专利名称：一种脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别方法
技术领域：
本发明涉及一种脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别方法，属 于药物鉴别领域。
背景技术：
脑心清片是柿叶经水提醇沉后，水提液再由乙酸乙酯萃取，得到 柿叶提取物，再由柿叶提取物加辅料制成的中药制剂，是广州白云山 和记黄埔中药有限公司独家中药保护品种，收载于《中华人民共和国
卫生部药品标准》中药成方制剂第二十册第294页。脑心清片共两种 规格，其中规格(l)[每片重0. 41g (克)]的批准文号为国药准字 Z44021765，才丸行标准为WS厂B-3974-98，规格(2 )[每片重O. 41g(每 片含柿叶乙酸乙酯浸出物72毫克)]的批准文号为国药准字Z20053259， 4丸4亍标准为YBZ02432005。
现行标准中的脑心清片的色谱鉴别方法为
取5片[规格(1)]或3片[规格(2)],研细，加乙酸乙酯25ml (毫升)，加热回流l小时，滤过，滤液浓缩至约2. 5ml作为供试品溶 液。另取糠酸、原儿茶酸、琥珀酸对照品分别加乙酸乙酯制成每lml (毫升)含lmg (毫克)溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国 药典2005版一部附录VI B，简称附录VIB)试—险，吸取上述四种溶液 各3ial (微升)，分别点于以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板 上，以曱苯-乙酸乙酯-曱酸(5 :4:1)为展开剂，展开，取出，晾 干，在105。C加热半小时，放冷，喷以0. 05%溴曱酚绿乙醇溶液。供试 品色谱中，分别在与各对照品色语相应的位置上显相同颜色的斑点。 发明人在研究中发现，在原标准的鉴别方法中，利用三个有机酸 "糠酸、原儿茶酸和琥珀酸，，鉴别时，错误地将脑心清片中含量较高 的一种未知化合物(可能为苹果酸)误认为是琥珀酸，且糠酸和原儿茶酸鉴别的重现性较差。同时，由于脑心清片是柿叶提取物加辅料制成的制剂，脑心清片 和柿叶提取物两者的有效成分一致，薄层色谱鉴别方法应该基本一致。 考虑到目前未有柿叶提取物的薄层色谱鉴别方法，本发明将两者的薄 层色谱鉴别方法放在一起申请专利。发明内容针对上述缺陷，本发明解决的技术问题在于，提供一种脑心清片 和柿叶提取物的薄层色谱鉴别方法，能够更加准确地鉴别脑心清片或 柿叶提取物。一种脑心清片和柿叶^是取物的薄层色语鉴别方法，包括如下步骤a) 将供试样品磨碎研细，加入甲醇并用超声波处理，过滤，将滤 液蒸干，残渣加水，充分搅拌溶解，滤过，滤液加盐酸，用无水乙醚 振摇提取，分取乙醚层，挥干，残渣加曱醇溶解，作为第一供试品溶 液；b) 将柿叶对照药材磨石f研细，加入曱醇并用超声波处理，过滤， 将滤液蒸干，残渣加水，充分搅拌溶解，滤过，滤液加盐酸，用无水 乙醚振摇提取，分取乙醚层，挥干，残渣加曱醇溶解，作为第一对照 药材溶液；c) 取原儿茶酸对照品，加甲醇溶解，作为第一对照品溶液；d) 将第一供试品溶液、第一对照药材溶液和第一对照品溶液进 行薄层色镨分析；供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相 应的位置上，如果不能显相同颜色的斑点，则供试品不为脑心清 片或柿叶提取物。对照药材是通过权威机构鉴定后，能达到某种标准的，并且能用 以鉴别其他药材真伪的药材。薄层色谱是天然药物化学及其他相关专业常用的一种定性鉴别、 分析手段，其基本步骤是将待分析的样品点样于铺有载有吸附剂的 玻璃板上，将该薄层板置于装有按一定比例配置好溶剂的容器中，展开，观察荧光，显色，根据荧光和显色情况对样品进行分析。 优选地，所述超声波处理的时间为20分钟以上。 优选地，所述超声波处理的时间为30分钟。
优选地，步骤d)的具体操作为
分别吸取第 一供试品溶液、第一对照药材溶液和第 一对照品溶 液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干， 置紫外灯(254nm (纳米))下观察。供试品色谱中，在与对照药 材及对照品色谱相应的位置上，如果不能显相同颜色的斑点，则 供试品不为脑心清片或柿叶提取物。
优选地，所述展开剂为二氯甲烷、曱醇和曱酸的混合物。 优选地，所述二氯甲烷、甲醇和甲酸的体积比为9 ~ 11: 0. 2 ~ 0. 4: 0. 2 ~ 0. 4。
优选地，所述二氯曱烷、曱醇和曱酸的体积比为10: 0.3: 0.3。 在完成上述的鉴别方法之后，如果确定其不是脑心清片或柿叶提 取物，那么鉴别即可结束。如果在完成上述的鉴别之后，供试品色谱 中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，如果能显相同颜 色的斑点，那么则可以进行如下的步骤
d) 将供试样品磨碎研细，加入曱醇并用超声波处理，过滤，将滤 液蒸干，残渣加曱醇，充分搅拌溶解，作为第二供试品溶液；
e) 将柿叶对照药材磨石卒研细，加入曱醇并用超声波处理，过滤，
将滤液蒸干，残渣加曱醇，充分搅拌溶解，作为第二对照药材溶液； f )再取齐墩果酸对照品，加曱醇溶解，作为第二对照品溶液。 g)将第二供试品溶液、第二对照药材溶液和第二对照品溶液进行
薄层色语分析。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的
位置上，如果不能显相同颜色的斑点，则供试品不为脑心清片或柿
叶提取物。
优选地，步骤g)的具体操:作为
分别吸取第二供试品溶液、第二对照药材溶液和第二对照品溶 液，分别点于同一硅胶薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照 药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
优选地，所述展开剂为曱苯、乙酸乙酯和甲酸的混合物。 优选地，所述曱苯、乙酸乙酯和甲酸的体积比为6 ~ 8: 1 ~ 3: 0. 2 ~
0. 4。
优选地，所述曱苯、乙酸乙酯和甲酸的体积比为7: 2: 0.3。 本发明中所述的柿叶提取物是指由柿叶药材经水提，醇沉，萃取等 多种工艺得到的 一种棕黄色至褐色干浸膏，用来生产脑心清片及其它 制剂的中间体。具体工艺(见脑心清片的执行标准WS厂B-3974-98中脑 心清片的制法)如下取干柿叶，加水煎煮二次，第一次2小时，第 二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.12-1.15(60 °C),加乙醇至含醇量达85%，静置过夜，滤取上清液，备用；沉淀物 用65°/。乙醇洗涤两次，合并洗涤液，静置过夜，滤耳又上清液，合并两次 上清液，回收乙醇，加入适量的水，混匀，滤过，滤液用乙酸乙酯提 取四次，合并乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯并浓缩成稠膏，低温干燥， 即得。
本发明所提供的脑心清片和柿叶提取物的薄层色i普鉴别方法与现 有技术相比，本方法选用原儿茶酸和齐墩果酸作为鉴别成分，对供试 品溶液的制备方法进行了改进，增加了柿叶对照药材鉴别，该色谱鉴 别方法准确，可靠，重现性好。
图1是实施例1 ~ 5的薄层色谱比较图。 图2是实施例7中的薄层色语比较图。 图3是实施例8中的薄层色谱比较图。 图4是实施例9中的薄层色语比较图。
以上薄层色谱图均是在温度为25。C和相对湿度为60%的条件下完 成；薄层板为自制板；图2和3是在紫外光灯254nm下观察到的色谱 情况；图1和4是在显色后，肉眼即可观察到的色谱情况。
具体实施例方式
为了本领域的技术人员能够更好地理解本发明所提供的技术方 案，下面结合具体的实施方式进行阐述。 实施例1
取5片[规格(1 )]或3片[规格(2 )]待测片，研细，加乙酸乙 酯25ml,加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至约2. 5ml作为供试品;容 液，简称为供试品1。
实施例2 ~ 3
重复实施例1的步骤，分别得到供试品2和供试品3。 实施例4
取苹果酸对照品，加入乙酸乙酯制成每lml (毫升)含lmg (毫克) 的苹果酸对照品溶液。 实施例5
取琥珀酸对照品，加入乙酸乙酯制成每lml (毫升)含lmg (毫克) 的苹果酸对照品溶液。 实施例6
将实施例1 ~ 3得到的供试品溶液1 ~ 3、实施例4得到的苹果酸对 照品溶液和实施例5得到的苹果酸对照品溶液，照薄层色谱法(附录 VI B)试验。吸取上述三种溶液各1(V1 (其中供试品溶液为一式三份， 以下同)，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-曱醇-甲酸(25: 1: l)为展开剂，展开，展距12cm(厘米)，取出，晾午，放冷，喷以0.05% 溴曱酚绿乙醇溶液，得到薄层色谱图，如图1所示。
从图1可以看出，脑心清片中含量较高的一种未知化合物(可能 为苹果酸)在现有技术中被误认为是琥珀酸，而在与琥珀酸标准品对 应位置，样品色谱中基本无琥珀酸斑点出现，证明脑心清片中琥珀酸 的含量很低，不适合用于薄层色谱鉴别。
实施例7
由实施例1 ~ 3得到供试品1 ~ 3。另取糠酸、原儿茶酸、琥珀酸对照品分别加乙酸乙酯制成每lml含lmg溶液，作为对照品溶液。照薄 层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各3^1，分别点于以羧 甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以曱苯-乙酸乙酯-甲酸(5 : 4 : 1)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外灯光(254nm (纳米)) 下观察薄层色谱情况，如图2所示。
从图2可以看出，在原儿茶酸荧光斑点附近，有大量的其他荧光 物质存在，能对原儿茶酸荧光斑点判断产生干扰。
实施例8
本实施例利用的原儿茶酸鉴别原理为原儿茶酸易溶于极性较大 的溶剂，所以先用曱醇进行提取；所得的提取物用水处理，去掉一部 分杂质；利用酸性条件下，原儿茶酸易溶于乙醚的性质，用乙醚萃取 出水溶液中的原儿茶酸；将原儿茶酸点于硅胶GF254板上，展开，取出， 晾干，置紫外光灯下(254nm (纳米))下检视，在原儿茶酸色谱相应 的位置上，显一定颜色的荧光斑点。
具体操作如下取供试样品5片[脑心清片规格(1)]或3片[脑 心清片规格(2)]或0. 2g(柿叶提取物)，研细，加甲醇"ml,超声 处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml，充分搅拌使溶解，滤 过，滤液加盐酸O. 5ml，用无水乙醚30ml振摇提取，分取乙醚层，挥 干，残渣加曱醇lml使溶解，作为供试品溶液(本实施例中，脑心清 片供试品溶液平行制备三次，得供试品4 6;柿叶提取物供试品溶液 一份，简称柿叶提取物供试品)。另取柿叶对照药材8g,同法制成对照 药材溶液(简'称柿叶对照药材)。再取原儿茶酸对照品，加甲醇制成每 lml含lmg的溶液，作为对照品溶液(原儿茶酸对照品)。照薄层色谱 法(附录VI B)试验，吸取上述三种l(Vl,分别点于同一硅胶GF254薄 层板上，以二氯甲烷-曱醇-曱酸(10 : 0.3: 0.3)(或者为10: 0.2: 0. 4或者为10: 0.4: 0. 2等都是可以接受的)为展开剂，展开，取出， 晾干，置紫外光灯(254nm)下抬3见。供试品色谱中，在与对照药材及 对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
具体如图3所示。从图3可以看出，本发明所提供的方法可以清晰鉴别脑心清片和柿叶才是取物。
实施例9
本实施例选择齐墩果酸进行鉴别的依据齐墩果酸在柿叶、柿叶 提取物和脑心清片中的含量较高，显色稳定，且有一定的抗心脑血管 疾病的活性，因此，将齐墩果酸作为薄层的鉴别指标成分之一，薄层 鉴别的主要原理是齐墩果酸易溶于甲醇；10%硫酸乙醇溶液是该类物 质的常用显色剂；105。C加热至斑点显色清晰也是该类物质通用的显色 方法。
具体操作如下取供试样品5片[脑心清片规格(1 )]或3片[脑 心清片规格(2)]或0. 2g(柿叶提取物)，研细，加曱醇25ml,超声 处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加曱醇lml使溶解，作为供试品 溶液(本实施例中，脑心清片供试品溶液平行制备三次，得供试品7~ 9;制备柿叶提取物供试品溶液一次)。另取柿叶对照药材2g，同法制 成对照药材溶液。再取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的 溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述 三种溶液各10pl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以曱苯-乙酸乙酯-曱酸(7: 2: 0. 3)(或者为7: 1: 0. 4或者为7: 3: 0. 2等都是可 以接受的)为展开剂，展开，展距12cm,取出，晾干，喷以10%硫酸 乙醇溶液，在105。C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照 药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
具体如图4所示。从图4可以看出，本发明所提供的方法可以清 晰鉴别脑心清片和柿叶提取物。
本发明的实施例中薄层板自制过程为
1. 配置好0. 8°/ 的羧曱基纤维素钠水溶液。
2. 取薄层硅胶(硅胶G或者硅胶GF254)约100g,加入0. 8°/。的羧甲 基纤维素钠水溶液约300ml,用玻璃棒充分搅拌使其混合均匀，得到一 乳浊液。
3. 用铺板器将乳浊液平铺于数块备好的玻璃板上，晾干，将晾干 的硅胶板放入烘箱，ll(TC温度下烘约30min (分钟)，拿出，放冷，备
ii用。
本发明对选择原儿茶酸和齐墩果酸两种成分对脑心清片进行鉴 别，与原标准中利用三种有机酸(糠酸、原儿茶酸、琥珀酸)对脑心 清片进行鉴别的方法相比，选择的鉴别成分更加合理；本发明还对供 试品溶液的制备过程进行了优化，优化后的供试品色谱中，；险测成分 的斑点清晰可见，未见其它成分的干扰，使色谱鉴别更加明显且重复
性好；增加利用柿叶对照药材进行鉴别，^f吏鉴别方法更加合理和完整。 综上所述，本发明所提供的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴 别方法与现有技术相比，可以更加准确地对脑心清片和柿叶才是取物进 行鉴别。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出 若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1、一种脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别方法，包括如下步骤a)将供试样品磨碎研细，加入甲醇并用超声波处理，过滤，将滤液蒸干，残渣加水，充分搅拌溶解，滤过，滤液加盐酸，用无水乙醚振摇提取，分取乙醚层，挥干，残渣加甲醇溶解，作为第一供试品溶液；b)将柿叶对照药材磨碎研细，加入甲醇并用超声波处理，过滤，将滤液蒸干，残渣加水，充分搅拌溶解，滤过，滤液加盐酸，用无水乙醚振摇提取，分取乙醚层，挥干，残渣加甲醇溶解，作为第一对照药材溶液；c)取原儿茶酸对照品，加甲醇溶解，作为第一对照品溶液；d)对第一供试品溶液、第一对照药材溶液和第一对照品溶液进行薄层色谱分析，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，如果不能显相同颜色的斑点，则供试品不为脑心清片或柿叶提取物。
2、 根据权利要求1所述的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别 方法，其特征在于，所述超声波处理的时间为20分钟以上。
3、 根据权利要求2所述的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别 方法，其特征在于，所述超声波处理的时间为30分钟。
4、 根据权利要求1所述的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别 方法，其特征在于，步骤d)的具体操作为'分别吸取第一供试品溶液、第一对照药材溶液和第一对照品溶液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干， 置紫外灯254纳米下观察，供试品色谱中，在与对照药材及对照 品色镨相应的位置上，显相同颜色的斑点。
5、 根据权利要求4所述的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别 方法，其特征在于，所述展开剂为二氯曱烷、曱醇和曱酸的混合物。
6、 根据权利要求5所述的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别 方法，其特征在于，所述二氯甲烷、曱醇和甲酸的体积比为9 ~ 11: 0. 2 ~
7、 根据权利要求6所述的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别 方法，其特征在于，所述二氯曱烷、曱醇和曱酸的体积比为10: 0.3: 0. 3。
8、 根据权利要求1~7所述的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱 鉴别方法，其特征在于，步骤d)中，供试品色语中，在与对照药材 及对照品色语相应的位置上，如果显相同颜色的斑点，则进4亍如下 步骤e) 取供试样品，磨碎研细，加入甲醇并用超声波处理，过滤，将 滤液蒸干，残渣加曱醇，充分搅拌溶解，作为第二供试品溶液；f) 将柿叶对照药材磨碎研细，加入曱醇并用超声波处理，过滤， 将滤液蒸干，残渣加曱醇，充分搅拌溶解，作为第二对照药材溶液；g) 再取齐墩果酸对照品，加甲醇溶解，作为第二对照品溶液；h) 将第二供试品溶液、第二对照药材溶液和第二对照品溶液进 行薄层色谱分析，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的 位置上，如果不能显相同颜色的斑点，则供试品不为脑心清片。
9、 根据权利要求8所述的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别 方法，其特征在于，步骤h)的具体操作为分别吸取第二供试品溶液、第二对照药材溶液和第二对照品溶 液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷 以10。/。碌u酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，在105。C加热至斑点显 色清晰，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。
10、 根据权利要求9所述的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴 别方法，其特征在于，所述展开剂为曱苯、乙酸乙酯和甲酸的混合物。
11、 根据权利要求10所述的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴 别方法，其特征在于，所述曱苯、乙酸乙酯和曱酸的体积比为6~8: 1~ 3: 0.2-0.4。
12、 根据权利要求11所述的脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别方法，其特征在于，曱苯、乙酸乙酯和曱酸的体积比为7: 2: 0.3。
全文摘要
本发明公开一种脑心清片和柿叶提取物的薄层色谱鉴别方法，包括如下步骤a)将供试样品磨碎研细，加入甲醇并用超声波处理，过滤，将滤液蒸干，残渣加水，充分搅拌溶解，滤过，滤液加盐酸，用无水乙醚振摇提取，分取乙醚层，挥干，残渣加甲醇溶解，作为第一供试品溶液；b)另将柿叶对照药材进行与步骤a)相同的操作，作为第一对照药材溶液；c)再取原儿茶酸对照品，加甲醇溶解，作为第一对照品溶液；d)将第一供试品溶液、第一对照药材溶液和第一对照品溶液进行薄层色谱分析。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，如果不能显相同颜色的斑点，则供试品不为脑心清片或柿叶提取物。
文档编号A61K36/44GK101658546SQ200910171358
公开日2010年3月3日 申请日期2009年8月27日 优先权日2009年8月27日
发明者幼 利, 尹仁杰, 张小雪, 李楚源, 挺 林, 梁敬仪, 王德勤, 杰 罗, 薇 陈 申请人:广州白云山和记黄埔中药有限公司