专利名称：：一种用于组织修复的颗粒状生物材料及其制备方法
技术领域：
：本发明属於组织工程领域的假体材料或假体被覆材料，特别涉及一种用于组织修复的颗粒状生物材料及其制备方法。
背景技术：
：在皮肤组织修复领域中，如何利用患者有限的正常皮肤组织，尽量扩大组织移植范围，是大面积皮肤缺损修复治疗中需要改进的重要问题。将正常皮肤组织或假体被覆材料颗粒化，采用喷撒、播撒的方式可以达到上述目的，现已广泛应用于大面积烧伤患者的治疗。可注射或可填充的颗粒化组织生物材料也广泛应用在整形美容外科、神经外科、泌尿外科、口腔颌面外科领域，以期用最小创伤达到最佳的修复效果。目前，组织修复与再生研究的热点也在为组织工程种子细胞寻找合适的颗粒状组织生物材料作为载体，进行组织、器官的细胞移植的治疗，比如将皮肤、神经、软骨和心肌的细胞或干细胞负载于颗粒状组织生物材料进行相应的组织修复等。可见，如何制备出适合不同组织修复需要、大小均匀的组织生物材料颗粒一直是研发组织修复与再生材料的关注焦点。将生物材料颗粒化的方法，公诸于世的现有技术报道比较少。美国LifeCell公司有一件2008年4月15公开的发明专利，公开号为US7，358，284，其制备方法摘要如下将干燥的AlloDerm采用改造后Zimmer网状皮制备器碾切成细条，然后在超低温下采用匀浆机将细条绞碎，绞成颗粒后在低温下应用不同的筛网将其分开，最后将颗粒冻干处理，包装，消毒；其制备的颗粒分布集中度为68%，粒径范围为58iim593ym[SclafaniAP，RomoT，JaconoA.Evaluationofacellulardermalgraftinsheet(AlloDerm)andinjectable(micronizedAlloDerm)formsforsofttissueaugmentation:clinicalobservationsandhistologicalanalysis.ArchFacialPlastSurg2000;2:130-6.]。还有一件2008年6月11日公开的CN101195044A，它是将脱细胞真皮基质经低温冷冻、反复冻融后粉碎成颗粒，过筛后的大小为50ym500iim。但上述现有技术仍存在着以下缺点(l)制备条件苛刻，需超低温和低温；(2)制备操作步骤繁多，需经低温冷冻、反复冻融；(3)制备的颗粒外形不规整；(4)制备的颗粒即使经过过筛，其粒径分布仍不集中；(5)粒径过小的颗粒(小于52微米)将会对机体的免疫细胞产生损伤。
发明内容本发明的目的就是针对现有技术存在的缺陷，提供一种用于组织修复的颗粒状生物材料及其制备方法，使之制备条件温和，制备方法简单，制备的颗粒形态规整，可制备的粒径范围大，单一规格的粒径分布集中，不仅适用于直接应用，也可以负载相应组织细胞或促进组织再生的相关分子，以满足多种组织或器官修复的需要。本发明的总体构思是利用机械切割参数的可控性，通过设置不同的切割参数来控制所制备颗粒的尺寸大小，从而使得制备某一尺寸颗粒的粒径范围可控、分布相对集中，而且可切割的颗粒粒径范围大；进而实现将膜片状生物材料于常温下直接切割成颗粒状生3物材料，满足多种组织或器官修复的需要。为实现本发明的目的，所采取的技术方案如下。—种用于组织修复的颗粒状生物材料，原料是脱细胞组织基质(例如脱细胞真皮支架)、胶原、硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、藻酸盐中任一种或至少两种组合而制备的膜片状生物材料；成品颗粒的形态规整，外形呈立方体或长方体；颗粒的粒径范围为60iim6000iim;单一规格的颗粒粒径分布集中度^85%。它的制备方法由膜片状生物材料的冻干、细条状生物材料制备、颗粒状生物材料制备三步过程组成。1)膜片状生物材料的冻干将膜片状生物材料置于冻干机中，在真空为0.04mbar0.4mbar，温度为-3(TC_701:条件下冻干3小时12小时，使其去除水分，完全干燥。2)细条状生物材料制备常温下，在60iim6000ym的范围内设置宽度切割参数，将膜片状生物材料切割成所设置宽度参数的细条状生物材料。3)颗粒状生物材料制备常温下，在60iim6000ym的范围内设置颗粒粒度切割参数，将细条状生物材料切割成所设置颗粒粒度参数的颗粒状生物材料；再将获得的颗粒状生物材料分装成lg100g直接浸泡于75%乙醇中保存或PVC抽真空后包装；最后用10kGy25kGy钴60辐照处理保存或PVC抽真空后包装，环氧乙烷消毒保存。本发明的颗粒状生物材料及其制备方法，具有以下优点一是切割条件为常温，无需超低温或低温；二是方法操作简便，便于生产线操作；三是获得的产品形态规整，外形呈立方体或长方体颗粒；四是无需过筛，同一尺寸的颗粒粒径分布集中度^85%;五是颗粒的粒径范围为60i!nT6000iim，不同尺寸的颗粒之间可以混合使用；六是不同尺寸的颗粒，可采用注射、喷撒、播撒、填塞方法应用于组织或器官修复；七是原料来源广泛，可以是脱细胞组织基质、胶原、硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、藻酸盐中任一种或至少两种组合而制备的膜片状生物材料。本发明制备的颗粒状生物材料适合于直接应用，也可以在负载相应组织细胞或促进组织愈合与再生的相关分子后使用，可以满足多种组织或器官修复的需要。图1为1.2mm规格脱细胞真皮支架颗粒的大体观察照片。图2为0.7mm规格脱细胞真皮支架颗粒粒径分布检测结果。图3为0.2mm规格脱细胞真皮支架颗粒粒径分布检测结果。图4为脱细胞真皮支架颗粒上接种人角质形成细胞后3小时的显微镜下照片(400倍)图5为脱细胞真皮支架颗粒复合移植自体断层皮(STSG+MADM)术后20周创面愈合皮肤的生物力学特性检测。具体实施例方式下面列举用脱细胞真皮支架为原料制备颗粒状生物材料的多个实施例，来进一步说明本发明的颗粒状生物材料及其制备方法。需要强调的是本发明不局限于所列举的实施例。实施例1规格为1.2mm的脱细胞真皮支架颗粒的具体制备方法如下(1)脱细胞真皮支架冻干将制备的脱细胞真皮支架置于冻干机中，真空0.lmbar，冻干6小时，温度_45°C;(2)细条状脱细胞真皮支架制备设置切割参数为1.2mm，将冻干后的脱细胞真皮支架切割成细条(宽度1.2mm)状生物材料；(3)颗粒状脱细胞真皮支架制备设置切割参数为1.2mm，将制备的宽度为1.2mm的细条状脱细胞真皮支架切割成颗粒(规格1.2mm)，所制备颗粒形态规整，大小均匀，平均粒径为1261iim(见图1);(4)包装，消毒制备的脱细胞真皮支架颗粒分装成lg，直接浸泡于75X乙醇中保存。实施例2规格为0.7mm的脱细胞真皮支架颗粒的具体制备方法如下(1)脱细胞真皮支架冻干将制备的脱细胞真皮支架置于冻干机中，真空0.lmbar，冻干6小时，温度-55°C;(2)细条状脱细胞真皮支架制备设置切割参数为0.7mm，将冻干后的脱细胞真皮支架切割成细条(宽度0.7mm)状生物材料；(3)颗粒状脱细胞真皮支架制备设置切割参数为0.7mm，将制备的宽度为0.7mm的细条状脱细胞真皮支架切割成颗粒(规格0.7mm)，所制备颗粒形态规整，大小均匀，外形呈近立方体状；(4)包装，消毒制备的脱细胞真皮支架颗粒分装成2g，PVC抽真空后包装，环氧乙烷消毒保存；(5)粒度分析仪检测脱细胞真皮支架颗粒的平均粒径为875iim，在479iim1096iim粒径范围内的颗粒分布集中度为90.93X(见图2)。结果证明，所制备的脱细胞真皮颗粒粒径跨度范围小，且分布度高度集中。实施例3:规格为0.2mm的脱细胞真皮支架颗粒的具体制备方法如下(1)脱细胞真皮支架冻干将制备的脱细胞真皮支架置于冻干机中，真空0.lmbar，冻干6小时，温度_50°C;(2)细条状脱细胞真皮支架制备设置切割参数为0.2mm，将冻干后的脱细胞真皮支架切割成细条(宽度0.2mm)状生物材料；(3)颗粒状脱细胞真皮支架制备设置切割参数为0.2mm，将制备的宽度为0.2mm的细条状脱细胞真皮支架切割成颗粒(规格0.2mm);(4)包装，消毒制备的脱细胞真皮支架颗粒分装成2g，PVC抽真空后包装，环氧乙烷消毒保存；(5)粒度分析仪检测脱细胞真皮支架颗粒的平均粒径为323m，在182m417ym粒径范围内的颗粒分布集中度为87.86%(见图3)。结果证明，所制备的颗粒粒径跨度范围明显小于AlloDerm颗粒的58ym593ym，而颗粒分布集中度高于AlloDerm颗粒(68%)近二十个百分点。实施例4:负载人角质形成细胞脱细胞真皮支架颗粒的制备，具体操作步骤如下(1)脱细胞真皮支架颗粒的准备将保存的脱细胞真皮支架颗粒20mg，用生理盐水浸泡后清洗3遍。将颗粒置于1.5ml的无菌离心管中，加入细胞培养液lml浸泡6小时后弃去培养液备用。(2)人角质形成细胞的准备无菌条件下，将培养的人角质形成细胞用0.25%胰蛋白酶于37t:消化5min后进行吹打；将含有人角质形成细胞的培养液离心1000rpm，5min;弃去上清；加入培养液后混匀细胞，计数。(3)负载人角质形成细胞脱细胞真皮支架颗粒的培养加入含有2X106个/ml人角质形成细胞的培养液0.5ml与备用的20mg颗粒载体混合于5ml的无菌离心管，于37°C5%0)2孵箱静置孵育3小时。(4)负载人角质形成细胞脱细胞真皮支架颗粒的显微镜下观察弃去培养液，用生理盐水清洗负载人角质形成细胞脱细胞真皮支架颗粒2遍。显微镜下观察可见人角质形成细胞已附着在颗粒支架上，表明脱细胞真皮支架很容易负载人角质形成细胞(见图4)。实施例5:脱细胞真皮支架颗粒用于皮肤缺损创面修复的动物实验，具体操作步骤如下(1)皮肤缺损模型的制作在SD大鼠(雄性，220260g)麻醉(1%戊巴比妥，40mg/kg，腹腔注射)，固定后背部正中剪取4cmX6cm的全厚皮片。(2)制备自体断层皮将4cmX6cm的自体全厚皮制成自体断层皮(STSG)，用PBS溶液湿润的纱布包裹待用。(3)脱细胞真皮支架颗粒的准备将浸泡于75%酒精中的脱细胞真皮支架颗粒(规格0.5mm，面积扩张比例为2:1)置于加有滤纸的漏斗中，用PBS溶液冲洗数次，洗去酒精。(4)自体断层皮(STSG)与脱细胞真皮支架颗粒的复合移植将洗净的脱细胞真皮支架颗粒均匀的播撒在STSG的真皮面上，然后将其覆盖创面，缝合时皮片边缘距离缝线lmm2mm。创面术后油纱包扎、固定(绷带2周)。(5)术后20周剪取已愈合创面皮肤检测其生物力学特性(见图5)，结果表明，与未加脱细胞真皮颗粒的自体断层皮移植大鼠(STSG)相比，脱细胞真皮颗粒复合自体断层皮移植大鼠(STSG+MADM)的已愈合创面皮肤具有更高的皮肤拉伸强度。权利要求一种用于组织修复的颗粒状生物材料，其特征在于它以膜片状生物材料为原料制备而成；成品颗粒的形态规整，外形呈立方体或长方体；颗粒的粒径范围为60μm～6000μm；单一规格的颗粒粒径分布集中度≥85％。2.按照权利要求1所述的颗粒状生物材料，其特征在于所说的膜片状生物材料是脱细胞组织基质、胶原、硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、藻酸盐中任一种或至少两种组合而制备的。3.—种如权利要求1所述用于组织修复的颗粒状生物材制备方法，其特征是它由以下三步过程组成1)膜片状生物材料的冻干将膜片状生物材料置于冻干机中，在真空为0.04mbar0.4mbar，温度为-3(TC_701:条件下冻干3小时12小时，使其去除水分，完全干燥；2)细条状生物材料制备常温下，在60iim6000iim的范围内设置宽度切割参数，将膜片状生物材料切割成所设置宽度参数的细条状生物材料；3)颗粒状生物材料制备常温下，在60iim6000iim的范围内设置颗粒粒度切割参数，将细条状生物材料切割成所设置颗粒粒度参数的颗粒状生物材料；再将获得的颗粒状生物材料分装成lg100g直接浸泡于75%乙醇中保存或PVC抽真空后包装；最后用10kGy25kGy钴60辐照处理保存或PVC抽真空后包装，环氧乙烷消毒保存。全文摘要一种用于组织修复的颗粒状生物材料及其制备方法，先将脱细胞组织基质、胶原、硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、藻酸盐中任一种或至少两种组合而制备的膜片状生物材料冻干，再在设定参数下常温切割成细长条，最后切割成粒径范围为60μm～6000μm的颗粒状，包装，消毒。它的制备条件温和，制备方法简单，获得的产品形态规整，颗粒粒径分布集中度≥85％；本发明颗粒状生物材料可采用注射、喷撒、播撒、填塞方法直接应用于组织或器官修复，也可以在负载相应组织细胞或促进组织愈合与再生的相关分子后使用，能满足多种组织或器官修复的需要。文档编号A61L27/18GK101695583SQ20091019125公开日2010年4月21日申请日期2009年10月29日优先权日2009年10月29日发明者左海斌,彭代智,郑必祥申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院;