抑制肝细胞癌的方法和试剂的制作方法

专利名称：抑制肝细胞癌的方法和试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术或药学领域；更具体地，本发明涉及抑制肝细胞癌的方法 和试剂。
背景技术：
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是世界范围内的一个重要健康问
题，位列世界第五大常见癌症，以及第三大常见癌症相关死因。HCC显示出很强的地域 差异性，在亚洲及撒哈拉以南非洲的发病率最高，但目前它在西方国家也越来越普遍。 在过去的二十年中，美国的肝细胞癌发病率增长了 114%，这与作为HCC的一个主要风 险因子——慢性肝炎的发病率的增长相似。在肝癌发生的起始阶段，转化的肝细胞必需逃避细胞的各种抵御行为，并获得 非同寻常的生存和增殖的能力。由受体酪氨酸激酶(RTKs)介导的异常信号通路，在肝癌 的发生和发展中扮演着重要角色。Eph受体组成了最大的RTK家族之一，并且被报道与 多种肿瘤有关。比如，在许多恶性肿瘤中，都观察到EphA2(受体Eph家族的成员)的 上调，同时伴随着细胞增殖加快，新血管生成增强，激素依赖性改变等表型。EphB4在 黑色素瘤，膀胱癌，结肠癌和乳腺癌中都显示出异常表达，尽管对其促癌效应的机制尚 不清楚。而对Eph/Ephrin成员在HCC中的研究亦很少见。因此，研究参与肝癌发生发展过程的分子及相关信号通路，为肝癌的预防或治 疗提供新的靶点或途径，具有重要的意义。

发明内容
本发明的目的在于提供抑制肝细胞癌的方法和试剂。在本发明的第一方面，提供一种EphrinA2抑制剂的用途，用于制备预防或治疗 肝癌的组合物。在一个优选例中，所述的EphrinA2抑制剂选自特异性干扰EphrinA2表达的小 干扰RNA分子或反义核苷酸；或特异性与EphrinA2结合的抗体或配体。在另一优选例中，所述的EphrinA2(特别是过表达EphrinA2)抑制肝癌细胞的凋亡。在另一优选例中，所述的EphrinA2抑制剂是特异性干扰EphrinA2表达的小干扰 RNA分子，其识别的靶序列如SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示。在另一优选例中，所述的组合物用于提高肝癌细胞对肿瘤坏死因子α (TNF-α )的敏感性；促进肿瘤坏死因子α诱发的肝癌细胞凋亡；抑制Akt的磷酸化(或活化)；抑制Racl的活性；或抑制NF-kappa B 的活性。
在另一优选例中，所述的肝癌是肝细胞癌。在本发明的另一方面，提供一种小干扰RNA分子，其识别的靶序列如SEQID NO 1 或 SEQ IDNO 2 所示。在本发明的另一方面，提供一种特异性识别EphrinA2蛋白或其编码基因的物质 的用途，用于制备诊断肝癌的试剂或试剂盒。在一个优选例中，所述的特异性识别EphrinA2蛋白或其编码基因的物质选自特异性扩增EphrinA2蛋白的编码基因或转录本的引物；
特异性识别EphrinA2蛋白的编码基因或转录本的探针；或特异性结合EphrinA2蛋白的抗体或配体。在另一优选例中，所述的特异性扩增EphrinA2蛋白的编码基因或转录本的引物 是SEQ ID NO: 5禾口 SEQ ID NO: 6所示序列的引物。在另一优选例中，所述的特异性结合EphrinA2蛋白的抗体或配体是(但不限 于)抗EphrinA2的山羊源性抗体。在本发明的另一方面，提供一种诊断肝癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有特 异性识别EphrinA2蛋白或其编码基因的物质。在本发明的另一方面，提供一种筛选预防或治疗肝癌的潜在物质的方法，所述 方法包括(1)用候选物质处理表达EphrinA2蛋白的体系；和(2)检测所述体系中EphrinA2蛋白的表达或活性；其中，若所述候选物质可降低EphrinA2蛋白的表达或活性，则表明该候选物质 是预防或治疗肝癌的潜在物质。在一个优选例中，步骤(1)包括在测试组中，将候选物质加入到表达 EphrinA2蛋白的体系中；禾口 /或步骤(2)包括检测测试组的体系中EphrinA2蛋白的表达或活性，并与对照组 比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达EphrinA2蛋白的体系；如果测试组中EphrinA2蛋白的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如 低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，就表明该候选物是预防 或治疗肝癌的潜在物质。在另一优选例中，所述的体系选自细胞体系(如表达EphrinA2蛋白的肝癌细 胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞 实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗肝癌有用的物 质。在另一优选例中，步骤(1)中，所述的体系中还表达Racl蛋白，Akt蛋白 和NF-kappa B蛋白，且形成Rac 1 /Akt/NF-kappa B信号通路(即这三个分子在未被 EphrinA2所激活时，可能并非处于一条信号通路中，而当被EphrinA2所激活后，形成一 条上下承接相连的信号通路)；步骤⑵还包括检测体系中Racl蛋白，Akt蛋白或NF-kappa B蛋白的表达或 活性；若所述候选物质可降低Racl，Akt或NF-kappa B的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗肝癌的潜在物质。在本发明的另一方面，提供一种用于预防或治疗肝癌药物组合物，包括(a)有效量的EphrinA2抑制剂；(b)有效量的肿瘤坏死因子α ；以及(c)药学上可接受的载体。 在一个优选例中，所述的EphrinA2抑制剂是特异性干扰EphrinA2表达的小干扰 RNA分子，其识别的靶序列如SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示。在本发明的另一方面，提供提供一种治疗哺乳动物肝癌的方法，所述方法包 括下调所述哺乳动物肝癌细胞内EphrinA2蛋白的表达或活性。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。


图l.EphrinA2在HCC细胞系及临床样本中表达上调。A)实时定量PCR的结果显示了 EphrinA2在两株正常肝细胞系(7701和7702)和 五株肝癌细胞系(7404，7405，7402，7721和HepG2)中的相对表达水平。B)实时定量PCR的结果显示了 EphrinA2在52对配对HCC和正常肝组织样本 中的相对表达水平。EphrinA2的表达参照β -Actin的水平进行了标准化。C)在配对的HCC组织样本中，EphrinA2表达的免疫组织化学结果(N 正常肝 组织；T 原位HCC，P 门静脉癌栓)。D)EphrinA2在11对HCC样本中的蛋白水平。上部的图示显示了具有代表性的 4对样本的western blot结果。下部的箱线图显示了所有配对样本中EphrinA2表达的量化 结果。使用SPSS软件，通过ANOVA分析了三组间的统计学差异。图2.EphrinA2在HCC细胞中的表达正向调控了体内肿瘤生长。A)EphrinA2在7404细胞中的过表达和表达抑制。左图为将EphrinA2表达 载体转入7404细胞中，并且分离得到三个EphrinA2的稳定表达株(7404/Α2#1，7404/ A2#2，7404/A2#3)用于后续实验，7404/vec表示转入pcDNA3.1空载体的7404细胞。右 图为分别用两种针对EphrinA2的siRNA慢病毒(对应于靶序列#l_si，#2_si，以Con_si 为对照)感染EphrinA2表达水平最高的7404/Α2#1，抑制效率由EphrinA2westem blot所不。B)EphrinA2对于7404细胞移植瘤生长的作用。左图将空载体对照(7404/ vec)和过表达EphrinA2的7404细胞(7404/Α2#1，7404/A2#2)注射入裸鼠的身体两侧和 背部，以肿瘤体积描绘出移植瘤的生长曲线(每组4只小鼠)。右图比较EphrinA2过 表达的7404细胞(7404/Α2#1)以及其所对应的EphrinA2表达被siRNA(靶序列为分别为 #l-si, #2-si，以Con-si为对照)所抑制的细胞的移植瘤生长测试(每组4只小鼠)。C)EphrinA2在7402和HepG2细胞中的表达抑制。两种细胞都感染了如A)所 述的siRNA，而抑制效率由EphrinA2western blot所示。D) EphrinA2缺失对于7402细胞移植瘤生长的影响。E)过表达EphrinA2促进了 HCC细胞在远端器官的生长。7404空载体对照(7404/vec)和EphrinA2过表达的细胞(7404/Α2#1)，均被荧光素酶标记，然后注射入裸 鼠的左心室，分别在第0天，第30天及第45天通过荧光素酶的活性，检测细胞的转移 (每组5只小鼠)。图3.EphrinA2抑制了 HCC细胞的体内凋亡。A)EphrinA2的表达抑制了移植瘤中被剪切的PARP的表达。收取图2B中所 述的移植瘤并抽提蛋白，EphrinA2和被剪切的PARP的蛋白水平均显示于具有代表性的 western blot中，β -Actin用于测定和显示蛋白加样量。B) EphrinA2的表达抑制了移植瘤中DNA的断裂。7404空载体对照细胞和 过表达EphrinA2的细胞通过福尔马林固定，石蜡包埋，然后切片，进行TUNEL检 测。Fluorescein-12-dUTP(绿色信号，箭头所示)染出了凋亡细胞中的DNA断片，而 PropidiumIodide(红色信号)则染出了所有细胞的核，因此重叠的黄色信号标示了凋亡细 胞(左边两图)。右图所示的凋亡细胞的平均值是通过对于每一组的9个视野进行计数得 到的。图4.EphrinA2使HCC细胞对体外凋亡产生了抗性。A)将空载体对照(7404/vec)，过表达 EphrinA2 的 7404 细胞(7404/Α2#1，7404/ A2#2)以及其所对应的EphrinA2表达被抑制的细胞分别用PBS或20ng/mlTNF-a加上 667nM Actinomycin D处理30小时，收集细胞进行DNA含量测定。亚Gl群体代表凋
亡细胞。上部的图示表示TNF-a处理组的DNA含量；下部的图示显示了对照组以及 TNF-α处理组的量化结果。B)对照和EphrinA2表达缺陷的HepG2细胞分别用PBS或20ng/ml TNF- α加上 500nM Actinomycin D处理30小时，然后收集细胞，进行如A)所述的DNA含量测定。C)各细胞进行A)和B)中同样的处理，收集细胞进行western blot分析并检测被 剪切的PARP的表达。图5.在HCC细胞中，Rac 1 -Akt通路被EphrinA2所激活。A)空载体对照(7404/vec)和 EphrinA2 过表达的 7404 细胞(7404/Α2#1，7404/ A2#2)(左图)，EphrinA2过表达的7404细胞和相对应的EphrinA2表达被抑制的细胞(中 图)，以及HepG2细胞与相对应的EphrinA2表达被抑制的细胞(右图)经过培养后，收 取蛋白进行western blot,检测pAkt以及总Akt的表达。B)在HCC样本中EphrinA2的表达和Akt磷酸化水平的相关性。上部的图示显 示了四对样本中具有代表性的EphrinA2和pAkt的western blot结果。EphrinA2和pAkt 在所有11对样本中的表达被量化，每一对T/N间的EphrinA2及pAkt的比率均使用SPSS 软件，进行了双变量相关分析，结果显示于下部的图表中。其中，N:配对的正常肝组 织，T:原位HCC，P门静脉癌栓。C)抑制Akt磷酸化逆转了 EphrinA2稳定表达株对于TNF- α所诱发凋亡的抗 性。空载体对照(7404/vec)和EphrinA2过表达的7404细胞(7404/Α2#1)使用或者不用 50 μ tg/ml LY294002 加上 20ng/ml TNF- α 和 667nM ActinomycinD 处理 4 天，通过 MTT 实验测定细胞生长。结果代表了三次独立实验的平均值士标准误。D)阻断PI3K/Akt级联损害了 EphrinA2过表达细胞的生长优势。在第1天， 7404空载体对照(7404/vec)和EphrinA2过表达细胞(7404/Α2#1)被注射入8只裸鼠的身体两侧。注射后10天，将小鼠随机分成两组，开始进行雷帕霉素敏感性测试。每4天 测定每只小鼠的肿瘤体积，所显示的数据为第26天的测量结果。对照(Control)为不给 予雷帕霉素，而给予相同量溶剂的小鼠的测量结果。E) Racl的活化与Akt磷酸化有关。空载体对照(7404/vec)和EphrinA2过表达 的7404细胞(7404/Α2#1，7404/A2#2)(左图)，EphrinA2过表达的7404细胞和相对应 的EphrinA2表达被抑制的细胞(中图)被收取进行Racl活性测定(pull-down实验)，细 胞GTP所结合的Racl的量由western blot所示。右图空载体对照和EphrinA2过表达 的7404细胞使用或者不用100 μ M NSC23766处理48小时，然后收取细胞检测GTP结合 的Racl以及磷酸化的Akt。图6.NF-kappa B 通过 Rac 1 -Akt 通路被 EphrinA2 激活。A)NF-kappa B报告基因活性受到EphrinA2的调控。空载体对照(7404/vec)和 EphrinA2 过表达的 7404 细胞(7404/Α2#1，7404/A2#2, 7404/A2#3)(左图)，EphrinA2 过表达的7404细胞和相对应的EphrinA2表达被抑制的细胞(中图)以及HepG2细胞与 相对应的EphrinA2表达被抑制的细胞(右图)被转入NF_kappaB报告基因和renilla报告 基因，进行 Dual Luciferase Assay。B) EphrinA2增强了 NF-kappa B的核转移。收取空载体对照(7404/vec)和 EphrinA2过表达的7404细胞(7404/Α2#1，7404/A2#2)和相对应的EphrinA2表达被抑 制的细胞的全细胞裂解液以及核裂解液，通过western blot检测NF-kappaB。Nucleoporin
p62用于衡量核蛋白的加样。 C) EphrinA2 增强 了 NF-kappa B 的核转移。将 7404 空载体对照(7404/vec)和 EphrinA2过表达细胞(7404/A2#2)铺种于玻片上，并进行p65的免疫染色。D)NF-kappa B的激活是由Racl-Akt通路所调控的。左图使用三种不同的 方法对7404空载体对照和EphrinA2过表达细胞进行处理对照，50 μ MLY294002处理 24小时，或者转入2 μ g显性失活的Akt表达载体，然后通过Dual Luciferase Assay测定 NF-kappaB报告基因的活性。右图使用三种不同方法处理如左图所示的同样的细胞 对照，100 μ M NSC23766处理24小时或转入2 μ g显性失活的Racl表达载体，然后通过 Dual Luciferase Assay 测定 NF-kappa B 报告基因的活性。
具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，首次发现，EphrinA2在肝癌细胞或组织中高表达， EphrinA2的高表达可以促进肝癌的生长，并且EphrinA2激活了 Racl/Akt/NF_kappa B通 路，由此抑制了凋亡，促进了肝癌细胞的存活。因此，EphrinA2本身对于肝癌的诊断是 有用的，而EphrinA2的抑制剂则对肝癌具有抑制的作用。本发明的研究突显了 EphrinA2 在肝癌发生发展过程中的重要性，为肝癌治疗提供了一个新的药物靶点。EphrinA2EphrinA2属于Eph/Ephrin家族的成员，现有技术中对于Eph/Ephrin成员在肝癌
中的功能尚无研究。EphrinA2蛋白的序列可以与NP 001396.2所示的序列基本上相同，其编码分子 可以与NM 001405.2所示的序列基本上相同。EphrinA2蛋白或基因可以从细胞中分离得到，或者可通过人工合成的方式获得。在获知EphrinA2蛋白或编码基因的序列后，本领 域人员可以方便地制备获得EphrinA2蛋白或基因。本发明人发现，无论是在已建立的肝癌细胞系中，还是在肝癌的临床组织样本 中，EphrinA2的表达都显著升高。在肝癌细胞中过表达EphrinA2显著提高了细胞的体内 成瘤性，而抑制其表达则削弱了致癌作用。本发明人进一步发现，EphrinA2是通过抑制 凋亡，而非促进增殖，来提高肝癌细胞的成瘤性的。EphrinA2使肝癌细胞对TNF-α诱发 的凋亡产生了抗性，从而有利于它们的存活。此外，本发明还揭示了在肝癌细胞中，具 有凋亡抑制效应的一条全新的信号通路EphrinA2/Racl/Akt/NF-kappaB。综上所述， 本发明揭示了 EphrinA2通过抑制凋亡，促进了肝癌细胞的存活，从而在肝癌发生发展的 过程中，扮演了重要的角色，提示它是肝癌治疗的一个靶分子。EphrinA2抑制剂及其用途基于本发明的新发现，本发明还提供了 EphrinA2抑制剂的用途，用于制备预防 或治疗肝癌的组合物。所述的肝癌特别是肝细胞癌。所述的组合物还用于提高肝癌细 胞对肿瘤坏死因子α (TNF-Ci)的敏感性；促进肿瘤坏死因子α (TNF-α )诱发的肝癌细 胞凋亡；抑制Akt的磷酸化(或活化)；抑制Racl的活性；或抑制NF-kappaB的活性。如本文所用，所述的EphrinA2的抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断 剂等。任何可抑制EphrinA2的转录和翻译，从而抑制其蛋白表达；降低EphrinA2蛋白的 稳定性；抑制EphrinA2蛋白的分泌；减少EphrinA2蛋白有效作用时间；降低其生物学 活性的物质均可用于本发明，作为可用于预防或治疗肝癌的有效物质。所述的EphrinA2 的抑制剂也可以是经过修饰的形式。在得知了 EphrinA2对于肝癌的作用后，本领域人员可以方便地得知EphrinA2抑 制剂可以通过抑制EphrinA2来防治肝癌的发生及发展。因此，任何EphrinA2的抑制剂都 可用于本发明。根据EphrinA2的特性，本领域人员可以获得多种EphrinA2的抑制剂。所述的EphrinA2的抑制剂例如包括但不限于与EphrinA2蛋白特异性结合， 阻断其功能的抗体、配体或肽段；特异性干扰EphrinA2表达的小干扰分子，如siRNA分 子、miRNA分子、反义核苷酸等。作为本发明的优选方式，所述的EphrinA2的抑制剂是特异性针对于EphrinA2 的mRNA的小干扰RNA (siRNA)。如本文所用，术语“ RNA干扰(RNAinterference， RNAi) ”是指一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使mRNA 降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，也被称为RNA干预或者RNA干扰。RNA 干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默，它是体内抵御外在感染的重要保护机 制之一。简要地说，RNA干扰包含一个由小干扰RNA(SiRNA)所激发的机制，造成靶 mRNA的降解。如本文所用，术语“小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)”是指 一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA， 这个过程就是RNA干扰途径(RNA interference pathway)。本发明对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于化学合成 法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了本发明所提供的siRNA所针对靶 序列以后，可以以各种途径方便地制备或表达所述的小干扰RNA。例如，在本发明的一 种优选例中，所述的小干扰RNA是化学合成的。
小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这 两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反 义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火 杂交，产生合成的双链RNA复合物。所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本 领域已知的多种技术被输送到细胞内。此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义 链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的 转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果良好的siRNA，所述的SiRNA 特异性识别SEQ ID NO 1或SEQ IDNO 2所示的靶序列。可特异性的干扰EphrinA2 的表达，干扰效果良好，且与其它的人类核酸序列没有显著的同源性。EphrinA2相关检测用途基于本发明人的上述新发现，可以将EphrinA2作为诊断肝癌的标志物(i)进行 肝癌的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；Gi)评估相关人群的肝癌治疗药物、药物疗 效、预后，以及选择合适的治疗方法；Gii)早期评估相关人群肝癌患病风险，早期监测 早期防治。比如，对于EphrinA2基因表达异常的肝癌人群，可进行具针对性的更为有效 的治疗。因此，本发明提供了 EphrinA2基因或蛋白的用途，用于制备诊断(或检测)肝 癌的试剂或试剂盒。可采用各种本领域已知的技术来检测EphrinA2基因的存在与否以及表达情况， 这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、 DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。本发明还提供了用于在分析物中检测EphrinA2基因的存在与否以及表达情况的 试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增EphrinA2的引物；或特 异性识别EphrinA2的探针来确定EphrinA2基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时， 可以采用特异性结合EphrinA2编码的蛋白的抗体或配体来确定EphrinA2蛋白的表达情况。作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物，其可特异性扩增出EphrinA2基因 或基因片段。更优选的，所述的引物具有SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示的序列。 由该引物扩增所得的产物具有合适的长度，且特异性高，对于复杂体系的扩增也具有良 好的特异性。针对EphrinA2基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备 一种探针，其可与EphrinA2基因上特定位点发生特异性结合，而不与EphrinA2基因以外 的其它基因发生非特异性结合，且所述探针带有可检测信号。利用特异性结合EphrinA2蛋白的抗体来检测分析物中EphrinA2蛋白表达情况的 方法也是本领域人员熟知的技术。本发明还提供了用于在分析物中检测EphrinA2基因的存在与否以及表达情况 的试剂盒，该试剂盒包括特异性扩增EphrinA2基因或转录本的引物；特异性识别EphrinA2基因或转录本的探针；或特异性结合EphrinA2蛋白的抗体或配体。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各 种试剂，包括但不限于抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。筛选方法在得知了所述的EphrinA2与肝癌的相关性后，可以基于该特征来筛选调节 EphrinA2的表达或生物学活性，进而可预防或治疗肝癌的物质。因此，本发明提供一种筛选可用于预防或治疗肝癌的潜在物质的方法，所述的 方法包括将候选物质与表达EphrinA2的体系接触；和检测候选物质对EphrinA2的影 响；若所述候选物质可降低EphrinA2的表达或活性，就表明该候选物是预防或治疗肝癌 的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到EphrinA2的 表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达 EphrinA2的体系。在得知了 EphrinA2与Racl/Akt/NF-kappa B信号通路的相关性后，可以建立同 时表达EphrinA2蛋白、Racl蛋白，Akt蛋白和NFkappa B蛋白的体系；基于该体系，所
述方法还可包括检测体系中Racl蛋白，Akt蛋白或NF-kappaB蛋白的表达或活性；若 所述候选物质可降低Racl，Akt或NF-kappaB蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是 预防或治疗肝癌的潜在物质。所述的体系包括(但不限于)溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、 器官体系、或动物体系。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的 细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于预防或治疗肝癌真正有用的物质。另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于预防或治疗肝癌的 潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出 真正有用的物质。药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的 EphrinA2抑制剂，以及药学上可接受的载体。作为一种本发明优选的药物组合物，所述的药物组合物，包括(a)有效量(如 0.001-20wt% )的EphrinA2抑制剂；(b)有效量(如0.001_20wt% )的肿瘤坏死因子 α (TNF- α )；以及(c)药学上可接受的载体(如用量为80_99.999wt% )。该药物组合物 可有效地提高肝癌细胞对TNF-α的敏感性，促进TNF-α所诱发的肝癌细胞凋亡，从而 对于肝癌的治疗产生积极的作用。所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如 毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生疗效的，且可被人和/或动物所接
受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀 释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，但施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington，s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.Co., N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在
组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体 中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。本发明的EphrinA2抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度 等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如 通过临床试验)。所述的因素包括但不限于EphrinA2抑制剂的药代动力学参数例如生 物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病、患者的体重、患者的免疫状况、给 药的途径等。通常，当本发明的EphrinA2抑制剂每天以约O.OOl-lOOmg/kg(优选的为 0.01-20mg/kg)动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次 分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为 0.005-100mg,较佳的约为0.008-50mg。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如， 由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于口服、静脉内注射、皮下注 射、肌肉给予、局部给予、植入、缓释给予、肿瘤内给予等；优选的，所述给药方式是 非肠道给予的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按 照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，
否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的 意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料和方法HCCcDNA，组织样本和细胞系HCC CDNA从52对原发性HCC及相对应的邻近正常组织(与肿瘤组织至少相 距3 4cm)中制备得到，这些组织来源于2004 2006年间在复旦大学附属中山医院 接受治疗、签署过“知情同意”后的HCC患者。所有的cDNA样本均保存于-80°C超 低温冰箱中，直至分析检测。正常肝组织，原位及门静脉转移的HCC样本来自东方肝 胆外科医院，所有的标本都保存于液氮中。正常肝细胞系7701、7702、以及肝癌细胞 系7404、7402、7405和7721从中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心购得，使 用RPMI1640(添加了 10%胎牛血清，10单位/ml青霉素，以及10单位/ml链霉素)， 在37°C，5% CO2.的细胞培养箱中进行培养。HepG2购自ATCC，使用DMEM进行培养 (添加了 10%胎牛血清，10单位/ml青霉素，以及10单位/ml链霉素)。试剂鼠源 anti-Myc 和 anti-p65 的单克隆抗体购自 Santa Cruz Biotechnology。兔源 anti-Akt 和 anti-phosphorylated Akt 的多克隆抗体购自 Cell Signaling。鼠源 anti-Rac 1、anti-Ki67 和 anti-cleaved PARP 的单克隆抗体来自 BD Biosciences。anti_EphrinA2 的山羊 源性抗体和人 TNF- α 购自 R&D Systems。Dual luciferase system 购自 Promega。G418, Superscripts II，lipofectamine 2000 禾口 TRIzol reagent 者β来自 Invitrogen。Luciferin 从 Xenogen Biotechnology 购得。Real-time PCR 分析实验中所检测基因相对应的引物均由PRIMER5软件设计。扩增反应体系为 20 μ L 的 LightCycler-DNA Master SYBR Green I mix (Roche Applied Science, Penzberg, Germany), 包含有 IOpmol 弓I 物，2mmol/L MgCl2, 200 μ mol/LDeoxynucleotide Triphosphate Mixture, 0.5单位Taq DNA聚合酶，以及通用缓冲液。所有反应均一式三 份，在iCycleriQ system(Bio-Rad，Hercules, CA)中进行，热循环的条件设置如下 95°C3分钟；之后为95°C30秒，58°C 20秒，72°C 30秒，循环40次；最后72°C延伸10 分钟。在每个临床样本或所培养的细胞样本中，基于β-actin的EphrinA2的相对 mRNA水平按照下述方法进行计算。简言之，当经过固定数目的循环后，扩增的PCR产 物得以检测到，这个循环数值即被定义为Ct，用它对反应进行描述。未知样本中的目的 信息通过测定Ct值进行量化，而β-actin的Ct值亦被作为内源RNA参照。每个样本 中EphrinA2的表达水平以β-actin的量为基础，通过以下公式进行标准化LeVelEphnnA2/ Level0_actm = 2(Cte^ε ιη"αΕρ1ιπηΑ2)。而每一对 HCC 样本中 EphrinA2 的相对表达水平，当 EphrinA2timor > EphrinA2n_al 时，以 EphrinA2tumor/EphrinA2nOTmal 计算，当 EphrinA2tumor < EphrinA2n_al时，以-(EphrinA2n_al/EphrinA2tumJ计算。使用配对t检验进行统计 学分析。当P <0.05时，统计结果被认为是显著的。所有的数据分析均使用SPSS for Windows 程序。其中， 检测 EphrinA2 的 弓 | 物 是EphrinA2F: 5-AGAAGTTCCAGCTCTTCACGC ； 3 (SEQ ID NO 5)； 禾P EphrinA2R 5-TACAGGGTCTCGTTGGTCGG-3 (SEQ ID NO 6)。质粒构建和转染人EphrinA2的全长cDNA通过BamH 1和Xho 1位点，克隆插入pcDNA3.1 / Myc-His 载体(Invitrogen)的相应位点中，得到 pcDNA3.1-EphrinA2。使用 Lipofectamine 2000转染试剂将pcDNA3.1-EphrinA2和空载体pcDNA3.1分别转入7404细胞中。通过 G418对转染的细胞进行筛选，并用Western blotting进一步鉴定抗性克隆。Luc2基因被克隆入FG12表达载体中，用于慢病毒表达。具体克隆方法如 下Luc2 是原初表达载体 pGL4.17[luc2/Neo] (GenBank DQ188837.1)中的 Firefly 荧 光素酶的人工序列。将Luc2基因序列克隆入pCSCG的NheI和XhoI两个酶切位点 间，克隆引物为LuciCSCGF 5-CATGCTAGCGCCACCATGGAAGATGCCAAAAAC -3 (SEQ ID NO 7)，LuciCSCGR 5-AACCTCGAGTTACACGGCGATCTTGCC-3 (SE Q ID NO 8)，得到 pCSCG_Luc2 质粒。然后，用 BamHI 和 XhoI 消化 pCSCG_Luc2， 得到包含CMV启动子序列的CMV-Luc2片段。再将这一片段插入pBS_U6_l质粒 (参见 Qin XF, An DS， Chen IS， Baltimore D, Inhibiting HIV-I infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5, Proc Natl AcadSci USA., 100 (1) 183-8，2003)中，得到 pBS-CMV_Luc2，然后通过 XbaI 和 XhoI 消化pBS-CMV-Luc2，再将这次消化所得的CMV_LUC2片段克隆入FG12载体(参 JAL Qin XF, An DS, Chen IS, Baltimore D, Inhibiting HIV-Iinfection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5, Proc Natl Acad Sci USA.，100(1) 183-8，2003)，最终得到 FG12-CMV_Luc2 质粒。空载体对照和EphrinA2表达的7404细胞均通过FG12-CMV_Luc2进行标记， 用于转移实验。标记方法如下将包装质粒FG12-CMV_Luc2、pMDLg、pRSVREV、 pHCMVG(参见Atrogin-I基因沉默对肌细胞营养不良保护作用的实验研究，《中华外科 杂质》，2009，权⑶)用lipofectamine 2OOO(Invitrogen)转染293T细胞，48小时候收取 细胞上清，用0.45um的滤膜进行过滤，20000RPM/min离心2小时以浓缩病毒，得到的 病毒用Iml DMEM培养基溶解后加入到7404和EphrinA2表达的7404细胞中进行感染， 即实现了 Luc2基因对上述细胞的标记。Racl的显性失活型表达载体(DNRacl)获自美国北卡罗莱那大学。Akt的显性 失活型表达载体(DNAkt)获自美国西弗吉尼亚大学。针对 EphrinA2 的 RNA 干扰针对EphrinA2的小干扰RNA的三个靶序列为#1-Si GACTACCTGGACATCTAC (SEQ ID NO 1)，#2-Si TTCTCGGAGAAGTTCCAG (SEQ ID NO 2)，禾口#3-Si TTCCAGCTCTTCACGCCC (SEQ ID NO 3)。小干扰RNA的对照(Con-si)核苷酸序列为GAATGCGAGCGAGCGAGCA(SEQ ID NO 4)；该对照核苷酸不针对任何人的基因编码序列。常规方法获得可表达出双链的SiRNA的载体。简单而言，分别根据上述靶序列 设计引物，所述的引物包含了互补的序列结构，在酶切和克隆入表达载体后，可折叠形 成双链的siRNA。FG12 RNAi载体被用于产生小的双链RNA (小干扰RNA)，以在肝癌细 胞中抑制靶基因的表达。载体的克隆方法如下先把用于RNAi的序列用BbsI和HindIII 位点接入 pBS-U6-l 载体(参见 SuiG，SoohooC, Affar elB，Gay F，Shi Y，et al. (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci U S A 99 : 5515 5520)中，再用 Xbal 和 Xhol 位点把 pBS_U6_l 中的序列接 入到FG12载体中，即完成了重组FG12 RNAi载体(分别可表达出对应于靶序列#l_Si， #2-Si，#3-Si，Con-si的siRNA)的构建。病毒的包装和感染方法同前。经鉴定，所获 得的慢病毒在转染细胞后可良好地表达出相应的siRNA。实验过程中发现，针对于#3_Si靶序列来抑制EphrinA2的表达效果不够理想， 因此后续实验针对于#1-Si和#2-Si靶序列来抑制EphrinA2的表达，其中，针对于#l_Si 靶序列的抑制效果最好。体内成瘤实验雄性裸鼠在标准条件下进行饲养。对6周大的雄性裸鼠在身体两侧和/或背部 进行皮下注射，每一处注射2 X IO6个肝癌细胞。每隔4到5天，使用游标卡尺测量生成 的肿瘤，其体积(cm3)使用标准公式“长X宽X高X0.5236”进行计算。最后，麻醉动物并取出皮下肿瘤。雷帕霉素敏感性测试将雷帕霉素以100mg/ml的浓度溶于DMSO中，并存储于-20°C备用。在实验 当天，以ddH20稀释储液，得到最终的工作溶液。小鼠按照如上所述的方法进行HCC细 胞的皮下注射，然后随机分为两组对照组和雷帕霉素处理组。对处理组，自肿瘤移植 后第12天起，以3mg/kg(雷帕霉素用量/动物体重)的剂量，以强饲法每天口服一次。 对照组的小鼠以完全相同的方式给以溶剂。肿瘤转移实验使用luc2表达载体标记HCC细胞。将2X105个癌细胞注射入6周大 裸鼠的左心室(每组5只，分别注射空载体(pcDNA3.1)对照细胞以及过表达 EphrinA2 (pcDNA3.1-EphrinA2)的细胞)。通过IVIS系统验证了注射的成功性。每周通 过解剖动物，观察转移情况。TUNEL 实验将移植瘤用福尔马林固定，经石蜡包埋，按照生产商(Promega Corporation， Madison, USA)的说明进行TUNEL实验。TNF-α 处理在将细胞铺种于液体培养基36小时后，用Actinomycin D(对7404细胞，处理浓 度为667ηΜ;对HepG2细胞，浓度为500nM)处理30分钟，然后加入20ng/ml TNF-α， 处理30小时。DNA含量检测将对照细胞和经过TNF-α处理的细胞用胰酶消化，用PBS洗两次后，以2000g 的速度离心5分钟，再用250 μ 1 PBS加上750 μ 1冰冷的乙醇重悬，于4°C放置1小时。 然后再重复使用PBS洗两次，重悬于含有Propiduim Iodide和RNaseA的PBS中，于37°C 孵育1小时后，用流式细胞仪进行分析。荧光素酶活性检测空载体对照(7404/vec)和EphrinA2 过表达的 7404 细胞(7404/Α2#1，7404/ A2#2，7404/A2#3)，EphrinA2过表达的7404细胞和相对应的EphrinA2表达被抑制的细 胞以及HepG2细胞与相对应的EphrinA2表达被抑制的细胞中被转入NF-kappaB报告基因 和renilla报告基因的方法转染前24小时，先把实验所需的细胞按每孔十万个细胞的分 量铺种于24孔培养板中，转染时，每孔细胞用Lipofectamine2000 (Invitrogen)转入0.5ug 的pBL3-NF_kappa B-reporter和0.02ug的Renilla质粒(均来自美国加州大学洛杉矶分 校)。细胞转染24小时后，按照试验说明书，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System 检测NF-kappa B报告基因的荧光素酶活性。Western Blot将培养的细胞用PBS清洗，再用RIPA缓冲液在冰上裂解30分钟。将细胞 裂解物于10,OOOg离心15分钟，取上清，用Bradford试剂(Sigma)测定蛋白浓度，使 用 10 % 或 12 % SDS-PAGE 跑胶，然后将蛋白转移至 Immobilon membrane (Millipore， Bedford, ΜΑ)上，用特异性的抗体进行免疫印迹。所有的免疫印迹均用Enhanced Chemiluminescene (Pierce, Rockford, IL)进行显影。
免疫荧光细胞铺种于载玻片上36小时后，在室温下用PBS清洗3次，然后用含有4%福 尔马林的PBS在冰上固定30分钟。细胞用含有5%山羊血清，2%驴血清，2%BSA， 0.1% Tween-20和0.3% Triton X-IOO的PBS在室温封闭1小时，于4°C一抗孵育过夜。 二抗(Alexa Fluor 488-偶联的驴抗兔 IgG (Molecular Probes)或 Alexa Fluor 546-偶联的山 羊抗鼠IgG (Molecular Probes))均以1 1000的比例稀释使用。使用倒置共聚焦激光显 微镜(Carl Zeiss，New York, NY)检测荧光信号。统计学分析所有数据均以平均值士标准误的方式表示。Student’ St检验用于不同组之间 的比较，当ρ <0.05时，认为组间存在显著差异。II.实施例实施例1、EphrinA2在肝细胞癌(HCC)的已建细胞系中以及临床组织样本中表 达上调为了研究Eph/Ephrin成员在HCC中的作用，本发明人首先在正常的肝细胞系 (7701, 7了02)及肝癌细胞系(7404，7405, 7721, 7402, HepG2)中，通过 Real-Time
PCR检测了它们的表达水平。在所有被检测的成员中，与正常的肝细胞系相比， EphrinA2的表达在肝癌细胞系中显著上调(图1A)。接着，本发明人检测了 EphrinA2在 52对配对肝组织样本中的表达，发现相比于所对应的正常肝组织，EphrinA2的表达水平 在HCC组织中是显著升高的(图IB)。EphrinA2在细胞系及临床样本中的表达模式提示 它与HCC的发病有关。HCC具有很高的门静脉侵入的风险性。门静脉癌栓(PVTT)是肝功能恶化的标 志，并且作为一个不良预后因子，伴随着频繁的复发以及肝内转移。因此，本发明人推 测在癌栓组织样本中，EphrinA2的表达水平可能会进一步升高。如预期所料，本发明人 发现在正常肝组织中，EphrinA2的蛋白水平最低，在原位HCC中相对较高，而在PVTT 中进一步升高，提示它不仅在HCC的起始阶段有作用，还参与了对HCC进展的调控(图 IC和图1D)。实施例2、EphrinA2在HCC细胞中的表达正向调控了体内肿瘤生长为了进一步研究EphrinA2在HCC中的功能，本发明人利用7404细胞(在所有 HCC细胞系中，该细胞系的EphrinA2表达量相对低)构建了过表达EphrinA2的稳定细胞 株(7404/EphrinA2)，并选取了三株具有不同EphrinA2表达水平的7404/EphrinA2稳定细 胞株用于后续实验(图2A)。分析发现，在对照细胞(转入空载体pcDNA3.1的7404细胞)和7404/EphrinA2 细胞之间，没有显著的体外增殖差异。然而，在裸鼠中，7404/EphrinA2细胞产生的移植 瘤大于对照细胞所产生的移植瘤(图2B，左图)，表明EphrinA2促进了体内肿瘤生长。为了验证上述促瘤效应的特异性，本发明人通过RNAi技术下调了 7404稳定细 胞株中EphrinA2的表达。当EphrinA2的表达被抑制后，7404稳定细胞株的体内肿瘤生 长相应的被延缓了(图2B，右图)。更重要的是，针对EphrinA2的siRNA同样能够抑制7402和HepG2这两株 EphrinA2表达量相对较高的细胞中EphrinA2的内源表达(图2C)，而且EphrinA2的下调明显抑制了 7402细胞在裸鼠体内的肿瘤生长(图2D)。此外，本发明人还发现，EphrinA2显著增强了 7404细胞在远端器官形成肿瘤的能力(图2E)。综上所述，这些结果提示EphrinA2能够促进HCC的发生和/或发展。实施例3、EphrinA2抑制了 HCC细胞的凋亡为了揭示在裸鼠体内促癌作用的机制，本发明人分别检测了 EphrinA2对于体内 细胞增殖和凋亡的影响。对照细胞和7404/EphrinA2细胞所产生的移植瘤的Ki67 ( — 种存在于增殖细胞中的核抗原)染色没有差异，表明EphrinA2对于增殖并无影响，这 与本发明人之前所观察到的现象是一致的。而在7404/EphrinA2产生的移植瘤中，被 剪切的PARP(—个凋亡的敏感标志物)的水平下降表明了凋亡的显著降低，而抑制内源 EphrinA2的表达有效的回复了被剪切的PARP的表达(图3A)。经典的TUNEL检测也 同样显示了在EphrinA2过表达的移植瘤中，凋亡DNA断片显著降低了(图3B)。这些 结果提示，EphrinA2的促瘤效应主要归结于它对HCC细胞凋亡的抑制。HCC常与肝炎病毒感染所引起的慢性炎症反应相伴随，而慢性炎症反应通常会 导至文 TNF- α 的水平升高(Nakazaki H.Preoperative and postoperative cytokines in patients with cancer.Cancer 1992 ； 70: 709-713)。TNF-α与诱发凋亡以及引发肝损伤都密切相关 (Luedde T 等，Losing balance cytokine signaling and cell death in the context of hepatocyte injury and hepatic failure.Eur Cytokine Netw 2002 ； 13 377-383)。为 了检测在细胞因子诱 发的凋亡中，EphrinA2是否具有相同的抗性作用，本发明人对对照细胞和EphrinA2过表 达的细胞(7404/EphrinA2)进行了TNF-α处理。如图4A所示，相比于对照细胞，7404/ EphrinA2细胞对于TNF-a所诱发的凋亡表现出强烈的抗性。而当EphrinA2被抑制后 (分别用两种针对EphrinA2的siRNA慢病毒(对应于靶序列#l_si，#2_si，以Con-si为 对照)感染EphrinA2表达水平最高的7404/Α2#1，然后给予TNF-α处理；处理后，经 鉴定，细胞内含有小干扰RNA和TNF-Ci )，这种抗性也被削弱了。在EphrinA2表达量相对较高的HepG2细胞(图1A)中下调内源的EphrinA2的 表达，同样会导致对于TNF-α处理的超敏性(图4B)，这与本发明人在7404/EphrinA2 细胞中观察到的现象是一致的。在TNF- α存在的情况下，在过表达EphrinA2的7404细胞中，作为凋亡标志物 的被剪切的PARP显著下调了(图4C，左图)，而其水平在EphrinA2表达被抑制的细胞 中则相应升高了(图4C，右图)。实施例4、Racl/Akt/NF-kappaB通路受到EphrinA2的调控，并且介导了由 EphrinA2所引起的细胞存活的变化PI3K/Akt是一条传递抗凋亡信号，阻断凋亡引发的重要信号通路。通过Akt磷 酸化所引起的这一通路的上调在某些肿瘤中是频发事件，因此，本发明人检测了在HCC 中是否也存在这样的变化。如图5A所示，在7404/EphrinA2细胞中，磷酸化Akt(pAkt) 的水平显著升高了，而当7404/EphrinA2细胞或者HepG2细胞中的EphrinA2被抑制后， 磷酸化Akt的水平降低了。此外，在配对的临床样本中，亦能观察到EphrinA2的表达和Akt磷酸化的正相 关性(图5B)，提示它们在HCC发展过程中的协同作用。
用一种PI3K/Akt通路的特异性抑制剂LY294002 (购自Sigma)处理7404/ EphrinA2细胞，导致了对TNF-α处理的抗性的消失(图5C)，表明活化的Akt介导了 EphrinA2所引起的体外凋亡抗性。使用雷帕霉素阻断体内的PI3K级联，能够显著的抑制EphrinA2过表达细胞的肿 瘤生长(图5D)。上述数据揭示了由EphrinA2所介导的生物学效应利用了活化的PI3K/Akt通路。Rho家族成员是众所周知的PI3K/Akt通路的上游调控因子，而Rho家族蛋白的 活性在某些种类的细胞中亦为一些Eph/Ephrins所调控(Nakada M等，Ephrin_B3 Iigand promotes glioma invasion through activation of Rac 1.Cancer Res2006 ； 66 8492—8500 ； Hunter SG 等，Essential role of Vav family guanine nucleotide exchange factors in EphA receptor-mediated angiogenesis.Mol Cell Biol2006 ； 26 4830-4842)，因此本发明人假设 在HCC细胞中过表达EphrinA2也许会增强Racl (Rho家族的一个重要成员)的活性。如 本发明人所料，相比于对照细胞，在7404/EphrinA2细胞中，活化Racl的水平的确有所 增高，而抑制EphrinA2的表达则导致了活化形式的Racl水平降低(图5E)。此外，在 过表达EphrinA2的细胞中，通过一种特异性的抑制剂NSC23766 (Calbiochem, USA)阻 断Racl的活性，显著降低了活化的Akt的水平，而在对照细胞中，仅产生了极其微弱的 影响，这 和两种细胞中活化的Racl的水平差异是相一致的。NF-kappa B,是Akt下游的一个著名的抗凋亡信号介导因子，并且参与了肝 癌的发生(Arsura M, Cavin LG.Nuclear factor-kappaB and liver carcinogenesis.Cancer Lett 2005 ； 229 157—169 ； Chiao PJ 等，Role of Rel/NF—kappaB transcription factors in apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells.Cancer2002 ； 95: 1696-1705)。本发明人 预测EphrinA2通过激活NF-kappa B增强了细胞的存活能力。本发明人通过荧光素酶报 告基因实验，检测了 NF-kappaB的激活情况。与对照细胞相比，在7404/EphrinA2细胞 中，NF-kappa B的转录活性显著升高(图6A)。与之相反，当EphrinA2的表达在7404/ EphrinA2细胞或HepG2细胞中被siRNA所抑制后，NF-kappa B的活性也同时降低了。在大多数细胞中，非活化的NF-Kappa B和掩盖其入核信号的一个U B抑制蛋 白相结合，以失活二聚体的方式存在于胞质中。通过免疫荧光检测，与对照细胞相比， 在7404/EphrinA2细胞中，可观察到明显的NF-kappa B核定位，而抑制EphrinA2的表达 则降低了核内的NF-kappa B (图6B，C),这就进一步支持了本发明人关于EphrinA2激活 NF-kappa B 的论述。如图6D所示，EphrinA2所诱导的NF_kappa B的激活分别为被LY294002， NSC23766，显性失活的(DN) Akt，以及显性失活的Racl所阻断，虽然不同处理的抑制 效果不一样。这些结果表明Racl/Akt通路参与了对EphrinA2所引发的NF-kappaB的活 性调控，由此揭示了存在于EphrinA2，Racl, Akt和NF_kappaB之间的一个精细的调节网络。实施例5、筛选方法设置测试组HepG2细胞(内源性EphrinA2表达较高)，并给予候选物质； 对照组HepG2细胞，不给予候选物质。分别检测测试组和对照组中EphrinA2的表达情况，并进行比较。如果测试组中EphrinA2的表达在统计学上低于(如低50%或更低)对照组，就表明该候选物是抑制肿 瘤的潜在物质。分另Ij将对应于 #l-Si(GACTACCTGGACATCTAC，SEQ ID NO 1)禾口 #2-Si(TTCTCGGAGAAGTTCCAG，SEQ ID NO 2)的 siRNA，以及相应对照的 siRNA (GAAUGCGAGCGAGCGAGCA, SEQ ID NO 9)分别作为候选物质，加入至Ij HepG2培养物中，观察胞内EphrinA2的表达情况。结果发现，对应于#l_Si和#2_Si的siRNA可有效地降低EphrinA2蛋白的表达 (其中#1-Si的效果更佳，见图2A右)，而相应的对照不能有效地降低EphrinA2的表达。讨论在发明中，揭示了 EphrinA2使HCC细胞 对本底以及细胞因子所引发的凋亡产生 抗性，从而为肿瘤细胞提供了生长优势，由此促进了 HCC的发展及恶化。鉴于在肿瘤细 胞中，Eph/Ephrins对于细胞存活和凋亡的调节机制至今仍不清楚，本发明为这一机制的 探索提供了全新的视角。本发明人首次确定了 EphrinA2的表达和HCC发展之间的关系。EphrinA2的水
平在正常肝细胞中最低，在原位HCC细胞中有所升高，而在PVTT细胞中达到最高。这 种逐渐递增的表达模式与这种疾病的恶化相对应，提示了 EphrinA2在HCC进程中可能具 有的作用。此外，在HCC细胞中过表达EphrinA2增强了细胞的转移能力。HCC常伴随着慢性肝炎，尤其在亚洲。已知TNF-C和慢性肝病的发病密切相 关。作为由渗透的淋巴细胞释放的一种前炎性细胞因子，TNF-Ci能够诱导多种细胞发 生凋亡，包括HCC细胞。本发明人发现在HCC细胞中上调EphrinA2能降低细胞对于 TNF-α所诱发凋亡的敏感性，而下调EphrinA2则增加了细胞对于TNF-α所诱发凋亡的 敏感性，这提示EphrinA2能够使HCC细胞产生对TNF- α凋亡作用的抗性，从而支持它 们的存活。之前的一系列研究提示TNF-α是一种富有前景的用于肿瘤治疗的细胞因子，然 而，临床实验结果却令人失望，主要归结于这个因子在高剂量时的非特异性毒性。人们 对改进它的应用做了种种努力，比如对TNF-α进行修饰，以改进它对于肿瘤组织的特异 性。另一种可能的策略是提高肿瘤细胞对于TNF-α的敏感性，这将降低该细胞因子的 有效用药剂量，从而避免意外的全身毒性。在本发明人的研究中，抑制HCC细胞中内源 EphrinA2的表达使细胞对TNF- α更加敏感，提示对EphrinA2的操作有助于改进TNF- α 在肿瘤治疗中的应用。本发明人进一步揭示了 EphrinA2/Racl/Akt/NF_kappa B信号通路介导了细胞对 TNF-Ci处理的抗性。Akt的激活是与HCC复发及不良预后相关的一个风险因子。本发 明人在临床HCC样本中，注意到EphrinA2的表达和Akt磷酸化之间的显著相关性，提示 在HCC的进程中，Akt受到了 EphrinA2的调控。一旦Akt被激活，它的一系列下游因 子也被激发，从而影响细胞存活和凋亡之间的平衡。本发明人还发现NF-kappaB，这个 活化Akt的最重要的效应分子之一，在HCC细胞中被高度激活，并且和在其它一些肿瘤 中的情况类似，它的活化是Akt依赖性的。因此，本发明人证明了由EphrinA2所诱发的 Akt/NF-kappaB级联赋予了 HCC细胞抗凋亡的能力。EphrinA2和TNF-α都是作为配体，通过结合并激活相应受体而发挥作用的。已知Racl参与了这两个分子的下游信号转导。提示EphrinA2能够通过依赖于Racl，并且 有受体参与的方式，干扰TNF-α所诱发的凋亡通路，最终削弱了 TNF-α的毒性作用。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>抑制肝细胞癌的方法和试剂<130>093920<160>11<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><22 l>misc_feature<223>寡核苷酸<400>1gactacctgg acatctac 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>寡核升酸<400>2ttctcggaga agttccag 18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>3ttccagctct tcacgccc 18
<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>4gaatgcgagc gagcgagca 19<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>5agaagttcca gctcttcacg c 21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>6tacagggtct cgttggtcgg 20<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>7 catgctagcg ccaccatgga agatgccaaa aac 33<210>8<211>27<212>DNA
<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>8aacctcgagt tacacggcga tcttgcc 27<210>9<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>9gaaugcgagc gagegagca19<210>10<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>10gacuaccugg acaucuac18<210>11<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>寡核 苷酸<400>11uucucggaga aguuccag 18
权利要求
1.一种EphrinA2抑制剂的用途，用于制备预防或治疗肝癌的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的EphrinA2抑制剂是特异性干扰 EphrinA2表达的小干扰RNA分子，其识别的靶序列如SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于 提高肝癌细胞对肿瘤坏死因子α的敏感性；促进肿瘤坏死因子α诱发的肝癌细胞凋亡； 抑制Akt的磷酸化或活化； 抑制Racl的活性；或 抑制NF-kappaB的活性。
4.一种小干扰RNA分子，其识别的靶序列如SEQ IDNO 1或SEQ ID NO: 2所示。
5.一种特异性识别EphrinA2蛋白或其编码基因的物质的用途，用于制备诊断肝癌的 试剂或试剂盒。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的特异性识别EphrinA2蛋白或其编 码基因的物质选自特异性扩增EphrinA2蛋白的编码基因或转录本的引物； 特异性识别EphrinA2蛋白的编码基因或转录本的探针；或 特异性结合EphrinA2蛋白的抗体或配体。
7.—种诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有特异性识别 EphrinA2蛋白或其编码基因的物质。
8.一种筛选预防或治疗肝癌的潜在物质的方法，所述方法包括(1)用候选物质处理表达EphrinA2蛋白的体系；和(2)检测所述体系中EphrinA2蛋白的表达或活性；其中，若所述候选物质可降低EphrinA2蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是预 防或治疗肝癌的潜在物质。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括在测试组中，将候选物质 加入到表达EphrinA2蛋白的体系中；禾Π /或步骤(2)包括检测测试组的体系中EphrinA2蛋白的表达或活性，并与对照组比 较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达EphrinA2蛋白的体系；如果测试组中EphrinA2蛋白的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物 是预防或治疗肝癌的潜在物质。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的体系中还表达Racl 蛋白，Akt蛋白和NF-kappa B蛋白，可形成Racl/Akt/NF-kappa B信号通路；步骤(2)还包括检测体系中Racl蛋白，Akt蛋白或NF-kappa B蛋白的表达或活 性；若所述候选物质可降低Racl，Akt或NF-kappa B的表达或活性，则表明该候选物质 是预防或治疗肝癌的潜在物质。
11.一种用于预防或治疗肝癌药物组合物，包括(a)有效量的EphrinA2抑制剂；(b)有效量的肿瘤坏死因子α；以及(C)药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及抑制肝细胞癌的方法和试剂。公开了一种EphrinA2抑制剂的用途，用于制备预防或治疗肝癌的组合物；还公开了EphrinA2以及特异性识别EphrinA2蛋白或其编码基因的物质的用途，用于制备诊断肝癌的试剂或试剂盒；还公开了筛选预防或治疗肝癌的潜在物质的方法。本发明论证了EphrinA2在肝癌发生发展过程中的重要性，为肝癌治疗提供了一个新的药物靶点。
文档编号A61P1/16GK102008724SQ20091019529
公开日2011年4月13日 申请日期2009年9月8日 优先权日2009年9月8日
发明者冯宇雄, 李晶晶, 谢东, 赵江沙 申请人:中国科学院上海生命科学研究院