专利名称：含日本血吸虫基因的重组表达载体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种含日本血吸虫基因的重组表达载体及应用。
背景技术：
血吸虫病是一种广泛流行于热带与亚热带地区的人兽共患寄生虫病，所引发的病原体是血吸虫，我国主要受日本血吸虫的危害。日本血吸虫的生活周期复杂，包括在终末宿主体内的有性世代和在中间宿主体内的无性世代的交替。其终末宿主主要包括人、牛、羊、猪、兔等多种哺乳动物，虫体即吸附在其门静脉和肠系膜静脉的内壁上。宿主的血液处于一种有氧呼吸的环境，而虫体要实现其长期寄生，必然有一套克服氧自由基所带来的损害的机制，其中抗氧化酶的作用至关重要，硫氧还蛋白过氧化物酶家族(thioredoxin peroxindasesfamily)即是其中的一类。
硫氧还蛋白过氧化物酶家族在多种细胞功能中发挥重要作用，如抗氧化损伤保护蛋白和脂质，细胞增殖、分化，调节凋亡过程中细胞内信号传导等。增加细胞内抗氧化酶水平可抑制凋亡。硫氧还蛋白过氧化物酶家族是红细胞中主要的抗氧化剂，并且介导早期红细胞系的分化。该家族所包含的一类过氧化物酶，能够利用其活性半胱氨酸残基清除过氧化物及羟基。根据氨基酸序列的差异，硫氧还蛋白过氧化物酶家族有六个亚型，并被分为两大亚家族。亚家族一含有两个保守性半胱氨酸残基，包括I、 II、 III、 IV四个亚型，亚家族二拥有一个保守性半胱氨酸残基，包括V和VI两个亚型。目前研究表明，硫氧还蛋白过氧化物酶II (tpll)具有硫氧还蛋白依赖的过氧化物酶活性，能够抑制细胞凋亡，与细胞膜结合，与红细胞中钙离子激活的钾离子转运相关。
另有研究表明，硫氧还蛋白过氧化物酶II富集于日本血吸虫的皮质层，而皮质层是虫体与宿主环境直接发生相互作用的表面结构，推测该酶在维系皮质层膜结构的稳定以及拮抗药物作用方面起重要作用。
疫苗是控制传染性疾病的有效手段，也是血吸虫病综合防治的重要措施之一，世界卫生组织专家认为，短效的化疗手段必须与长效的疫苗措施相结合。尽管目前所有实验性血吸虫病疫苗在免疫后均只能诱导出对血吸虫感染部分抵抗力，但由于血吸虫在其终宿主体内不繁殖，故对控制血吸虫病仍有重要的生物学与临床意义。寻找新的疫苗候选抗原仍是当今血吸虫疫苗研究的重点之一。
到目前为止，还没有出现关于本发明日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II作为疫苗应用的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，该重组载体表
达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶n可作为抗血吸虫的疫苗候选抗原。
此外，还需要提供一种含日本血吸虫基因的重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现
在本发明的一个方面，提供了一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，所述基因是日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因。
优选的，所述日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因序列是编码SEQ ID NO:l所示氨基酸序列的核苷酸序列；更优选的，该日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因序列为SEQ IDNO:2所示核苷酸序列。
优选的，所述表达载体为原核表达载体；更优选的，所述表达载体为原核表达载体pET28a(+)。
在本发明的另一方面，提供了一种包含上述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞。在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II的制备方法，包括以下步骤
构建含日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因的重组表达载体；将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；
培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II;
纯化诱导表达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II 。
优选的，所述诱导表达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶n还连接有包含6个组氨酸
的标签序列。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组表达载体在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。
本发明重组载体表达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II可以作为诊断抗原对血吸虫病畜进行诊断。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述制备方法生产的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II作为预防或治疗血吸虫病疫苗的用途。
本发明含日本血吸虫基因的重组表达载体，能够高表达日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物 酶II，该高表达的重组日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II在小鼠免疫性保护实验中，使免 疫组小鼠的减虫率与肝组织减卵率分别达到29. 37%和25. 54%,表明本发明重组日本血吸虫硫 氧还蛋白过氧化物酶II能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。 图1是本发明实施例1重组质粒的酶切与PCR鉴定图2是本发明实施例2重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)后经IPTG诱导表达结果图； 图3是本发明实施例3重组日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II表达形式的鉴定与纯化图。
具体实施例方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明利用重组DNA技术将日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II (tpll)基因的编码序 列克隆至原核表达载体，并使其在大肠杆菌中大量表达，且纯化得到其表达产物。纯化产物可 应用于小鼠免疫保护实验，以评估其抗血吸虫的保护效果，为抗血吸虫病疫苗分子的筛选提 供重要的参考价值。
实施例1 日本血吸虫tpll基因编码序列原核表达载体的构建
查找日本血吸虫tpII基因在Genebank中的序列设计引物，用DNAstar分析其序列特征，并 找到其最大的开放阅读框(SEQ ID N0:2)，即其编码蛋白质的序列部分，根据这一部分序列 设计引物如下
Sense: 5， - GGCGGATCCATGAAGTGTTTAAATTCG -3， ( SEQ ID NO:3)， Anti-sense: 5， - GGCCTCGAGGTTTACAGAGGAAAAGTACG -3， ( SEQ ID N0:4)， 分别引入限制性内切酶BamHI和XhoI酶切位点(下划线部分)。TpII开放阅读框的扩增 以日本血吸虫雌虫cDNA文库为模板进行PCR。采用的原核表达载体pET28a(+)为表达6XHis标 签的高效表达载体，该载体设计有多克隆酶切位点，可以插入外源基因片段tpll基因编码序 列。将扩增tpII基因编码序列的PCR产物经胶回收、双酶切后，与同样双酶切的质粒pET28a(+) 于16'C连接过夜，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞中，均匀涂布于含有卡那霉素(100ug/ml) 的LB平板上。挑取单一菌落扩大培养，提取质粒，进行PCR及单、双酶切鉴定，将初步鉴定正
5确的阳性克隆菌液进行测序。
图l为重组质粒Sjtp11-pET28a(+)的酶切与PCR鉴定图，图1中，Ml: DNA标志物(DL15000); 1:重组质粒BamHI单酶切鉴定；2:重组质粒BamHI、 Xhol I双酶切鉴定；3:重组质粒PCR 鉴定；M2: DNA标志物(DL2000)。从图l可以看出，在"2"、 "3"泳道都有明显的681bp大小 的tpll条带，表明经PCR扩增出的tpII基因片段，成功地插入了原核表达载体pET28a(+)的多 克隆酶切位点。
重组质粒DNA经测序得知，重组质粒中插入片段的序列与Genebank中公布的日本血吸虫 SJCHGC00794蛋白mRNA完整编码区完全一致，达到100%的吻合度，且与曼氏血吸虫硫氧还蛋白 过氧化物酶II的mRNA也有94M的吻合度，可以证明本发明成功地将日本血吸虫tpll的编码序列 插入了原核表达载体，且插入方向正确。
实施例2日本血吸虫tpll基因原核表达载体的诱导表达
将测序正确的阳性克隆的质粒Sjtp11-pET28a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞 中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，挑取单一菌落，鉴定正确后接种于液体LB培养基中， 待达到对数生长期后，加入异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度为lmM/L)进行诱导表 达，分别收集诱导前及诱导后lh、 2h、 4h、 6h及8h的菌液，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝 胶电泳(SDS-PAGE电泳，5M浓縮胶80V电压，12c/。分离胶120V电压)分析验证。
结果如图2所示，在图2中，M:蛋白质标志物；1:未诱导的菌液；2:诱导后lh; 3:诱 导后2h; 4:诱导后4h; 5:诱导后6h; 6:诱导后8h。从图2可以看出，诱导前及诱导后各时
相，经过SDS-PAGE,其中l条带随着诱导时间的延长而增宽，8h达最大，该条带与目的蛋白大 小Mr30000Da相近(日本血吸虫tpII基因所编码的蛋白质序列如SEQ IDN0:1所示，其相对分子 质量约为25000Da，表达出的产物为包含有部分载体序列的6个组氨酸标签和插入片段Sjtpn 基因所编码的蛋白质的融合体rSjtpII，该融合体蛋白的相对分子质量约为30000Da)。可以证 实，重组质粒在大肠杆菌当中获得了高水平的表达。 实施例3 原核表达载体表达产物的纯化
小量诱导重组菌(100ml) ，4。C，4000rpm离心15min，收集菌体沉淀，用PBS洗涤后，加 入1X结合缓冲液(binding buffer)重悬菌体，反复冻融3次后，超声破碎细胞。将超声 后的悬液于4"， 12000rpm，离心30min，分别收集上清和沉淀鉴定其表达形式。由图3可知， 重组质粒的表达产物出现在超声后的沉淀中，说明其表达形式为包涵体。在图3中，1:超声
后的上清；2:超声后的沉淀；3:纯化后的蛋白。
利用重组表达的融合体蛋白中的组氨酸和镍离子的亲和性可将该融合体蛋白加以纯化，
纯化步骤按照Novagen His-tag纯化手册进行。将沉淀用含6M尿素的1X结合缓冲液溶解，4'C， 12000rpm，离心30min，收集上清。用 His^ind树脂纯化表达产物。具体操作如下
(1) 将40(^L树脂悬液加入到1.5mL离心管中，低速离心后除去上清。
(2) 按以下顺序和次数进行树脂的离子化和平衡。
a. 2倍体积灭菌去离子水，2次
b. 2倍体积1X离子化缓冲液(charge buffer), 3次
c. 2倍体积1X结合缓冲液，2次
(3) 加入前述用尿素溶解后的上清，轻柔混匀，孵育5min， 2000rpm，离心5min，弃上清。
(4) 3倍体积1X结合缓冲液清洗树脂3次。
(5) 3倍体积1X冲洗缓冲液(washing buffer)清洗树脂3次。
(6) 1倍体积1X洗脱缓冲液(stripping buffer)将目的蛋白从树脂上剥离下来。 由图3可知，表达产物rSjtpII得到了纯化(见图3第"3"泳道箭头所指的条带)，且纯度较高。
实施例4 纯化后表达产物对小鼠的免疫
将6周龄雄性BALB/c小鼠分为两组(实验组和对照组)，每组10只。首次免疫按每只小 鼠lOO吗纯化后的日本血吸虫tpII (rSjtpII)与206佐剂混合的乳剂，皮下注射。每隔14 天同样剂量进行第二次和第三次免疫。用PBS与206佐剂的混合乳剂以同样方法处理对照组 小鼠。
第三次免疫一周后，每只小鼠攻击日本血吸虫尾呦40条。
感染后42天将两组小鼠剖杀，肝门静脉冲虫，计算减虫率。同时每只小鼠取0.5g肝脏， 匀桨后，经氢氧化钾消化后进行肝组织虫卵计数，计算减卵率。通过对减虫率与减卵率的分 析，评估本发明重组日本血吸虫tpll蛋白作为抗原的免疫保护效果。
减虫率=(l-免疫组平均虫荷数/对照组平均虫荷数)X100%
减卵率=(1-免疫组平均卵荷数/对照组平均卵荷数)X100%
结果如下表l所示，rSjtpII实验组的减虫率与减卵率分别为29. 37%和25. 54T。，表明rSjtp II能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用，本发明重组抗原rSjtpII具有一
定的免疫保护效果。
表1 rSjtpII免疫小鼠的减虫率和减卵率
平均虫荷数减虫率t检验平均卵荷减卵率t检验
(x±s)(%)数(x士s)(%)
实验组12. 80±2.329. 37p<0. 052545325. 54p<0. 05
对照组18. 20±3. 1一一34184——
7以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而 理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，
本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表
〈110>中国农业科学院上海兽医研究所
〈120>含日本血吸虫基因的重组表达载体及应用
<160〉 4
〈170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 226
<212> PRT
<213> Schistosoma japonicum
〈400〉 1 Met Lys Cys 1
lie lie Ser
Met Leu Leu 35
lie Gly Thr 50
Tyr Val Leu 65
Thr Glu Leu
Gly Cys Gin
Ala Trp Thr 115
lie Pro Leu
130 Val Leu Asp 145
Asp Pro Asn
Gly Arg Ser
Phe Glu Lys 195
Ala Thr lie
210 Val Asn 225
Leu Asn Ser Glu 5
Ser lie Ser Ser 20
Pro Asn Gin Pro
Glu Phe His Pro 55
Leu Val Phe Tyr 70
lie Ala Phe Ser 85
Val lie Ala Cys 100
Lys Leu Asp Arg
Leu Ser Asp Lys 135
Glu Glu Glu Gly 150
Gly Val Leu Arg 165
Val Asp Glu Ala 180
Asn Gly Glu Val
Lys Pro Asp Pro 215
Pro Phe
Gin Ser
25 Ala Pro 40
lie Thr
Pro Leu
Glu Arg
Ser Thr 105 Lys Ala 120
Asn Leu
His Ala
Gin lie
lie Arg 185 Cys Pro 200
Thr Ala
Phe lie Val 10
Glu Ser Val
Asp Phe Glu
Leu Arg Gin 60
Asp Phe Thr 75
Ala Ala Glu 90
Asp Ser lie
Gly Gly Leu
Lys lie Ser 140
Phe Arg Gly
155 Thr Val Asn 170
Leu Leu Asp
Ala Asn Trp
Ala Leu Ser 220
Ser
Asn
Gly
45
Phe
Phe
Phe
Tyr
Gly 125 Arg
Met
Asp
Ala
Lys 205 Tyr
Leu Leu Ser 15
Arg Thr Asn 30
Thr Ala Val
Arg Gly Ser
Val Cys Pro 80
Lys Ser Arg 95
Ser His Leu 110
Gin Met Asn
Ala Tyr Gly
Phe Leu lie 160
Arg Pro Veil
175 Phe lie Phe 190
Pro Lys Ser Phe Ser Ser
<210〉 2
〈211〉 681
〈212〉 DNA
〈213> Schistosoma japonicum<220>
〈221> CDS 〈222> (1).
(681)
〈400〉 2 alg肪g tgt Lys
Met 1
lie
8tg Met
att lie
tat
Tyr
65
act
Thr
att lie
ttg Leu
gga
Gly
50
gtg
Val
gag Glu
Cys
tec Ser
ttg
Leu
35
ac3
Thr
tt￡L
Leu
ctg Leu
Ala
ata lie
gtt Val 145 gat Asp
tgg Trp
cct Pro 130 ctt Leu
cct Pro
ttc Phe
gca Ala
gag Glu
Thr 210
Lys 195
lie
tta Leu
tcg Ser 20
CC3
Pro
aat Asn 5
att lie
aal Asn
tcg gag Ser Glu
cca ttt Pro Phe
gaa ttc Glu Phe
ttg gta Leu Val
ggt tgt caa Gly Cys Gin
aca Thr 115 ctg Leu
gat Asp
肪t Asn
att lie
gtg Val 100 aaa Lys
gcg
Ala
85
att
lie
tta Leu
ctt tea Leu Ser
gaa gaa Glu Glu
ggg卿tea Gly Arg Ser
ggt Gly
gtt Val 180 肌c Asn
gtt Val 165 gat Asp
ggt Gly
tea Ser
c幼 Gin
cat His
ttt
Phe
70
ttt
Phe
Ala
gat Asp
gac Asp
gag Glu 150 tta Leu
agt Ser
cct Pro
Pro 55 tat Tyr
agt Ser
tgc Cys
cga Arg
aaa Lys 135 ggt Gly
cgt Arg
gag gcg Glu Ala
aa3 cct Lys Pro
g朋 Glu
gat Asp
cag Gin
get
Ala
40
att
lie
tea
Ser
25
ccc
Pro
acc Thr
ttc
Phe
10
gag
Glu
cca ctt Pro Leu
gaa aga Glu Arg
tea Ser
aaa Lys 120 aat Asn
gtt Val
cct Pro 215
att lie
tgt Cys 200
Thr
ate lie
tea Ser
gtc tea Val Ser
gtt aat Val Asn
gat ttt Asp Phe
ttg cgt Leu Arg
act Thr 105 get Ala
ttg Leu
cat gca His Ala
cag att Gin lie
cgt Arg 185 cca Pro
get Ala
gac Asp
get
Ala
90
gst
Asp
ggt Gly
匕ys
ttc Phe
Thr 170 ctt Leu
gca Ala
get Ala
ttc
Phe
75
gcg
Ala
tcg Ser
gga Gly
ata lie
卿 Arg 155 gtt Val
ctg Leu
肪t Asn
etc Leu
gaa Glu
cag
Gin
60
acg
Thr
ggt
Gly
45
ttt
Phe
ttt Phe
tgg Trp
tcg Ser 220
Lys 205 tac Tyr
ttg Leu
egg Arg 30
Thr
ttg Leu 15 ax; a Thr
get Ala
tea Ser
肌t Asn
gtt Val
cgc ggg agt Arg Gly Ser
gaa ttc Glu Phe
att tat lie Tyr
tta gga Leu Gly 125 tea cga Ser Arg 140
ggg atg Gly Met
aac gst Asn Asp
gat get Asp Ala
gtt Val
卿 Lys
tea Ser 110 csa Gin
tgc Cys
tec
Ser
95
cat
His
atg Met
cca
Pro
80
aga
Arg
ctg Leu
Asn
get tac gga Ala Tyr Gly
ttc Phe
cgc Arg
ttc Phe 190 cca_ Pro
etc Leu
ccc Pro 175 att lie
鄉 Lys
att lie 160 gta Val
ttc Phe
tcg Ser
ttt tec tct Phe Ser Ser
48
96
144
192
240
288
336
384
432
480
528
576
624
672gta aac tga bSl
Vsl Asn
225
<210> 3
〈211> 27
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220〉
〈221> misc一feature
<222> (l)..加
〈223〉 引物
〈220〉
〈221> misc一signal
〈222〉 (4).. (9)
〈223〉 BamHl酶切位点
〈400> 3
ggcggatcca tgaBgtgttt aaattcg 27
〈210〉 4
<211> 29
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220〉
〈221> misc一feature
〈222〉 (1).. (29)
〈223〉 引物
〈220>
〈221> misc—signal 〈222〉 (4).. (9)
<223> Xhol酶切位点
〈400> 4
ggcctcgagg tttacagagg aaaagtacg 29
权利要求
1.一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，其特征在于，所述基因是日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因。
2. 根据权利要求i所述的重组表达载体，其特征在于，所述日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因序列是编码SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因序列为SEQ ID N0:2所示核苷酸序列。
4. 根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为原核表达载体pET28a(+)。
5. —种包含权利要求1所述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞。
6. —种日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II的制备方法，其特征在于，包括以下步骤构建含日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因的重组表达载体；将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II;纯化诱导表达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II 。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II还连接有包含6个组氨酸的标签序列。
8. 权利要求1所述的重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。
9. 权利要求1所述的重组表达载体在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。
10. 权利要求6所述制备方法生产的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II作为预防或治疗血吸虫病疫苗的用途。
全文摘要
本发明公开一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，所述基因是日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II基因。本发明还公开了日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II的制备方法及上述重组表达载体的应用。本发明的含日本血吸虫基因的重组表达载体，能够高表达日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II，该高表达的重组日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶II能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染的保护作用。
文档编号A61K39/00GK101671690SQ20091005767
公开日2010年3月17日 申请日期2009年7月29日 优先权日2009年7月29日
发明者磊 张, 朱传刚, 林矫矫, 汪勇沛, 珂 陆 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所