可检测的变化。
总之，本项研究检验了 CYP4A抑制剂对HUVEC的VEGF的促有丝分 裂应答和在体内对角膜中的生长因子诱导血管生成的作用。结果表明用 HET0016阻断CYP4A活性阻断了 HUVEC中VEGF的已知增殖性应答 (Kurzen H等，"通过非毒性剂量的替莫唑胺抑制血管生成"(Inhibition of angiogenesis by non-toxic doses of temozolomide)， Anticancer Drugs 2003， 14:515-22)。使用稳定的20-HETE类似物WIT003的实验提示了花生四烯酸 代谢物在VEGF诱导的增殖中可能有作用的其它证据。用WIT003处理 HUVEC以与用VEGF处理内皮细胞后发生的变化类似的方式增加细胞增 殖。
体内血管生成应答涉及远不止内皮细胞增殖的增加一种，因为它还涉 及包括细胞迁移、基质降解、内皮细胞分化和perimural细胞募集的其它过 程。考虑血管生成过程的复杂性，必需要证实的是血管生成的任何可能的抑制剂能影响体内完全成形血管的形成。由于我们假定对CYP4A的抑制可 改变体内血管生成应答，我们在大鼠角膜袋血管生成试验， 一种体内血管 生成模型中测试了该假设。该测定涉及将含有血管生成诱导物(在我们的实 验中是血管生成生长因子或癌细胞)的小球置于刻入角膜基质的袋中。小球 ;缓慢而持续地释放血管生成因子，进而刺激周围脉管系统缘依浓度梯度向
小球生长。由于角膜最初是无血管且透明的(Kenyon BM等，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996， 37:1625-1632)，与其它体内测定相比，仅检测 新血管更有利。
当VEGF、 bFGF或EGF植入大鼠角膜时观察到强有力的血管生成应 '答。HET0016的存在消除了所有这些生长因子的血管生成应答。由于存在 有效的CYP4A抑制剂时血管生成应答实际上被消除，这表明CYP4A是血 管生成的关键调控物。已报道烯烃化合物DDMS是有效和高度选择性的 CYP4A抑制剂，其结构和作用机理与HET0016无关(Wang MH等，J Pharmacol Exp Ther 1998， 284:966-73)。 DDMS也消除了 VEGF对角膜新血 管化的作用。因此，两种不同的CYP4A抑制剂消除了 VEGF诱导的血管生 成应答，从而加强了这些抑制剂影响血管生成过程中的主要步骤的观点。 由于抑制CYP4A明显是HET0016和DDMS之间的共同点，我们得出结论 CYP4A酶活性的一种产物是血管生成过程进行的介体或所需组分，缺少其 血管生成过程就无法进行。
血管生成是生理状况，例如伤口愈合与女性生殖周期中的关键现象， 并且也是病理情况，例如糖尿病性视网膜病变、黄斑变性和慢性炎症中的 关键现象。特别是，肿瘤扩张依赖于血管生成，这对于超过l-2mm以上的 肿瘤生长是至关重要的。因此，抑制肿瘤生成新血管的能力是有吸引力的 治疗目标。
因此，我们研究了 HET0016是否可影响肿瘤诱导的血管生成。为此目 的，我们选择了已知是高度血管生成的恶性成胶质细胞瘤细胞模型，成胶 质细胞瘤细胞系U251。由于成胶质细胞瘤的多种形态由强烈的血管生成所 区分(HsuSC等，Cancer Res 1996， 56:5684-91)，这是临床相关的。我们将U251球状体连同含有HET0016或对照(棕榈酸或盐水)的小球一起植入大鼠 角膜基质。所有的对照眼睛显示显著的角膜新血管化；然而，HET0016显 著降低约70%的血管生成应答。
实施例3
HET0016抑制人胶质瘤癌细胞中的细胞增殖 该实施例显示20-HETE对人癌细胞生长重要。1 fim的20-羟基二十碳 -5(Z),14(Z)-二烯酸， 一种稳定的20-HETE促效剂使人胶质瘤U251细胞增 殖增加约20%。剂量-应答研究表明用10 HET0016处理48小时抑制约 60%的U251细胞增殖，同时[3司胸苷摄取降低65%。 二溴十二碳烯基甲磺 酰亚胺(DDMS，也称为iV-甲磺酰基-12, 12-二溴十二烷基-11-烯酰胺)， 一种 结构不同的CYP4A抑制剂也阻断约60%的细胞增殖。DDMS和HET0016 均对正常人血管内皮细胞或角化细胞的基础生长无作用。流式细胞计数研 究证实HET0016通过使细胞周期停滞于Go/G,来特异性抑制人U251癌细 胞的增殖。加入20-HETE促效剂(l pM)逆转HET0016对细胞增殖的阻断约 70%。 Western印迹实验表明HET0016改变U251癌细胞的酪氨酸磷酸化从 而导致在HET0016处理24和48小时后观察到的抑制作用。进一步研究显 示加入HET0016特异性抑制p42/p44 MAPK和SAPK/JNK的磷酸化。 材料与方法
潘應系与试^/: U251人胶质瘤细胞得自Stephen L. Brown博士(辐射肿 瘤学部门，Henry Ford Health System, Detroit, MI)。人血管内皮细胞(HUVEC) 购自Cambrex (East Rutherford, NJ)。原代人角化细胞得自George Murakawa 博士(皮肤病学系，Wayne State University, Detroit, MI)。 HET0016 [N-羟 基—N'-(4-丁基-2甲基苯基)甲脒]由Taisho Pharmaceuticals(Japan)馈赠。 DDMS、棕榈酸和EGF购自Sigma (St. Louis， MO)。 WIT003[20-羟基二十 碳-6(Z),15(Z)-二烯酸]， 一种20-HETE促效剂由德克萨斯大学西南医学中心 生物化学系(Dallas， Texas)的John R Falck博士合成。所有其它细胞培养试 剂购自Invitrogen (Carlsbad, CA)。4^荞条伴细胞常规维持于补充有10。/。热灭活的胎牛血清(FBS)、青霉
素(IO IU/ml)、链霉素(IO pg/ml)和10%非必需氨基酸的DMEM中(均购自 Invitrogen)。细胞于37'C维持在含有5% C02.的增湿孵育箱中。细胞生长在含 有10%FBS的培养基中，然后用使U251细胞对数生长的无血清培养基替换 FBS。除去血清一天后开始处理。
潘應潜遭漱定用以至少保证对数生长5天的密度涂布的培养物进行 增殖研究。涂布24小时后，用无血清培养基替换生长培养基。如方法中所 述，用各种浓度的给定化合物处理细胞24或48小时。HET0016、 DDMS 和WIT003均用乙醇(EtOH)溶解并稀释。有机溶剂切勿超过总培养物体积 的0.1%。通过与0.05。/。胰蛋白酶/EDTA接触来收集细胞并用血球计数器计 数。
/"3/// 渗乂^^充:使用生长于35-mm培养皿中的细胞进行胸苷掺入研 究。用HET0016处理1小时后，培养物在各时间用[甲基-311]胸苷(1 |uCi/ml 培养基)脉冲。棕榈酸和EtOH分别用作脂肪酸和载体对照。脉冲结束时， 吸去培养基并用冷的1 X磷酸缓冲盐水(PBS)清洗细胞两次。清洗的培养 物通过在4。C与冷的5%三氯乙酸接触过夜固定，然后按照前述提取固定的 细胞(Scholler等，Mo/.尸/^rmoco/. 45: 944-954， 1994)。第二组未固定的培 养皿用0.05%胰蛋白酶/EDTA处理来估计细胞数目。通过闪烁计数检测卩H] 胸苷并表示为dpm/103细胞。
嚴式潘應^教细胞以能保证在收集时为对数生长的密度培养于 100-mm培养皿中。先前描述过通过使用碘化丙锭(PI)的流式细胞计数检测 DNA的收集和加工方案(Reiners等，Carc/"ogenew^ 20: 1561-1566， 1999)。 在Wayne State University Flow Cytometry Core Facility, Detroit, MI用 Becton Dickinson FACScan分析细胞。用DNA直方图拟合程序(MODFIT; Verity Software, Topsham， ME)确定处于细胞周期Go/G,、 S和G2/M期的 细胞百分比。至少收集104种情况/样品。
DA^ TI/A^丄实验HET0016-处理的培养物用1 X PBS洗
涤两次并与裂解缓冲液[20 mM Tris-HCl、 10 mM EDTA、 0.3% Triton X-100]一起孵育。提取基因组DNA并在2M琼脂糖凝胶上分离。通过用溴化乙锭 (EtBr)染色凝胶来使分离的DNA显像。同时将U251培养物接种于盖玻片 上并用HET0016处理来进行TUNEL测定。盖玻片用3 X PBS洗涤，风 干。然后用新鲜配制的固定溶液(4。/。PBS配制的低聚甲醛，pH7.4)于室温固 定样品1小时，接着在新鲜的渗透化溶液(0.1。/。柠檬酸钠配制的0.1% Triton X-100)中于冰上孵育2分钟。最后根据生产商的建议使用原位细胞死亡检 观!Ji式齐U盒，AP (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)力卩工样品。
i M4 iA庸浙逆存^-,^糜链《及应(7 r-PC7 力培养物分别用10 |aM HET0016或100 pM DDMS处理24和48小时。乙醇处理的培养物用作溶 剂对照。简言之，用Trizol试剂(Invitrogen)分离总RNA并使用首链合成试 剂盒(Invitrogen)用1-2叫RNA来合成cDNA。我们使用特异识别CYP4A 的PCR引物和P-肌动蛋白-特异性引物。向Platinum PCR Supermix (Invitrogen)中加入1 (iCi "P/样品。用于扩增CYP4A和(5-肌动蛋白的PCR 条件包括95。C、 3分钟的预循环；然后是95。C、 45秒'52°C、 30秒和72 °C、 2分钟的35轮循环；和72'C、 10分钟的最终延伸。所用的引物是(3-肌动蛋白正向引物，5，- TGC GTG ACA TTA AGG AGA AG -3， (SEQ ID NO:3);卩-肌动蛋白反向引物，5，-GCTCGTAGC TCT TCT CCA -3， (SEQ ID NO:4); CYP4A11正向引物，5，-CCA CCT GGA CCA GAG GCC CTA CAC CAC C-3， (SEQ ID NO:5); CYP4A11反向引物，5，-AGG ATA TGG GCA GAC AGG AA -3，(SEQ ID NO:6)。 PCR产物经5%双-丙烯酰胺凝胶电泳并 通过放射自显影显像。
煮y备凝遂欲激浙『ew""伊遂用10 |aM HET0016处理细胞不同时间 并用冰冷却的l X PBS洗涤两次。然后于4。C以1,000 g离心细胞5分钟 得到沉淀。加入RIPA缓冲液[20 mM HEPES (pH 7.4)， 100 mM NaCl， 1% Nonidet P-40， 0.1% SDS， 1%脱氧胆酸，10%甘油，1 mM EDTA， 1 mM NaV03， 50 mM NaF和蛋白酶抑制剂Set 1 (Calbiochem， La Jolla， CA)]裂 解细胞。然后刮板并将细胞收集在1.5-ml离心管中，再于冰上孵育30分钟。 细胞悬浮液的匀浆液于4。C以14,000 g离心10分钟，弃去沉淀并通过二辛可宁酸(bicinchoninic acid)(BCA)蛋白质实验确定上清液中的蛋白质浓度。
20 pg蛋白质一般在14。/。三甘氨酸凝胶(Irwitrogen)上分离并电印迹至 PVDF膜(Biotrace，Bothell， WA)。膜在与封闭缓冲液[1 X PBS配制的0.2% I-封闭试剂(Tropix， Bedford, MA)， 0.P/o吐温-20]配制的一抗孵育(4。C过 夜)前，用封闭缓冲液于室温封闭1小时。磷酸-酪氨酸(Y102)、磷酸-丝氨 酸/苏氨酸-Pro MPM2、磷酸-p42/p44 MAPK (T202/Y204)(20G1 l)和磷酸 -SAPK/JNK(T183/Y185)(98F2)单克隆抗体购自Upstate, Waltham， MA。此 夕卜，CYP4A多克隆抗体购自Research Diagnostics (Flanders, NJ)和Chemicon (Temecula， CA)来检测CYP4A蛋白。使用1:2000稀释的对应抗体检测磷 酸-酪氨酸(Y102)和磷酸-丝氨酸/苏氨酸-Pro MPM2，使用1:1000稀释的抗 体检测磷酸-p44/p42MAPK和磷酸-SAPK/JNK。 CYP4A抗体以1:100稀释 度使用。膜在洗涤缓冲液(l X TBS和0.1%吐温-20)中洗涤3次后，于室 温和过氧化物酶偶联的山羊抗-小鼠或抗-家兔抗体(Upstate， Waltham， MA) (在封闭缓冲液中以1:4000稀释)孵育1小时。然后在洗涤缓冲液中洗涤膜3 次，并根据生产商的方案用改善的化学发光试剂盒(Upstate)进行化学发光检
测。肌动蛋白用作加样对照。
统7^学分析数据通过Tukey HSD测试分析。用Statistica 5.0软件包 (StaSoft， Tulsa, OK)进行这些计算。p < 0.05处的差异认为是统计学显著的。
结果
C1T" #劍对潘應潜遭游/^^:为评价20-HETE在调节U251细胞生 长中的作用，我们研究了 CYP4A抑制剂HET0016在体外对人U251胶质瘤 癌细胞增殖和生长的作用。我们用各种浓度的HET0016处理细胞2天，然 后计数细胞。HET0016以浓度依赖性的方式抑制U251细胞的基础增殖(图 15A)。由于台盼蓝排除显示细胞的存活率未受HET0016影响，这认为是细 胞抑制作用。此外，HET0016也抑制EGF诱导的增殖(图16)。剂量-应答 研究显示10 jliM HET0016抑制约60%的U251细胞增殖，该浓度用作我们 所有随后研究的工作浓度。进行DNA片断化和TUNEL实验来检测 HET0016是否在U251细胞中诱导凋亡。由于两种结果均是阴性(数据未显示)，我们的结论是HET0016未在这些细胞中诱导凋亡。为确定HET0016 对正常细胞是否有对U251癌细胞相同的作用，我们用10 ^MHET0016处 理HUVEC和人基础角化细胞。HET0016对两种正常类型人细胞的生长或 增殖均无作用(图17)。胸苷掺入的分析显示向培养基中加入HET0016约24和48小时后， 50%和60%的DNA合成受到抑帝D(图15B)。与HET0016相同的是，DDMS， 一种结构不同的20-HETE合成抑制剂也以剂量依赖性方式抑制U251癌细 胞增殖(图18)。
魔式浙應术进行细胞DNA含量的流式细胞术来确定HET0016的抗 增殖作用是否反映了细胞周期停滞在某一特定位置(图15C)。含有G"G, DNA的细胞在HET0016处理的24和48小时处积累，伴有S和G2/M期细
胞的丧失。
CT尸W ,mi A^浙歪^屑^:乎游表达:我们进行了 RT-PCR和Western 印迹实验来确定CYP4A是否在U251细胞中表达。DNA测序证实CYP4A11 mRNA在对照U251培养物中表达。用10 ^MHET0016处理细胞24小时后 转录水平下降，而在用100 pM DDMS处理的培养物中未受影响。因此， CYP4A基因得到转录并在U251培养物中表达信息。此外，使用得自两种 商业来源的两种不同CYP4A多克隆抗体的Western印迹实验显示两种抗体 检测到与CYP4A的预期分子量一致的约55 kDa的免疫活性蛋白质。因此， 人U251癌细胞在mRNA和蛋白质水平表达CYP4A。
^#炬资^/好丝游77￡7^类^激W t/25/虜潘應谱遭游 :我们 测试了具有促效剂特征的稳定的20-HETE类似物WIT003对生长于培养基 中的U251癌细胞增殖的作用。用0.1和1.0 fiM的20-HETE促效剂处理血 清禁食培养物48小时，然后计数细胞。由于已知EGF能导致U251细胞最 大增殖，它用作阳性对照。浓度为O.l [iM的WIT003对U251细胞增殖的 刺激作用不比50 ng/ml EGF强，但1.0 WIT003剌激约20%U251癌细 胞增殖。作用的强度与200 ng/mlEGF诱导的生长刺激作用相当(图19)。
20-//￡r￡炬效^/逆^i^r卯/6游贫潜潜H:我们检测了外源性添加
3920-HETE促效剂WIT003是否可逆转用HET0016阻断内源性20-HETE合成 所诱导的U251细胞增殖抑制。在该实验中，用1 iliM WTT003、 10 (iM HET0016或同时用两种化合物处理U251培养物。处理2天后计数细胞。 在存在WIT003和HET0016时，U251增殖增加至70%，超过了在单用 HET0016处理的培养物中观察到的(图20)。这些结果说明加入稳定的 20-HETE促效剂WIT003逆转了 HET0016抑制U251癌细胞增殖的作用。
CJ7M^ #觀矽惑7應^#号存导歪^游;^發众游 :为阐明与 HET0016在U251细胞中对20-HETE形成抑制相关的下游信号传递作用， 从用HET0016处理不同时间的U251培养物中分离蛋白质提取物。为检测 HET0016在U251细胞的蛋白质的酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化状态 中诱导的变化，使用磷酸-酪氨酸(Y102)抗体和磷酸-Ser/Thr-Pro MPM2抗体 进行Western印迹。我们发现HET0016在U251细胞中改变了酪氨酸磷酸 化，导致其在加入HET0016后24和48小时显著降低。然而，用HET0016 处理的U251细胞中蛋白质的丝氨酸/苏氨酸磷酸化未见有明显变化。其它 两种抗体用于检测HET0016如何如何影响p42/p44 MAPK和SAPK/JNK磷 酸化。HET0016在24和48小时抑制p42/p44 MAPK和SAPK/JNK磷酸化。 因此，MAPK和SAPK/JNK途径可在CYP4A抑制导致的信号转导中起作 用。
实施例4
20-HETE抑制剂在体外和体内抑制大鼠胶质肉瘤细胞增殖 该实施例显示CYP4A的选择性抑制剂HET0016在体外对9L生长和体 内在大鼠的9L诱导大脑肿瘤中的作用。RT-PCR确定C YP4A基因在9L细 胞中高度表达。用高度选择性的抑制剂，HET0016抑制CYP4A活性以剂 量相关的方式降低9L细胞增殖。加入10 pM HET0016 48小时后使9L细 胞增殖降低60%。 1 ^M的稳定的20-HETE促效剂WIT003拯救HET0016 抑制的细胞增殖约70%。 EGF (200 ng/ml)使生长于体外的9L细胞增殖增加 约30%。用1 nM WIT003获得类似的刺激程度。HET0016几乎消除了 EGF-诱导的9L细胞生长。Western印迹分析显示HET0016降低p42/p44 MAPK 和SAPK/JNK的磷酸化。在大鼠中，通过将9L细胞直接注射入前脑诱导体 内大脑肿瘤。用HET0016 (1 mg/Kg/天，的处理大鼠约2周使大脑肿瘤体积 降低80%。这是因为注射的9L细胞的有丝分裂降低一级凋亡增加。 材料和方法
潜孝条伴9L大鼠胶质肉瘤细胞购自ATC(Gaithersburg， MD)并维持 于DMEM(Invitrogen)中，其中DMEM补加了 10。/。热灭活的胎牛血清(FBS)、 青霉素(IO IU/ml)、链霉素(IO吗/ml)和10%非必需氨基酸(均购自 Invitrogen)。细胞于37'C维持在含有5% (302.的增湿孵育箱中。细胞生长在含 有10%FBS的培养基中，然后用使9L细胞对数生长的无血清培养基(给出类型 和来源)替换FBS。
潘應潜;^实验用以至少保证对数生长5天的密度涂布的培养物进行 增殖研究。涂布24小时后， 一般用无血清培养基替换生长培养基。用 HET0016 (Taisho Pharmaceuticals, Japan)、 DDMS、棕榈酸(非特异性脂肪 酸对照)、EGF(Sigma， St. Louis， MO)或WIT003 (20-HETE促效剂)处理细 胞24或48小时。HET0016、 DDMS和WIT003均用乙醇(EtOH)溶解并稀 释。加入培养基的乙醇浓度切勿超过0.1%。通过与0.05。/。胰蛋白酶/EDTA 溶液接触来收集细胞并用血球计数器计数。
,///廯,渗乂,究:使用生长于35-mm培养皿中的细胞进行胸苷掺入研 究。用HET0016处理1小时后，培养物在各时间用[甲基-3司胸苷(1 pCi/ml 培养基)脉冲。棕榈酸和EtOH分别用作非特异性脂肪酸和载体对照。脉冲 结束时，吸去培养基并用冷的1 X磷酸缓冲盐水(PBS)清洗细胞两次。清 洗的培养物通过在4X:与冷的5%三氯乙酸接触过夜固定，然后按照前述提 取固定的细胞(Scholler等，Mo/.尸/zwmaco/. 45: 944-954， 1994)。第二组未 固定的培养皿用0.05%胰蛋白酶/EDTA处理来估计细胞数目。通过闪烁计 数检测[力]胸苷并表示为dpm/103细胞。
戶銜众^7rWVE丄实-澄HET0016-处理的9L培养物用1 X PBS 洗涤两次并与裂解缓冲液[20 mM Tris-HCl、 10 mM EDTA、 0.3% Triton
41X-100]—起孵育。提取基因组DNA并在2。/。琼脂糖凝胶上分离。分离的DNA 通过用溴化乙锭(EtBr)染色凝胶来目测。同时将9L培养物接种于盖玻片上 并用HET0016处理来进行TUNEL实验。盖玻片用3 X PBS洗涤，风干。 然后用新鲜配制的固定溶液(4。/。PBS配制的低聚甲醛，pH7.4)于室温固定样 品1小时，接着在新鲜的渗透化溶液(0.1%柠檬酸钠配制的0.1% Triton X-100)中于冰上孵育2分钟。最后根据生产商的建议使用原位细胞死亡检 测试剂盒，AP (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)加工样品。
^V^分,/〃逆存f-,^朦楚《f座(^r-尸C7 "培养物分别用10 MM HET0016或100 (iM DDMS处理48小时。EtOH处理的培养物用作溶剂对 照。然后用Trizol试剂(Invitrogen)分离总RNA并使用首链合成试剂盒 (Invitrogen)用1-2 |ag RNA来合成cDNA。我们使用特异识别CYP4A的PCR 引物和P-肌动蛋白-特异性引物。Platinum PCR Supermix (Invitrogen)用作反 应混合物。用于扩增CYP4A1/2/3和P-肌动蛋白的PCR条件包括95°C、 3 分钟的预循环；然后是95。C、 45秒，52°C、 30秒和72。C、 2分钟的35轮 循环；和72'C、 10分钟的最终延伸。所用的引物是(3-肌动蛋白正向引物， 5，-TTC AAC ACC CCA GCC ATG T-3， (SEQIDNO:3); (3-肌动蛋白反向引 物，5，- GTG GTA CGA CCA GAG GCA TAC A -3' (SEQ ID NO:4); CYP4A1/2/3正向引物，5，- TTC CAG GTT TGC ACC AGA CTC T -3， (SEQ IDNO:5); CYP4A1/2/3反向引物，5，國TTC CTC GCT CCT CCT GAG AAG -3， (SEQ ID NO:6)。 PCR产物经5%双-丙烯酰胺凝胶电泳并通过放射自显 影显像。
劍备樣楚欲激萝『ew""伊遂用10 pM HET0016处理9L细胞各种 时间并用冰冷却的PBS洗涤两次。然后于4°C以1,000 g离心细胞5分钟得 到沉淀。加入RIPA缓冲液[20 mM HEPES (pH 7.4)， 100 mM NaCl， 1% Nonidet P-40， 0.1% SDS， 1%脱氧胆酸，10%甘油，1 mM EDTA， 1 mM NaV03， 50 mM NaF和蛋白酶抑制剂Set 1 (Calbiochem， La Jolla， CA)]裂 解细胞。然后刮板并将细胞收集在1.5-ml离心管中，再于冰上孵育30分钟。 细胞悬浮液的匀浆液于4t:以14,000 g离心10分钟，弃去沉淀并通过二辛可宁酸(BCA)蛋白质实验确定上清液中的蛋白质浓度。
得自细胞匀浆液的20 iag蛋白质一般在14。/。三甘氨酸凝胶(Irwitrogen) 上分离并转移至PVDF膜(Biotrace， Bothell， WA)。膜用封闭缓冲液[l X PBS配制的0.2% I-Block试剂(Tropix， Bedford, MA)， 0.1%吐温-20]于室 温封闭1小时，然后于4。C与封闭缓冲液配制的一抗孵育过夜。磷酸-p42/p44 MAPK (T202/Y204)(20G1 l)和磷酸-SAPK/JNK(Tl83/Y185)(98F2)单克隆抗 体购自Upstate(Waltham， MA)。此夕卜，购自Research Diagnostics (Flanders， NJ)和Chemicon (Ternecula， CA)的CYP4A多克隆抗体用于检测CYP4A蛋 白。使用1:1000稀释的抗体检测磷酸-p44/p42MAPK和磷酸-SAPK/JNK。 CYP4A抗体以1:100稀释度使用。膜在洗涤缓冲液(l X TBS和0.1%吐温 -20)中洗涤3次后，于室温和过氧化物酶偶联的山羊抗-小鼠或抗-家兔抗体 (Upstate)(在封闭缓冲液中以1:4000稀释)孵育1小时。然后洗涤膜3次， 并使用改善的化学发光试剂盒(Upstate)显影。然后剥下膜并用作为加样对照
的(3肌动蛋白一抗再次探查。
,i腔A:植入前，90%汇合的9L细胞经胰蛋白酶化并离心。细胞沉 淀重悬于DMEM+ 10。/。FBS并用血球计数器计数。9L细胞的浓度调整为1 X 104细胞/5 W培养基。
按照下述通过将9L细胞悬浮液注射入购自Charles River Laboratories (Wilmington, MA)的Fisher 344大鼠的前脑皮层来接种大脑肿瘤。用开他 敏(80 mg/Kg, im)和甲苯噻嗪(13 mg/Kg)麻醉大鼠，将头部固定于立体定向 框架(David Kopf Instruments, Tujunga， CA)并暴露颅骨。在颅骨中前囱的 侧面2 mm和前部2.5 mm处钻一小孔，使用装有26规格针头的10 Hamilton (#2701 )注射器在5分钟期间将5 ^ 9L胶质肉瘤细胞悬浮液注射入 大脑皮层内3.5mm处。用骨蜡封闭该孔并闭合切口 。让肿瘤生长2天并形 成后，大鼠每天以10mg/kg/天的剂量皮下(sc)注射HET0016或载体卵磷脂 两次。用HET0016或载体处理15天后，用80 mg/Kg(开他敏)麻醉杀死大 鼠并用250 ml无菌的0.9。/。盐水溶液经心脏穿刺冲洗，然后用生理盐溶液配 制的10%福尔马林灌注固定。取出大脑并保存于10%福尔马林中。页
伊份/W蘑沐茨福尔马林固定的大脑置于Coronal大鼠大脑基质中并 切为3毫米小块。然后将这些块包埋于石蜡中并制备6pM厚的切片。制备 用于H&E染色的切片放于无涂层的载玻片上。用于免疫组织化学分析的切 片放于带正电的超磨砂载玻片上。该系列切片用H&E染色来评价肿瘤大小 并通过Ki-67抗原的免疫组织化学方法来评价增殖程度。
使用2X物镜的SONY CCD照相机拍下含有肿瘤的H&E染色切片的 图像。使用AIS图像分析系统(Imaging Research, St. Catherine, ON， Canada) 软件手工绘出每个切片中肿瘤的面积并以mmh则量。然后面积乘以切片的 厚度来计算切片体积。然后将所有切片的体积取和得到每只大鼠的总肿瘤 体积。
制备用于免疫组织化学分析的切片通过于加热板上在柠檬酸缓冲液 (pH6.0)煮沸IO分钟来除去石蜡。切片冷至室温，置于封闭缓冲液[PBS配 制的2。/。常规血清、1。/。BSA]中1小时，在洗涤缓冲液中[PBS配制的0.05吐 温-20]洗涤两次，用过氧化氢封闭10分钟并在洗涤缓冲液中漂洗。然后将 切片与家兔多克隆抗-ki67抗体(AbcamInc.， Cambridge, MA;在PBS配制 的1.0%BSA中以1:200稀释)孵育30分钟。切片在洗涤缓冲液中洗涤，与 生物素化的山羊抗-家兔IgG(Vector Laboratories, Inc., Burlingame， CA; PBS配制为l:500)孵育30分钟并再次洗涤。切片然后与HRP-链霉抗生物 素蛋白(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; PBS 配制为l:500)孵育30分钟并洗漆。DAB底物(Vector Laboratories, Inc.， Burlingame, CA; 2滴底物缓冲液，4滴DAB， 2滴用5 ml蒸馏水配制的 过氧化物)涂布于切片8分钟。然后洗涤切片，在Meyer苏木精中复染5秒， 在氨水中染蓝，在水中漂洗，千燥，清洁并固定。
嚴泣源亡分桥其它切片如上述除去石蜡并用ApopTag过氧化物酶检 测试剂盒(Chemicon International Inc., Temecula， CA)分析凋亡情况。简言 之，用蛋白酶(20 (ig/ml)于室温消化复水的切片15分钟，然后在3.0%11202 中猝灭5分钟并洗涤。然后于37"C用TdT酶在增湿室中标记1小时并于室 温施用抗-洋地黄毒苷偶联物30分钟。洗涤切片、在过氧化物酶底物中显
44影、在5%甲基绿中复染IO分钟，干燥并固定用于光显微镜检测。
!^/"学分,使用ANOVA，再用Tukeys测试分析数据。p < 0.05处
的差异认为是统计学显著的。 结果
CJT"游/ r-尸CR:由于据报道HET0016是CYP4A禾卩4F酶催化的 20-HETE合成的高度选择性抑制剂，我们首先通过RT-PCR检测CYP4A mRNA是否在9L胶质肉瘤细胞中表达。我们观察到CYP4A的mRNA在体 外生长的9L细胞中表达。
,虔y C1TW ^沐,/^ 9丄it资應發潘應潜遭游/，屑各种浓度的 HET016对9L胶质肉瘤细胞生长的作用示于图21。根据细胞计数直接评估， HET0016对生长在培养物中的9L细胞产生剂量依赖性抑制(图21A)。即使 在非常低的10 nM浓度(接近该化合物抑制CYP4A —些同种型的报道 IC50)，虽然与对照的差异不显著(p-0.056)，对细胞生长一定程度的抑制也 是明显的。1和10 pM浓度的HET0016在24和48小时明显使细胞数量降 低30-40%。
在其它实验中，我们测试了高浓度(IOO )aM)的HET0016对9L细胞生 长的作用。这导致细胞数量显著降低。然而，我们也观察到细胞实质性的 解离和培养基中漂浮有死细胞，这提示此浓度的HET0016可能具有直接的 细胞毒性作用。因此，我们决定在以后所有的实验中使用10 浓度的 HET0016。如图21B所示，HET0016 (10 iiM)在9L胶质肉瘤细胞的培养物 中使胸苷掺入降低60%。图21B所示生长曲线的检测表明HET0016改变该 特性曲线的斜率，这表明其是对细胞增殖起作用而非杀死一群细胞进而导 致特性曲线中预期的基线偏移。
DDMS在体外对9L细胞增殖的作用DDMS是CYP4A的一种高度选 择性的自杀底物抑制剂，但其化学结构和作用机理与HET0016极为不同。 各种浓度的DDMS在体外对9L细胞的生长速率的作用示于图22。这些结 果与用HET0016观察到的相当。在接近抑制CYP4A酶的IC50的10 pM浓 度时，DDMS明显降低细胞数量。在较高浓度(IOO ^M)， DDMS降低这些细胞增殖的作用和HET0016(10 nM)的相似。
//五r卯M ^沐,/对五GF W激游处潘應全长游伊^: 9L细胞与EGF (200 ng/ml)接触在24和48小时增加细胞数量(图23)。加入HET0016 (10 |uM) 防止EGF在24小时对细胞生长的作用并在48小时降低细胞数量(图23)。 比较生长曲线的斜率提示HET0016的抑制作用在24-48小时间变弱。
20-//￡7^类奴欽#//五7^"游生长肃^伊賴游/，^:为确定HET0016 对9L胶质肉瘤细胞生长的抗增殖作用是否与抑制20-HETE合成相关，我 们检测了外源性加入WIT003， 一种稳定的20-HETE促效剂是否可阻止 HET0016的抗增殖作用。示于图24的结果表明向培养基中加入WIT003 (1 ^M)部分拯救了 9L细胞免遭HET0016的抑制作用。将单用HET0016诱导 的抑制视为100%，用HET0016 + WIT003处理的细胞显示仅使增殖有60% 的提高。
/7￡7^)/6 W M4尸《萝游激賓發艨發众游/fl:为进一步理解 HET0016可抑制9L细胞生长的机理，我们检测了 HET0016对有丝分裂原 激活的蛋白质激酶(MAPK)的磷酸化和激活的作用，该激酶已知在9L细胞 的细胞生长和增殖中起作用。用HET0016 (10 pM)处理9L细胞4小时明显 降低了 p42/p44 MAPK和SAPK/JNK的磷酸化。p42/p44 MAPK磷酸化的降 低甚至高于接触HET001624小时后的。JNK的磷酸化也观察到相同的趋势， 虽然抑制在48小时达到最高而非在接触HET0016的24小时时。
浙W渐劍^/,丈廣沐片jy犬嵐处^^^應^^7t^,i^生长游, y^: 9L细胞植入正常、免疫活性大鼠的前脑后，它们形成具有明确边界的 快速生长的肿瘤。在现有实验条件下，如果不处理动物通常在2-3周后死 亡。在本项研究中，植入肿瘤17天后，我们发现用HET0016处理的大鼠 看起来更健康并且在尸检时显示比在未处理对照大鼠中所观察到的小得多 的肿瘤(图25)。对照和HET0016处理大鼠通过肿瘤中面的代表性切片连同 对肿瘤体积的比较示于图26。与对照动物中观察到的相比，HET0016处理 大鼠的肿瘤体积降低了 80%(图26)。
嚴泣源亡分,游/^菜9L肿瘤的切片用抗体免疫染色来确定细胞增殖和凋亡的面积。用HET0016慢性处理的大鼠9L肿瘤中用Ki67抗体阳性染 色的有丝分裂细胞数量极大降低。相反，用载体或HET0016处理的大鼠9L 肿瘤中阳性染色的凋亡细胞数量上无明显差异。这些结果表明用HET0016 抑制20-HETE的合成通过使细胞增殖停滞来抑制肿瘤生长而非刺激癌细胞 的凋亡和程序性死亡。
本发明不受上述实施例的限制，但包括附加的权利要求范围内的所有 改进和变化形式。序列表
〈110〉 R. J.罗曼(Roman, Richard J.) A.格林(Greene, Andrew) S.阿马拉尔(Amaral， Sandra L.) G.希^利(Scicli' Alfonso Guillermo) S. L布朗(Brown, Stephen) P.陈(Chen, Ping) M.享R (Guo， Meng)
<120>调节血管生成和癌细胞增殖的方法
<130> 650053.00031
〈150〉 US 60/520， 172 〈151〉 2003-11-14
<160〉 6
<170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211> 22
〈212〉 DNA <213>人工的
〈220〉
<223〉 合成的PCR引物 〈400〉 1
ttccaggttt gcaccagact ct
〈210〉2
〈211〉21
〈212〉廳
〈213>人工的
〈220〉
〈223〉 合成的PCR引物 〈400〉 2
ttcctcgctc ctxctgagaa g 〈210> 3
48〈211> 20
〈212〉 DNA <213〉人工的
〈220〉
〈223> 合成的PCR引物
〈400〉 3
tgcgtgacat taaggagaag 20
〈210〉 4
〈211> 18
〈212〉 DNA
<213〉 人工的
<220〉
<223〉 合成的PCR引物
<400> 4
gctcgtagct cttctcca
<210>5
〈211〉28
〈212〉DNA
<213〉人工的
〈220〉
〈223〉合成的PCR引物 <400> 5
ccacctggac cagaggccct acaccacc
<210> 6
〈211〉 20
<212〉 DNA
<213> 人工的
<220>
〈223〉 合成的PCR引物
<400〉 6
aggatatggg c卿caggaa
权利要求
1. 20-HETE或20-HETE促效剂在制备用于诱导和促进人或非人哺乳动物组织中血管生成的药物中的用途。
2. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，制备中使用的是20-HETE促效剂。
3. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，用于制备用于促进非肌肉 组织中的血管生成的药物。
4. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，用于制备用于治疗或预防 与人或非人哺乳动物中血管生长不足或血管退化有关的疾病或病症的药 物。
5.20羟基二十碳-6(Z),15(Z)-二烯酸在制备用于诱导和促进人或非人哺 乳动物组织中血管生成的药物中的用途。
6. 20-HETE合成抑制剂或20-HETE拮抗剂在制备通过抑制癌细胞增殖 来治疗人或非人动物中癌症的药物中的用途。
7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，制备中使用的是20-HETE 合成抑制剂。
8. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述20-HETE合成抑制剂 选自N-羟基-N'-(4-丁基-2-甲基苯酚)-甲脒(HET0016)、 二溴十二碳烯基甲 磺酰亚胺(DDMS)、 N-(3-氯-4-吗啉-4-基)苯基-N'-羟基亚氨甲酰胺(TS-011)、 l-氨基苯并三唑(ABT)、 17-十八炔酸(17-ODYA)、酮康唑、氟康唑或10十 一炔基硫酸酯(10-SUYS)。
9. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述20-HETE合成抑制剂 是HET0016、 TS-011或DDMS。
10. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，制备中使用的是20-HETE 拮抗剂。
11. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述癌症选自胶质瘤、 星形细胞瘤、肠癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、结肠癌或卵巢癌。
12. 如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述癌症选自胶质瘤、 乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌、胰腺癌或结肠癌。
13. 如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述癌症是人或大鼠胶
全文摘要
公开了通过调节20-HETE活性来调控血管生成的方法。还公开了通过使癌症和肿瘤细胞接触20-HETE抑制剂来抑制癌症和肿瘤细胞生长的方法。
文档编号A61K31/335GK101507720SQ20091000986
公开日2009年8月19日 申请日期2004年11月12日 优先权日2003年11月14日
发明者A·格林, G·希克利, R·J·罗曼, S·L·布朗, S·阿马拉尔 申请人:Mcw研究基金会股份有限公司;亨利福特健康系统