专利名称：大肠杆菌在鱼类疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学及分子生物学领域，具体地说是无毒性大肠杆菌在鱼类疫苗中 的应用，即大肠杆菌在水产养殖动物病害免疫防治中的应用。
背景技术：
由细菌侵染导致的微生物病害为阻碍我国及世界水产养殖业发展的主要因素。嗜 水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种常见的养殖水产生物病原菌，能够感染多种鱼 类，同时还可感染人类、动物以及鸟类等，因而是一种典型的人/畜/鱼共患性病原菌。哈 维氏弧菌是一种重要的鱼、虾、贝等水产养殖动物病原，其所诱发的弧菌病每年对养殖业造 成严重的经济损失。目前对于这些细菌病的免疫防治主要是运用单一性的灭活疫苗，即每 种疫苗针对一种病原；同时针对不同种病原的交叉保护疫苗尚未有应用性报道。发明内容
本发明目的在于提供大肠杆菌在鱼类疫苗中的应用，大肠杆菌的免疫以及交叉保 护免疫应用方法。本发明所得疫苗能同时对两种不同的病原菌有高效交叉保护作用，而且 制备及免疫操作简单，无需任何纯化过程。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
大肠杆菌在鱼类疫苗中的应用，疫苗以大肠杆菌为有效成份，作为对嗜水气单胞 菌感染具有免疫保护效应的嗜水气单胞菌疫苗。
其免疫应用方法为将在LB培养基中培养的大肠杆菌直接腹腔注射鱼类。
所述大肠杆菌为非致病性、无毒大肠杆菌，即工程用大肠杆菌。
其制备过程为将所述大肠杆菌DH5 α，于37°C在LB培养基中培养至OD6tltl为 1-1. 2后，离心收集菌体，在经PBS洗涤后获得可用于直接注射鱼类的疫苗。
所述大肠杆菌作为疫苗载体菌用于传递针对鱼类其它细菌的疫苗抗原，所得疫苗 能同时对两种不同的病原菌(嗜水气单胞菌及除嗜水气单胞菌外的鱼类其它细菌)有高效 交叉保护作用，因而能够保护鱼类抵御多种不同病原的感染。
所述大肠杆菌作为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)疫苗抗原表达载体，从而对嗜水 气单胞菌和哈维氏弧菌侵染起到交叉免疫保护作用；即将质粒PAQl转化大肠杆菌DH5ci后 得到的菌株DH5 α /pAQl。其制备过程为将质粒pAQl转化大肠杆菌DH5 α，得菌株DH5 α / pAQl ；将DH5 α /pAQl在LB培养基中培养至OD6tltl为1-1. 2，离心收集菌体，将菌体悬浮于PBS 中至终浓度为2-6xl08cfU/ml，得可用于直接注射鱼类的疫苗，可作为哈维氏弧菌、嗜水气 单胞菌、或哈维氏弧菌和嗜水气单胞菌交叉保护疫苗。
所述鱼类疫苗以大肠杆菌为有效成份，其中可添加有药物学上可接受的载体或助 剂。
本发明具有如下优点
1.高保护率。本发明的疫苗对嗜水气单胞菌和哈维氏弧菌的相对免疫保护效率可达89%或以上。
2.具交叉免疫保护效应。本发明的大肠杆菌除了自身即具有针对嗜水气单胞菌的 免疫保护性以外，还可作为疫苗载体菌用于传递针对其它细菌的疫苗抗原，因而能够保护 鱼类抵御多种不同病原的感染。
3.应用简单。本发明的疫苗制备过程简单，只需常规的细菌培养，不涉及蛋白质提 取、纯化等。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。
实施例1
大肠杆菌DH5ci作为嗜水气单胞菌疫苗的应用
步骤1)疫苗制备。将大肠杆菌DH5 α (购于美国New England Biolabs公司)在 LB液体培养基中过夜培养；取0. Iml过夜后的培养液，将其加入IOml新鲜的LB液体培养基 中，于37°C下转速160rpm摇动培养至OD6tltl为1-1. 2，而后将细菌培养液离心(5000g，4°C， IOmin)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为^108cfu/ml，即为疫苗制备液。
所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97. 5%蒸馏水；所述PBS组成成分按重量百分比计0.8% NaCl,0. 02% KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12H20,0. 024% NaH2P04。
步骤2~)疫苗的免疫注射。将40条牙鲆(每条重约12g)随机分为2组，每组20 条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤1)的疫苗 制备液。将B组的每条鱼分别腹腔注射lOOulPBS。20天后，再次将A组的每条鱼分别腹腔 注射IOOul上述步骤1)的疫苗制备液，将B组的每条鱼分别腹腔注射IOOul PBS0
步骤幻嗜水气单胞菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养嗜水气单胞菌AHl. 927 至OD6tltl为0.6，然后离心(5000g，4°C )10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为 5xl07cfu/ml即为嗜水气单胞菌悬液。
所述嗜水气单胞菌AHl. 927购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心 CGMCC (编号 1. 927)。
步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤幻第一次免疫注射后的第30天，用上 述步骤幻的嗜水气单胞菌悬液腹腔注射步骤幻的A和B组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。 在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目 A组，2条；B组，19条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)
RPS = 100x(l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)由此得出 大肠杆菌DH5ci针对嗜水气单胞菌感染的免疫保护效率为90%。
实施例2
大肠杆菌DH5ci作为哈维氏弧菌和嗜水气单胞菌交叉保护疫苗的应用步骤1) 疫苗制备。将表达哈维氏弧菌免疫保护原DegQ的的质粒pAQl (见参考文献1 Jhang W, Sun S, Cheng S, and Sun L. 2008. Characterization OfDegQvh, a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrioharveyi strain. Appl EnvironMicrobiol. 74,6254-6262.) ■ Hanahan Tj (Sambrook and Russell:Molecular Cloning :A Laboratory Mannua 1. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)转U人大 肠杆菌DH5 α，得菌株DH5 α /pAQl。将DH5 α /pAQl在含有50ug/ml安卡青霉素(Ap)的LB 液体培养基中过夜培养；取0. Iml过夜后的培养液，将其加入IOml新鲜的含Ap (50ug/ml) 的LB液体培养基中，于下转速160rpm摇动培养至0D_为1-1. 2，而后将细菌培养液 离心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为^108cfu/ml，即为疫苗 制备液。
步骤2~)疫苗的免疫注射。将80条牙鲆(每条重约12g)随机分为4组，每组20 条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤 1)疫苗制备液。将B和D组的每条鱼分别腹腔注射IOOul PBS0 20天后，再次将A和C组 的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤1)疫苗制备液，将B和D组的每条鱼分别腹腔注射 IOOul PBS0
步骤幻哈维氏弧菌和嗜水气单胞菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养哈维氏 弧菌T4和嗜水气单胞菌AHl. 927至OD600为0. 6，然后离心(5000g, 4°C ) IOmin0收集菌体， 将其悬浮于PBS中至终浓度分别为8xl07cfu/ml和hl07cfu/ml，即为哈维氏弧菌和嗜水气 单胞菌悬液。
所述哈维氏弧菌T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 1985 ；
步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤幻第一次免疫注射后的第30天，用上 述步骤幻的哈维氏弧菌悬液腹腔注射步骤幻的A和B组鱼，每条鱼的注射量为IOOul ；用 上述步骤幻的嗜水气单胞菌悬液腹腔注射步骤幻的C和D组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。 在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目 A组，1条；B组，16条；C组，2条；D组，18条。故DH5 α /pAQl针对哈维氏弧菌和嗜水气单 胞菌的免疫保护效率为分别为94%和89%。
权利要求
1.大肠杆菌在鱼类疫苗中的应用，其特征在于所述鱼类疫苗以大肠杆菌为有效成 份，作为对嗜水气单胞菌感染具有免疫保护效应的嗜水气单胞菌疫苗。
2.按权利要求1所述的应用，其特征在于所述大肠杆菌为非致病性、无毒大肠杆菌。
3.按权利要求1所述的应用，其特征在于将所述大肠杆菌DH5α，于37°C在LB培养 基中培养至OD6tltl为1-1. 2后，离心收集菌体，在经PBS洗涤后获得可用于直接注射鱼类的 疫苗。
4.按权利要求1所述的应用，其特征在于所述大肠杆菌作为疫苗载体菌用于传递针 对鱼类其它细菌的疫苗抗原，所得疫苗能同时对两种不同的病原菌有高效交叉保护作用， 因而能够保护鱼类抵御多种不同病原的感染。
5.按权利要求4所述的应用，其特征在于所述大肠杆菌作为哈维氏弧菌疫苗抗原表 达载体，从而对嗜水气单胞菌和哈维氏弧菌侵染起到交叉免疫保护作用；即将质粒PAQl转 化大肠杆菌DH5 α后得到的菌株DH5 α /pAQl，作为对哈维氏弧菌具有免疫保护性的哈维氏 弧菌疫苗、或哈维氏弧菌和嗜水气单胞菌交叉保护疫苗。
6.按权利要求5所述的应用，其特征在于将质粒pAQl转化大肠杆菌DH5α，得菌株 DH5 α /pAQl ；将DH5 α /pAQl在LB培养基中培养至0D_为1_1. 2，离心收集菌体，将菌体悬 浮于PBS中至终浓度为2-6X108cfu/ml，得可用于直接注射鱼类的疫苗。
7.按权利要求1、2、3、4、5或6所述的应用，其特征在于所述鱼类疫苗以大肠杆菌为 有效成份，其中添加有药物学上可接受的载体或助剂。
全文摘要
本发明涉及免疫学及分子生物学领域，具体地说是无毒性大肠杆菌在鱼类疫苗中的应用，所述鱼类疫苗以大肠杆菌为有效成份，作为对嗜水气单胞菌感染具有免疫保护效应的嗜水气单胞菌疫苗；或者所述大肠杆菌作为疫苗载体菌用于传递针对鱼类其它细菌的疫苗抗原，因而能够保护鱼类抵御多种不同病原的感染。本发明所得疫苗能同时对两种不同的病原菌有高效交叉保护作用，而且制备及免疫操作简单，无需任何纯化过程。
文档编号A61P31/04GK102028942SQ20091001952
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月30日 优先权日2009年9月30日
发明者孙黎, 程爽 申请人:中国科学院海洋研究所