专利名称：中药黄连解毒汤在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药，具体涉及黄连解毒汤在制备防治类风湿关节炎的药物中 的应用。
背景技术：
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种病因尚未明了的慢性 全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表 现，属于自身免疫炎性疾病。该病好发于手、腕、足等小关节，反复发作，呈对 称分布。早期有关节红肿热痛和功能障碍，晚期关节可出现不同程度的僵硬畸形， 并伴有骨和骨骼肌的萎縮，极易致残。从病理改变的角度来看，类风湿性关节炎 是一种主要累及关节滑膜(以后可波及到关节软骨、骨组织、关节韧带和肌键)， 其次为浆膜、心、肺及眼等结缔组织的广泛性炎症性疾病。类风湿性关节炎的全 身性表现除关节病变外，还有发热、疲乏无力、心包炎、皮下结节、胸膜炎、动 脉炎、周围神经病变等。但是，类风湿性关节炎至今尚无特效疗法，仍处于对炎 症及后遗症的治疗。黄连解毒汤首载于葛洪《肘后备急方》，王焘《外台秘要》引崔氏方"前 军督护刘车者，得时疾三日已汗解，因饮酒复剧，苦烦干呕，口燥呻吟，错语不 得卧，余思作此黄连解毒汤。此方由"黄连三两(9g)，黄吝、黄柏各二两(6g)， 栀子十四枚(9g)组成。上四味切，以水六升，煮取二升，分二服。此方淳火解 毒，主治三焦火毒热盛证。凡大热烦躁，口燥咽干，错语不眠；或热病吐血，衄 血；或热甚发斑，身热下利，湿热黄疸；外科痈疡疔毒，小便黄赤，舌红苔黄， 脉数有力皆可用之。"本方证乃火毒充斥三焦所致。火毒炽盛，内外皆热，上扰神明，故烦热错语； 血为热迫，随火上逆，则为吐衄；热伤络脉，血溢肌肤，则为发斑；热盛则津伤， 故口燥咽干；热壅肌肉，则为痈肿疔毒；舌红苔黄，脉数有力，皆为火毒炽盛之200910195341.8 ，治宜泻火解毒。方中以大苦大寒之黄连清泻 心火为君，因心主神明，火主于心，泻火必先泻心，心火宁则诸经之火自降，且 兼泻中焦之火。臣以黄芩清上焦之火。佐以黄柏泻下焦之火。使以栀子通泻三焦， 导热下行，是火热从下(小便)而去。四药合用，苦寒直折，三焦之火邪去而热 毒解，而诸证可愈。吴昆《医方考》巻3曰"阳毒上窍出血者，此方主之。治 病必求其本，阳毒上窍出血，则热为本，血为标，能去其热则血不必治而归经矣。 故用连、芩、桅、柏苦寒解热之物以主之。然惟阳毒实火，用之为宜。若阴虚之 火则降多亡阴，苦从火化而出血益甚，是方在所禁矣。"《肘后备急方》巻2亦 载"烦呕不得眠可用此方。"《成方便读》载"可治一切火邪，表里俱盛， 狂躁烦心，口燥咽干，大热干呕，错语不眠，吐血，衄血，热盛发斑等证。"现代药理研究表明黄连解毒汤具有明显的抗炎、镇痛、抗菌、抗内毒素、 调节消化系统、解热、降压、等多方面作用。为寻求中医药治疗类风湿性关节炎 的有效方剂，本发明人经大量试验证实，黄连解毒汤有明显的抗炎及免疫作用， 能较好的预防和治疗类风湿性关节炎。发明内容本发明所要解决的技术问题在于研究设计黄连解毒汤在制药中的应用。 本发明提供了中药黄连解毒汤在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用。 所述中药黄连解毒汤的中药组成成分为黄连9g、黄芩6g、黄柏6g和栀子9g。本发明采用黄连解毒汤进行动物药效试验，结果显示黄连解毒汤可抑制CIA (Collagen-Induced Arthritis,胶原诱导的关节炎)的临床发病，明显抑制了CIA的 发病严重程度和发病率，说明黄连解毒汤对CIA具有明显的保护作用。并能下 调脾细胞上清液中TNF-a (肿瘤坏死因子a) 、 IL-17 (白介素17) 、 IFN-y (干扰 素y),抑制促炎细胞因子TNF-a、 IFN-y和IL-17的分泌，从而对CIA疾病具有保 护作用。TNF-a和IFN-Y在RA发病机制中起着重要作用。TNF-a可直接诱导蛋白 水解酶的合成，造成基质结构的破坏。实验结果也表明，黄连解毒汤可较大程度 降低脾脏细胞分泌TNF-a。用抗TNF-a疗法在治疗RA上取得了良好的效果，不但 阻止了骨组织破坏而且也抑制了IL-I7的产生。黄连解毒汤对炎症的控制及对关 节组织的保护可能与其降低TNF-a含量有关。 IFN-Y主要由浸润在病灶局部的CD4+T细胞分泌，它可以激活巨噬细胞，活化MIP-la、MIP-ip和IP-10的表达，这些趋化因子参与淋巴细胞向病灶迁移的过程。 本发明的实验中，黄连解毒汤在体内明显降低了IFN-Y的水平，有可能与阻断了 淋巴细胞的后继迁移有关。有研究报道，TNF-a与IFN-Y在体外共同刺激纤维原 细胞和人微血管内皮细胞可协同诱导趋化因子CXCLIO的产生，RA病人滑液中 大量CXCLIO的表达导致活化Thl细胞及自然杀伤细胞的浸润，对组织造成损 伤。在类风湿关节炎的模型中升高的IL-15可通过诱导IL-17而发挥其促炎症细胞 因子的特性，IL-15可能通过环孢菌素A和类固醇敏感的途径，导致关节中的IL-17 过度分泌。IL-17除了可刺激滑膜细胞释放各种炎症介质外，还可通过刺激 RANKL与RANK结合，刺激骨吸收，是目前认识到的在类风湿性关节炎骨破坏 病理中最重要的细胞因子之一。本发明中，黄连解毒汤可显著抑制IL-17的生成， 黄连解毒汤对CIA有明显的疗效，可明显抑制CIA临床发病，降低炎性细胞因 子TNF-a及IFN-Y的分泌，这是黄连解毒汤治疗类风湿关节炎的机制。本发明通过药理学研究实验，明确所述中药黄连解毒汤可用于制备防治类风湿 性关节炎药物，为临床治疗类风湿性关节炎提供了新的中药，可以克服化学药的 毒付作用，给患者带来治疗的信心，有较大的临床应用价值。
具体实施方式
一、实验材料 药物与试剂鸡II型胶原(CII): Chondrex， Redmond, WA 98052， USA;不完全弗氏完全 佐剂(IFA) Difco Laboratories, Detroit, MI;磷酸缓冲盐溶液(PBS):由本 实验室自行配制，在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44gNa2HP04和 0.24gKH2PO4。用盐酸调PH至7.4，加水定容至l L，过滤除菌后使用；DMSO二 甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO):为sigma公司产品；1640培养基吉诺生 物医药技术有限公司；小牛血清民海生物有限公司；96孔平底板，CORNING 公司；70pm细胞研磨滤网，BD Falcon公司；15ml、 50ml离心管，BD Falcon公 司；0.22pm滤器，Millipore公司；1ml旋口注射器，BD公司；贝朗三通，德 国贝朗公司；甲氨喋呤片上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂(080605);黄连解毒汤实验室自制，其制备方法为取黄连9克，黄芩6克，黄柏6克，栀子9克，混合后用300ml的水泡半小时，加热煮沸，保持沸腾煮至l小时，煎煮液 过滤，滤液备用。滤渣再用240ml的水加热煮沸，保持沸腾煮至l小时，煎煮液过 滤，合并两次滤液，浓縮至lg/ml即可。 动物DBI/I型小鼠，雄性，6-8周，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可 证号SCXK(沪)2007-0005，饲养于第二军医大学实验动物中心清洁级环境中。 仪器与设备高速台式离心机，Eppendorf;高速台式低温离心机，HITACHI公司；倒置显 微镜，Nikon公司；超净台，苏净集团安泰公司制造；电热恒温鼓风干燥箱，上 海精宏实验设备有限公司；湿度C02培养箱，Heraus公司；恒温水浴锅，上海 国华电器有限公司。二、 实验方法 模型的建立 实验准备完全弗氏佐剂(CFA)的制备在不完全弗氏佐剂中加入热灭活的结核分支杆 菌至终浓度4mg/ml，使用之前充分混匀。 0.01M冰乙酸制备11.43pl冰乙酸溶于20ml去离子水中，过滤，4"C备用。 CII制备将CII溶解于0.01M冰乙酸至终浓度4mg/ml， 4 。C保存。 抗原的乳化用三通管连接两支玻璃针管，将PBS、完全弗氏佐剂和抗原CII 分别加入一支针管中(每100pl乳化液含200吗CII和5(Hi1完全弗氏佐剂)，排 除针管内气泡后，来回推动针管约500次，将针管内各成分充分混匀成乳化状态。 CIA模型的诱导第0天，小鼠尾根部2-3厘米处给予10(Hi1 /只乳化好的CII抗原皮下注射免 疫；第21天，加强免疫50plCl1和150plPBS充分混匀，150ul/只腹腔注射；正常组用生理盐水同法注射。三、 实验分组和给药方案大鼠随机分为6组，每组12只，分别为正常组、CIA模型组、阳性对照组(甲 氨喋呤2mg/kg)、黄连解毒汤组分为高、中、低三个剂量组，其给药量分别为500mg/kg、 250mg/kg、 125 mg/kg。于二次免疫前一天(第20天)至第34天黄连 解毒汤组分别按500mg/kg、 250mg/kg、 125mg/kg连续灌胃给药，甲氨喋呤组每 两天按2mg/kg给药，正常组和模型组按10ml/kg给予饮用水。1、 多发性关节炎指数(arthritis index, AI)评分二次免疫后，定期记录小鼠全身关节病变情况，按3级评分法评价，计算发病 率及平均发病指数。具体评分标准为O分-关节正常；l分-关节轻微红肿；2分-关节红肿严重，累及整个关节，活动受限；3分-爪子或关节功能障碍，关节僵硬。 四肢的总和为小鼠的评分，最高为12分。2、 淋巴及脾脏单个核细胞(MNC)悬液的制备小鼠处死，固定，剪开腹部皮肤，取两侧腹股沟淋巴结；后打开腹腔，取出脾 脏，立即放入装有1640的15ml离心管中，置于冰上；将脾脏倒入70pm的细胞 研磨滤网中，用lml注射器针芯充分研磨，使之成细胞悬液；收集细胞悬液，4'C ， 1000卬m，离心8min，离心后弃去上清；打散细胞，加入0.83%氯化铵水(约1.0ml/ 脾脏)，裂解5min;加入3倍体积的PBS终止裂解反应，并用玻璃吸管去除细胞 悬液中的絮状物；4'C， 1000rpm，离心8min，离心后弃去上清；打散细胞，加 入lml 1640 (含小牛血清)，混匀后计数，以1640完全培养基(含小牛血清)在 96孔板中培养，5xlO"ml每孔100ul，贴壁2小时。3、 脾细胞NO测定在96孔平圆底板中每孔加入5xl06/ml脾脏MNC100ul，每组4复孔；贴壁2小 时后，换液DMEM培养基，每孔加LPS (终浓度lug/ml)，将细胞置于37'C， 5 %C02培养箱中培养18小时后取出上清液检测NO。4、 脾、淋巴细胞增值测定在96孔平圆底板中分别加入5xlO"ml脾脏及淋巴MNC100ul，每组4复孔；贴 壁2小时后，加CII (100ug/ml)，将细胞置于37'C， 5%C02培养箱中培养72小 时后取出加MTS测增值。5、 脾细胞细胞因子测定在96孔平圆底板中加入5xlO"ml脾脏MNC100ul，每组4复孔；贴壁2小时后， 加CII (100ug/ml)，将细胞置于37。C， 5%C02培养箱中培养48小时后取上清液 检测细胞因子。四、结果1、黄连解毒汤可抑制CIA的临床发病在此CIA的实验中，用CII诱导CIA模型，初次免疫为第0天，第21天加 强免疫后小鼠随机分为6组对照组和三组黄连解毒汤组。于第20天开始给，阳 性对照组每两天给予甲氨喋呤药2mg/kg，黄连解毒汤高剂量组给予500 mg/kg， 中剂量组为250mg/kg，低剂量组为125mg/kg，连续给药14天，直到实验结束。 每天观察小鼠并依据评分标准给每只小鼠评分。CII诱导CIA，加强免疫后小鼠陆续出现发病，对照组与用药组在发病时间上 没有明显差异。发病后，模型组组小鼠疾病严重程度加重较快，在免疫后第37天 达到高峰，而给药组小鼠发病后疾病发展较对照组小鼠缓和(图l)。从发病率 来看，模型组为92%，对照组为75%，黄连解毒汤高、中、低三个剂量组分别为 72%， 70%和75%。由此可见，黄连解毒汤对CIA发病时间没有明显影响，但明 显抑制了CIA的发病严重程度和发病率，说明黄连解毒汤对CIA具有明显的保 护作用。2、黄连解毒汤能下调脾细胞上清液中TNF-a、 IL-17、 IFN-y在体内给予药物治疗CIA的实验中，疾病达到平台期后处死小鼠，取出脾脏细 胞，制成单细胞悬液，每孔1.5"06个细胞铺板，在体外用20pg/ml的抗原ClI刺 激，培养48小时后收集上清，用ELISA方法测量细胞因子TNF-a、 IFN々的浓度。如图2所示，CII刺激后，模型组细胞上清中TNF-a、 IFN-y及IL-17均高于各 个药物处理组，与阳性对照组及黄连解毒汤组相比，存在统计学差异(p<0.05)。 说明体内给予药物治疗后，能够抑制促炎细胞因子TNF-a、 IFN-y和IL-17的分泌， 并能从而对CIA疾病具有保护作用。
图l黄连解毒汤临床评分中+模型组+对照组+黄连解毒汤 500mg/kg +黄连解毒汤250111§/1^ +黄连解毒汤12511^/1^图2脾细胞上清细胞因子结果中(1) TNF-a检测结果(2) IL-17检测 结果(3) IFN-y检测结果；。空白组國模型组國甲氨喋呤组s黄连解毒汤 500mg/kg ia黄连解毒汤250mg/kg S黄连解毒汤125mg/kg; *P<0.05 ** PO.01 。
权利要求
1、中药黄连解毒汤在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用。
2、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述中药黄连解毒汤的中药组成成 分为黄连9g、黄芩6g、黄柏6g和栀子9g。
全文摘要
本发明提供了中药黄连解毒汤(中药组成成分为黄连9g、黄芩6g、黄柏6g和栀子9g)在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用。本发明采用黄连解毒汤进行动物药效试验，结果显示黄连解毒汤可抑制CIA(Collagen-Induced Arthritis，胶原诱导的关节炎)的临床发病，明显抑制了CIA的发病严重程度和发病率，说明黄连解毒汤对CIA具有明显的保护作用。并能下调脾细胞上清液中TNF-α、IL-17、IFN-γ，抑制促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17的分泌，从而对CIA疾病具有保护作用。为临床治疗类风湿性关节炎提供了新的中药，可以克服化学药的毒副作用，给患者带来治疗的信心，有较大的临床应用价值。
文档编号A61K36/756GK101653502SQ20091019534
公开日2010年2月24日 申请日期2009年9月8日 优先权日2009年9月8日
发明者刘心如, 刘晓华, 磊 单, 张卫东, 徐希科, 李慧梁, 柳润辉, 沈云亨, 窦圣姗, 娟 苏 申请人:中国人民解放军第二军医大学