专利名称：Toll样受体9阻断剂及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种阻断剂，特别涉及一种Toll样受体9(TLR9)阻断剂及应用。
背景技术：
病原微生物感染人体通常引起全身或局部的免疫炎症反应。以往普遍认为微生物的蛋白质、脂多糖是主要的免疫剌激源，而最近研究发现微生物中特有的非甲基化CpG核苷酸序列片段(CpG-0DN)同样具有免疫剌激作用，从而提示抗炎、抗过敏的策略不仅仅局限于传统的方法，而需要考虑清除非甲基化CpG-ODN导致的致炎作用。
非甲基化CpG-ODN的致炎机制与哺乳动物的众多免疫细胞上具有TLR9受体(Tolllike rec印tor 9)有关。TLR9受体为I型跨膜蛋白，能特异性地识别来自病原微生物中非甲基化CpG-0DN中的CpG-motif结构，与其结合后，能触发经典的TLR信号级联，通过MyD88、 IRAK、 TRAF-6信号通路，活化MAP激酶、NF-KB等转录因子。这些因子启动了保守的前炎症过程，导致TNF-a等前炎症介质的大量释放，继而引发后续的炎症效应。因此，寻找阻断由TLR9介导的前炎症反应，对于临床感染导致的抗炎抗过敏治疗具有积极的意义。
虽然CpG-0DN是已明确的TLR9配基，但是不同结构的CpG-0DN仍然具有不同的特性，主要表现在以下两个方面一是种属特异性，如(l)CpG-0DN1826对鼠免疫细胞有很强剌激作用，而对人的免疫细胞没有作用；(2)CpG-0DN2216对人有作用，对鼠无作用；(3)CpG-ODN M362对两者均有作用；二是效应强度差异，开始发现的主要剌激性CpG-ODN片段，后来研究发现有些CpG-ODN片段被认为具有中和作用，能消除剌激性CpG-ODN的致炎效应，然而，迄今不明确是否通过TLR9拮抗方式来起作用，更不明确这些CpG-ODN的结构特征，更同时，也未见通过阻断TLR9受体来进行抗炎、抗过敏的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Toll样受体9(TLR9)阻断剂及应用。所述阻断剂能特异性与TLR9结合，有效阻断其它剌激性配基与TLR9的结合，抑制由此受体介导的前炎症效应，可用于抗炎、抗过敏的辅助治疗。
本发明的技术方案是 Toll样受体9特异性阻断剂，其特征在于所述阻断剂为非甲基化CpG核苷酸序列片段，其核心结构为CGCG核苷酸序列。 所述非甲基化CpG核苷酸序列片段的长度为12-30个核苷酸。 所述非甲基化CpG核苷酸序列片段的核心结构CGCG位于序列第4_7位点。 所述非甲基化CpG核苷酸序列片段的侧翼序列为来自微生物基因组核苷酸序列
或人工设计的核苷酸序列结构。 所述非甲基化CpG核苷酸序列为骨架为全硫代，其分子结构为
Toll样受体9特异性阻断剂用于制备抗炎、抗过敏的辅助治疗药物以及制备免疫炎症的实验用试剂的应用。 本发明所述核心结构为CGCG核苷酸序列的非甲基化CpG核苷酸序列片段能与TLR9发生特异性结合，并阻断其它具有剌激性配基与TLR9结合，具有较高亲和力， 一般不具有炎症剌激性，没有细胞毒性，能够到达拮抗并阻断其它剌激分子与TLR9的结合，从而抑制前炎症效应。 本发明所述的CpG-ODN可用于辅助治疗抗微生物感染所致的过度炎症和过敏性疾病，以及作为生物医学科研试剂辅助有关炎症和过敏的研究，具有广泛的应用前景。用于临床抗炎、抗炎过敏辅助治疗药物，其作用靶点明确、阻断活性较高、安全性好的优点。本发明所述的CpG-0DN可以注射剂或输液剂等形式给药。 本发明所述的CpG-ODN体外实验证明，所述阻断剂能够显著阻断等当量的剌激分子， 一般地，两倍于剌激剂或2 ii M阻断剂能够较为完全地阻断1 X 106个免疫细胞上的TLR9受体。 上述CpG-0DN可以通过化学合成的方法获得。
图1为MTT检测CpG-0DN c41对RAW264. 7的细胞毒性； 图2为MTT检测CpG-0DN c32对RAW264. 7的细胞毒性； 图3为MTT检测CpG-0DN c35对RAW264. 7的细胞毒性； 图4为MTT检测CpG-0DN c41对人巨噬细胞的细胞毒性； 图5为MTT检测CpG-0DN c32对人巨噬细胞的细胞毒性； 图6为MTT检测CpG-0DN c35对人巨噬细胞的细胞毒性； 图7为CpG-0DN c41竞争性阻断RAW264. 7细胞TLR9对TNF- a释放影响； 图8为CpG-0DN c32竞争性阻断RAW264. 7细胞TLR9对TNF- a释放影响； 图9为CpG-0DN c35竞争性阻断RAW264. 7细胞TLR9对TNF- a释放影响； 图10为CpG-0DN c41竞争性阻断人巨噬细胞TLR9对TNF_ a释放影响； 图11为CpG-0DN c32竞争性阻断人巨噬细胞TLR9对TNF_ a释放影响； 图12为CpG-0DN c35竞争性阻断人巨噬细胞TLR9对TNF_ a释放影响。
具体实施例方式
下面的实施例可详细地说明本发明，但不以此限制本发明。 实施例1 CpG-0DN样TLR9阻断剂实例及制备 1. 1阻断剂名称C41序列结构TGGCGCGCACCCACGGCCTG 1. 2阻断剂名称C32序列结构CTTCGCGTTAGCGTTGAGTG 1. 3阻断剂名称C35序列结构TTGCGCGCCCTCCATCGAGG 以上三种CpG-0DN样TLR9阻断剂均具有该发明所述结构特征，即于第4_7位点处具有CGCG核心结构，只是侧翼序列有所不同，均具有类似的阻断作用。其制备方式为化
4学合成全硫代核苷酸片段(委托上海生工生物有限公司合成)，以上每种阻断剂合成量为300D。 实施例2 CpG-0DN样TLR9阻断剂对细胞活力影响的测定(MTT法) 2. 1主要材料、试剂与设备 l)MTT试剂Sigma， Inc. USA. 2)DMEM培养液(1L/袋)，Gibco， Inc. USA. 3) 二甲基亚砜，重庆川东化工(集团)有限公司。 4)酶标仪:Bio-RAD Model 550. 5)细胞培养箱FORMA 3111. 6) RAW264. 7细胞株ATCC， USA. 7)(健康)人外周血巨噬细胞西南医院血库提供 2. 2实验方法采用四氮噻唑蓝(MTT)法，用DMEM培养液将鼠RAW264. 7细胞和人外周血巨噬细胞分别稀释至1X106/mL，加入96孔板(200iiL/孔)，置37。C，5X C02培养箱培养2h后，C41、C32、C35三种阻断剂均分别按不同浓度(0. 5线1线2线4 y M)依次设立实验组；正常对照组不加任何试剂。各组均设5个复孔。继续培养24h后，弃上清，每孔加入180 ii L DMEM培养液和20 ii L MTT溶液(5g/L)，再继续培养4h，吸弃细胞培养上清，每孔加入150ii L 二甲基亚砜，振荡lOmin使结晶充分溶解，以550nm处测定的各孔吸光度(0D55。)值表示鼠RAW264. 7细胞和人巨噬细胞活力。 2. 3实验结果MTT实验结果显示，不同浓度的C41、C32、C35对鼠RAW264. 7细胞和人巨噬细胞活力均无影响(P > 0. 05)，表明其对细胞无明显的毒性作用和增殖剌激作用。结果如附图1-6所示。 实施例3 :CpG-ODN样TLR9阻断剂对剌激分子诱导RAW264. 7细胞和人外周血巨噬
细胞释放TNF-a的影响 3. 1主要材料、试剂与设备 l)DMEM培养液(1L/袋)，Gibco， Inc. USA. 2)人TNF- a ELISA i式剂盒，eBioscience， Inc. USA. 3)鼠TNF- a ELISA i式剂盒，eBioscience, Inc. USA. 4)酶标仪:Bio-RAD Model 550. 5)细胞培养箱FORMA 3111. 6) RAW264. 7细胞株ATCC， USA. 7)(健康)人外周血巨噬细胞西南医院血库提供 3. 2实验方法采用DMEM培养液将鼠RAW264. 7细胞和人巨噬细胞分别稀释至1X106/mL，分别加入96孔板(200 iiL/孔，各实验组为4复孔)，在37°C 、5% C02条件下孵育2h，细胞贴壁后，更换细胞上清为200 L无血清的DMEM培养液，实验组依次加入终浓度为1 M的TLR9剌激分子(CpG-ODN 1826 (鼠敏感)、CpG_0DN2216 (人敏感)、CpG-ODNM362(人鼠敏感))，除作为阳性对照外，相应实验组分别补加C41、C32、C35三种不同的阻断剂，每种阻断剂均分别按以下浓度分组0. 5 M、 1 M、2 M，继续孵育4h ;同时设不加任何药物的空白对照组(medium)，继续孵育4h ;取上清按照人和鼠ELISA试剂盒操作说明进行操作，检测TNF-a浓度，结果以均值表示。
3. 3实验结果1)C41、C32、C35阻断剂与空白对照相比无显著差异(P > 0. 05)， 不刺激细胞释放TNF-a，表明自身无炎症剌激效应。2)各阻断剂在l-2i!M均能显著抑制 TLR9剌激分子对鼠RAW264. 7细胞和人巨噬细胞的TNF- a释放，量效关系明显。结果如附 图7-12所示。 序列表 〈110〉中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 〈120>Toll样受体9阻断剂及应用 〈130〉 〈160>3 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉阻断剂C41的序列 〈400〉 1 tggcgcgcac ccacggcctg 20 〈210>2 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉阻断剂C32的序列 〈400>2 cttcgcgtta gcgttgagtg 20 〈210>3 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉阻断剂C35的序列 〈400>3 ttgcgcgccc tccatcgagg 20
权利要求
一种Toll样受体9特异性阻断剂，其特征在于所述阻断剂为非甲基化CpG核苷酸序列片段，其核心结构为CGCG核苷酸序列。
2. 根据权利要求l所述的Toll样受体9特异性阻断剂，其特征在于所述非甲基化CpG 核苷酸序列片段的长度为12-30核苷酸。
3. 根据权利要求l所述的Toll样受体9特异性阻断剂，其特征在于所述非甲基化CpG 核苷酸序列片段的核心结构CGCG位于序列第4-7位点。
4. 根据权利要求1所述的Toll样受体9特异性阻断剂，其特征在于所述非甲基化 CpG核苷酸序列片段的侧翼序列为来自微生物基因组核苷酸序列或人工设计的核苷酸序列 结构。
5. 根据权利要求l所述的Toll样受体9特异性阻断剂，其特征在于所述非甲基化CpG 核苷酸序列为骨架为全硫代，其分子结构为NNNCGCGNNNNNNNNNNNNN。
6. 权利要求1-5任一所述的Toll样受体9特异性阻断剂用于制备抗炎、抗过敏的辅助 治疗药物以及制备免疫炎症的实验用试剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种针对Toll样受体9(TLR9)的特异性阻断剂，所述阻断剂为非甲基化CpG核苷酸序列片段，其核心结构为CGCG核苷酸序列，所述非甲基化CpG核苷酸序列片段的长度为12-30核苷酸。所述阻断剂能特异性与TLR9结合，有效阻断其它刺激性配基与TLR9的结合，抑制由此受体介导的前炎症效应，可用于抗炎、抗过敏的辅助治疗以及制备免疫炎症的实验用试剂。
文档编号A61P29/00GK101712957SQ20091019157
公开日2010年5月26日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者向阳, 周红, 曹红卫, 李彦, 王宁, 赵苛岑, 郑江, 鲁永玲 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院