专利名称：一种经紫外线和钴60γ-射线照射并经早熟选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种兽用疫苗的制备方法，尤其是一种经紫外线和钴
60 y -射线照射并经早熟选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法。
背景技术：
鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫中的一种或多种寄生于鸡 肠上皮细胞内所引起的一种以肠炎、血痢为主要特征的疾病，多发于 3月龄以内的仔鸡，以15-50日龄的雏鸡最易感染，发病率高达100%， 病死率为20%-30%，严重者可达80%，是危害养鸡业的重要疾病之一。
目前，对该病的防治主要有药物防治和疫苗控制两种方法，其中 药物防治是通过在伺料或饮水中加入预防或治疗量的抗球虫药来达 到防治的目的。常用的抗球虫药有妥曲珠利、地克珠利、氨丙琳、 盐霉素、莫能霉素、磺胺喹啞啉、磺胺氯吡嗪等。但长期使用药物防 治会造成抗药株的产生。通过免疫方法对鸡球虫病进行防治已是大势 所趋。目前国内外已研制开发的鸡球虫疫苗有强毒株疫苗、弱毒株疫 苗和基因工程苗等，其中，强毒株疫苗以美国的混合卵囊球虫疫苗 Coccivac为代表，它在1-10日龄通过饮水或饲料给鸡接种少量含有 8种球虫的混合卵囊，通过鸡群繁殖后把子代卵囊播撒到垫料上，使 鸡群反复感染而不断增强免疫力。但这种强毒虫株疫苗问世40多年 来并没有在商品肉鸡广泛使用，主要原因是其存在两大缺陷 一是存 在于虫苗中的各球虫株都是完全致病性的；二是由于鸡群摄入卵囊量 的不一致，结果有的鸡感染太轻，不足以产生免疫力，有的鸡摄入卵 囊过多而引起发病。由于活的强毒株疫苗未经致弱，如果免疫量不准确或免疫接种经 鸡传代后卵囊的数量越来越多，有可能导致球虫病的爆发，于是致弱 疫苗应运而生。目前对强毒株球虫的致弱方法主要有三种理化致弱 法、鸡胚传代致弱法和早熟卵囊选育法。
理化致弱法是通过对卵囊进行冷却、加热、超声、离子辐射等物 理处理，而使之减毒。
鸡胚传代致弱不引起出血，对组织损伤小，以此致弱虫株免疫的 鸡对强毒株的攻击有良好的保护作用。但鸡胚传代致弱有四大缺点 (1)致弱性能相对不稳定，当在鸡体内传代时毒力有可能返强；(2) 通过鸡胚致弱获得大量商品化致弱球虫卵囊比较困难；(3)鸡胚传代 致弱，随着代数的增加虫体的免疫原性就会逐渐减少或丧失；(4)最 主要的局限性在于流行最广的巨型、堆型和早熟艾美尔球虫虽然可以 在鸡胚内发育，但卵囊生长不良，因此通过鸡胚传代生产全价致弱疫 苗就受到了限制。
早熟卵囊选育法致弱的虫株，其致病力的减弱是由于第2代裂殖 体没有完全分化或在成熟时变得非常小，利用这些致弱虫株制成球虫 疫苗能够诱导机体产生免疫力。这种虫苗能防治发病，而不是抵抗感 染，尽管用苗后鸡群仍有卵囊排出，但鸡群的球虫病确实得到了预防 和控制。此外，目前人们正努力开发球虫基因疫苗，尝试用纯化的抗 原来免疫鸡以获得保护。虽然近几年基因工程球虫疫苗制备技术已经 取得了进步，但离实际应用的目标还很遥远。
发明内容
本发明的目的是提供一种经紫外线和钴60 Y -射线照射并经早熟 选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法，它能大大縮短早熟选育所用时 间，提高选育的效率，短时间内即可获得大量的商品化早熟致弱虫株。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案本发明的制备方法是(一)、取样在偏远山区散养鸡中采集七种鸡 艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、 毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球 虫)样品；
(二) 、增殖卵囊利用单卵囊分离技术得到七种艾美尔球虫(柔 嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、 布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)的纯化卵囊， 分别接种生长在无球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊；
(三) 、禾U用紫外线和钴60Y-射线照射子代卵囊 一种方法是 将七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔 球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾
美尔球虫)的子代卵囊置于254mn紫外线下照射；另一种方法是将 七种艾美尔球虫的子代卵囊置于钴60 Y -射线下照射;第三种方法是 将七种艾美尔球虫的子代卵囊先置于钴60 Y-射线下照射，然后再置 于254nm紫外线下照射；第四种方法是先将卵囊置于254nm紫外 线下照射，然后再置于钴60Y-射线下照射。最后将经各种方法处理 后的卵囊放在2.5%重铬酸钾溶液中，放入28。C恒温箱中，培养48小 时；
(四) 、紫外线和钴60Y-射线照射剂量的确定以紫外线和钴 60Y-射线照射后1-60%的球虫卵囊存活为基本适宜的照射剂量；以
1-20%的球虫卵囊存活为适宜的照射剂量；以1-10%的球虫卵囊存活
为较适宜的照射剂量；以1-5%的球虫卵囊存活为非常适宜照射剂量， 以1-3%的球虫卵囊存活为最适宜的照射剂量；以1-2%的球虫卵囊存 活为最佳的照射剂量；
(五) 、获得七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球 虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)早熟株卵囊以第3步中紫外线和钴60 Y _ 射线处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，选 育出柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美
尔球虫的早熟株；
(六) 、以第3步中紫外线和钴60Y-射线处理后的球虫卵囊为 亲本，进行鸡球虫早熟选育，若无法获得七种艾美尔球虫(柔嫩艾美 尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏 艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)的早熟株，可以重 复第3步中的方法，然后再进行各虫种的早熟选育，如此反复，直到 获得七种鸡艾美尔球虫的早熟株；
(七) 、混合，将上述四种(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、 巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)致弱的鸡艾美尔球虫的孢子化卵 囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球 虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
紫外线和钴60 Y-射线照射剂量为以紫外线和钴60 Y-射线照 射后1 60%的球虫卵囊存活为基本适宜的照射剂量；以广20%的球虫 卵囊存活为适宜的照射剂量；以1 10%的球虫卵囊存活为较适宜的照 射剂量；以广5%的球虫卵囊存活为非常适宜照射剂量，以1~3%的球 虫卵囊存活为最适宜的照射剂量；以1 2%的球虫卵囊存活为最佳的 照射剂量。
本发明先将鸡球虫卵囊在紫外线和钴60 Y-射线下照射，然后再 进行早熟选育，经3-4代的早熟选育就可以得到各个虫种(柔嫩艾美 尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)的早 熟株，大大縮短了早熟选育所用时间，提高了选育的效率，为短时间 内获得大量的商品化早熟致弱虫株提供了一个切实可行的方法。
具体实施例方式
具体实施方式
一在偏远山区散养鸡中采集鸡球虫样品，利用单 卵囊分离技术得到四种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球 虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)的纯化卵囊，分别接种给生 长在无球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊。将四种艾美尔球虫的子代
卵囊悬液倒入平皿，悬液深2mm，置于254nm紫外线下照射30-60s。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2. 5%重铬酸钾溶液的培养 皿中，溶液深度约5mm，放入28。C恒温箱中，培养48小时。
以上述经紫外线处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育 致弱的原理，选育柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球 虫、毒害艾美尔球虫的早熟株。将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫 的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆 形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式
二采用具体实施方式
一的方法收集子代卵囊；将 四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60Y-射线下照射，悬液深 2mm，照射剂量为1-2KGy;将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2. 5% 重铬酸钾溶液的培养皿中，溶液深度约5mm，放入28X:恒温箱中，培 养48小时。
以上述经钴60 y -射线处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早 熟选育致弱的原理，选育柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾 美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟株；将早熟选育获得的四种鸡艾美 尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球 虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式
三采用具体实施方式
一的方法收集子代卵囊；将 四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60Y-射线下照射，悬液深 2mm，照射剂量为l-2KGy;然后再将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液 置于254nm紫外线下照射30-60s。将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2. 5%重铬酸钾溶液的培养 皿中，溶液深度约5mm，放入28"C恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原 理，选育柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害 艾美尔球虫的早熟株；将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化 卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔 球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式
四采用具体实施方式
一的方法收集子代卵囊；将 四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于254nm紫外线下照射30-60s， 悬液深2mm;然后再将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60 y -射线下照射，照射剂量为卜2KGy。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2. 5%重铬酸钾溶液的培养 皿中，溶液深度约5mm，放入28。C恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原 理，选育柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害 艾美尔球虫的早熟株；将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化 卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔 球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式
五采用具体实施方式
一的方法收集子代卵囊；将 四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60Y-射线下照射，悬液深 2mm，照射剂量为l-2KGy。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2. 5%重铬酸钾溶液的培养 皿中，溶液深度约5min，放入28t:恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原 理进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾 美尔球虫的早熟选育。将上述早熟选育得到的球虫卵囊孢子化后，口服接种给生长在无 球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊，将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬
液再置于钴60Y-射线下照射，悬液深2mm，照射剂量为1-2KGy。这 些卵囊经孢子化后再根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，进行柔嫩艾美 尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟选育。
如此反复直到获得四种鸡艾美尔球虫的早熟株。
将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合 即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美 尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式
六采用具体实施方式
一的方法收集子代卵囊；将 四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于254腦紫外线下照射30-60s， 悬液深2mm。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2. 5%重铬酸钾溶液的培养 皿中，溶液深度约5mm，放入28'C恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原 理进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾 美尔球虫的早熟选育。
将上述得到的球虫卵囊孢子化后口服接种给生长在无球虫环境 下的雏鸡，收集子代卵囊，再将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于 254nm紫外线下照射30-60s，悬液深2mm;这些卵囊经孢子化后再根 据鸡球虫早熟选育致弱的原理，进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球 虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟选育。
如此反复直到获得四种鸡艾美尔球虫的早熟株。
将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美 尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式
七采用具体实施方式
一的方法收集子代卵囊；将 四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60Y-射线下照射，悬液深 2mm，照射剂量为1-2KGy;然后再将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液 置于254nm紫外线下照射30-60s。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2. 5%重铬酸钾溶液的培养 皿中，溶液深度约5mm，放入28。C恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原 理进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾 美尔球虫的早熟选育。
将上述早熟选育得到的球虫卵囊孢子化后口服接种给生长在无 球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊，将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬 液再置于钴60Y-射线下照射，悬液深2mm，照射剂量为1-2KGy;然 后将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液再置于254mn紫外线下照射 30-60s。这些卵囊经孢子化后再根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，进 行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔 球虫的早熟选育。
如此反复直到获得四种鸡艾美尔球虫的早熟株。
将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合 即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美 尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式
八采用具体实施方式
一的方法收集子代卵囊；将 四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于254mn紫外线下照射30-60s， 悬液深2mm;然后再将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60 Y -射线下照射，照射剂量为1-2KGy。将处理后的卵囊放入置有IO倍体积的5%重铬酸钾溶液的培养皿 中，溶液深度约2.5mm，放入28"C恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原 理进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾 美尔球虫的早熟选育。
将上述得到的球虫卵囊孢子化后口服接种给生长在无球虫环境 下的雏鸡，收集子代卵囊，将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液再置于 254nm紫外线下照射30-60s，悬液深2mm;再将四种艾美尔球虫的子 代卵囊悬液置于钴60Y-射线下照射，照射剂量为l-2KGy。这些卵囊 经孢子化后再根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，进行柔嫩艾美尔球 虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟选育。
如此反复直到获得四种鸡艾美尔球虫的早熟株。
将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合 即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美 尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
本具体实施方式
具有以下积极效果将自然分离的鸡球虫强毒株 直接进行早熟选育， 一般每个虫种都需要选育20代左右才能获得其 早熟株。若先将鸡球虫卵囊在紫外线和钴60Y-射线下照射，然后再 进行早熟选育，经3-4代的早熟选育就可以得到各个虫种(柔嫩艾美 尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)的早 熟株，大大縮短了早熟选育所用时间，提高了选育的效率，为短时间 内获得大量的商品化早熟致弱虫株提供了一个切实可行的方法。
权利要求
1、一种经紫外线和钴60γ-射线照射并经早熟选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法，其特征在于它的制备方法是(一)、取样在偏远山区散养鸡中采集七种鸡艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)样品；(二)、增殖卵囊利用单卵囊分离技术得到七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)的纯化卵囊，分别接种生长在无球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊；(三)、利用紫外线和钴60γ-射线照射子代卵囊一种方法是将七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)的子代卵囊置于254nm紫外线下照射；另一种方法是将七种艾美尔球虫的子代卵囊置于钴60γ-射线下照射；第三种方法是将七种艾美尔球虫的子代卵囊先置于钴60γ-射线下照射，然后再置于254nm紫外线下照射；第四种方法是先将卵囊置于254nm紫外线下照射，然后再置于钴60γ-射线下照射。最后将经各种方法处理后的卵囊放在2.5％重铬酸钾溶液中，放入28℃恒温箱中，培养48小时；(四)、紫外线和钴60γ-射线照射剂量的确定以紫外线和钴60γ-射线照射后1-60％的球虫卵囊存活为基本适宜的照射剂量；以1-20％的球虫卵囊存活为适宜的照射剂量；以1-10％的球虫卵囊存活为较适宜的照射剂量；以1-5％的球虫卵囊存活为非常适宜照射剂量，以1-3％的球虫卵囊存活为最适宜的照射剂量；以1-2％的球虫卵囊存活为最佳的照射剂量；(五)、获得七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)早熟株卵囊以第3步中紫外线和钴60γ-射线处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，选育出柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟株；(六)、以第3步中紫外线和钴60γ-射线处理后的球虫卵囊为亲本，进行鸡球虫早熟选育，若无法获得七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)的早熟株，可以重复第3步中的方法，然后再进行各虫种的早熟选育，如此反复，直到获得七种鸡艾美尔球虫的早熟株；(七)、混合，将上述四种(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)致弱的鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
2、根据权利要求1所述的一种经紫外线和钴60 y -射线照射并 经早熟选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法，其特征在于紫外线和钴 60 y -射线照射剂量为以紫外线和钴60 y -射线照射后1-60%的球虫 卵囊存活为基本适宜的照射剂量；以1-20%的球虫卵囊存活为适宜的 照射剂量；以1-10%的球虫卵囊存活为较适宜的照射剂量；以1-5% 的球虫卵囊存活为非常适宜照射剂量，以1_3%的球虫卵囊存活为最 适宜的照射剂量；以1_2%的球虫卵囊存活为最佳的照射剂量。
全文摘要
一种经紫外线和钴60γ-射线照射并经早熟选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法，它的制备方法是取样；增殖卵囊；利用紫外线和钴60γ-射线照射子代卵囊；紫外线和钴60γ-射线照射剂量的确定；获得七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)早熟株卵囊；以第3步中紫外线和钴60γ-射线处理后的球虫卵囊为亲本，进行鸡球虫早熟选育；混合。它能大大缩短早熟选育所用时间，提高选育的效率，短时间内即可获得大量的商品化早熟致弱虫株。
文档编号A61K39/002GK101642566SQ20091014818
公开日2010年2月10日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者王江青 申请人:青岛圣诺威特生物技术有限公司