专利名称：：淫羊藿苷元微乳剂及其制备方法
技术领域：
：本发明属于纳米医学领域，特别涉及一种将植物性、水不溶性药物淫羊藿苷元加工成理化性质稳定的微乳及其制备方法。
背景技术：
：骨质疏松症是一个世界范围的疾病，随着社会日趋老龄化，骨质疏松症己列为三大老年性疾病之一。淫羊藿苷元是从中医临床常用药物淫羊藿中提取反应得到的黄酮单体成分。国内外诸多研究表明淫羊藿苷元具有明显的抗骨质疏松药理活性(参见:JianHuang,LanYuan,XiWang,etal.Icaritinanditsglycosidesenhanceosteoblastic,butsuppressosteoclastic,differentiationandactivityinvitro[J.LifeSciences,2007，81:832-840.)。但其水溶性很差，影响其口服吸收及药效发挥。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、物理性质稳定、并能显著提高淫羊藿苷元水溶性的微乳及其制备方法。本发明采用的技术方案为一种淫羊藿苷元微乳剂，它是以淫羊藿苷元为活性成分，将其溶解于油脂中，加上乳化剂、助乳化剂和水制备而成的微乳粒径为10-lOOnm的微乳剂，所述的油脂可以是油酸、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯或蓖麻油等中的一种或几种，其中，各组分的质量百分比为淫羊藿苷元的油的饱和溶液0.666.02%乳化剂10~50%助乳化剂1038%余量为水、Hank's平衡盐溶液(HBSS)、PBS缓冲液或生理盐水。上述的微乳剂中，所述的乳化剂可以是OP。上述的微乳剂中，所述的助乳化剂可以是丙三醇、异丙醇、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或1,2-丙二醇。一种上述淫羊藿苷元微乳剂的制法，它包括如下步骤步骤l.淫羊藿苷元油溶液的制备将过量的淫羊藿苷元溶于油中，混合使充分溶解，离3心除去未溶解的淫羊藿苷元，得淫羊藿苷元的油的饱和溶液；淫羊藿苷元在油中的溶解度油相溶解度(mg/mL)肉豆蔻酸异丙酯0.34油酸乙酯0.64油酸0.39蓖麻油0.08步骤2.按配方称取乳化剂、助乳化剂、水相、步骤1所得的淫羊藿苷元的油的饱和溶液；步骤3.将步骤2所称取的四种组分搅拌使充分混合，得澄清透明的淫羊藿苷元微乳剂。微乳制备过程中以得到澄清透明溶液为终点。微乳剂的粒径小，稳定性好。本发明制备的淫羊藿苷元微乳剂，室温放置一年均保持澄清、透明、稳定、均一，充分表明其良好的稳定性。本发明制备淫羊藿苷元微乳过程中不需要用胶体磨进行分散，也不需要进行高速剪切(一般的微乳剂制造都需要)，而是简单搅拌或自发即可形成。细胞和动物实验表明淫羊藿苷元微乳能够增加淫羊藿苷元穿透细胞层，促进药物摄取吸收，增强药物疗效。图1为实施例8制备的淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布图；图2为实施例8制备的淫羊藿苷元微乳剂Zeta电位分布图；图3为为实施例9制备的淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布图；图4为实施例9制备的淫羊藿苷元微乳剂Zeta电位分布图；图5为为实施例10制备的淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布图；图6为实施例10制备的淫羊藿苷元微乳剂Zeta电位分布图；图7为为实施例11制备的淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布图；图8为实施例11制备的淫羊藿苷元微乳剂Zeta电位分布图；图9为为实施例14制备的淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布图；图10为实施例14制备的淫羊藿苷元微乳剂Zeta电位分布图；图11为为实施例15制备的淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布图12为实施例15制备的淫羊藿苷元微乳剂Zeta电位分布图13为为实施例16制备的淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布图；图14为实施例16制备的淫羊藿苷元微乳剂Zeta电位分布图；图15为为实施例17制备的淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布图；图16为实施例17制备的淫羊藿苷元微乳剂Zeta电位分布图；图17为为实施例18制备的淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布图；图18为实施例18制备的淫羊藿苷元微乳剂Zeta电位分布图；图19为为实施例19制备的淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布图；图20为实施例19制备的淫羊藿苷元微乳剂Zeta电位分布图21为实施例22淫羊藿苷元微乳剂抗骨质疏松活性测试图，a为空白组；b为淫羊藿苷元微乳剂组。具体实施例方式下面通过一些实例来进一步说明本发明，但并不将本发明限制在所述的实例范围内。实施例1.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。_组分质量/%OP33.27甘油33.27水28.52淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液4.94实施例2.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均匀，加入水，混合均勾，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。组分质量/%OP29.13甘油29.12水38.84淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液2.91实施例3.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。组分质量/%OP24.56甘油24.56水49.12淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液1.77实施例4.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。组分质量/%OP19.85甘油19.84水59.52淫羊藿苷元的油酸乙酯0.79实施例5.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>水29.01淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液3.29实施例6.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的肉豆蔻酸异丙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。组分质量/%OP50.13甘油20.06水18.80淫羊藿苷元的肉豆蔻酸异丙酯饱和溶液6.02实施例7.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的肉豆蔻酸异丙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。组分质量/°/。OP45.13甘油22.57水29.01淫羊藿苷元的肉豆蔻酸异丙酯饱和溶液3.29实施例8.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、异丙醇，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布和Zeta电位见图l和图2。组分OP16.55异丙醇16.55水66.23淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液0.66实施例9.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、聚乙二醇400，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布和Zeta电位见图3和图4。组分质量/%OP19.76聚乙二醇40019.76水59.28淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液1.19实施例10.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、聚乙二醇300，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布和Zeta电位见图5和图6。组分质量/%OP38.17聚乙二醇30038.17水19.08淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液4.58实施例11.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、聚乙二醇200，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布和Zeta电位见图7和图8。组分质量/%OP29.30聚乙二醇20029.30水39.06淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液2.34实施例12按下列配方称取OP、异丙醇，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。组分质量/%OP21.19异丙醇21.19水56.50淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液1.13实施例13按下列配方称取OP、异丙醇，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。组分质量/%OP9.92异丙醇9.92水79.37淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液0.79实施例14.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的蓖麻油饱和溶液，搅拌至澄清透明。淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布和Zeta电位组分质量/%OP24.88甘油24.88水49.75淫羊藿苷元的蓖麻油饱和溶液0.50实施例15.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均匀，加入生理盐水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布和Zeta电位见图11和图12。组分质量/%OP19.69甘油19.69生理盐水59.06淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液1.57实施例16.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均匀，加入PBS缓冲液，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布和Zeta电位见图13和图14。组分质量/%OP38.83甘油19.42PBS缓冲液38.84淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液2.91实施例17.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均匀，加入HBSS，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的肉豆蔻酸异丙酯饱和溶液，搅拌至澄清透明。淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布和Zeta电位见图15和图16。组分质量/%OP33.27甘油33.27HBSS28.52淫羊藿苷元的油酸乙酯饱和溶液4.94实施例18.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、甘油，混合均勾，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸饱和溶液，搅拌至澄清透明。淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布和Zeta电位见图17和图18。组分质量/%OP34.45甘油34.45水29.53淫羊藿苷元的油酸饱和溶液1.57实施例19.淫羊藿苷元微乳剂的制备按下列配方称取OP、1,2-丙二醇，混合均匀，加入水，混合均匀，再加入淫羊藿苷元的油酸饱和溶液，搅拌至澄清透明。淫羊藿苷元微乳剂的粒径分布和Zeta电位见图19和图20。组分质量/%11甘油34.31水29.41淫羊藿苷元的油酸饱和溶液1.96实施例20以Caco-2细胞模型考察淫羊藿苷元微乳的吸收转运情况Caco-2细胞单层模型的建立Caco-2细胞单层模型，置于75mL培养瓶中，以DMEM为培养液。在37"、5%<:02培养箱中培养，隔l天更换l次培养液，培养57天，待细胞长满培养瓶，用含0.25%胰蛋白酶的消化液消化。一般消化时间约为58分钟。显微镜下计数。以3000r/min离心5min后，混悬在培养液中，接种在预先用鼠尾胶原处理过的Transwells上，细胞接种密度为100,000细胞cm人Caco-2细胞于1921天左右分化形成，即可用于试验。转运试验过程37。C下用pH7.4的HBSS将单层细胞冲洗3次，测量跨膜电阻，弃去跨膜电阻值小于500QXcr^的细胞。细胞在缓沖液中孵育lh后吸走孵化介质。对于药物从细胞绒毛面Apical(A)侧到基底面Basolateral(B)侧的转运在细胞层的绒毛面(AP)加入含有待试药物的溶液作为供给池，在基底面(BL)加入空白的HBSS溶液作为接收池，随后发生一系列的跨膜转运。AP侧底液每隔60min中取样40(^L，并补充同体积含有待试药物的溶液保持AP侧体积恒定；BL侧底液每隔60min中取样400pL，并补充同体积空白底液保持BL侧体积恒定。在每份样品中加入100nL溶液，混合物离心，上清液HPLC分析。对于药物从基底面Basolateral(B)侧到细胞绒毛面Apical(A)侧的转运在细胞层的基底面(BL)加入含有待试药物的溶液作为供给池，在绒毛面(AP)加入空白的HBSS溶液作为接收池，随后发生一系列的跨膜转运。BL侧底液每隔60min中取样400nL，并补充同体积含有待试药物的溶液保持BL侧体积恒定；AP侧底液每隔60min中取样40(VL，并补充同体积空白底液保持AP侧体积恒定。在每份样品中加入10(HiL溶液，混合物离心，上清液HPLC分析。本试验以Caco-2细胞模型考察淫羊藿苷元微乳的吸收转运情况浓度为20fiM时AP侧到BL侧的转运速率为8.38X10—4cm/sec，BL侧到AP侧的转运速率为6.88X1(T4cm/ssco浓度为80nM时AP侧到BL侧的转运速率为9.59X10—4cm/sec，BL侧到AP侧的转运速率为9.04X10—4cm/ssc可见在各浓度，吸收速率大于外排速率，淫羊藿苷元微乳有利于淫羊藿苷元的吸收。实施例21大鼠肠灌注模型研究淫羊藿苷元微乳的体内吸收情况麻醉SD大鼠，置于小电热毯上和灯光下，保持正常的体温，沿腹中线切口4cm打开腹腔，靠近十二指肠处插入胆汁导管，分别在十二指肠、空肠、回肠和结肠两端插聚乙烯管，用手术线固定，实验时用等渗生理盐水浸渍的纱布覆盖于肠组织表面以保湿。以HBSS溶液配制淫羊藿苷元微乳溶液作为灌流液。用等渗生理盐水冲洗肠内容物后换灌流液，用一恒速泵灌流肠腔。每隔30min收集出口管中灌流液，灌注后测量小肠的长度。出口管中药物浓度用HPLC检测。结果淫羊藿苷元微乳各肠段吸收良好，平均渗透系数为3.87，吸收百分比为72.96%。实施例22:骨髓基质干细胞培养及诱导分化测定淫羊藿苷元微乳剂抗骨质疏松活性碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞的标志性酶，通常用其染色来鉴定成骨细胞。取大鼠骨髓基质干细胞培养,于培养第12天以重氮盐法(改良Kaplow氏法〉测定细胞ALP酶活性(CAKP染液购于南京建成生物工程研究所)。细胞培养及给药处死鼠，75%酒精浸泡，取鼠腿(上两节)，将肌肉等分离。于生物安全柜中打开鼠骨髓腔，用注射器从骨髓腔一头将骨髓基质干细胞吹出，交换操作，至无色。用注射器将条索状细胞对管壁反复吹打成单细胞悬液，可见DMEM由澄清变混浊。细胞培养基中加入Vc，双抗，地塞米松等，同时加入药物(淫羊藿苷元微乳)。以不加药物组作为空白对照。放入培养箱(37%,5%C02)培养。细胞隔三天换液。于培养第12天进行CAKP染色。由图21a和b可见淫羊藿苷元微乳剂组相对于空白对照组而言，细胞见多而深染色，ALP活性增强。权利要求1.一种淫羊藿苷元微乳剂，其特征是它是以淫羊藿苷元为活性成分，将其溶解于油或酯中，加上乳化剂、助乳化剂和水制备而成的微乳粒径为10～100nm的微乳剂，所述的油是油酸、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯或蓖麻油，其中，各组分的质量百分比为淫羊藿苷元的油的饱和溶液0.66～6.02％乳化剂10～50％助乳化剂10～38.17％余量为水、Hank’s平衡盐溶液、PBS缓冲液或生理盐水。2.根据权利要求1所述的微乳剂，其特征是所述的乳化剂是OP。3.根据权利要求1所述助乳化剂是丙三醇、异丙醇、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或1,2-丙二醇。4.一种制备权利要求1所述淫羊藿苷元微乳剂的方法，其特征是它包括如下步骤步骤l.淫羊藿苷元油溶液的制备将过量的淫羊藿苷元溶于油中，混合使充分溶解，离心除去未溶解的淫羊藿苷元，得淫羊藿苷元的油的饱和溶液；步骤2.按配方称取乳化剂、助乳化剂、水相、步骤1所得的淫羊藿苷元的油的饱和溶液；歩骤3.将歩骤2所称取的四种组分搅拌使充分混合，得澄清透明的淫羊藿苷元微乳剂。全文摘要一种淫羊藿苷元微乳剂，它是以淫羊藿苷元为活性成分，将其溶解于油脂中，加上乳化剂、助乳化剂和水制备而成的微乳粒径为10～100nm的微乳剂，所述的油脂可以是油酸、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯或蓖麻油等中的一种或几种，其中，各组分的质量百分比为淫羊藿苷元的油的饱和溶液0.66～6.02％；乳化剂10～50％；助乳化剂10～38％；余量为水、Hank’s平衡盐溶液(HBSS)、PBS缓冲液或生理盐水。本发明的淫羊藿苷元微乳剂，室温放置一年均保持澄清、透明、稳定、均一，充分表明其良好的稳定性。细胞和动物实验表明本发明的淫羊藿苷元微乳能够增加淫羊藿苷元穿透细胞层，促进药物摄取吸收，增强药物疗效。本发明公开了其制法。文档编号A61K9/107GK101513388SQ200910029928公开日2009年8月26日申请日期2009年3月27日优先权日2009年3月27日发明者兰雪莲,娥孙,贾晓斌,彦陈申请人:贾晓斌