专利名称：生存素与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生存素(Survivin)与路易斯寡糖(Lewis )的复合物(Survivin-Lewis),还涉及该复合物的制备方法和应用。
背景技术：
恶性肺瘤的治疗已取得很多进展，但微小残留病灶仍难以被现行的化疗、 放疗、手术等方案彻底清除。应用肿瘤免疫治疗激发机体免疫监视系统，消灭 残存肿瘤细胞，有可能彻底治愈肿瘤。因此，肿瘤免疫治疗和肿瘤疫苗开发成 为现今研究热点之一。Survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，具有抑制细胞凋亡和维持 细胞有丝分裂的双重功能。Survivin在正常的终末分化组织中几乎不表达，但在 几乎所有恶性肿瘤组织中高表达，被视为最具肿瘤特异性的肿瘤共享抗原。 Survivin表达水平与肺瘤恶性程度成正相关，若肿瘤组织高表达Survivin,则肿 瘤细胞凋亡指数下降，对放化疗的耐受性增强，预后差；反之，若肿瘤组织低 表达或不表达 survivin,贝'J对》丈化疗敏感，预后良好。近年来研咒发5见,月中瘤新 生血管内皮细胞受到某些细胞因子如血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞 生长因子等的刺激后可以高表达Survivin,而静止的血管内皮细胞几乎不表达 Survivin,因此，Survivin又被视为一种新的胂瘤新生血管标志物。以Survivin 为抗肿瘤靶标具有以下独特优势(1) Survivin表达于几乎所有肿瘤细胞中，尤 其在恶性度高、耐放化疗的肿瘤细胞中高表达，若肿瘤细胞为逃逸免疫监视而 下调Survivin表达，则会相应增加其凋亡指数和放化疗敏感性；(2 ) Survivin所 诱导的特异性细胞免疫在杀伤肺瘤细胞的同时，还可石皮坏肿瘤新生血管内皮细 胞，由此产生协同抗肺瘤效应，即使在部分肿瘤细胞逃逸免疫监视的情况下，同样能通过抑制血管生成达到打击肿瘤的目的。但是，肿瘤抗原为自身抗原，存在免疫原性低，特异性细胞免疫激活不足, 外周免疫耐受等问题，在设计肿瘤疫苗时需增强免疫系统对肿瘤抗原的识别能 力以激发有力的特异性细胞免疫。树突状细胞(DC)是体内最强大的专职抗原递呈细胞，能够识别、捕获、 加工、递呈抗原引发初始免疫反应。利用DC来改善肺瘤疫苗的免疫原性是肺瘤 疫苗设计的重要策略之一。其主要方式有体外和体内两种。体外方式是先体外分离DC,再用肿瘤细胞裂解物、肺瘤抗原蛋白、肺瘤抗原多肽或肿瘤来源的 RNA冲击致敏DC,或将肺瘤细胞与DC融合，或将肺瘤相关抗原(TAA)基因 转染DC,制成各种DC肿瘤疫苗，最后回输体内。体内方式是将蛋白、多肽或 基因疫苗直接体内靶向DC，是更简便、更易于临床操作的方式，但其存在如下 问题既往研究的蛋白疫苗多以DC表达的Fc受体、补体受体、甘露糖受体、 CD40或B7为靶向受体，但这些受体在血细胞上也有表达，乂人而在DC特异性 靶向方面有所欠缺；基因疫苗多采用具有高转染率的病毒载体，但大多数病毒 载体并不能特异性靶向DC,且病毒载体本身可能表达大量的具有免疫原性的蛋 白，不仅会干扰目的基因的免疫效果，而且可能导致含目的基因的病毒载体被 机体迅速清除，另外，生物安全性也是病毒载体的固有缺陷。树突状细胞表面特异性C型凝集素-细胞间黏附分子3结合非整合素分子(DC-SIGN)是新近发现的限制性表达于DC和某些组织巨噬细胞上的凝集素 受体，可有效地摄取颗粒性抗原和可溶性抗原，再以主要组织相容性复合体(MHC) I类分子和II类分子限制性方式进行抗原递呈，因此，DC-SIGN是较 好的DC特异性靶向受体。进一步研究发现，与DC-SIGN结合的实际是表达于 自然配体上的结构简单的寡糖，主要有高甘露糖结构和Lewis系列包括路易斯 寡糖-a (Lea)、路易斯寡糖-x (Lex)和路易斯寡糖-y (Ley)等。其中，高甘露 糖结构虽然可被DC-SIGN高效摄取，但对DC-SIGN的靶向特异性较差，同时 可被甘露糖受体等其他凝集素受体识别、摄取；而Lex是DC-SIGN的高亲和力配体，对DC-SIGN具有较强的特异性。 发明内容有鉴于此，本发明的目的之一在于^是供一种Survivin-Lewis;目的之二在于 提供所述Survivin-Lewis的制备方法；目的之三在于提供所述Survivin-Lewis在 医药方面的应用。为达到上述目的，在本发明的第 一 方面，提供了 一种Survivin-Lewis,由 Survivin与Lex以非共价4建结合而成，所述Survivin具有SEQ ID No.2所示的氨 基酸序列；进一步，由Survivin与Lex通过链霉亲和素(SA)与生物素(biotin)的高 亲和力结合而成。在本发明的第二方面，提供了所述Survivin-Lewis的制备方法，包括以下步骤a、 Survivin与SA的交4关物(Survivin-SA )的制备将SA与Traut，s试剂反应制得巯基化修饰的SA;将Survivin与巯基化修饰 的SA反应制得Survivin-SA;b、 Survivin-Lewis的制备在酶标板中加入(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素(Lex-PAA-biotin )溶液， 4'C包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入牛血清白蛋白(BSA)溶液， 4。C封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，再加入步骤a所得Survivin-SA溶 液，37。C反应0.5 2小时，再室温反应10-60分钟，即得Survivin-Lewis。进一步，所述步骤a是将SA与Traut，s试剂在含有PBS和乙二胺四乙酸 (EDTA)的水溶液中4。C避光反应2小时，超滤脱盐，再用含有PBS和EDTA 的水溶液稀释后继续超滤以稀释Traut，s试剂，制得巯基化修饰的SA;向所得巯 基化修饰的SA溶液中，加入Survivin溶液，混匀，4。C反应4小时，即得Survivin-SA;进一步，所述步骤b是在酶标板中加入浓度为10|ag/ml的Lex-PAA-biotin 溶液，4。C包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入质量百分比浓度为 2%的BSA溶液，4。C封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，再加入浓度为 10jig/ml的Survivin-SA溶液，37。C反应1小时，再室温反应30分钟，即得Survivin-Lswis。在本发明的第三方面，提供了所述Survivin-Lewis在制备肿瘤疫苗中的应用。本发明的有益效果在于本发明复合物通过Lex的导向作用，可成功靶向 DC-SIGN，促进Survivin特异性T细胞免疫应答，高效-漆导肿瘤细胞凋亡并抑 制肿瘤血管生成，可用于制备肿瘤疫苗，在肿瘤免疫治疗领域有着良好的开发 应用前景。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发 明作进一步的详细描述，其中图1为蛋白免疫印迹(Western Blot)鉴定Survivin;图2为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测Survivin-SA;图3为SDS-PAGE检测Survivin-Lewis;图4为酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测Survivin-Lewis激发T细胞分泌干扰素-y (IFN-y)的能力；图5为51Cr释放法检测Survivin-Lewis激发T细胞对Survivin阳性肿瘤细胞的特异性杀伤效应。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。一、Survivin-Lewis的制备1、 Survivin-SA的制备 (1 ) Survivin基因的克隆将高表达Survivin的白血病细胞HL-60用RPMI 1640培养基常规培养，调 节细胞密度为2x 10 个/mL，用浓度为100U/mL的重组人白介素-3刺激24小时， 收集细胞，用PBS (即pH为7.4的磷酸盐緩沖液)洗涤3次，再用总RNA提 取试剂盒提取细胞总RNA,紫外分光光度法测定所得RNA的纯度和浓度；根 据GenBank登录号为NM—001168.2的Survivin基因序列，设计并合成如下PCR 引物以扩增含有Survivin全长编码基因、5，端BamHI酶切位点和3，端Hincffll酶 切位点的DNA片卑更引物F1: 5，-tagg^eeatgggtgccccgacgttgccccctg-3 ， ( SEQ ID No.3 )，下划线部分为BamHI酶切4立点；引物Rl: 5，-gcaagcttatccatggcaccagctgctg -3， (SEQIDNo.4)，下划线部分为HindIII酶切位点；将提取的细胞总RNA逆 转录为cDNA,再以所得cDNA为模板进行PCR， PCR条件为94。C预变性3 分钟，然后94。C变性1分钟、58。C退火1分钟，72。C延伸1分钟，共30个循环， 最后72。C延伸7分钟；PCR产物经浓度为20g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶 回收试剂盒切胶回收纯化后，与克隆载体pGEM-TEasy连接，连接产物转化大 肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨千青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取 质粒，委托上海生工公司测定基因序列，将序列正确的阳性克隆质粒命名为 pGEM-T Easy/Survivin。琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约450bp处呈单一特异性条带，与预 期结果相符；测序结果显示插入基因序列与Survivin全长编码基因序列(SEQ ID No.l) —致。(2 ) Survivin基因重组原核表达载体的构建将步骤(1 )所得质粒pGEM-T Easy/Survivin和原核表达载体pET32a(+)分 別用限制性内切酶Bamffl和HindIII进行双酶切，用凝胶回收试剂盒切胶回收纯 化双酶切后的SurvivinDNA片段和线性载体pET32a(+)，以摩尔比为3 : 1于16 。C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的 LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，用BamHI和HindIII进行双酶切鉴定，并委 托上海生工公司测定基因序列，序列和阅读框架正确的阳性克隆质粒即为构建 成功的Survivin基因重组原核表达载体，命名为pET32/Survivin。双酶切鉴定结果显示双酶切产物在约450bp处出现电泳带，与插入片段大 小相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列无突变，阅读框架正确， 无移码。(3 ) Survivin基因工程菌的构建将步骤(2 )所得Survivin基因重组原核表达载体pET32/Survivin用限制性 内切酶SalI酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化 产物涂布于MD平板上，3(TC培养3 4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于MD 平板和MM平板上，30。C培养3 6天(每天向MM平板中添加曱醇100pL)， 挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL 的G418的YPD平板上，30。C培养7天，所得酵母菌即为高拷贝Survivin基因 工程菌。(4) Survivin的诱导表达将步骤(3 )所得高拷贝Survivin基因工程菌于30。C培养至OD600为2，按 10。/。接种量接入BMGY培养基中，30。C培养24小时，5000g离心5分钟，弃上 清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于等体积的BMMY培养基中，3(TC诱导表 达3天(每24小时补加诱导剂曱醇至最终体积百分浓度为0.5% ) ， 4°C 、 6000g 离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80%的硫酸铵溶液使蛋白质沉淀， 离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、 pH为8.0的PBS透析脱盐，再 用琼脂糖凝胶(Q-Sepharose)柱进行分离纯化，收集洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶(Sephdex G-25 )柱脱盐，即得纯化的Survivin (氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)，取样进行Western Blot鉴定。Western Blot鉴定取纯化的Survivin，加入内参卩-actin和上样緩沖液，100 。C加热3 5分钟，用质量百分浓度为12%的分离胶、质量百分浓度为5%的积层 胶进行SDS-PAGE,电泳完毕后，将分离产物电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜 上，用质量百分浓度为5%的脱脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人Survivin单克隆抗 体和鼠抗人P-actin单克隆抗体，温度37。C孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化 物酶标记的兔抗鼠IgG,温度37。C孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对 照(不加入纯化的Survivin);结果见图1，其中1泳道为纯化的Survivin, 2 泳道为阴性对照，可见1泳道除内参P-actin条带外，还有一明显蛋白条带，而 2泳道未见相应条带。(5) Survivin-SA的制备取浓度为5mg/ml的SA溶液lml,加入新鲜配制的浓度为2mg/ml的Tmut，s 试剂68.8^1、 10xPBS 0.2ml、浓度为0.5mol/L的EDTA溶液8(al和超纯水lml, 混匀，4。C避光反应2小时，超滤离心管10KD超滤脱盐，再用含有lxPBS和浓 度为2mmol/L的EDTA的平衡溶液稀释后继续超滤以稀释Traut，s试剂，得巯基 化修饰的SA溶液；向上述巯基化修饰的SA溶液中，加入浓度为10mg/ml的 Survivin溶液200|il,混匀，4。C反应4小时，即得Survivin-SA,用S印harose 4B 柱纯化，冻干保存，取样进行SDS-PAGE鉴定。SDS-PAGE鉴定结果如图2所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1泳 道为Survivin-SA，可见1泳道在18KD处出现电泳带，与预期结果相符。2、 Survivin-Lewis的制备在酶标板中，每孔加入浓度为10ng/ml的Lex-PAA-biotin, 4。C包被过夜， 弃去包^皮液，用PBS洗涤后，再加入质量百分浓度为2%的BSA溶液(以PBS 为溶剂)，4。C封闭过夜，弃去封闭液，用 洗涤后，加入浓度为10pg/ml 的Survivin-SA溶液，37。C反应1小时，再室温反应30分钟，即得Survivin-Lewis，冻干保存，取样进行SDS-PAGE鉴定。SDS-PAGE鉴定结果如图3所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1泳 道为Survivin-Lewis，可见1泳道在18KD处出现电泳带，与预期结果相符。二、 Survivin-Lewis促进特异性T细胞免疫应答的检测效应细胞的制备将30只6~8周龄雌性Babl/c小鼠随机分为3组实验组、对照组和空白组(每组10只)，实验组以浓度为lmg/mL的Survivin-Lewis溶液(以10 x PBS为溶剂)为免疫原，对照组以浓度为lmg/mL的survivin溶液(以10xPBS为溶剂)为免疫原，空白组以10xPBS为免疫原，各组于小鼠背侧尾根部皮下注射免疫原，每只lOO^L,之后每隔1周，以同样方法加强免疫l次，共免疫3次；末次免疫后l周，断颈处死各组小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为1 x 106个/11丄，作为后续实验中各组的效应细胞。1 、 ELISPOT法检测Survivin-Lewis激发T细胞分泌IFN-y的能力釆用ELISPOT检测试剂盒进行4全测，具体操作参照试剂盒说明书在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70。/。的乙醇100pL，室温放置10分钟，用PBS洗涤后，再加入稀释度为l : 100的IFN-Y捕获抗体100^L,温度4。C孵育过夜，用PBS洗涤后，再加入质量百分浓度为2Q/。的脱脂奶粉溶液100jiL,室温封闭2小时，用PBS洗涤后，再加入效应细胞100^L,温度37。C孵育48小时，用PBST (即含有质量百分浓度为0.P/。的吐温20的PBS)洗涤后，再加入稀释度为l : 100的biotin标记抗IFN-y抗体100^iL，温度37。C孵育1.5小时，用PBST洗涤后，加入稀释度为1 : 5000的SA标记碱性磷酸酶100(iL，温度37。C孵育1小时，用PBST洗涤后，拍干培养板，加入即用型BCIP/NBT底物反应液100jiL，室温避光显色2 10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；同时设置阴性对照组(不加入效应细胞)，各组斑点凄t以3个复孔的均值表示。结果见图4，实验组的斑点数(253个)明显高于其它3组(对照组为186个，空白组为14个，阴性对照组为3个)，表明本发明的Survivin-Lewis具有良 好的免疫原性，能够有效激发t细胞分泌IFN-y。2、 51Cr释放法才企测Survivin-Lewis激发T细胞对Survivin阳性肿瘤细胞的 特异性杀伤效应靶细胞的制备将Survivin阳性的结肠癌细胞CT26用含有质量百分浓度为 10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基体外培养，收集细胞，离心洗涤2次后， 用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为1 xl()6个/mL,取lmL置lOmL血清瓶中，加入Na51Cr04 100pCi，温度37。c孵育 90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的51Cr,再用含有质量百分浓度为10°/。的胎 牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度为lxl()S个/mL,作为草巴细胞。在96孑L U型板中，每孔分别按效輩巴比(E/T)为100 : 1、 50 : 1和25 : 1 加入效应细胞与耙细胞，每种效耙比设3个复孔，同时设最大释放组(用浓度 为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放组(用含有质量百分浓度为10%的 胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞)，将96孔板500r/min离心30秒后， 温度37。c孵育4小时，再1000r/min离心10分钟，各孔取上清lOO(iL,用y计 数器测定每分钟放射活性(cpm值)，按下述公式计算杀伤率杀伤率(％)=[(实 验组cpm均值-最小释放组cpm均值)/(最大释》欠组cpm均值-最小释放组cpm均 值)]x亂结果见图5，实验组在各效靶比对CT26细胞均有特异性杀伤作用，且 随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，当E/T为IOO:I时，杀伤率 为53.4%，而对照组杀伤率为37.2%,空白组对CT26细胞无特异性杀伤作用， 表明本发明的Survivin-Lewis能够有效激发T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤 效应。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管 通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所 附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。序 列 表<110〉 中国人民解放军第三军医大学<120>生存素与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用<160〉 4<210〉 1<211> 429<212〉 薩<213> 智人(homo sapiens) <220><221> CDS<222〉 (1)......(429)<400〉 1atg ggt gcc ccg acg ttg ccc cct gcc tgg cag ccc ttt etc aag gac 48Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gin Pro Phe Leu Lys Asp15 10 15cac cgc ate tct aca ttc aag aac tgg ccc ttc ttg gag ggc tgc gcc 96His Arg lie Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala20 25 30tgc acc ccg gag egg atg gcc gag get ggc ttc ate cac tgc ccc act 144Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe lie His Cys Pro Thr35 40 45gag aac gag cca gac ttg gcc cag tgt ttc ttc tgc ttc aag gag ctg 192Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gin Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu50 55 60gaa ggc tgg gag cca gat gac gac ccc ata gag gaa cat aaa aag cat 240Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro lie Glu Glu His Lys Lys His65 70 75 80teg tec ggt tgc get ttc ctt tct gtc aag aag cag ttt gaa gaa tta 288Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gin Phe Glu Glu Leu85 90 95acc ctt ggt gaa ttt ttg aaa ctg gac aga gaa aga gcc aag aac aaa '336Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys100 105 110att gca aag gaa acc aac aat aag aag aaa gaa ttt gag gaa act gcg 384lie Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala115 120 125gag aaa gtg cgc cgt gcc ate gag cag ctg get gcc atg gat tga 429Glu Lys Val Arg Arg Ala lie Glu Gin Leu Ala Ala Met Asp 130 135 140<210〉 2<211> 142<212> PRT<213〉 智人(homo sapiens)<400〉 2Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro1 5 His Arg lie Ser Thr Phe Lys 20Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala 35Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala 50 55 Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp65 70 Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu85Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys 100lie Ala Lys Glu Thr Asn Asn 115Glu Lys Val Arg Arg Ala lie 130 135Pro Ala Trp Gin Pro Phe Leu Lys Asp10 15 Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala25 30 Glu Ala Gly Phe lie His Cys Pro Thr40 45 Gin Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu60Asp Pro lie Glu Glu His Lys Lys His 75 80 Ser Val Lys Lys Gin Phe Glu Glu Ixu90 95 Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys105 110 Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala 120 125 Glu Gin Leu Ala Ala Met Asp140<210〉 3<2U〉 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物Fl<400〉 3
taggatccat gggtgccccg acgttgcccc ctg
<210〉 4
〈211〉 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Rl<400> 4
gcaagcttat ccatggcacc agctgctg
权利要求
1、生存素与路易斯寡糖的复合物，其特征在于由生存素与路易斯寡糖-x以非共价键结合而成，所述生存素具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2、 根据权利要求l所述的生存素与路易斯寡糖的复合物，其特征在于由 生存素与路易斯寡糖-x通过链霉亲和素与生物素的高亲和力结合而成。
3、 权利要求l所述的生存素与路易斯寡糖的复合物的制备方法，其特征在 于包括以下步骤a、 生存素与链霉亲和素的交联物的制备将链霉亲和素与Traut，s试剂反应制得巯基化修饰的链霉亲和素；将生存素 与巯基化修饰的链霉亲和素反应制得生存素与链霉亲和素的交联物；b、 生存素与路易斯寡糖的复合物的制备在酶标板中加入(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素溶液，4"C包被过夜，弃 去包被液，用PBS洗涤后，再加入牛血清白蛋白溶液，4。C封闭过夜，弃去封闭 液，用PBS洗涤后，再加入步骤a所得生存素与链霉亲和素的交联物溶液，37 。C反应0.5 2小时，再室温反应10 60分钟，即得生存素与路易斯寡糖的复合物。
4、 根据权利要求3所述的生存素与路易斯寡糖的复合物的制备方法，其特 征在于所述步骤a是将链霉亲和素与Traut，s试剂在含有PBS和乙二胺四乙酸 的水溶液中4。C避光反应2小时，超滤脱盐，再用含有PBS和乙二胺四乙酸的 水溶液稀释后继续超滤以稀释Traut，s试剂，制得巯基化修饰的链霉亲和素；向 所得巯基化修饰的链霉亲和素溶液中，加入生存素溶液，混匀，4。C反应4小时， 即得生存素与链霉亲和素的交联物。
5、 根据权利要求3所述的生存素与路易斯寡糖的复合物的制备方法，其特 征在于所述步骤b是在酶标板中加入浓度为10jig/ml的^各易斯寡糖-x)-聚丙烯 酸钠-生物素溶液，4"C包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入质量百 分浓度为2%的牛血清白蛋白溶液，4'C封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，再加入浓度为10i!g/ml的生存素与链霉亲和素的交联物溶液，37。C反应1小时， 再室温反应30分钟，即得生存素与路易斯寡糖的复合物。
6、权利要求1所述的生存素与路易斯寡糖的复合物在制备肿瘤疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了生存素与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用，该复合物由生存素与路易斯寡糖-x以非共价键结合而成，所述生存素具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；其制备方法是先制得生存素与链霉亲和素的交联物，再与(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素通过链霉亲和素与生物素的高亲和力进行结合，即制得生存素与路易斯寡糖的复合物；本发明复合物通过路易斯寡糖-x的导向作用，可成功靶向树突状细胞表面特异性C型凝集素-细胞间黏附分子3结合非整合素分子(DC-SIGN)，促进生存素特异性T细胞免疫应答，高效诱导肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤血管生成，可用于制备肿瘤疫苗，在肿瘤免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。
文档编号A61K47/48GK101623503SQ20091010454
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者吴玉章, 曌 杨 申请人:中国人民解放军第三军医大学