专利名称：：一种血小板添加液及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及生物学和医学领域，尤其是涉及一种血小板添加液及其制备方法。
背景技术：
：血小板输血主要是针对血小板减少或血小板功能异常的患者进行的血小板输注替代性治疗，以达到止血或预防出血的目的。临床上应用的血小板制品主要有手工浓縮血小板和单采血小板2种。目前常规血小板保存方法为2(TC24。C常温振荡保存，其保存介质为血浆，每个治疗量的血小板制品含血小板数^2.5X107L，在含250ml300ml血浆的血小板保存袋中，保存期为5天。如以晶体盐溶液替代血浆介质保存血小板，不但节约保贵的血浆资源，而且还可降低血浆引起的许多不良反应，如过敏反应、循环负荷加大而使病人的心肾负担加重、迟发性溶血反应、输血相关性肺损伤等，此外还可降低输血传染病的发生风险。1988年，美国Bater公司研发出了一种血小板添加液一PASII液，应用PASII液替代60~70%的血浆保存手工浓縮血小板，血小板保存5天内的体外质量在可接受的范围内。PASII液的成分是氯化钠115.5mmol/L、枸橼酸钠10.0mmol/L、醋酸钠30.0mmol//L。PASII液的特点有(1)用醋酸钠作为血小板营养物；(2)用枸掾酸钠抑制血小板的活化和聚集；(3)氯化钠维持溶液的渗透压；(4)能替代60~70%的血浆保存手工浓縮血小板。临床证实PASII液保存的浓缩血小板有较好的输注疗效。目前，PASn液及其各种PASII的改良液已在国际上日益广泛应用。但是此类血小板添加液多用于手工浓縮血小板的保存，对于单采血小板的保存效果差；只能替代60~70%的血浆介质；血小板储存后的一些体外质量参数虽在可接受的范围内，但仍差于100%的血浆介质；血小板的活化率及凋亡率高，对进一步提高血小板储存后的体内外功能质量存在一定障碍。抑制血小板代谢和活化是延长血小板保存期及提高血小板保存质量的主要策略。以往研究表明，血小板在保存过程中能保持良好的质量主要取决于三个方面(1)在血小板采集制备和储存过程中血小板的活化应减少到最低水平；(2)糖分解的活性水平，即葡萄糖的酵解和乳酸的产生应维持最低；(3)在储存期内，血小板保存介质中的葡萄糖要有一定量的存在。血小板的储存温度常规采用22°C±2°C，血小板储存温度的提高使血小板的代谢增强，葡萄糖经糖酵解代谢产生乳酸的速度加快，使保存介质的pH下降迅速，当pH下降到6.5(血小板储存的适宜pH为6.77，4)以下时，会引起血小板功能的不可逆损伤，故在血小板的储存中，保持pH的相对稳定是获得良好血小板储存质量的必要条件。葡萄糖和醋酸钠是血小板代谢所需的营养成份。在室温储存中，血小板通过葡萄糖的酵解途径获得约15%能量，而85%的能量来自于葡萄糖的有氧氧化。醋酸钠是血小板有氧氧化代谢途径最重要的物质，醋酸钠可转变为乙酰-CoA,进入三羧酸循环后氧化代谢提供能量，醋酸钠可作为血小板代谢的维一能量来源，但以往的研究表明，在血小板添加液中加入醋酸钠只能减少葡萄糖的用量，但不能维持完整的血小板功能和能量水平，在血小板的整个储存过程中，需要一定量的葡萄糖存在。钾离子和镁离子可抑制血小板代谢，在维持血小板膜的稳定中起重要作用，当钾离子缺乏时，细胞内的钾离子渗漏出胞外，会激活能量依赖的钾泵，来维持细胞内外钾的平衡，这会使血小板的能量代谢增强，产酸量增加。镁离子可影响钙离子的内流，减低血小板的活化，在维持细胞内外钾的平衡方面也起一定的作用。一氧化氮(NO),为无色,透明,无味的自由基气体分子,具有调节众多生理,病理生理过程的功能,NO所涉及的领域极其广泛，包括血管调节，舒张支气管，神经介质,机体防御，抑制血小板,细胞毒作用等。研究发现，加入一定量的N0，还可抑制体外保存血小板的活化。血小板内含有一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)，能利用L-精氨酸(L-Arg)合成血小板一氧化氮(platelet-derivednitricoxide,PDNO)，PDN0通过使细胞内环磷酸腺苷(cGMP)升高,抑制血小板的的活化，阻止血小板的黏附与聚集。L-精氨酸是血小板一氧化氮合酶(NOS)的底物，NO是在一氧化氮合酶(NOS)催化下由L-精氨酸产生。在血小板添加液中加入L-精氨酸，通过激活血小板内存在的L-精氨酸/一氧化氮(L-Arg/N0)系统，促进NO生成来抑制体外保存血小板的活化未见报导。
发明内容本发明的目的在于针对目前的血小板添加液使用中存在的血小板活化率高，体外保存质量低于100%血浆介质，只能替代60~70%的血浆介质，对于单采血小板的保存效果差等问题。提供一种能与10096血桨介质具有同等保存效果，能替代90%以上血浆介质，对手工浓縮血小板制剂和单采血小板制剂均具有良好保存效果的添加液及其制备方法。本发明的目的是这样实现的一种血小板添加液，其特征在于，在1000ml血小板添加液中含有碳酸氢钠枸櫞酸钠磷酸二氢钠L-精氨酸0.84~1.26g;3.97~4.85g;0.45~0.75g;22~35mg;氯化钠4.21~5.14g;氯化镁0.37~0.45g;醋酸钠1.85~2.25g;氯化钾0，34~0.42g;葡萄糖1.80~3.60g;添加液的pH值为7.2~7.4。一种上述血小板添加液的制备方法，其特征在于称取下列药典级药物氯化钠4.21~5.14g、氯化镁0.37M).45g、氯化钾0.34~0.42g、枸橼酸钠3.974.85g、醋酸钠1.852.25g、葡萄糖1.803.60g、磷酸二氢钠0.45~0.75g、碳酸氢钠0.84~1.26g、L-精氨酸22~35mg;将它们溶于适量的双蒸水中，制备1000ml药液，灭菌处理，用无菌医用塑料袋常温保存。在血小板添加液的制备方法中可以将所述药典级药物放入容器中，加入800ml双蒸水，搅拌至颜色变为清晰，继续加入双蒸水调整至lOOOml，搅拌均匀后形成药液;将药液用0.22pm除菌滤器过滤至无菌，获得lOOOml血小板添加液，封装于医用塑料袋中常温保存。在血小板添加液的制备方法中也可以将所述药典级药物中的氯化钠、氯化镁、氯化钾、枸橼酸钠、醋酸钠、碳酸氢钠和L-精氨酸放入容器中，加入800ml双蒸水，溶解后继续加入双蒸水调整至900ml形成A药液，封装于医用塑料袋中；将所述药典级药物中的葡萄糖和磷酸二氢钠放入容器中，加入80ml双蒸水，溶解后继续加入双蒸水调整至100ml形成B药液，封装于医用塑料袋中；封装于医用塑料袋中的A药液和B药液经高温灭菌配对常温保存，使用时将A药液和B药液在常温下混合形成血小板添加液。所述的高温灭菌是指将A药液和B药液在温度12rC的软包装通风干热式灭菌器中放置15分钟或115'C放置30分钟后，自然冷却至常温。在血小板添加液的制备方法中所述药液配制的环境温度为20~25'C。本发朋的优点在于本血小板添加液的电解质浓度与血浆介质一致，能替代90%以上的血浆，不但能用于多人份手工分离血小板汇集用的稀释保存液，也能用于机采血小板的稀释保存，其保存效果与100%血浆介质相同；在血小板添加液中加入L-精氨酸，通过激活血小板内存在的L-精氨酸/一氧化氮(L-Arg/NO)系统，促进NO生成，来抑制体外保存血小板的活化，更好的维持血小板的保存质量；本血小板添加液可有效的使机采血小板解聚，防止血小板的聚集；碳酸氢钠(NaHCO3)是血浆中的主要缓冲碱，添加液保存的浓縮血小板(pas-PCs)由于血浆含量低，继而使PAs-PCs中的碳酸氢钠含量减少，缓冲能力下降，但碳酸氢钠的过量加入会影响NaHC03与C02之间的动态平衡，不利于C02散发出保存袋，干扰pH值的稳定。磷酸盐能提高血小板的ATP水平，在维持血小板的高生存力方面有重要作用。本血小板添加液中加入生理浓度的NaHC03,又添加了酸性的磷酸二氢钠，两者加入比例正好使添加液的pH值为7.27.4，勿需再调节其pH值。本发明的优点还在于采用的药典级的原料均为商品，存在市场销售渠道，很容易满足本血小板添加液的生产需求。具体实施例方式实施例1血小板添加液的制备1(以配制1000ml为例)原材料的准备氯化钠4.67g;氯化镁0.41g;氯化钾(U8g;枸橼酸钠4.41g;醋酸钠2.05g;葡萄糖2.97g;磷酸二氢钠0.63g;碳酸氢钠1.09g;L-精氨酸30mg;(以上各原料均为药典级，下同)，足量的双蒸水。1000ml的容器一个，量杯1个，玻璃搅拌棒1根，1000ml无菌医用塑料袋一个,0.22pm除菌滤器1台。制备过程.环境温度为21°C。将所述药典级药物放入容器中，加入800ml双蒸水，搅拌至颜色变为清晰，继续加入双蒸水调整至1000ml，搅拌均匀后形成药液；将药液用0.22pm除菌滤器过滤至无菌，获得1000ml血小板添加液，封装于医用塑料袋中常温保存。实施例2血小板添加液的制备2(以配制1000ml为例)原材料的准备氯化钠4.958;氯化镁(X38g;氯化钾0.41g;枸橼酸钠4.21g;醋酸钠2.15g;葡萄糖3.60g;磷酸二氢钠0.57g;碳酸氢钠0.988;L-精氨酸25mg;足量的双蒸水。1000ml的容器一个，500ml的容器一个，量杯1个，玻璃搅拌棒1根，1000ml无菌医用塑料袋一个，100ml无菌医用塑料袋一个，软包装通风干热式灭菌器l台。制备过程-环境温度为24'C。将原材料中的氯化钠、氯化镁、氯化钾、枸橼酸钠、醋酸钠、碳酸氢钠、L-精氨酸放入一个1000ml的容器中，加入800ml双蒸水，溶解后继续加入双蒸水调整至900ml,形成A药液，并封装于医用塑料袋中；将原材料中的葡萄糖和磷酸二氢钠放入500ml的容器中，加入80ml双蒸水，溶解后继续加入双蒸水调整至100ml，形成B药液，并封装于医用塑料袋中；封装于医用塑料袋中的A药液和B药液经高温灭菌配对常温保存，使用时将A药液和B药液在常温下混合形成血小板添加液。所述的高温灭菌是指将A药液和B药液置于温度控制在12rC的软包装通风干热式灭菌器中停留15分钟(也可以将温度控制在115°C，停留30分钟)后，自然冷却至常温。实施例3实施例1获得的血小板添加液在汇集多人份浓縮血小板中的应用实施过程单一血单位的白膜(BC)层的分离取用四联袋采集的400ml原料全血，在温度为22。C士2。C的离心机中，以3450g的离心力，离心10min，将富含血小板的白膜层(含有血小板、红细胞、白细胞)挤到l个子袋中，挤出的量为40ml^45ml,热合后与母袋分离，挤出的白膜在22匸±2°(:条件下静置过夜。添加液汇集白膜层制备汇集多人份浓縮血小板将ABO及RH血型同型的6袋白膜用无菌接驳技术汇集到同一个血浆袋内，再加入200220ml的血小板添加液稀释白膜，稀释后的白膜在温度为22'C士2。C的离心机中，以卯0转/分，离心10min,上层富含血小板悬液经白细胞滤除器去除白细胞后，转移至血小板保存袋中，即制备成l个成人标准剂量的少白细胞的添加液汇集多人份浓縮血小板制品，将其放血小板保存箱中，22'C士2-C振荡条件下保存。实施例4实施例1获得的血小板添加液与血浆介质汇集浓縮血小板的质量对比试验实施过程单一血单位的白膜(BC)层的分离同实施例3。将ABO及RH血型同型的12袋白膜汇集在一起，充分混匀后分为2等份，按实施例3的方法，1份加220ml实施例1获得的血小板添加、液(简称本添加液组，下同)，而另1份加220ml的ABO同型血浆稀释白膜(简称血浆组)，分别制备成汇集多人份浓縮血小板制品，共制备10个配对样品，.均放血小板保存箱中，22'C士2'C振荡条件下保存，分别在保存l、5、7天取样检测血小板制品的保存质量。结果参见表l-2。表l本发明与血桨汇集浓縮血小板制品制备质量比较本添加液组血浆组容量(ml)265±30248±33WBC混入量(X106)1.3±0.21.4±0.3RBC混入量(X109)5.6±1.07.8±1.5PLT含量(X1011)2.9±0.32.6±0.2表2本发明与血浆汇集浓縮血小板制品保存质量比较保存1天保存5天保存7天检测指标本添加液组血浆组本添加液组血浆组本添加液组血浆组pH7.15±0.017.12±0.037.21±0.027.03±0.047.11±0.036.93:t0.04PLT(x1011)2.姊32.6±0.22.6±0.32.W0.32.6±0.3MPV(fl)9.0±0.49.2±0.59.0±0.49.1i0.49.1±0.69>2±0.5PDW11.9±0.9ll.肚l.Oll.fttl.O11.8±1.112.3±1.012.4±1.2HSR(%)71.5±8.173.0±8.272.5±7.971.9±8.760.0±6.357.1±7.6ES賜16.3辽216.ft±2.49.9±2.49.6±2.27.3±2.07.1±1.9CD62p(%)15.9.±8.516.5±9.224.5±9.526.5±10.243.5±12.241.7±12.9结论本发明汇集浓縮血小板制品的红细胞(RBC)混入量低于血浆汇集浓縮血小板制品；血小板(PLT)得率高于血浆组；制品的制备质量本添加液组优于血浆组。在7天内，2组血小板制品的保存质量无显著差异。由于制备的白膜中含有血浆，故添加液汇集浓縮血小板制品中含血浆大约为35%，添加液大约为65%。实施例5实施例1获得的血小板添加液与PASII液汇集浓縮血小板的质量对比试验实施过程单一血单位的白膜(BC)层的分离同实施例3。将ABO及RH血型同型的12袋白膜汇集在一起，充分混匀后分为2等份，按实施例3的方法，1份加220ml实施例1获得的血小板添加液，而另1份加220ml的PASII稀释白膜(简称PASn组)，分别制备成汇集多人份浓缩血小板制品，共制备10个配对样品，取样检测2种制品的制备质量，并均放血小板保存箱中，22。C士2'C振荡条件下保存，分别在保存l、5、7天取样检测血小板制品的保存质量。结果参见表34。表3本发明与PASII液汇集浓缩血小板制品制备质量比较本添加液组PAsn组容量(ml)273±26278±30WBC混入量(X106)1.4±0.31.4±0.3RBC混入量(X109)5.9±1.25.8±1.3PLT含量(X1011)3.2±0.43.2±0.3表4本发明与PASII液汇集浓縮血小板制品保存质量比较保存l天保存5天保存7天<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结论本发明与PASII液汇集浓缩血小板制品的制备质量无显著性差异。本添加液组的血小板保存质量明显优于PASII液组，保存5天时的血小板活化率(CD62p表达率)本添加液组明显低于PASII液组；血小板低渗休克反应率(HSR)、血小板形变率(ESC)，本添加液组明显高于PASII液组。保存7天时，除CD62p、HSR、ESC显著差异外，PASII液组的pH值也显著低于本添加液组。同实施例4，2种添加液汇集浓縮血小板制品中含血浆大约为35%，添加液为大约为65%。实施例6实施例1获得的血小板添加液与血浆介质保存机采血小板的对比试验实施过程采用Amicus血细胞分离机(美国Baxter)采集的单人份超浓縮的干血小板，血小板计数》10xl09/1111。实验分组A组实施例l获得的血小板添加液；B组100%血浆。用上述2组介质，按2.5xlO"血小板悬浮在250ml保存介质中的浓度，确定血小板保存时的终浓度为^1.0xl09/1111，稀释超浓縮的干血小板后，放血小板保存袋中，在血小板保存箱中，22。C士2。C振荡条件下保存，分别于保存l、5、7天时取样检测血小板的储存质量。每组设10份样品。结果参见表5。表5本发明与血浆介质保存机采血小板的质量比较保存1天保存5天保存7天<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结论本发明与血浆介质相比，2种介质保存7天内的机采血小板质量无显著差异。由于超浓縮的干血小板中含有血浆，加本添加液稀释成保存的血小板悬液后，其中血浆含量<10%，而添加液的含量为〉90%，故本发明用于血小板的保存，可以替代90%以上的血浆。实施例7实施例1获得的血小板添加液与PASII液保存机采血小板的对比试验实施过程采用Amicus血细胞分离机(美国Baxter)采集的单人份超浓缩的干血小板，血小板计数^3.4xl09/011。实验分组C组70%本添加液+30%血浆；D组70。/。PASII液+30。/。血桨。用上述2组介质，按2.5xl0"血小板悬浮在250ml保存介质中的浓度，确定血小板保存时的终浓度为^1.0xl09/1111，稀释超浓縮的干血小板后，放血小板保存袋中，在血小板保存箱中，22'C士2'C振荡条件下保存，分别于保存l、5、7天时取样检测血小板的储存质量。每组设10份样品。结果参见表6。在本实施例中，本添加液是指由实施例1获得的血小板添加液。表6本发明与PASII液保存机采血小板的质量比较保存l天保存5天保存7天检测指标C组D组C组D组C组D组PH7.34±0.077.21±0.057.30±0.066.5±0.047.21±0.055.9±0.03PLT(x10'VL)11.6±1.711.7±1.611.7±1.610.5±1.711.7±1.79.5±1.8MPV(fl)8.9i0.48.9±0.49.0±0.511.9±0.69.1±0.514.5±0.7PDW11.2±0.511.4±0.612.2±0.616.3±0.812.2±0.720.9±1.2HSR(%)69.7±7.867.7±8.167.5±8.140.4±6.061.7±5.435.5±4.3ESC(0/o)14.4±3.314.0±3.78.5±1.806.0±1.00CD62p(%)26.7±9.632.6±10.740.0±9.855.3±13.245.5±10.564.6±15.5结论70%本发明+30%血浆的混合介质保存的机采血小板，保存7天内的质量符合中华人民共和国国家标准(全血及成分血质量要求，GB18469-2001)，而70%PASII液+30%血浆的混合介质保存的机采血小板，保存5天时的质量就不符合要求。PASII液不能用于机采血小板的保存。如果运用实施例2获得的血小板添加液重复实施例3~7的过程，也能获得一致的试验数据，得出相同的结论。上述各实施例通过例举的一个具体配比实例，并以此制备的血小板添加液在手工分离浓縮血小板和机采单人份血小板保存中与PASII液及血浆进行对比，不是对本发明的一种限制，具体实施时，所述的血小板添加液可以按照权利要求涉及的配比范围和制备方法进行配制，所述的血小板添加液可以替代血浆液应用于多种方法制备血小板的保存。权利要求1、一种血小板添加液，其特征在于，在1000ml血小板添加液中含有氯化钠4.21～5.14g；碳酸氢钠0.84～1.26g；氯化镁0.37～0.45g；枸橼酸钠3.97～4.85g；醋酸钠1.85～2.25g；磷酸二氢钠0.45～0.75g；氯化钾0.34～0.42g；L-精氨酸22～35mg；葡萄糖1.80～3.60g；添加液的pH值为7.2～7.4。2、如权利要求1所述血小板添加液的制备方法，其特征在于称取下列药典级药物氯化钠4.21~5.14g、氯化镁0.37~0.45g、氯化钾0.34~0.42g、枸橼酸钠3.97~4.85g、醋酸钠1.85~2.25g、葡萄糖1.80~3.60g、磷酸二氢钠0.45~0.75g、碳酸氢钠0.84~1.26g、L-精氨酸2235mg;将它们溶于适量的双蒸水中，制备lOOOml药液，灭菌处理，用无菌医用塑料袋常温保存。3、根据权利要求2所述的血小板添加液的制备方法，其特征在于将所述药典级药物放入容器中，加入800ml双蒸水，搅拌至颜色变为清晰，继续加入双蒸水调整至lOOOml，搅拌均匀后形成药液；将药液用0.22nm除菌滤器过滤至无菌，获得lOOOml血小板添加液，封装于医用塑料袋中常温保存。4、根据权利要求2所述的血小板添加液的制备方法，其特征在于将所述药典级药物中的氯化钠、氯化镁、氯化钾、枸橼酸钠、醋酸钠、碳酸氢钠和L-精氨酸放入容器中，加入800ml双蒸水，溶解后继续加入双蒸水调整至卯Oml形成A药液，封装于医用塑料袋中；将所述药典级药物中的葡萄糖和磷酸二氢钠放入容器中，加入80ml双蒸水，溶解后继续加入双蒸水调整至100ml形成B药液，封装于医用塑料袋中；封装于医用塑料袋中的A药液和B药液经高温灭菌配对常温保存，使用时将A药液和B药液在常温下混合形成血小板添加液。5、根据权利要求4所述的血小板添加液的制备方法，其特征在于所述的高温灭菌是指将A药液和B药液置于^L度控制在11512rC的软包装通风干热式灭菌器中停留15-30分钟后，自然冷却至常温。6、根据权利要求2或3或4或5所述的血小板添加液的制备方法，其特征在于所述药液配制的环境温度为2025"C。全文摘要本发明涉及一种血小板添加液及其制备方法，在1000ml血小板添加液中含有氯化钠4.21～5.14g；碳酸氢钠0.84～1.26g；氯化镁0.37～0.45g；枸橼酸钠3.97～4.85g；醋酸钠1.85～2.25g；磷酸二氢钠0.45～0.75g；氯化钾0.34～0.42g；L-精氨酸22～35mg；葡萄糖1.80～3.60g；添加液的pH值为7.2～7.4。其制备方法是按照组分称取药典级的氯化钠、氯化镁、氯化钾、枸橼酸钠、醋酸钠、葡萄糖、磷酸二氢钠、碳酸氢钠和L-精氨酸；将它们溶于适量的双蒸水中制备药液，灭菌处理，用无菌医用塑料袋常温保存。文档编号A61K47/26GK101485886SQ20091002508公开日2009年7月22日申请日期2009年2月18日优先权日2009年2月18日发明者唐荣才,肖健宇,肖国锋,胡政芳,鹏魏,黄成垠申请人:江苏省血液中心