一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体的制作方法

专利名称：一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程产品领域，更具体地，本发明公开了一种具有高亲和力的 CTLA4-Ig融合蛋白突变体和其在制备治疗免疫排斥反应或者自身免疫性疾病药物中的用 途。
背景技术：
CTLA-4，即细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4 (Cytotoxic T Lymphocyte associate Antigen-4，又称⑶15 ，是表达在活化T细胞表面的标志性分子之一。研究表明，该分子是 维持体内T细胞稳定性的负调控因子，具有抑制活化T细胞增值的功能，与CD^构成了一 对十分重要的免疫调节因子。目前，它被作为免疫抑制受体进行了广泛的研究，在临床上有 可能作为抑制免疫排斥反应的制剂进行应用。
T细胞、抗原提呈细胞表面参与产生共刺激作用的分子统称为共刺激分子。目前 公认最重要的共刺激通道为共刺激通路。B7位于抗原提呈细胞，与T细胞表面的 CD28分子结合可以产生共刺激。当T细胞激活后，其细胞表面会出现另外一种可以与B7细 胞结合的分子CTLA-4。CTLA-4与B7的亲和力很高，该分子与B7细胞结合后可以诱导B7 细胞的调亡。因此目前认为它对T细胞激活有负调节作用，对于维持人体内免疫状态的平 衡起重要作用。
CTLA-4是一种极性跨膜蛋白。将这种蛋白的膜外可溶性部分与抗体分子的Fc片 段的编码区融合在一起构成的融合基因sCTLA4-Ig，插入适当的载体，导入适当的细胞后可 以得到一种天然不存在的融合蛋白，它既有细胞表面受体预期原有配体结合的能力，又有 抗体分子一样的可溶性。CTLA4-Ig融合蛋白半衰期和抗体分子接近，保持活性时间比较长。 利用人源基因获得的蛋白分子在体内不会引起免疫反应。目前已经由多种类似的可溶性融 合蛋白质被制备出来并成功地用于临床。CTLA-4的可溶性受体可以竞争性地与B7分子结 合，而且其对B7的亲和力远远大于⑶观，因此可以明显地抑制通道。
CTLA4-Ig融合蛋白也可以用于一些自身免疫性疾病的治疗。例如，类风湿关节炎 是一种慢性自身免疫性疾病，它能引起关节炎症和畸形。同时也能引起周身系统性疾病，例 如血管炎、身体局部出现类风湿性皮下小结、肺部疾病、血液紊乱和骨质疏松症。类风湿关 节炎是一种渐进发展的风湿性疾病，在发达国家中病人比例大概占2%。这种疾病的特点 是持续不断的关节膜炎，破坏软骨和造成骨侵蚀，进而导致关节接合处外周发生结构性畸 形。类风湿关节炎的症状包括关节肿胀、炎症、晨僵和疼痛。最终严重患者发展为结构性损 坏，包括伴随骨侵蚀的关节损伤(Principals of Internal Medicine, Harrison, 13. sup. thedition,pages 1648-1655)此外，患者呈现出其他各种器官损伤的并发症，包括皮肤、肾 脏、心脏、肺、中枢神经系统和眼睛的损伤。
类风湿性关节炎被认为是一种T细胞介导的自身免疫病，其中涉及T淋巴细胞与 抗原提呈细胞间的抗原非特异性相互作用。总体上说，T细胞的反应程度主要取决于T细 胞表面分子与其配体相互作用所引导的共刺激反应。(Mueller, et al. , 1989 Ann. Rev.3Immunol. 7 :445-480)关键的共刺激信号主要是由T细胞表面受体⑶观和CTLA-4以及位于 抗原提呈细胞上的配体，例如B7相关分子CD80和CD86决定(Linsley，P. and Ledbetter, J.1993Αηη· Rev. Immunol. 11 :191-212)。
T细胞激活过程中缺少共刺激因子会导致无能T细胞反应(ktiwartz，R. H.，1992 Cell71 :1065-1068),使其不再对刺激发生反应。由于类风湿关节炎被认为是T细胞介导的 免疫系统疾病，其中一种治疗策略是开发新的试剂用来阻断内源性的CD^或者CTLA-4与 B7的结合。Abata^pt由施贵宝公司开发，已经获得批准在美国用于治疗对抗TNF α治疗 无效的类风湿性关节炎的病人。Abatac印t是可溶性的CTLA-4分子与抗体Fc的融合蛋白， 通过与内源性的CTLA-4受体分子竞争，阻断共刺激信号。Belatacept同样是由施贵宝公司 开发，与Abataapt仅仅具有两个氨基酸的不同。
由于CTLA4_Ig融合蛋白的药理作用是通过竞争阻断共刺激因子对T细胞的激活， 因此，如果开发出具有更高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白，不但可以显著提高抑制活性，更 加有效的阻断共刺激因子对T细胞的激活，同时还可以降低使用剂量，降低治疗成本。发明内容
本发明的申请人进行了大量的实验，采用基因工程技术构建了多种具有高亲和力 的CTLA4-Ig融合蛋白突变体。这些突变体与Abataapt相比具有更高的亲和力活性，能够 更加有效的阻断共刺激因子对T细胞的激活。高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体可用于 制备治疗免疫排斥反应或者自身免疫性疾病药物，与Abatac印t相比，可以降低使用剂量， 降低治疗成本。
本发明公开了
1，一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体，其特征在于所述突变体包括如SEQ ID NO :2所示的CTLA-4膜外区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述位 点为第四、61或104位氨基酸的位置。
2，上述的突变体，其特征在于所述一个或多个氨基酸位点上由脯氨酸、赖氨酸、谷 氨酸或丝氨酸取代。
3，上述1或2所述的突变体，其特征在于所述突变体的亲和力与Abataapt相比 提高至少2倍。
4，上述3所述的突变体，其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:6，7， 11，13，15，16，18，19 或 20 之一。
5，上述1或2所述的突变体，其特征在于所述突变体的亲和力与Abata^pt相比 提高至少4倍。
6，上述5所述的突变体，其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:6，7， 16，18，19 或 20。
7，上述1或2所述的突变体，其特征在于所述突变体的亲和力与Abataapt相比 提高至少10倍。
8，上述7所述的突变体，其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO 20。
9，一种制剂，含有上述1至8任一所述的突变体和可药用的载体。
10，上述1至9任一所述的突变体或其制剂在制备治疗免疫排斥反应或者自身免疫性疾病药物中的用途。
11，上述10的用途，其中自身免疫性疾病为类风湿关节炎。
更具体地，本发明的申请人通过大量实验，首先构建了 CTLA-4膜外区基因和Fc区 基因，然后将CTLA-4膜外区基因和Fc区基因融合表达、纯化，获得CTLA4-Ig融合蛋白。根 据图1所示的氨基酸突变位点，采用overlapPCR的方式对CTLA4_Ig突变体进行构建，其 构建与表达、纯化的方法与未突变的原本CTLA4-Ig融合蛋白相同。所述CTLA4-Ig突变体 包括CTLA-4膜外区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述位点为第29、 51、53、61、95或104位氨基酸的位置，取代氨基酸为脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或丝 氨酸。
对于本发明，任何合适的真核表达载体都可以使用，这些载体可以为 pcDNA3. 1 (+)，pDRl, pDHFF 之一。
本发明的申请人对上述CTLA4_Ig突变体进行了 biacore鉴定，实验结果表明，申 请人构建的原本CTLA4-Ig融合蛋白的亲和力与Abatac^pt的亲和力相似。相对于未突变 的原本CTLA4-Ig融合蛋白或市售的Abatac印t，提高亲和力程度较高的单点突变体为第 29位脯氨酸或赖氨酸取代(D29Y或D29K)的突变体，亲和力提高了约4倍；第61位脯氨酸 取代(D61Y)或第104位谷氨酸或丝氨酸取代(D104E或D104Q的突变体，亲和力至少提高 了 2倍。提高亲和力程度较高的单点组合突变体为第四位脯氨酸和第61位脯氨酸同时 取代(拟9Y，D61Y)的突变体，第61位脯氨酸和第104位谷氨酸同时取代(D61Y，D104E)的 突变体，第四位脯氨酸和第104位谷氨酸同时取代(拟9Y，D104E)的突变体，上述三个两单 点组合突变体的亲和力提高了至少4倍；第四位脯氨酸、第61位脯氨酸和第104位谷氨酸 三单点组合取代(拟9Y，D61Y，D104E)的突变体亲和力提高最大，至少提高了 18倍。
以上实验结果说明，高亲和力的CTLA4_Ig融合蛋白突变体，其最佳突变位点为第 29,61或104位氨基酸位点，最佳取代的氨基酸为脯氨酸或谷氨酸。并且，多个单点组合突 变体的亲和力要高于单点突变体。
本发明公开上述CTLA4_Ig融合蛋白突变体，可以和药学上可以接受的辅料一起 组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等 制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述CTLA4-Ig融合蛋白突变体的水针或冻 干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或 其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或 80) ；poloxamer (如poloxamer 188) ；Triton ；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷 基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics ；M0NAQUAT 等，其加入量应使CTLA4_Ig融合蛋白 突变体颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包 括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液 稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持 稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸 盐缓冲液之一。
上述制剂为包含CTLA4_Ig融合蛋白突变体的组合物，在对包括人在内的动物给 药后，阻断共刺激因子对T细胞激活的效果明显。具体来讲，CTLA4-Ig融合蛋白突变体通 过负调节T细胞激活作用，对治疗免疫排斥反应或者自身免疫性疾病有效，可以作为治疗上述疾病的药物使用。
本发明中CTLA4_Ig融合蛋白突变体及其组合物在对包括人在内的动物给药时， 给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验 的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0. 1 3000mg/天。


图1. CTLA-4膜外区核苷酸序列和氨基酸序列。图中第一行序列表示CTLA-4膜外 区的碱基序列，第二行序列表示氨基酸序列。其中有下划线的地方表示构建突变体的突变 点，其碱基序列上对应的是其序列号。
图2. biacore检测Abatac^pt及CTLA4_Ig突变体。不同突变体按照相同浓度，等 倍比稀释在50μ Ι/min流速和25°C环境下进行检测。图中所示为，不同CTLA4_Ig突变体在 相同浓度下的sensorgram图。WT，表示未突变的原本CTLA4_Ig融合蛋白。
具体实施方式
以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施 例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因 插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域 中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook， J. , Fritsch, Ε. F. and Maniais, Τ. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Sedition, Cold spring Harbor Laboratory Press.
实施例1. CTLA-4膜外区基因和Fc区基因的克隆
用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂Gnvitrogen公司产品) 提取总RNA，设计引物扩增CTLA-4膜外区基因(GeneID :1493)，并用引物FC有义GCCCAGA TTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGAC 和 FC 反义GAATTCTCATTTACCCGGAGACAGG 扩增抗体 Fc 区。 PCR反应均采用热启动，反应条件94°C 45秒，60°C 45秒，72°C 1分10秒，30个循环；72°C 10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T(pr0mega公司)载体中，测 序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2显示了 CTLA-4膜外区的 核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4分别显示了 IgGl Fc区的核苷酸序列 和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CT和pGEM-T/Fc。
实施例2. CTLA4-Ig融合蛋白的表达载体构建
设计引物将合成的信号肽序列SEQ ID NO 5与克隆出来的CTLA-4膜外基因片段 进行overlapPCR，将连接测序正确的片段与抗体IgGl Fc进行overlapPCR，装pGEM-Τ载体 进行测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切CTLA4_Ig融合蛋白基因，经琼脂 糖凝胶电泳纯化回收，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3. 1 (+)(美国Invitrogen 公司产品)进行连接，构建成真核表达载体pcDNA3. 1 (+)，记作pcDNA3. 1 (+) (CTLA4_Ig)。
实施例3.融合蛋白的稳定表达与纯化
于3. 5cm组织培养皿中接种3X105 CH0-K1细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养 至90% -95%融合时进行转染取质粒1(^8(质粒？00嫩3.1(+) (CTLA4-Ig)10y g和20 μ ILipofectamine2000 Reagent (Invitrogen 公司产品)分别溶于 500 μ 1 无血清 DMEM 培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形 成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂 质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置 于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600yg/ml G418选择培养基筛选抗性克 隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4°C过 夜，用2% BSA-PBS于37°C封闭浊，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Abata^pt)， 37°C温育浊，加入HRP-羊抗人Fc(CH2)进行结合反应，37°C温育lh，加入TMB于37°C作用 5min，最后用H2SO4终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培 养，用ftOtein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化融合蛋白。将纯化的融合蛋白用PBS进 行透析，最后以紫外吸收法定量。
实施例4.融合蛋白突变体的构建及表达
采用overlapPCR的方式对CTLA4_Ig突变体进行构建，其构建与表达、纯化的方法 与原本CTLA4-Ig融合蛋白相同(如实施例1至3所述)。其中，CTLA-4膜外区的突变点选 择见图1所示，突变体氨基酸序列见SEQ ID NO :6 20。
实施例5. CTLA-4/Ig突变体的biacore鉴定
将CM5芯片(GE公司)在50 μ 1/min的PBS溶液(磷酸盐缓冲液)中25°C平衡 30min,然后用100 μ 1的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)和100 μ 1 EDC (1-乙基-3- (3- 二甲基 氨丙基)-碳化二亚胺)混合，以 ο μ 1/ml活化芯片8min。然后将终浓度为5 μ g/ml的 CD86-Fc蛋白(R&D公司)以10 μ 1/ml的流速包被芯片，最终Δ Ru = lOORu。然后用PBS 缓冲液50 μ 1/min平衡lOmin。将待检测样品以等两倍比稀释五个浓度，50 μ 1/min上样 75sec，然后用PBS解离IOmin。图2显示了在相同样品浓度下biacore检测的sensorgram 图；具体检测亲和力数值见表1。其中，我们构建的原本CTLA4-Ig融合蛋白的亲和力与 Abatacept的亲和力相似。
相对于未突变的原本CTLA4_Ig融合蛋白，提高亲和力程度较高的单点突变体为 突变体CTmutl和CTmut2，亲和力分别提高了 3. 98和4. 04倍；突变体CTmut6，亲和力提高 了 2. 倍；突变体CTmutlO，亲和力提高了 2. 68倍。最终，亲和力提高最高的为三点组合 突变体CTmutl5，其亲和力最终提高了 18. 2倍。
相对于市售的Abatacept，提高亲和力程度较高的单点突变体为突变体CTmutl 和CTmut2，亲和力分别提高了 4. 24和4. 31倍；突变体CTmut6，亲和力提高了 2. 44倍；突变 体CTmutlO，亲和力提高了 2. 86倍。最终，亲和力提高最高的为三点组合突变体CTmutl5， 其亲和力最终提高了 19. 4倍。
表一
突变体名称位置突变为氨基酸T, WT mutant KtJ /RdKabat i-ir mutant d /l^dKdWT=25.73±3 nMCTmutlCTmut2CTmut3CTm ut4CTmut5CTmut6CTmut CTmut8CTmut9CTmutlO串-点组合突变体CTmutlICTmut 12CTmutl 3CTmut 14CTmut 15Kdabat=27.42±3 nMD29AlaTyrD29AlaLysD51ThrLysD53MetGIuD61LeuLysD61LeuTyrD95GluTyrD104LeuGluD104LeuAsnD104LeuSerD29Y’D61YD29Y，D53ED61Y,D104ED29Y,D104ED29Y,D61Y,D104E3.98 士 0.19 4.04 ± 0.90 0.55 ±0.14 1.75 ±0.07 1.85±0.16 2.29 ±0.31 1.64 士 0.12 2.00 士 0.39 0.88 ±0.06 2.68 土 1.144.68 ± 1.78 1.83 ±0.25 4.52 ±0.14 5.47 ±0.56 18.20 士 1.054.24 士 0.20 4.3 i 土 0.96 0.58 ±0.15 1.87 ±0.08 1.97 士 0.]7 2.44 ±0.33 1.75 士 0.13 2.13 ±0.42 0.94 士 0.06 2.86 ± 丨.224.99 ± 1.90 1.95 ±0.27 4.82±0.15 5.83 土 0.60 19.40± 1.12
实验误差采用SD表示，通过三次不同的实验确定。WT，表示未突变的原本 CTLA4-Ig融合蛋白；abat，表示市售Abatac^pt ；CTmutl CTmutl5，表示单点突变或单点 组合突变的CTLA4-Ig融合蛋白突变体。
序列表
<110>上海抗体药物国家工程研究中心有限公司
<120> 一种高亲和力的CTLA4_Ig融合蛋白突变体
<160>20
<170>PatentIn version 3. 2
<210>1
<211>375
<212>DNA
<213>CTLA_4膜外区核苷酸序列
<400>1
atgcacgtgg
tgtgagtatg
gacagccagg
ctagatgatt
ggactgaggg
ccatactacc
ccagattctg
<210>2
<211>125
<212>PRTcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtg60catctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggct120tgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttc180ccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaa240ccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccg300tgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgc360atcag37500670068006900700071007200730074007500760077007800790080 0081 0082008300840085008600870088 00890102010301040105<213>CTLA-4膜外区氨基酸序列 <400>2His Val Ala Gln Pro Ala Val ValMet 1AlaSer PheArg ValThr35ThrVal 20 Val5CysGlu Tyr Ala Ser 25 AspAla Ala 50Cys ThrLeu Arg Gln Ala 40 AsnAla Ser Gly Lys Ser Gln ValLeu 10 Prolie 65Gly Leu Arg AlaMet Tyr Pro Pro 100 AspTyr Met Met Gly ThrMet85ProSer70AspGly Asn Glu Leu Thr Phe 5560Ser Gly Asn Gln Val AsnGly Asn Gln Thr Gly LeuTyr Tyr LeuTyr Vallie 115Pro Glu ProCys 120Gly 105 ProTyr90lieVal75lieCys Gly Asn Asp Ser AspSerAlaThr45LeuLeuLysGlyGln 125Arg Gly 15Thr Glu 30Glu Val Asp Asp Thr lielieValCysSerGln 80 LeuVal Glu 95Thr Gln lie 110<210>3<211>705<212>DNA<213>IgGl Fc核苷酸序列 <400>30090]gagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaactcctg600091]gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgg1200092]acccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc1800093]aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcag2400094]tacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaat3000095]ggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacc3600096]atctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgg4200097]gatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagc4800098]gacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaga3. C 3.3. C 3. C 3.3.gaccacgcct5400099]cccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagc6000100]aggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccac6600101]tacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgaggatcc705<210>4<211>232<212>PRT<213>IgGl Fc氨基酸序列0106]<400>40107]GluProLysSerSerAspLysThrHisThrSerProProSerProAla0108]1510150109]ProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysPro0110]2025300111]LysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValVal0112]3540450113]ValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrVal0114]5055600115]AspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGln0116]657075800117]TyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGln0118]8590950119]AspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAla0120]1001051100121]LeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGlnPro0122]1151201250123]ArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThr0124]1301351400125]LysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSer0126]1451501551600127]AsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyr0128]1651701750129]LysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyr0130]1801851900131]SerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPhe0132]1952002050133]SerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLys0134]2102152200135]SerLeuSerLeuSerProGlyLys0136]2252300137]<210>50138]<211>930139]<212>DNA0140]<213>信号肽序列0141]<400>50142]aagcttgccg ccaccatggg tgtactgctc acacagaggacgctgctcag tctggtcc0143]gcactcctgt ttccaagcat ggcgagcatg gca0144]<210>69310
<211>357
<212>PRT
<213>CTmutl 氨基酸序列
<400>6
MetHisValAlaGlnProAlaValValLeuAlaSerSerArgGlylie
151015
AlaSerPheValCysGluTyrAlaSerProGlyLysTyrThrGluVal
202530
ArgValThrValLeuArgGlnAlaAspSerGlnValThrGluValCys
354045
AlaAlaThrTyrMetMetGlyAsnGluLeuThrPheLeuAspAspSer
505560
IleCysThrGlyThrSerSerGlyAsnGlnValAsnLeuThrlieGln
65707580
GlyLeuArgAlaMetAspThrGlyLeuTyrlieCysLysValGluLeu
859095
MetTyrProProProTyrTyrLeuGlylieGlyAsnGlyThrGlnlie
100105110
TyrVallieAspProGluProCysProAspSerAspGlnGluProLys
115120125
SerSerAspLysThrHisThrSerProProSerProAlaProGluLeu
130135140
LeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThr
145150155160
LeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValValValAspVal
165170175
SerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyVal
180185190
GluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSer
195200205
ThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeu
210215220
AsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAla
225230235240
ProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluPro
245250255
GlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGln
260265270
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210215220
AsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAla
225230235240
ProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluPro
245250255
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260265270
ValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAla
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290295300
ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeu
305310315320
ThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSer
325330335
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340345350
LeuSerProGlyLys
355
<210>18
<211>357
<212>PRT
<213>CTmutl3氨基酸序列
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65707580
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100105110
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115120125
SerSerAspLysThrHisThrSerProProSerProAlaProGluLeu
130135140
LeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThr
145150155160
LeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValValValAspVal
165170175
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180185190
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195200205
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210215220
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225230235240
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245250255
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260265270
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275280285
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325330335
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340345350
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<210>19
<211>357
<212>PRT
<213>CTmutl4氨基酸序列
<400>19
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151015
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260265270
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<211>357
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<213>CTmutl5氨基酸序列
<400>20
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151015
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GlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGln
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340345350
LeuSerProGlyLys
35权利要求
1.一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体，其特征在于所述突变体包括如SEQ IDNO 2所示的CTLA-4膜外区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述位 点为第四、61或104位氨基酸的位置。
2.权利要求1所述的突变体，其特征在于所述一个或多个氨基酸位点上由脯氨酸、赖 氨酸、谷氨酸或丝氨酸取代。
3.权利要求1或2所述的突变体，其特征在于所述突变体的亲和力与Abataapt相比 提高至少2倍。
4.权利要求3所述的突变体，其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQID NO :6， SEQID NO 7,SEQ ID N0:11，SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16,SEQ ID NO :18， SEQ ID NO 19 或 SEQ ID NO :20。
5.权利要求1或2所述的突变体，其特征在于所述突变体的亲和力与Abataapt相比 提高至少4倍。
6.权利要求5所述的突变体，其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQID NO 6, SEQID NO 7, SEQ ID NO :16，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO 19 或 SEQ ID NO :20。
7.权利要求1或2所述的突变体，其特征在于所述突变体的亲和力与Abataapt相比 提高至少10倍。
8.权利要求7所述的突变体，其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQID NO 20。
9.一种制剂，含有上述1至8任一所述的突变体和可药用的载体。
10.权利要求1至9任一所述的突变体或其制剂在制备治疗免疫排斥反应或者自身免 疫性疾病药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其中自身免疫性疾病为类风湿关节炎。
全文摘要
本发明公开了一种具有高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体和其在制备治疗免疫排斥反应或者自身免疫性疾病药物中的用途。所述突变体包括CTLA-4膜外区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代。这些突变体与Abatacept相比具有更高的亲和力活性，能够更加有效的阻断共刺激因子对T细胞的激活。
文档编号A61P37/02GK102030828SQ20091005795
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日
发明者侯盛, 李博华, 王皓, 赵磊, 郭亚军 申请人:上海抗体药物国家工程研究中心有限公司