专利名称：：黄连水提取物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物化学领域，更具体地，涉及黄连水提取物在制备治疗牙周炎的药物中的应用。
发明内容在以往的研究中，有涉及黄连治牙周炎的文献，但都是应用的复方制剂。本研究①釆用黄连水提取物这一单一的有效成分治疗牙周炎，这与以往采用复方制剂不同；②应用黄连水提取物制备成牙周药膜，临床应用更为方便，查阅文献未见相同的报道。本发明涉及黄连水提取物在制备治疗牙周炎的药物中的应用。1)黄连对牙周致病菌有明显的抑制作用，可以用于牙周疾病的预防及治疗。2)应用黄连水提取物制备成牙周药膜，对口腔组织没有明显的毒性刺激作用，可以应用于临床试验。3)机械治疗后，应用黄连药膜辅助治疗，可以显著提高牙周炎的治疗效果。4)黄连药膜应用于牙周炎的治疗，可以显著的减少龈沟液的量及其中有害细胞因子的含量，以上改变，可能是黄连药膜对牙周病治疗作用的机制之一。另一方面，本发明涉及黄连水提取物的制备方法，步骤如下取10g干的黄连才艮茎加入到100ml蒸馏水中，煮沸15分钟。待煮沸的黄连溶液冷却后，经滤纸过滤到容器中，并经O.22卿的滤网再次过滤至无菌试管中，以防可能的细菌污染，然后把它们放入-80°C中保存。当黄连溶液完全冻结后，应用EYEL4(TokyoRikakikaCoLtd)冻干机冻干，以获得黄连溶液的粉末。另一方面，本发明涉及一种药膜，其中活性成分为黄连。1)处方组成黄连粉末4g,甘油2ml，PVA(750)6g,CMC-Na2g。2)制备方法取PVA,用85。/。乙酉l浸泡24h,滤干后，再用蒸馏水浸泡24h,使其充分膨胀，在约9CTC水温上加热溶解，待全溶后加入蒸馏水浸泡的CMC-Na(羧甲基纤维素钠)搅匀，使成无色澄明粘稠性液体，过80目筛网，得滤液。将黄连粉末用蒸馏水溶解后，加入上述滤液中，边加边搅拌，再加入甘油，加蒸馏水至100ml,充分搅匀。在5CTC水浴保温2030min,待气泡完全消失后，经消毒处理，并在涂有少量液体石蜡的玻璃板上铺膜，膜厚约0.1mm,置平台面上自然干燥。根据使用需要，裁成适当大小(4mmx10mm)(每片约含黄连0.16mg)，装入小塑料袋内密封，Co^消毒、备用。空白药膜不加黄连，其他过程相同。材泮+和方法第一部分口腔微生物对某些中草药水提取物的药物敏感性材沣牛和方法1.本研究应用的中草药及其水提取物的制备本研究应用的中草药有夏枯草(selfheal)、金银花(honeysuckle)、厚朴(officialmagnolia)、菊花(chrysanthemummorifolium)、威灵仙(Chineseclematis)、黄连(Chinesegoldthread)、秦艽(large-leafedgentian)。分别取10g干的夏枯草穗，金银花花，厚朴皮，菊花花，威灵仙根，黄连根茎，和秦艽根加入到100ml蒸馏水中，煮沸15分钟。待煮沸的中草药溶液冷却后，经滤纸过滤到容器中，并经0.22iJm的滤网再次过滤至无菌试管中，以防可能的细菌污染，然后把它们放入-80。C中保存。当中草药溶液完全冻结后，应用E丫EL4(TokyoRikakikaCoLtd)冻干机冻干，以获得中草药溶液的粉末。2.口腔微生物菌林和培养口腔链球菌培养应用脑心浸液(BHI;DifcoLaboratories,Detroit,Mich.)肉汤培养基。首先，将一系列的中草药提取物稀释液，加入到培养基中，然后将过夜培养的变形链球菌Xc(S.mutansXc),萆毛链球菌(S.sobrinus),格登链球菌ATCC10558(S.gordoniiATCC10558),和唾液链球菌HT9R(S.salivariusHT9R)，分别接种到含有不同浓度中草药提取物的培养基中，然后，在37。C下培养。伴放线杆菌的培养将伴放线放线杆菌NCTC9710,ATCC29523,IDH1705和IDH781菌抹，分别接种于含1%酵母提耳又物(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.)的ToddHewett液体J咅养基(THB;DifcoLaboratories,Ditroit,Mich.)中，置37°C、5%co2温箱培养。培养基中，中草药稀释液(mg/ml)的制备，与链球菌培养基相同。牙龈卟啉菌的培养将牙龈卟啉菌ATCC33277，381和W83菌林，分别4妄种于含0.5%酵母才是耳又物(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.)、0.1%半胱氨酸、0.005%氯高4失血红素及0.001%维生素k1的脑心浸液培养基(BHI;DifcoLaboratoriesDetroit,Mich.)中,置厌氧培养系统(BectonDickinsonandCompanyCockeysville'MD)的GasPak罐中，于37t:、厌氧培养。培养基中，中草药稀释液(mg/ml)的制备与链球菌培养基相同。3.细菌生长速度的测定各株细菌，在不同条件下的生长速率，是通过测定特定时期培养基光密度变化来确定的。即口腔链球菌菌抹和伴放线杆菌菌抹的培养基光密度间隔2小时测定1次，共测定8次，而牙龈卟啉菌菌林每间隔8小时测定1次，共测定3次。在整个培养过程中，光密度值保持不变(细菌停止生长)的培养基中，中草药提取物的最小浓度，被定为最小抑菌浓度(MIC);而光密度值增加较对照组(培养基中没有中草药提取物)显著减小的培养基中，中草药提取物的最小浓度，被定为初始抑菌浓度(IIC)。每个实验重复3次，取平均值用于比较、分析。结果1.夏枯草、金银花、厚朴、菊花、威灵仙、秦艽的水浸液提取物对所试验的口腔微生物生长无明显抑制作用。2.而黄连的水浸液提取物，对所实验的口腔微生物的生长率，有不同程度的抑制作用。结果见下表表1黄连水浸液提取物对牙周致病菌生长的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2黄连水浸液提取物对口腔链球菌的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>1T^~~弁培养过程中，可观察到微生物生长明显抑制，光密度值增加较对照组(培养基中没有中草药提取物)显著减小的培养基中提取物浓度。$微生物停止生长的培养基中提取物浓度。第二部分黄连水提取物药膜的制备及毒性实验材料和方法1.实验动物采用健康II级Wistar大鼠9只，体重(250土20)g,由山东大学医学院实验动物中心提供。2.动物分组将Wistar大鼠随机分为3组，每组各3只大鼠①黄连药膜组Wistar大鼠用氯胺酮100mg/kg腹腔注射麻醉，将黄连药膜贴于大鼠的双侧颊黏膜；②空白药膜组麻醉方法同上，将空白药膜贴于大鼠的双侧颊黏膜；③空白对照组麻醉方法同上，但大鼠颊勦膜不做任何处理。3.取材及样品制备药膜贴附24h后，将所有大鼠活杀，取双侧颊部黏膜，置10%緩冲甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规切片，厚约67jjm，HE染色，光镜下观察。结果1.根据临床使用需要，将黄连药膜裁成适当大小(4mmx10mm)(每片约含黄连0.16mg)，装入小塑料袋内密封，Co^消毒、备用。空白药膜不加黄连，其他过程相同。2.贴敷黄连药膜一天后，光镜下观察，实验组与对照组相比，Wistar大鼠颊黏膜无明显病理变化。三組大鼠的颊黏膜角化层均无脱落，基底细胞排列整齐，形态正常，上皮下无明显水肺。实验组与对照组相比，均未见明显炎症细胞浸润(见图1~3)。图1空白对照组Wistar大鼠颊黏膜组织学形态(HE,x40)图2空白药膜组Wistar大鼠颊黏膜组织学形态(HE,x40)图3黄连药膜组Wistar大鼠颊翁膜组织学形态(HE，x40)第三部分黄连水提取物药膜辅助治疗慢性牙周炎的疗效评价材料与方法1.病例选择1.1纳入标准(1)全身健康，无严重系统性疾病如糖尿病、心血管疾病、癌症等，妇女未妊娠或哺乳。(2)25岁以上的男女患者，有中度或重度慢性牙周炎，每个象限内至少有1颗牙的探诊深度(PD>5mm)，且探诊出血(BOP)(+)。(3)患者在参加本实验前至少6月内未做过牙周治疗；2周内未服用抗生素或非甾体类抗炎药；无长期服用引起牙龈增生或影响牙周组织恢复的药物，如苯妥英钠、硝苯吡啶等。(4)签署知情同意书者。1.2病例组成30例成人慢性牙周炎患者，均选自山东省济南市口腔医院牙周科门诊，其中男14例，女16例，年龄在25~628岁，平均42.6岁。2.研究方法2.1分组本研究采用同一患者口腔内病情相同牙的自身对照设计，每个象限取1颗牙齿，共120颗，按计算机产生的随机数表分为以下4组药膜组，碘甘油组，药膜对照组和空白对照组。2.2试验步骤(1)对入选患者的口腔软组织和牙周状况进行检查，摄全景片，按要求确定受试牙，每颗牙探诊6个位点(MB、B、DB、DL、L、ML)，每颗牙探诊最深的位点用作统计学分析。(2)在基线前14天，完成全口龈上洁治并进行口腔卫生指导；评估所有患者的菌斑指数(Pl)、探诊出血(BOP)、探诊深度(PD)和附着丧失(AL)。探诊时用的牙周探针尖端直径为0.5mm,探诊力约为25g,全部临床检查均由一位指定的临床医生作为检查者完成。具体的纟企查指标和标准如下(3)基线时，由指定的检查者再次检查上述指标，确定仍为牙周袋探诊深度(PD>5mm),且探诊后出血(BOP)(+)的牙位作为受试牙。(4)基线当天，对所有受试牙进行刮治(用超声波洁牙机的龈下工作尖)。(5)给药方法指定另一名医生作为给药者，按不同分组给予不同的药物。①药膜组取一片黄连药膜，围绕牙一周放入牙周袋内。每周放1次，共方丈4次；②碘甘油组牙周袋内放入橫甘油，每周1次，共放4次；③药膜对照组取1片空白药膜，按药膜组相同的方法应用；④空白对照组牙周袋内不放任何药物。治疗结束后1周和4周患者复诊，由同一名检查者在不了解放药的情况下检查并记录以上各项指标，以及有无其他异常变化及不良反应。3.3统计学方法应用SAS6.12软件包对试验结果进行统计分析，计量资料组间比较用方差分析(ANOVA),均数间两两比较应用SNK;菌斑指数变化的比较应用按等级分组资料的秩和检验(Kruskal-wallisTest);探"^出血率的比專交用卡方4企—验(chi國square)。结果1.菌斑指数(Pl)的变化各组菌斑指数(Silness和L。e的记分标准)在基线及治疗后1周时，经统计学分析无显著性差异(P〉0.05)，治疗后4周时药膜组与药膜对照组及空白对照组相比，有显著性差异(P〈0.05);与-典甘油组相比，无显著性差异(P〉0.05);各组内不同时间比较，无显著性差异(P〉0.05)(表1)。表1.4组受试牙之间Pl情况对比<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注$表示与空白对照组比较，有显著性差异，P〈0.05;#表示与药膜对照组比较，有显著性差异，P<0.052.探诊深度(PD)在基线时，4组之间的PD相比无显著性差异(P〉0.05)，具有可比性。2.1各组内不同观察时间的比较各组在治疗后1周和治疗后4周与基线比较，均有显著性差异(P〈0.05)。治疗后4周与治疗后1周比较，药膜组的PD呈继续改善状态，两者之间有显著性差异(P<0.05);石典甘油组虽有改善，但无显著性差异(P〉0.05);而空白药膜组和空白对照组则有反跳，但亦无显著性差异(P〉0.05)。2.2各组间比较治疗后1周时，药膜组和石典甘油组与空白药膜组和空白对照组比较，均有显著性差异(P〈0.05);但药膜组与碘甘油组之间以及空白药膜组与空白对照组之间比较，均无显著性差异(P〉0.05)。治疗后4周时，药膜组与其他3组比较，均有显著性差异(P〈0.05),碟甘油组与2个空白组比较，亦有显著性差异(P〈0.05)，但2个空白组比较，无显著性差异(P〉0.05)。表2.4组受试牙之间PD(mm)情况对比(^土s)组另寸1T^治疗后1周治疗后4周药膜组5.86±0.473.55±0.56&*#$~3.17±0.36&@*#$石與甘')由纟且5.88±0.494.05±0.39&'#3.85±0.44#空白药膜组5.82±0.464.63±0.53&4.83±0.56&空白对照组5.76±0.464.85±0.52&4.94±0.43&注*表示与空白对照组比较，有显著性差异，P〈0.05;#表示与空白药膜组比较，有显著性差异，P〈0.05;$表示与碘甘油组比较，有显著性差异，P〈0.05;&表示与基线比较，有显著性差异，P〈0.05;@表示与治疗后1周比较，有显著性差异，P<0.053.附着丧失(AL)在基线时，4组之间的AL相比无显著性差异(P〉0.05),具有可比性。3.1各组内不同观察时间的比较各组在治疗后1周和治疗后4周与基线比较，均有显著性差异(P〈0.05)。治疗后4周与治疗后1周比较，药膜组的AL呈继续改善状态，两者之间有显著性差异(P〈0.05);碘甘油组虽有改善，但无显著性差异(P>0.05);而空白药膜组和空白对照组则有反跳，但亦无显著性差异(P>0.05)。3.2各组间比较治疗后1周时，药膜组和碘甘油组与空白药膜组和空白对照组比较均有显著性差异(P<0.05);但药膜组与碘甘油组之间以及2个空白组之间比较，均无显著性差异(P〉0.05)。治疗后4周时，药膜组与其他3组比较均有显著性差异(P〈0.05)，碘甘油组与2个空白组比较亦有显著性差异(P〈0.05),但是2个空白组比较无显著性差异(P>0.05)。表3.4组受试牙之间AL(mm)情况对比(^±s)组别基线治疗后1周治疗后4周药膜组碘甘油组空白药膜组空白对照组4.55±0.594.45±0.624.40±0.614.46±0.612.32±0.61&*#$2.69±0.47&*#3.25±0.66&3.52±0.58&1.94±0.49&@*#$2.49±0.55&*#3.42±0.67&3.61±0.55&注*表示与空白对照组比较，有显著性差异，P〈0.05;#表示与空白药膜组比较，有显著性差异，P〈0.05;$表示与碘甘油组比较，有显著性差异，P〈0.05;&表示与基线比较，有显著性差异，P〈0.05;@表示与治疗后1周比较，有显著性差异，P<0.054.探诊出血(BOP)在基线时，4组之间的BOP相比无显著性差异(P〉0.05)，具有可比性。4.1各组内不同观察时间的比较各组在治疗后1周和治疗后4周与基线比较，均有显著性差异(P〈0.05)。治疗后4周与治疗后1周比较，药膜组和硪甘油组虽有改善，但无显著性差异(P〉0.05);而空白药膜组和空白对照组则有反跳，^旦亦无显著性差异(P〉0.05)。4.2各組间比较治疗后1周时，药膜组BOP降低最为明显，但与各组之间比较均无显著性差异(P>0.05)。治疗后4周时，药膜组与其他3组比较，均有显著性差异(P〈0.05)，其他3组之间比较均无显著性差异(P〉0.05)。表4.4组受试牙之间BOP情况对比(％)组别基线治疗后1周治疗后4周药膜组10023.33(7/30)&3.33(1/30)&*#$碘甘油组10036.67(11/30)&30(9/30)&空白药膜组10046.67(14/30)&53.33(16/30)&空白对照组10050(15/30)&56.67(17/30)&注*表示与空白对照组比较，有显著性差异，P〈0.05;#表示与空白药膜组比较，有显著性差异，P〈0.05;$表示与碘甘油组比较，有显著性差异，P〈0.05;&表示与基线比较，有显著性差异，P〈0.05;@表示与治疗后1周比较，有显著性差异，P<0.05第四部分黄连水提取物药膜辅助治疗慢性牙周炎对龈沟液中炎症因子的影响材料和方法1.病例选#^:同第三部分2.主要试剂和仪器2.1人IL-1(3ELISA试剂盒和人IL-6ELISA试剂盒(邦定泰克生物技术)2.2酶标仪Beckman3.GCF标本的釆集和定量在基线龈下刮治和根面平整(SRP)及放药前及治疗后4周收集龈沟液(GCF)。收集时，去除测试牙面的菌斑。一夺WhatmanI号牙周试纸条(2mmx10mm)插入测试牙的近颊、远颊、近舌、远舌的裂隙，感到有轻微阻力时停止插入，放置30s后取出(若滤纸条上被血迹污染则弃用)，每颗测试牙的龈沟液量为4者相加之和。将每颗测试牙的4条滤纸条的湿润部分剪入一个Eppendorf管中，用锡纸密封后，迅速放入-2crc冻存、待检。测量剩余部分的长度，换算成浸润部分的长度并记录。收集完龈沟液后，再4企查和记录所选牙的各项临床指标(探诊深度、附着丧失、出血指数)。用与GCF相似的人血清为样本，用微量注射器取血清0.1、0.2、0.3......10juL,分别滴在制备好的滤纸条上，每个量点测两条滤纸，测量滤纸条的浸润长度，取其平均值绘制血清量与滤纸条浸润部分长度关系的标准曲线。根据标准曲线可换算检测样本中GCF的量。将上述样本在常温下解冻，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法，邦定泰克生物技术提供的人IL-6ELISA试剂盒检测IL-6。反应终止后用酶联检测仪测其OD值。结果判断①每个标准品/标本的OD值应减去零孔的OD值。②手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。细胞因子的表示方式及计算方法龈沟液30s样本中细胞因子含量(pg"洗提液中细胞因子检出量x洗提液体积,称为细胞因子总量。龈沟液中细胞因子浓度=细胞因子总量/龈沟液量。5.统计分析组内治疗前后结果比较应用符号秩和检验(signedranksumtest),组间比较应用KruskalWallis检验(KruskalWallistest)。结果1.龈沟液量在基线时，4组之间的龈沟液量相比无显著性差异(P〉0.05),具有可比性。1.1各组内治疗前后的比较各组在治疗后4周与基线比较，均有显著性差异(P〈0.05)。1.2各组间比较治疗后4周时，药膜组与其他3组比较，均有显著性差异(P〈0.05)，碘甘油组与2个空白组比较，亦有显著性差异(P〈0.05),但2个空白组比较，无显著性差异(P〉0.05),结果见表1。表1.4组受试牙之间龈沟液量对比。士s,ul)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注*表示与空白对照组比较，有显著性差异，P〈0.05;#表示与空白药膜组比较，有显著性差异，P<0.05;$表示与碘甘油组比较，有显著性差异，P〈0.05;&表示与基线比较，有显著性差异，P〈0.05;2.龈沟液IL-1(3浓度在基线时，4组之间的龈沟液1L-1(3浓度相比无显著性差异(P〉0.05)，具有可比性。2.1各组内治疗前后的比较药膜组和碘甘油组龈沟液IL-1(3的浓度，治疗前后相比具有显著性差异(P〈0.05),而空白药膜组和空白对照组，治疗前后相比均没有显著性差异(P>0.05)。2.2各组间比较治疗后4周时，药膜组与其他3组比较，均有显著性差异(P〈0.05),碘甘油组与2个空白组比较，亦有显著性差异(P〈0.05),但2个空白组比较，无显著性差异(P>0.05),结果见表2。表2.4组受试牙之间龈沟液IL-1(3含量对比(^土s,pg/ml)组别基线治疗后4周药膜组192,37±23.5349.86±21.62*#$&碘甘油组191.11±29.6187.61±30.17*#&空白药膜组183.84±26.96172.03±20.77空白对照组185.99±22.01174.68±16.31注*表示与空白对照组比较，有显著性差异，P<0.05;#表示与空白药膜组比较，有显著性差异，P〈0.05;$表示与碘甘油组比较，有显著性差异，P〈0.05;&表示与基线比较，有显著性差异，P〈0.05;3.龈沟液IL-6浓度在基线时，4组之间的龈沟液IL-6浓度相比无显著性差异(P0.05),具有可比性。2.3.1各组内治疗前后的比较药膜组和碘甘油组龈沟液IL-6浓度,治疗前后相比具有显著性差异(P<0.05);而空白药膜组和空白对照组，治疗前后相比均没有显著性差异(P〉0.05)。2.3.2各组间比较治疗后4周时，药膜组与其他3组比较，均有显著性差异(P〈0.05),碘甘油组与2个空白组比较，亦有显著性差异(P〈0.05),但2个空白组比较，无显著性差异(P>0.05),结果见表3。表3.4组受试牙之间龈沟液IL-6含量对比(^土s，pg/ml)组别基线治疗后4周药膜组71.93±10.4421.08±12.9"#$&碘甘油组74.18±10.0035.26±15.4"#&空白药膜组72.18±9.0366.67±8.43空白对照组73.30±10.0668.39±7.55注*表示与空白对照组比较，有显著性差异，P〈0.05;#表示与空白药膜组比较，有显著性差异，P〈0.05;$表示与碘甘油组比较，有显著性差异，P〈0.05;&表示与基线比较，有显著性差异，P〈0.05;结论1.黄连对牙周致病菌有明显的抑制作用，可以用于牙周疾病的预防及治疗。2.应用黄连水提取物制备成牙周药膜，对口腔组织没有明显的毒性刺激作用，可以应用于临床试验。3.机械治疗后，应用黄连药膜辅助治疗，可以显著提高牙周炎的治疗效果。4.黄连药膜应用于牙周炎的治疗，可以显著的减少龈沟液的量及其中有害细胞因子的含量，以上改变，可能是黄连药膜对牙周病治疗作用的机制之一。1权利要求1、黄连水提取物在制备治疗牙周炎的药物中的应用。2、权利要求1所述的黄连水提取物的制备方法，步骤如下取10g干的黄连根茎加入到100ml蒸馏水中，煮沸15分钟。待煮沸的黄连溶液冷却后，经滤纸过滤到容器中，并经O.221^m的滤网再次过滤至无菌试管中，然后把它们放入-80。C中保存，当黄连溶液完全冻结后，应用EYEL4(TokyoRikakikaCoLtd)冻干机冻干，以获得黄连溶液的粉末。3、一种药膜，其中活性成分为黄连的水提取物。4、根据权利要求3的药膜的制备方法，1)处方组成黄连4分末4g,甘油2ml，PVA(750)6g,CMC-Na2g。2)制备方法取PVA，用85。/o乙醇浸泡24h,滤干后，再用蒸馏水浸泡24h,使其充分膨胀，在约90。C水温上加热溶解，待全溶后加入蒸馏水浸泡的CMC-Na(羧曱基纤维素钠)搅匀，使成无色澄明粘稠性液体，过80目筛网，得滤液。将黄连粉末用蒸馏水溶解后，加入上述滤液中，边加边搅拌，再加入甘油，加蒸馏水至100ml,充分搅匀。在5(TC水浴保温2030min，待气泡完全消失后，经消毒处理，并在涂有少量液体石蜡的玻璃板上铺膜，膜厚约0.1mm,置平台面上自然干燥。全文摘要本发明公开了黄连水提取物在制备治疗牙周炎的药物中的应用。本发明首先制备黄连的水提取物，并制备成牙周药膜，应用于牙周炎的治疗。结果发现，黄连水提取物对牙周致病菌有明显的抑制作用；制备成牙周药膜，对口腔组织没有明显的毒性刺激作用；可以显著提高牙周炎的治疗效果；并显著的减少龈沟液的量及其中有害细胞因子的含量。文档编号A61K36/185GK101474266SQ20091001389公开日2009年7月8日申请日期2009年1月21日优先权日2009年1月21日发明者吴益华,张世周申请人:山东省立医院;吴益华