专利名称：：紫草酸酯类化合物在制备治疗疟疾药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药物，具体涉及一种紫草酸酯类化合物在制药中的应用，尤其涉及紫草酸酯类化合物在制备治疗由疟原虫引起的疟疾药物中的应用。
背景技术：
：疟疾是地球上发生最频繁的寄生虫病，是由按蚊进行传播、具有潜在致命危险的疾病。每年全球有5亿左右的疟疾病例，导致超过100万人死亡，绝大部分发生在非洲。世界卫生组织指出疟疾平均每30秒杀死一个5岁以下的儿童。疟疾由疟原虫引起。带有疟原虫的雌按蚊叮咬人体后，将疟原虫注入人体，经1020天会发生典型的疟疾临床症状，可分为四期发冷期、发热期、出汗期和间歇期。疟疾的反复发作后，病人会出现贫血、肝脾肿大，甚至出现脑型、超高热型、厥冷型和胃肠型等凶险症状，甚至危及生命。随着已有抗疟药物的耐药性的不断增加，疟疾的发病率日益增加，亟待具有新型治疗作用的抗疟药物的发现。红细胞内期的疟原虫在其酸性食物泡内水解宿主的血红蛋白以获得自身生命所需的能量和氨基酸。生物学研究表明，在疟原虫的食物泡内包涵一系列的水解酶，如天冬氨酸蛋白酶(plasm印sins)，半胱氨酸蛋白酶(falcipains)，和金属蛋白酶(falcilysins)。这些酶已成为疟疾化学治疗的潜在靶标。半胱氨酸蛋白酶是MT约为21000-30000的蛋白质，在pH4_6.5时具有最高水解活性，它的活性部位具有半胱氨酸残基。疟原虫的半胱氨酸蛋白酶属于木瓜蛋白酶家族。已知的疟原虫半胱氨酸蛋白酶有四个亚型，falcipain-l(疟原虫半胱氨酸蛋白酶-l)，falcipain-2A(疟原虫半胱氨酸蛋白酶-2A)，falcipain-2B(疟原虫半胱氨酸蛋白酶-2B)，falcipain-3(疟原虫半胱氨酸蛋白酶-3)。Falcipain1是第一个表达得到的疟原虫半胱氨酸蛋白酶，其生物学研究表明，它对疟原虫的无性生殖阶段并无影响，但能显著的影响卵囊的功能。Falcipain-2A，falcipain-2B具有97%的同源性，仅在氨基酸序列的7位有所不同。通过寡核苷酸探针的监测发现，falcipain-2BmRNA的表达水平比falcipain-2A低。然而falcipain-2A和falcipain-2B在症原虫营养体晚期其表达的时间依赖性和峰值极为相似，这表明两种不同的亚型具有相似的生物学功能。Falcipain-3与falcipain-2在催化域有66.6%的同源性，但是它们表达的阶段有所不同。Falcipain-2在营养体阶段表达达到最高峰，而falcipain-3在更为成熟的疟原虫阶段表达达到高峰。在这几种亚型中，对于falcipain-2的研究最多，因此其抑制剂的开发亦受到更为广泛的关注。中医中药治疗疟疾已经有很长的历史，比如在《素问*剌虐论》中就提出了用针灸预防治疗疟疾，在中草药方面，除了闻名世界的青蒿外，威灵仙、水蜈蚣、鸦胆子、常山、鹅不食草、槟榔、翻白草、石龙芮等也在民间用来治疗疟疾。从中药青蒿中发现的活性化合物青蒿素用于治疗疟疾取得了很好的效果，广泛用于临床。中药在治病强身方面有着神奇的疗效已经被世界所承认，因此从中药中寻找具有抗虐活性的化合物意义重大。本发明人通过多年的基础研究积累了2000多种，并建立了天然产物库，通过对库中化合物进行筛选，发现了具有抗虐作用的紫草酸酯类化合物。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于研究设计紫草酸酯类化合物在制备治疗疟疾药物中的应用。本发明提供了一种紫草酸酯类化合物，具有下述结构通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式中Ri为甲基或正丁基；I^为氢或甲基。紫草酸酯类化合物分布在许多种植物中，可以从植物中分离得到，也可以用化学合成的方式获得。所述的紫草酸酯类化合物为紫草酸二甲酯、紫草酸丁酯。本发明另一个目的是提供了紫草酸酯类化合物在制备治疗疟疾药物中的应用。本发明化合物紫草酸丁酯与Falcipain-2蛋白酶结合活性测定，结果显示紫草酸丁酯与FP-2蛋白有明显的结合；紫草酸酯类化合物对falcipain-2有较高的抑制率；紫草酸酯类化合物体外抗疟活性测定，结果显示紫草酸丁酯和紫草酸二甲酯均有较好的体外抗疟原虫活性。因此，紫草酸酯类化合物可用于制备治疗疟疾的药物。本发明又一个目的是提供以紫草酸酯类化合物为活性成分，用于制备治疗疟疾的药物组合物。尤其是制备由疟原虫引起的疟疾的药物组合物。本发明所述药物组合物含有治疗有效量的紫草酸酯类化合物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。其中活性成分在药物组合物中的重量含量为5-95%。所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形剂如水灯；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如明胶、聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如碳酸钙、碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、聚乙二醇等、另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其职称常规的固体制剂如片剂、颗粒剂、胶囊等或制成液体制剂如水或油悬浮剂、糖浆等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水货油性悬浮剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。具体实施例方式实施例1:紫草酸二甲酯和紫草酸丁酯的制备松叶青兰10kg粉碎成粗粉后，用80%乙醇回流提取3次，将提取液减压回收得到的浸膏溶于水中，先用乙酸乙酯萃取，回收得乙酸乙酯部分(200g)，水液部分再用正丁醇萃取，回收得正丁醇部分(700g)。正丁醇部分经过硅胶柱色谱，以氯仿-丙酮i:o-i:i梯度洗脱，分为5个大的流分。其中第4流分浓縮干燥后21.3g经甲醇溶解后经过反相硅胶色谱，以甲醇_水梯度洗脱，分为6个流分。其中第2流分经过S印hadexLH-20葡聚糖色谱，以氯仿甲醇i:l洗脱，经硅胶薄层色谱检测，共有3个组分，其中组分i浓縮干燥后为黄色粉末，称重为510mg，结构鉴定为紫草酸丁酯，组分2浓縮干燥后为淡黄色粉末，称重为625mg，结构鉴定为紫草酸二甲酯。紫草酸丁酯的结构如下(本法制得的紫草酸丁酯和紫草酸二甲酯用于下列实施例2-5)紫草酸二甲酯的结构如下实施例2:本发明化合物紫草酸丁酯与Falcipain-2蛋白酶结合活性测定Falcipain-2蛋白酶与紫草酸丁酯结合活性的筛选和动力学常数的测定基于SPR(表面等离子共振)原理，使用的仪器是Biacore3000(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)。(1)Falcipain-2质粒(pQE30-Fa12)的构建根据Falcipain-2cDNA序列设计引物，正向和反向引物分另U为5，CGTGGATCCCAAATGAATTATGAAG3，和5，ATATGTCGACTTATTCAATTAATGGAATG3，，包含BamHI和SalI酶切位点，通过PCR扩增Falcipain-2片段，将酶切后的PCR产物和表达载体pQE30连接后鉴定正确，转化入大肠杆菌M15进行表达。(2)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表达与纯化将构建好的质粒pQE30-Fa12转入大肠杆菌M15中得到表达工程菌，将工程菌培养于含100iig/mL氨苄青霉素和50iig/mL卡那霉素的10mLLB培养基中培养过夜(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)。然后按1:100转接入1L含氨苄青霉素和卡那霉素的新鲜LB培养基中，37t:下，220转/分培养。当0D600达到约0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mM，同时将温度降到25t:培养12小时进行蛋白的诱导表达。4000转/分离心30分钟收集菌体，收集好后放于-8(TC超低温冰箱保存过夜。将菌体用20mL的缓冲液1(20mMTris-Cl，O.5MNaCl，and10mM咪唑，pH8.0)悬起，将悬浮液冰浴上超声波破碎(300W，工作30分钟，一次5秒，中间间隔10秒)。破碎后得到的细胞匀浆在4°C，以10000转/分离心30分钟，弃上清，用20mL的buffer2(6M胍HC120mMTris_Cl250mMNaCl20mM咪唑，pH8.0)溶解沉淀，室温下温和搅拌1小时，10000转/分离心30min，并将上清上样到用绑定缓冲液(Bindingbuffer)2(6MguanidineHCl，20mMTris-Cl，250mMNaCl，pH8.0)平衡好的N产-NTA柱上，先后用冲洗缓冲液l(8M尿素，20mMTris-Cl，500mMNaClpH8.0)和冲洗缓冲液2(8M尿素，20mMTris-Cl，30mM咪唑)各30ml洗去非特异性结合的杂蛋白，再用洗脱缓冲液(8M尿素，20MmTris-Cl，IM咪唑)10ml洗去目的蛋白，用SDS-PAGE检测蛋白的分子量和纯度。(3)FP-2包涵体蛋白的复性将纯化得到的蛋白加入10mMDTT，37。C下温浴45分钟后，将蛋白溶液稀释到10g/ml进行透析(透析液100mMTris-Cl，lmMEDTA，20%甘油，250mML-精氨酸，lmM谷胱甘肽，lmM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，pH8.0)过夜。将透析好的蛋白浓縮即可用作酶抑制活性的测定。(4)FP-2蛋白的偶联彻底清洗Biacore3000机器后，用PBS缓冲液(10mM4-羟基哌嗪乙磺酸，150mMNaCl，3mMEDTAand0.005%(v/v)表面活性剂P20，pH7.4)平衡机器至基线平稳。0.2MN-乙基-N'-二甲基氨丙基碳二亚胺和50rnMMN_羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)1:1混和，以5iiL/min进样7分钟以活化芯片表面。FP-2蛋白用10mM乙酸钠，pH4.2，稀释至终浓度为69iig/ml，以5iiL/min流速进样。最后，用1M盐酸乙醇胺，pH8.5以5yL/min流速进样7分钟，封闭芯片表面，最终FP-2蛋白的偶联量为9300RU左右。[OO37](5)化合物筛选底物Z-Phe-Arg-pNAHC1(BachemAG)作为阳性对照。紫草酸丁酯用100%DMSO溶解，母液浓度为10mM。用HBS-EP缓冲液稀释化合物，至终浓度为1yM禾P10yM，匿SO的终浓度为O.1%。根据紫草酸丁酯与芯片上FP-2蛋白的结合的RU(ResponseUnit，共振单位)值，判断化合物是否具有结合活性。有结合活性的化合物可进行详细的动力学实验。结果证明紫草酸丁酯与FP-2蛋白有明显的结合。[OO39](6)动力学测定紫草酸丁酯用工作缓冲液HBS-EP(含0.1%DMSO)，分别配成不同的浓度梯度，以30l/min进样lmin，解离2min，然后用相同缓冲液稳定2min。得到紫草酸丁酯与FP_2蛋白相互作用的传感图，再用Biacore分析软件中的1:1(Langmuir)结合模型或稳态模型进行拟合，得到确切的动力学和热力学常数。(7)试验结果表1阳性对照和紫草酸丁酯与FP-2蛋白结合常数的测试结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3本发明化合物对falcipain-2蛋白酶百分抑制活性的测定(1)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表达与纯化和FP_2包涵体蛋白的复性参见实施例2(2)本发明化合物对FP-2酶抑制活性的测定在197iiL的lOOmMNaOAc，10mMDTT，pH5.5的缓冲液体系中加入FP-2蛋白(终浓度10g/ml)和溶于匿SO的待测化合物溶液，终浓度10M和OM(阴性对照)，室温下孵育30min后用MDSpectraMaxM5酶标仪于激发波长(excitation)355nm;发射波长(emission)460nm处连续测15min内的RFU值，计算出反应速率Km，以下列公式得出待测化合物在IOM下百分抑制率，计算公式为(对照组Km值-实验组Km值)/对照组Km值X100%(3)化合物活性测试结果表2.紫草酸酯类化合物对falcipain-2抑制率数据.<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例4本发明化合物对falcipain-2蛋白酶半数有效抑制浓度(IC5。)的测定选取10M抑制率在50%以上的化合物测IC5。，实验方法和体系如实施例3。根据化合物在不同浓度下FP-2酶活的反应速率Km，计算化合物在不同浓度下对FP-2酶活的抑制率，使用Sigmoidal公式用origin软件进行拟合得到化合物的1(:5。值，结果见表3。表3.紫草酸酯类化合物对falcipain-2酶活抑制IC5。序号编号IC5。(M)_1紫草酸丁酯3.182紫草酸二甲酯3.77实施例5紫草酸酯类化合物体外抗疟活性测定抗症活性可以通过测量症原虫LDH活性来确定(Jain，M.;Khan，S.I.;Tekwani，B丄；Jacob，M.R.;Singh，S.;Singh，P.P.;Jain，R.Synthesis,antimalarial,antileishmanial，andantimicrobialactivitiesofsome8_quinolinamineanalogues.Bioorg.Med.Chem.2005，13，4458-4466.).。在含10iiL连续稀释测试样本的96孔板的每个孔中加入感染了D6orW2株P.falciparum疟原虫半胱氨酸蛋白酶的红细胞混悬液(200iiL，在RPMI1640培养集中加入10%人血清和601g/mL阿米卡星，使疟原虫血症达到2%，红细胞压积达到2%)，然后用90%N2，5%02，and5%C02组成的混合气体冲洗板，在培育房内培育72小时，温度保持在37°C。LDH活性用MalstatTM试剂(FlowInc.，Portland,OR)测定，测定程序参照Makler和Hinrichs的程序(M.T.MaklerandD.J.Hinrichs，MeasurementofthelactatedehydrogenaseactivityofPlasmodi咖falciparumasanassessmentofparasitemia.J.Am.J.Trop.Med.Hyg.1993，48(2):205-210)。简要说来，就是将20iiL培育的混合物同100yLheMaistat试剂混合，在室温下培育30分钟.然后加入20微升NBT/PES的混合物(NBT/PES比例为1:1)(Sigma，St.Louis，MO)，在黑暗条件下培育1小时。之后，加入100iiL5%醋酸溶液终止这一反应，并用650nm来检测板.药物对照组中加入青蒿素和氯喹。从剂量-效应曲线中计算出IC5。。测定化合物抗疟活性的选择性指标时，也要测定他们在体外对哺乳动物细胞的毒性.测试在96孔组织培养板中进行(J.Mustafa,S.I.Khan，G.Ma，L.A.Walkerandl.A.Khan，SynthesisandAnticancerActivitiesofFattyAcidAnalogsofPodophyllotoxin.Lipids.2004,39(2):167-172.)。在96孔板中以25，000个/孔的密度种植非洲绿猴肾异倍体细胞并培育24小时.加入不同浓度的样品，即紫草酸丁酯溶液和紫草酸二甲酯匿SO溶液，浓度依次为528.8ng/ml、1586.4ng/ml、4760g/ml，继续培育48小时。利用NeutralRedassay方法测定存活细胞数，从剂量_效应曲线中计算出IC5。.用阿霉素作为阳性对照药物。紫草酸酯类化合物的对D6和W2的IC5。值如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结果显示，紫草酸丁酯和紫草酸二甲酯均有较好的体外抗疟原虫活性。权利要求一种紫草酸酯类化合物在制备治疗疟疾药物中的应用，其特征在于紫草酸酯类化合物具有以下结构通式式中R1为甲基或正丁基；R2为氢或甲基。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物为治疗由疟原虫引起的疟疾的药物。3.—种治疗疟疾的药物组合物，其特征在于含有如权利要求l中所述的紫草酸酯类化合物活性成分和药学上可以接受的载体。4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述活性成分紫草酸酯类化合物在药物组合物中的重量含量为5-95%。全文摘要本发明提供了一种紫草酸酯类化合物在制备治疗疟疾药物中的应用，该紫草酸酯类化合物具有以下结构通式；式中R1为甲基或正丁基；R2为氢或甲基。并提供了所述紫草酸酯类化合物活性成分和药学上可以接受的载体组成的药物组合物，活性成分在药物组合物中的重量含量为5-95％。本发明化合物紫草酸丁酯与Falcipain-2蛋白酶结合活性测定试验等，结果显示与FP-2蛋白有明显的结合、对falcipain-2有较高的抑制率。体外抗疟活性测定，结果显示紫草酸丁酯和紫草酸二甲酯均有较好的体外抗疟原虫活性。因此，紫草酸酯类化合物可用于制备治疗疟疾的药物。文档编号A61P33/00GK101693028SQ20091019747公开日2010年4月14日申请日期2009年10月21日优先权日2009年10月21日发明者单磊,张卫东,张寿德,张燕燕,李洪林,李蹊,苏娟,辛伟,陈瞳,黄瑾申请人:华东理工大学;中国人民解放军第二军医大学;