专利名称：：一种胸腺素α1注射型皮下植入剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是胸腺素al的一种新剂型一生物降解性注射型皮下植入剂。
背景技术：
：胸腺素al(Tal)是从胸腺组分V中分离出来的一种酸性多肽，由28个氨基酸残基组成，氨基酸序列为N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu國Ile画Thr誦Thr-Lys-Asp隱Leu誦Lys-Glu-Lys國Lys-Glu-Val隱Val國Glu画Glu-Ala國Glu國Asn-C,其相对分子量为3108Da，等电点为3.8。Tal能够诱导T细胞的增殖和分化，增加人淋巴细胞中IL-2的产生和IL-2受体的表达，促进免疫抑制小鼠体内T细胞介导的中和抗体反应的恢复。Tal还可促进正常骨髓的造血作用，调节树突细胞的分化和功能。单独使用或者与干扰素等合用，Tal可用于癌症、慢性肝炎等疾病的治疗。Tal作为免疫调节剂，一般使用疗程较长，但是Tal皮下注射后生物半衰期短(<3h)，临床应用时需频繁给药，因而有必要研制Tal的一种长效缓释制剂。蛋白、多肽类药物缓释长效及非注射给药系统已经成为药剂学研究的热点，尽管肺部吸入给药和口服给药是最方便的非注射给药途径，但上述途径由于多肽、蛋白类药物的生物利用度低(与皮下给药比较的生物利用度仅约为10-30%)，肺部吸入给药存在药物对呼吸道粘膜潜在的刺激性等原因而受到限制。多肽、蛋白类药物能作为产品开发研究的领域主要集中在植入剂和注射用微球。普通植入剂需经手术途径植入体内，可持续数月释放药物，但手术对机体的损伤较大，病人的顺应性较差，可注射长效缓释微球虽然可以通过注射给药而达到植入剂的缓释效果，体内自行降解，但是微球制备工艺复杂，药物活性损失和突释作用较难控制，制备成本较高。对于蛋白质和多肽类药物，临床上迫切需要一种长效缓释剂型以弥补其生物半衰期短、需频繁给药的不足。生物降解性注射型皮下植入剂是一种缓控释制剂新剂型，其特点是蛋白质或多肽类药物固体粉末和高分子聚合物溶液必须在临用时才将它们混合在一起再注射入皮下，注射入皮下后高分子聚合物溶液的溶剂迅速扩散到周围组织的体液中，使高分子聚合物基质在注射部位固化，通过水溶涨高分子聚合物的扩散释放和高分子聚合物表面或整体溶蚀释放达到缓释作用(HatefiA，AmsdenB.Biodegradableinjectableinsituformingdrugdeliverysystems[J].J.ControlledRelease,2002,80(1-3):9-28)。该剂型制备工艺简单，条件温和，药物的活性损失小，载药量容易控制，药物包封完全，批量生产易于实现。使用生物可降解的高分子聚合物作为基质，具有良好的生物相容性，释药完毕后无需手术取出。该剂型很好地解决了植入剂和注射用微球在生产和应用过程中存在的问题，应用前景广阔。自2002年以来，美国FDA已连续批准AtrixLaboratory公司的醋酸亮丙瑞林注射用植入剂四个剂量规格产品(商品名为Eligard7.5mg,Eligard22.5mg，Eligard30mg，Eligard45mg)上市用于治疗晚期前列腺癌。但至今未见Tal可生物降解性注射型植入剂的相关报道。
发明内容本发明目的是提供一种具有长效缓释作用的Tal生物降解性注射型植入剂及其制备方法，同时提供一种注射型植入剂的体外释放装置。本发明Tal生物降解性注射型植入剂的组分包括Tal、赋形剂、载体材料、有机溶剂、溶剂添加剂和Mg(OH)2微粉，其中，赋形剂为牛血清白蛋白(BSA)或壳聚糖；载体材料为生物可降解的聚乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)，优选为羧基封端的PLGA，粘度0.1-0.8dl/g;有机溶剂为N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基乙酰胺(DMA);溶剂添加剂为醋酸甘油酯，所占比例为有机溶剂总体积的0-60%。本发明制剂的制备方法如下一.制备Tal的微粉1.以壳聚糖为赋形剂制备Tal的微粉1)制备Tal/壳聚糖溶液按配比将一定量壳聚糖粉末溶于一定量0.5-2.5%的醋酸中，待壳聚糖溶胀完全后加入一定量Tal粉末，振摇溶解，即得Tal/壳聚糖溶液，它们的配比为壳聚糖粉末300600mg0.5-2.5%的醋酸620mlTal粉末20200mg;62)制备Tal微粉采用喷雾-冷冻干燥法制备Tal微粉，例如用小型喷雾干燥仪的喷嘴将Ta1/壳聚糖溶液雾化为小液滴，喷液以盛有液氮的冷冻干燥机外挂瓶收集，外挂瓶于低温冰箱中放置一定时间以挥尽液氮，然后将外挂瓶放入预冻好的冷冻干燥机中，冻干，收集外挂瓶内微粉，即得Tal微粉，分装备用。2.以BSA为赋形剂制备Tal的微粉1)制备Tal/BSA溶液按配比将一定量BSA粉末和一定量Tal粉末溶于一定量蒸馏水中，振摇溶解，即得Tal/BSA溶液，它们的配比为BSA粉末300600mgTal粉末20200mg蒸馏水620ml2)制备Tal微粉将Tal/BSA溶液用喷雾-冷冻干燥法制成Tal微粉分装备用，制备方法同上。二.制备PLGA溶液按配比将一定量的PLGA粉末加入有机溶剂NMP或DMA混匀，加或不加醋酸甘油酯，配比为PLGA粉末4080mgNMP或DMA0.050.2ml醋酸甘油酯00.2ml涡旋或加热至PLGA完全溶解，冷却至室温，即成PLGA溶液，分装备用。三.制备Tal注射型植入剂临注射时，将上述制备的Tal的微粉和PLGA溶液按一定配比即时混合，加入少量Mg(OH)2微粉，制成均一混悬液，即为Tal注射型植入剂。配比为Tal的微粉18mgPLGA溶液0.10.3mlMg(OH)/微粉0.42.4mg例如，取3mgTal微粉及0.7mgMg(OH)2微粉加入到0.07gPLGA溶液中，经均质乳化机匀化，得Tal粉末的均一混悬液，将其吸入一次性注射器中，静7置排出气泡，即可用于注入皮下。经体外药物释放实验和动物体内药物释放实验，本发明制剂的Tal可缓释至28天，体内28天累积释放97%左右，体外28天累积释放90%左右；细胞毒性实验表明，本发明注射型植入剂的细胞毒性低，生物相容性较好；组织刺激性实验表明，本发明注射型植入剂的组织刺激性较小，安全性良好。药效学评价实验表明，Tal注射型植入剂促进了免疫器官的恢复，有效提高了免疫抑制小鼠的机体免疫力。本发明制剂具有长效、低毒、能有效提高机体免疫力等优点。经皮下注射给药后可持续释放药物l个月，最后高分子材料在体内降解吸收。本发明剂型可大大减小病人的用药次数和病人的经济负担，提高用药质量和病人的顺应性，解决了Tctl临床应用长期未解决的难题，并提供了一种可客观评价注射型植入剂的体外释放实验装置。图1为本发明的Tal/壳聚糖微粉扫描电镜图图2为本发明的Tal/BSA微粉扫描电镜图图3为本发明的Tal注射型植入剂的体内释放曲线图图4为本发明的注射型植入剂的体外释放装置结构示意图图5为本发明的Tal注射型植入剂的体外释放曲线图图6为本发明的Tal注射型植入剂的细胞毒性实验结果图图7为本发明的Tal注射型植入剂的组织刺激性实验结果图具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。仪器和材料Tal粉末，杭州诺泰制药技术有限公司；壳聚糖粉末(分子量为16kDa)，浙江金壳生物化学有限公司；BSA粉末(生物级)，上海博光生物科技有限公司进口分装；PLGA(RG502H,RG503H,RG504H),德国BoehringerIngelheim公司；Biichi190小型喷雾干燥仪，瑞士Biichi公司；PT3100高速均质乳化机，瑞士Polytron公司NMP(药用级)，美国国际特品公司；醋酸甘油酯(分析纯)，北京化学试剂公司；Mg(OH)2微粉(化学纯)，上海试四赫维化工有限公司；环磷酰胺(200mg/瓶)，江苏恒瑞医药股份有限公司；CCK-8细胞活性检测试剂盒，日本同仁化学研究所；聚偏氟乙烯微孔滤膜(0.45^irn)，上海兴亚净化材料厂；动物SD大鼠和Balb/c小鼠均由中国人民解放军第二军医大学动物中心提供。实施例h以壳聚糖为赋形剂制备Tal的微粉称取壳聚糖粉末0.400g,加到10ml2e/。的醋酸(市售分析纯)中，待溶胀完全后加入Tal粉末0.100g，振摇溶解，即得Tal/壳聚糖溶液。用Biichi190小型喷雾干燥仪的喷嘴将Tal/壳聚糖溶液雾化为小液滴，喷液以盛有约200ml液氮的冷冻干燥机外挂瓶收集，再将外挂瓶于-50'C低温冰箱中放置4h以挥尽液氮，然后将外挂瓶放入预冻至-37。C的冷冻干燥机中，冻干48h后收集外挂瓶内Tal/壳聚糖微粉，约0.4g。电镜下观察，所得Tal/壳聚糖微粉较为圆整，粒径多集中在10-30拜之间，微粉表面多孔，呈网状支架结构，如图1所示。实施例2:以BSA为赋形剂制备Tal的微粉称取BSA粉末0.400g及Tal粉末0.100g，加到10ml蒸馏水中，振摇溶解，即得Tal/BSA溶液。用Biichi190小型喷雾干燥仪的喷嘴将Tal/BSA溶液雾化为小液滴，喷液以盛有约200tnl液氮的冷冻干燥机外挂瓶收集，再将外挂瓶于-50t:低温冰箱中放置4h以挥尽液氮，然后将外挂瓶放入预冻至-37x:的冷冻干燥机中，冻干48h后收集外挂瓶内Tal/BSA微粉，约0.4g。电镜下观察，所得Tal/BSA微粉形状不规则，粒径一般在10nm以下，偶有较大的微粒，微粒结构疏松，表面不圆整，孔隙较多，如图2所示。实施例3:制备Tal注射型植入剂将0.07gPLGA(RG504H，即羧基封端的PLGA，粘度0.45-0.60dl/g)加入到0.2mlNMP与醋酸甘油酯的混合溶剂(1:1，v/v)中，振摇使PLGA与有机溶剂充分接触，50T:水浴加热至PLGA完全溶解，冷却至室温，即为PLGA溶液。向溶液中加入实施例1制备的Tal/壳聚糖微粉3mg及研至100目以下的Mg(OH)2微粉0.7mg，用均质乳化机8000rpm匀化2min，即得均一的Tal粉末混悬液，亦即本发明Tal注射型植入剂。将其吸入一次性注射器中，静置排出气泡，即可用于注入皮下。本发明Tal注射型植入剂体内释放实验取雄性SD大鼠(200-220g)24只，随机分为8组，每组3只，将按实施例3制备的本发明Tal注射型植入剂注入大鼠背部皮下，每鼠0,2ml，1-8组依次于注射后l、3、5、7、10、14、21、28天处死大鼠，取出植入剂，剥除植入剂表面的组织，冷冻干燥。冻干后的植入剂以2ml乙腈溶解，涡旋至无团块，15000rpm离心5min，去除上清液，沉淀再加入2ml乙腈洗涤，重复洗涤三次，将沉淀真空干燥，以10ml2。/。的醋酸复溶，涡旋至全溶，15000rpm离心5min，取上清液进高效液相色谱仪检测Tal浓度。根据植入后不同时间的植入剂中所残留的Tal浓度，计算出本发明植入剂的Tal累积释放百分率，实验平行三份，取平均值，制作释放曲线，结果见图3。由图3可见，本发明制剂Tal的首日突释为29%左右，可缓释至28天，28天内累积释放达97%左右。本发明Tal注射型植入剂的体外释放实验本实验采用自制的体外释放装置，其构造为选用聚偏氟乙烯微孔滤膜(0.45Hm)，制成内部为平底的圆筒，其高不小于5mm，直径为8mm，容积为0.2ml左右，将其放入10ml试管，圆筒底部为单层滤膜，多余部分折叠成短柄状，以胶带固定，放入试管后该短柄结构起支撑作用，同时保证圆筒底部液体交换顺畅，本装置结构示意图见图4。本实验分成8组，每组3个装置，分别将按实施例3制备的本发明植入剂0.2ml注入到上述装置的微孔滤膜圆筒中，在该圆筒的外围加入10ml等渗的磷酸盐缓冲液(pH7.4)，l-8组依次在l、3、5、7、10、14、21、28天取出植入剂，冷冻干燥。冻干后的植入剂以2ml乙腈溶解，涡旋至无团块，15000rpm离心5min，去除上清液，沉淀再加入2ml乙腈洗涤，重复三次，将沉淀真空千燥，以10ml2。/。的醋酸复溶，涡旋至全溶，15000rpm离心5min,取上清液进高效液相色谱仪，同上法，根据不同时间的植入剂中所残留的Tal浓度，计算出本发明植入剂的Tal累积释放百分率，实验平行三份，取平均值，制作释放曲线，结果见图5。由图5可见，本发明制剂Tal的首日突释为16。/。左右，可缓释至28天，28天10内累积释放达卯％左右。对体内外累积释放百分率作线性回归，得线性回归相关系数为0.9899，说明本发明Tal注射型植入剂体内外释放相关性良好。实验结果表明本发明所用的体外释放装置可客观评价注射型植入剂的体外释放效果。本发明Tal注射型植入剂的细胞毒性实验本实验分成4组，每组3个体外释放装置，分别将按实施例3制备的本发明植入剂0.2ml注入体外释放装置的微孔滤膜圆筒中，并将该圆筒浸没在IOml等渗的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，l-4组依次在0h，24h，72h，168h分别更换新鲜释放液，更换后lh各取释放液5ml，用无菌的0.22^微孔滤膜过滤后，分别以无菌等渗的PBS稀释至一系列浓度(100%，50%，25%，12.5%)备用。将处于对数生长期的小鼠成纤维细胞NIH3T3接种于96孔细胞板，接种密度为105cells/ml，每孔100pl，培养基为含有10。/。新生牛血清的DMEM高糖培养基。培养板在37i:、5%C02条件下培养24h，吸除原有培养基，加入150pl新鲜培养基。向培养板中加入50pl上述不同浓度的释放介质稀释液，PBS作为对照。24h后，按CCK-8试剂盒的使用说明书向各实验孔中加入10pl细胞活性检测试剂CCK-8，继续培养4h。酶标仪测定各实验孔在450nm的吸光度值，以630nm作为参比波长。各浓度释放液作三复孔，取吸光度平均值，以释放时间为横坐标，吸光度值为纵坐标作图，实验结果见图6。由图6可见，相对于PBS组来说，只有111组中高浓度的释放液(100%，50%)的吸光度值有所减小，但也没有显著性差异(p>0.05)，而其它组未见明显的吸光度值减小，说明细胞活性相差不大。因此可以认为本发明注射型植入剂的细胞毒性低，生物相容性较好。本发明Tal注射型植入剂的组织刺激性实验雄性SD大鼠(200-220g)3只，分别取实施例3制备的本发明植入剂0.2ml，注入SD大鼠背部右侧皮下，背部左侧皮下注射等体积0.9%NaCl作为对照。在ld，7d，14d各处死大鼠一只，取下注射部位周围的皮下组织，放于10%中性福尔马林溶液中固定过夜。按常规将组织以50%100%浓度梯度的乙醇脱水后包埋于石蜡中。苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察组织细胞，结果见图7。图中，A、C、E分别为注射生理盐水l天、7天、14天后的皮下组织切片，B、D、F分别为注射本发明Tal注射型植入剂l天、7天、14天后的皮下组织切片。由ii图7可见，本发明Tal注射型植入剂给药l天后，可见明显的淋巴细胞浸润，7天后淋巴细胞明显减少，到14天时已经基本上降至正常水平，未见组织损伤或坏死。在7天和14天可以观察到巨噬细胞有所增多，表明组织产生了一定的慢性炎症反应，但这也是机体组织对外来损伤产生的正常的免疫反应。因此可认为，植入剂的组织刺激性较小，安全性良好。本发明Tal注射型植入剂的药效学评价实验选取体重为18-20g的雄性Balb/c小鼠32只，随机分为A、B、C、D四组，每组8只。A组为生理盐水对照组，B组为无Tal的注射型植入剂对照组，简称空白注射型植入剂组，C组为Tal水溶液(750ng/ml)对照组，D组为本发明Tal注射型植入剂治疗组。用免疫抑制剂环磷酰胺建立免疫抑制动物模型。在0d，各组Balb/c小鼠先按体重分别腹腔注射免疫抑制剂环磷酰胺溶液(浓度为10mg/ml)50mg/kg，再按常规于小鼠背部皮下分别注射相应溶液，A组注射O.lml0.9%NaCl，B组注射O.lml空白注射型植入剂，C组注射O.lmlTal水溶液(750pg/ml)，D组注射O.lml实施例3制备的Tal注射型植入剂；于7d、14d、21d再按上法分别给各组Balb/c小鼠注射环磷酰胺溶液，同时给A组和C组分别注射O.lml0.9n/cNaCl和Tal水溶液(750pg/ml)。然后，于28d处死全部小鼠，称体重，取出小鼠的胸腺和脾脏并称重，按胸腺重量除以体重或脾脏重量除以体重分别计算出小鼠的胸腺指数和脾脏指数，结果见表l。表l免疫抑制小鼠给药28天后免疫器官指数结果(11=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>ap<0.05与A组相比；b;K0.05与B组相比；e/K0.05与C组相比。由表1可见，与A、B、C三个对照组相比，本发明Tal注射型植入剂显著增加了小鼠的胸腺指数(;O.05);与A组相比，本发明Tal注射型植入剂显著增加了小鼠的脾脏指数(;K0.05)。由于胸腺和脾脏是机体最重要的免疫器官，通常用胸腺指数和脾脏指数的大小直接反映机体免疫水平的高低，因此可以认为本发明Tal注射型植入剂促进了免疫器官的恢复，有效提高了免疫抑制小鼠的机体免疫力。权利要求1.一种Tα1注射型植入剂，其组分包括Tα1、赋形剂、载体材料、有机溶剂、溶剂添加剂和稳定剂，所说赋形剂为BSA或壳聚糖；所说载体材料为生物可降解的PLGA；所说有机溶剂为NMP或DMA；所说溶剂添加剂为醋酸甘油酯，所占比例为有机溶剂总体积的0-60％；所说稳定剂为Mg(OH)2微粉。2.按权利要求1所述的Tal注射型植入剂，其特征在于所说的载体材料为羧基封端的PLGA，粘度0.1-0.8dl/g。3.权利要求1或2所述Tal注射型植入剂的制备方法，步骤如下1)制备Tal的微粉，或为Tal/壳聚糖微粉，或为Tal/BSA微粉，制备Tal/壳聚糖微粉按配比将一定量壳聚糖粉末溶于一定量0.5-2.5%的醋酸中，待壳聚糖溶胀完全后加入一定量Tal粉末，振摇溶解，即得Tal/壳聚糖溶液，它们的配比为壳聚糖粉末300600mg0.5-2.5%的醋酸620mlTal粉末20200mg;将Tal/壳聚糖溶液采用喷雾-冷冻干燥法制备Tal/壳聚糖微粉备用；或者，制备Tal/BSA微粉将一定量BSA粉末和一定量Tal粉末溶于一定量蒸馏水中，振摇溶解，得Tal/BSA溶液，它们的配比为BSA粉末300600mgTal粉末20200mg蒸馏水620ml再将Tal/BSA溶液用喷雾-冷冻干燥法制成Tal微粉分装备用；2)制备PLGA溶液按配比将一定量的PLGA粉末加入有机溶剂NMP或DMA混匀，加或不加醋酸甘油酯，配比为PLGA粉末4080mgNMP或DMA0.050.2ml醋酸甘油酯00.2ml涡旋或加热至PLGA完全溶解，冷却至室温，即成PLGA溶液，分装备用;3)制备Tal注射型植入剂临注射时，将上述制备的Tal的微粉和PLGA溶液按一定配比即时混合，加入少量Mg(OH)2微粉，制成均一混悬液，即为Tal注射型植入剂，配比为Tal的微粉18mgPLGA溶液0.10.3mlMg(OH)2微粉0.42.4mg。4.按权利要求3所述的Tal注射型植入剂的制备方法，其特征在于制备Tal/壳聚糖微粉时，配比为-壳聚糖粉末400mg`2%的醋酸10mlTal粉末lOOmg;或者，制备Tal/BSA微粉时，配比为BSA粉末400mgTal粉末100mg蒸馏水10ml。5.按权利要求3或4所述的Tal注射型植入剂的制备方法，其特征在于制备PLGA溶液时，配比为PLGA粉末70mgNMP0.1ml醋酸甘油酯0.1ml。6.按权利要求3或4所述的Tal注射型植入剂的制备方法，其特征在于制备Tal注射型植入剂时，配比为Tal的微粉3mgPLGA溶液0.2mlMg(OH)2微粉0.7mg。7.按权利要求5所述的Tal注射型植入剂的制备方法，其特征在于制备Tal注射型植入剂时，配比为Tal的微粉3mgPLGA溶液0.2mlMg(OH)2微粉0.7mg。8.权利要求1或2所述Tal注射型植入剂在制备治疗免疫低下型疾病药物中的应用。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，是胸腺素α1的一种新剂型一生物降解性注射型皮下植入剂。其组分包括Tα1、赋形剂BSA或壳聚糖、载体材料PLGA、有机溶剂N-甲基吡咯烷酮或二甲基乙酰胺和溶剂添加剂醋酸甘油酯。先分别制备Tα1的微粉和PLGA溶液备用，再在临用前将它们混匀，进行皮下注射。本发明制剂具有长效、低毒、能有效提高机体免疫力等优点。体内外药物释放实验表明Tα1可缓释至28天，累积释放90％以上。细胞毒性实验和组织刺激性实验表明，本发明注射型植入剂细胞毒性低，生物相容性较好；组织刺激性小，安全性良好，药效学实验表明能有效提高机体的免疫力。本发明自制的体外释放装置可用于注射型植入剂的体外释放实验。文档编号A61P37/00GK101669905SQ200910195349公开日2010年3月17日申请日期2009年9月8日优先权日2009年9月8日发明者媛俞,刘青锋,周闰臣,孙治国,宣吉明,翮张,张国庆,豪邹,威钟,钟延强,琰陈,马金华,静高,莹鲁申请人:中国人民解放军第二军医大学