专利名称：一种磁性纳米造影剂的制备方法及其在胰腺癌磁共振成像上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种造影剂的制备方法，具体为一种磁性纳米造影剂 的制备方法，以及这种造影剂在胰腺癌磁共振成像上的应用。
背景技术：
近年来，磁共振成像技术发展迅速，且已日益成熟完善，已经被 广泛应用于生物医学领域，成为临床诊断和基础研究中必不可少的重
要工具。磁共振成像(MRI)是一种新的、无创性的成像方法，属于 生物自旋成像技术，无射线影响。MRI图象的空间分辨率高，解剖结 构的关系非常清晰，提供的信息不但多于医学影像中的其他许多成像 术，而且提供的信息也不同与已有的成像术，图象的灰阶所反映的是 MR信号的强弱或弛豫原子核的相位和能级时间的长短，而不像CT图 象所反映的组织密度的差别。MRI当前已广泛地应用于临床，是医学 影像学非常重要的组成部分。
肿瘤的早期诊断(包括微小肿瘤与肿瘤转移灶)是有效地降低恶 性肿瘤致死率的关键。由于MRI可以用来对生物内脏器官进行无损的 快速检测，已经成为诊断肿瘤的最为有效方法之一。通常为了增强病变组织与正常组织的图像之间的对比度以提高病变组织的清晰度，需 要选择合适的造影增强剂来显示解剖学特征。目前，临床上常用的造
影剂是Gd—DTPA，但Gd—DTPA有明显的不足之处，如循环时间短， 注射后Gd—DTPA可迅速通过细胞间隙，并经肾脏排泄，因此需要相 应的快速扫描设备。此外，Gd-DTPA在体内分布没有特异性，而且其 价格也较昂贵。相比较而言，超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxides， SP10S)可以局部扩增外加磁场，使磁场不均匀，当水 分子弥散穿过不均匀磁场时加速了质子的失相位，从而使组织的横向 弛豫时间(T2)明显缩短，信号降低，而对纵向弛豫时间(Tl)影响 较小。此外，超顺磁性氧化铁在生物体组织内存在很高的特异性分布， 可被网状内皮系统吞噬，有助于提高肿瘤与正常组织的MRI成像对比 度，同时由于其高效、经济、安全等特点，作为造影增强剂被应用于 MRI，用于各种肿瘤及其他疾病的检测。纳米氧化铁外部包裹生物降 解高分子，例如葡聚糖、壳聚糖，可以增强其生物相容性，对细胞无毒， 而且在血管中循环时间大大延长。在超顺磁性氧化铁粒子包裹后表面 连接具有生物活性的专一性抗体，可以大大提高其作为造影剂的靶向 性。
胰腺癌是恶性程度很高的肿瘤，其生物学行为特异，临床疗效不 佳。80%的患者就诊时肿瘤已处晚期而无法切除，加之胰腺癌细胞 对放化疗有较强的抵抗性，患者病死率达98%。胰腺癌因其独特的解 剖位置，症状隐匿，同时缺乏细胞特异性的造影剂，其早期的磁共振 成像较为困难。本研究制备了生物降解高分子包裹的超顺磁性纳米粒子，并连接了肿瘤标记物，例如抗癌胚抗元CM9-9单克隆抗体，对其 作为耙向造影剂进行了 一系列体内和体外研究，从而为胰腺癌的早期 磁共振诊断提供有用的参考。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁性纳米造影剂及其在胰腺癌磁共 振成像上的应用，以弥补现有技术的上述缺陷。 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。
一种葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的制备方法，其具体步骤为
1) 将氯化铁(FeCl3 6H20)、氯化亚铁(FeCl2 4H20)和葡聚糖 (三者的质量比为5-100: 1-10: 1-50)溶解在100ml蒸馏水中，形成
透明稳定的微乳液体系；
2) 取11111浓度为25%-28%浓氨水(重量)用二次蒸馏水稀释，将 其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌10-30分钟使氨水均匀 分散在微乳液中；
3) 将体系的温度保持在15-40°C，同时不断搅拌2-5小时；反 应结束后离心去掉沉淀，分离去掉多余的葡聚糖，最终得到稳定的葡 聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液。
一种磁性纳米造影剂的制备方法，其具体步骤为
1)取1-5mLa呢/mU上述葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液，
加入浓度为1Omol/L的髙碘酸钾溶液50-500uL (氧化剂)，避光反应
5-10小时。2) 将溶液进行分离，把分离后的粒子分散在pH为8. 0的硼酸缓 冲溶液中。
3) 在溶液中加入10-50ul鼠抗人CA19-9抗体，在4"C的条件下 反应过夜。
4) 再加入2mol/L的硼氰化钾溶液2-5mL,反应5-10小时。
5) 将混合物纯化分离，然后分散在pH为7. 4的磷酸缓冲溶液中， 即得到磁性纳米造影剂。
经透射电子显微镜(TEM)检测，稳定的葡聚糖包裹的磁性纳米 粒子的水溶液的粒径为30-100 nm。
上述方法制备获得的造影剂可应用于胰腺癌细胞体外磁共振成像。
通过本发明提供的磁性纳米造影剂，在胰腺癌细胞体外磁共振成 像的应用中，可表现出明显的MRI信号下降，MRI信号下降值达到 28%。从而为肿瘤的诊断提供有用的依据。
图1为本发明的磁性纳米造影剂进入细胞的体外磁共振成像； 图中a为表面连有磁性造影剂的细胞悬液，b为细胞悬液，c 为PBS溶液；
图2为本发明磁性纳米造影剂进入小鼠体内的磁共振成像。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。 1、葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的制备 实施例1:
将氯化铁(FeCl3 6H20)、氯化亚铁(FeCl2'4H20)和葡聚糖三 者的质量比为5: 1: 1，溶解在100ml蒸馏水中，形成透明稳定的微 乳液体系。取lml浓度为25%浓氨水(重量)用二次蒸馏水稀释，将 其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌10分钟使氨水均匀分 散在微乳液中。将体系的温度保持在15°C，同时不断搅拌2小时； 反应结束后离心去掉沉淀，分离去掉多余的葡聚糖，最终得到稳定的 葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液。
实施例2:
将氯化铁(FeCl3 6H20)、氯化亚铁(FeCl2 4H20)和葡聚糖三 者的质量比为100: 10: 50,溶解在100ml蒸馏水中，形成透明稳 定的微乳液体系。取lml浓度为28%浓氨水(重量)用二次蒸馏水稀 释，将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌30分钟使氨水 均匀分散在微乳液中。将体系的温度保持在40°C，同时不断搅拌5 小时；反应结束后离心去掉沉淀，分离去掉多余的葡聚糖，最终得到 稳定的葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液。
实施例3:
将氯化铁(FeCl3 6H20)、氯化亚铁(FeCl2 4H20)和葡聚糖三 者的质量比为55: 5: 25溶解在100ml蒸馏水中，形成透明稳定的 微乳液体系。取lml浓度为27%浓氨水(重量)用二次蒸馏水稀释，将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌20分钟使氨水均匀
分散在微乳液中。将体系的温度保持在3(TC，同时不断搅拌4小时;
反应结束后离心去掉沉淀，分离去掉多余的葡聚糖，最终得到稳定的葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液。
实施例4:
将氯化铁(FeCl3 6H20)、氯化亚铁(FeCl2 4H20)和葡聚糖三者的质量比为75: 8: 40溶解在100ml蒸馏水中，形成透明稳定的微乳液体系。取lml浓度为27%浓氨水(重量)用二次蒸馏水稀释，将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌25分钟使氨水均匀分散在微乳液中。将体系的温度保持在35'C，同时不断搅拌3小时；反应结束后离心去掉沉淀，分离去掉多余的葡聚糖，最终得到稳定的葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液。
上述实施例1-4所制备的产物经透射电子显微镜(TEM)检测，其粒径大约为30-100 nm不等。
2、磁性纳米造影剂的制备实施例1
1)取一定量的葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液，加入高碘酸钾溶液(氧化剂)，避光反应5小时。将溶液进行分离，把分离后的粒子分散在pH为8. 0的硼酸缓冲溶液中。在溶液中加入10ul鼠抗人CA19-9抗体，在4X:的条件下反应过夜。再加入硼氰化钾溶液反应5小时。将混合物纯化分离，然后分散在pH为7. 4的缓冲溶液中，即得到磁性纳米造影剂。实施例2
1)取一定量的葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液，加入高碘酸钾溶液(氧化剂)，避光反应10小时。将溶液进行分离，把分离后
的粒子分散在pH为8. 0的硼酸缓冲溶液中。在溶液中加入50ul鼠抗人CA19-9抗体，在4"C的条件下反应过夜。再加入硼氰化钾溶液反应10小时。将混合物纯化分离，然后分散在pH为7. 4的缓冲溶液中，即得到磁性纳米造影剂。实施例3
1)取一定量的葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液，加入高碘酸钾溶液(氧化剂)，避光反应8小时。将溶液进行分离，把分离后的粒子分散在pH为8. 0的硼酸缓冲溶液中。在溶液中加入30ul鼠抗人CA19-9抗体，在4'C的条件下反应过夜。再加入硼氰化钾溶液反应8小时。将混合物纯化分离，然后分散在pH为7. 4的缓冲溶液中，即得到磁性纳米造影剂。
3、利用功能性磁性纳米粒子进行胰腺癌细胞体外磁共振成像研
究
1) 取适量磁性造影剂分散在细胞培养液RPMI1640中，过滤除菌。然后，将粒子与胰腺癌细胞BXPC-3 (细胞浓度为1X106个/mL)共同孵育2小时，用胰酶进行消化，然后离心去除未反应的粒子。
2) 把处理好的细胞用0.5-2%戊二醛固定，然后分散在PBS中，进行体外磁共振成像。
结果见附图l，由图可以看出连有粒子的细胞悬液与正常细胞相
比，在T2-weight和T*2-weight上都表现出明显的MRI信号下降，在T*2ieight上MRI信号下降值达到28%。
4、利用功能性的磁性纳米粒子进行胰腺癌细胞体内磁共振成像
研究
1) 将胰腺癌细胞BXPC-3制成1X106的细胞悬液，注入成年裸鼠(体重在20-30g)单侧腋下皮下，培养2-3周，待肿瘤长到1cm左右。
2) 将裸鼠麻醉后，进行磁共振成像，然后按照卜2mg Fe/kg体重的剂量注入磁性纳米造影剂，然后在不同时间对小鼠进行磁共振扫描。
结果见附图2，由图可以看出采用T2-weight序列成像，未打入造影剂之前，肿瘤呈现出较高的MRI信号，打入造影剂后，肿瘤MRI信号开始下降，肿瘤与正常相比一直呈现较低的MRI信号强度。打入造影剂两小时后，肿瘤MRI信号的下降值达到25%，从而为肿瘤的诊断提供有用的依据。
权利要求
1、一种葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于其具体步骤为1)将FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O和葡聚糖三者按照质量比为5-100∶1-10∶1-50的比例溶解在100ml蒸馏水中，形成透明稳定的微乳液体系；2)取1ml浓度为25％-28％浓氨水用二次蒸馏水稀释，将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌10-30分钟使氨水均匀分散在微乳液中；3)将体系的温度保持在15-40℃，同时不断搅拌2-5小时；反应结束后离心去掉沉淀，分离去掉多余的葡聚糖，最终得到稳定的葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液。
2、 根据权利要求1所述的一种葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液的粒径为30-100 nm。
3、 一种磁性纳米造影剂的制备方法，其特征在于其具体步骤为[1) 取浓度为lmg/mL的上述葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液l-5mL，加入浓度为10mol/L的高碘酸钾溶液50-500uL，避光反应5-10小时；[2) 将溶液进行分离，把分离后的粒子分散在pH为8. 0的硼酸缓冲溶液中；3) 在溶液中加入10-50ul鼠抗人CA19-9抗体，在4。C的条件下反应过夜；4) 再加入2mol/L硼氰化钾溶液2-5mL，反应5-10小时；5) 将混合物纯化分离，然后分散在pH为7. 4的磷酸缓冲溶液中，即得到磁性纳米造影剂。
4、根据权利要求3所述的磁性纳米造影剂的制备方法，起特征在于制备获得的造影剂可应用于胰腺癌细胞体外磁共振成像。
全文摘要
本发明公开了一种造影剂的制备方法，具体为一种磁性纳米造影剂的制备方法，以及这种造影剂在胰腺癌磁共振成像上的应用。取适量葡聚糖包裹的磁性纳米粒子的水溶液，加入高碘酸钾溶液，避光反应5-10小时。将溶液进行分离，把分离后的粒子分散在pH为8.0的硼酸缓冲溶液中。在溶液中加入10-50μl鼠抗人CA19-9抗体，在4℃的条件下反应过夜。再加入适量硼氰化钾溶液反应5-10小时。将混合物纯化分离，然后分散在pH为7.4的磷酸缓冲溶液中，即得到磁性纳米造影剂。通过本发明提供的磁性纳米造影剂，在胰腺癌细胞体外磁共振成像的应用中，可表现出明显的MRI信号下降。从而为肿瘤的诊断提供有用的依据。
文档编号A61K49/06GK101648025SQ20091019515
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月4日 优先权日2009年9月4日
发明者沈鹤柏, 飞 缪, 高明远, 黄明鸣 申请人:上海师范大学