专利名称：：野菊花总黄酮在制备防治心肌肥大、心室重构药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于医药
技术领域：
，具体地说，涉及野菊花总黄酮在制备防治心肌肥大、心室重构药物中的应用。
背景技术：
：慢性充血性心力衰竭(congestiveheartfailure,CHF)是一种严重而常见的临床综合症，是众多心血管疾病发展的终末阶段。随着人民生活水平和生活方式的改变，加之竞争的加剧，社会的老龄化，因此，作为所有心脏疾病终末阶段的心力衰竭，其患病人数还有增加的趋势。心力衰竭，心室重构的研究和防治工作愈发显得重要和紧迫。过去一般认为心肌肥大、心室重构(ventricularremodeling,VR)是心脏适应负荷增加的一种初期代偿性反应。随着对CHF发病机制的深入研究，人们逐渐认识到，VR是影响心力衰竭病程发生、发展和死亡的主要不利因素之一[1—3]。目前，关于心肌肥大、VR的确切机制尚不完全清楚，但越来越多的证据表明，VR是由于血流动力学异常和神经内分泌紊乱相互作用的结果，其中神经内分泌因素较血流动力学因素可能更为重要[2'3]。血管紧张素II(AngII)，醛固酮(ALD)，内皮素(ET)、肿瘤坏死因子(TNF)等神经内分泌细胞因子的长期慢性激活促进心肌损伤和重构；心脏受损或负荷改变引起VR，表现为心肌细胞肥大、间质细胞如成纤维细胞增殖和胶原组织增生，同时心脏大小、形状和功能也发生改变，这些最终导致心功能恶化[4]。临床研究证实由于CHF病程反复迁延难愈，病情错综复杂多变，单独使用强心-扩血管药物已经不能完全改善病人的生活质量和预后，而VR—旦进展到心力衰竭，则很难用药改变已经恶化的心脏结构和功能，因此，加强从中药及复方中发掘具有独立知识产权的抗VR的药物具有重要意义。野菊花为菊科植物野菊ChrysanthemumindicumL.的干燥头状花序，是著名的传统中药，性微寒，味苦、辛，有疏散风热、消肿解毒的功效。药理研究显示具有降压、抗血小板聚集、抗感染、抗氧化和改善心肌缺血的作用[5]。常用于治疗肿瘤、高血压病、高脂血症和各种急慢性感染性疾病，以及对感冒、流行性脑膜炎的预防。有报道野菊花总黄酮具有保护心肌缺血、降压和抗炎的作用；野菊花多糖有抗氧化的作用[6—9]。至今，未见野菊花总黄酮有改善心室重构、心肌肥大作用的报道。如果能揭示野菊花具有抗心室重构的作用，将为临床治疗心室重构提供新的选择。参考文献[l]Katz，Am.HeartFailure,Pathophysiology,MolecularBiology,andClinicalManagement.BaltimoreAD丄ippincottWilliams,2000，173-226.[2]WatsonAM，HoodSG，MayCN.Mechanismsofsympatheticactivationinheartfailure.ClinExpPharmacolPhysiol，2006;33(12):1269—1274.[3]汪道文，赵华月.植物神经系统与心血管疾病的研究进展.心血管病学进展，31995;16(5):257-260。[4]TakanoH，HasegawaH，NagaiT，etal.Implicationofcardiacremodelinginheartfailure-mechanismsandther即euticstrategies.InternMed.2003;42(6):465-469[5]候家玉等.中药药理学.中国中医药出版社，2002年8月第一版.[6]李道中.野菊花提取液的药理及临床应用.药学进展，1999，23(6):344[7]吴钉红.野菊花化学成分及药理研究进展.中药材，2004，27(2):142[8]张骏艳，张磊，金涌，等.野菊花总黄酮抗炎作用及部分机制.安徽医科大学学报，2005，40(5):405[9]李贵荣，野菊花多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用，中国公共卫生，2002,18(3):269
发明内容本发明所要解决的技术问题是野菊花总黄酮在制备防治心肌肥大、心室重构药物中的应用，达到防治慢性充血性心力衰竭等心脏疾病的目的。为了解决上述技术问题，本发明采用以下实验说明1.实验目的观察野菊花总黄酮(TotalflavonoidsofwildChrysanthemum,TFC)对实验性心室重构的影响2.实验材料2.1药品野菊花总黄酮为本实验室自备，见实施例l。盐酸异丙肾上腺素注射液(Isoprenalinehydrochlorideinjection,ISO)，上海禾丰制药有限公司；酒石酸美托洛尔片(MetoprololTartrate)，阿斯利康制药有限公司；卡托普利片(c即topril)，上海衡山药业有限公司；2.2试剂醛固酮(aldosterone,ALD)放免试剂盒购于北京北方生物技术研究所。血管紧张素II(angiotensinII，AngII)放免试齐U盒、月中瘤坏死因子_a(tumornecrosisfactora，TNF-a)放免试剂盒、心钠素(atrialnatriureticp印tides，ANP)放免试剂盒购于北京伟尔普业生物技术有限公司；羟脯氨酸(hydro邓roline，Hyp)试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。免疫组化匪P-2和匪P-9试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；Trizol，Invitrogen公司；RevertAidTMFirstStrandCDNASynthesisKit,Fermentas公司；rTaq酶，宝生物工程(大连)有限公司。2.3实验动物昆明种小鼠，雄性，体重2022g，购于上海西普尔_必凯实验动物有限公司，动物合格证号SCXK(沪)20080017，饲养于上海中医药大学实验动物中心清洁级动物实验室。SD种大鼠，雄性，体重220250g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物合格证号SCXK(沪)20080016，饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室。3.实验方法3.l采用两种不同的心室重构动物模型观察野菊花总黄酮(TFC)抗实验性VR的作用。异丙肾上腺素(ISO)致小鼠心室重构模型雄性小鼠50只随机分为正常对照组，模型组，美托洛尔0.06g.kg—1组和TFC0.5g.kg—\0.25g.kg—1组。除正常对照组外，各组连续7d背部皮下注射IS02mg.kg—、造成心室重构模型。正常组注射相同体积的NS。治疗组在给予ISO后灌胃给药；正常组、模型组灌胃给予相同体积的NS。连续7d后，取心肌组织，测定小鼠心肌肥厚指数和心肌AngII含量。腹主动脉不完全结扎(AAB)法致大鼠心室重构模型取200250g的雄性SD大鼠50只，手术前12h禁食不禁水，戊巴比妥钠按30mg.kg—1腹腔注射麻醉，仰位固定，打开腹腔，钝性分离腹主动脉，用内径为0.7mm的银夹，不完全结扎左右肾动脉之间的腹主动脉，使之外径狭窄至0.7mm，制备压力超负荷性心室重构模型。将造模成功动物随机分为模型组、卡托普利0.04g.kg—1组、TFC0.09g.kg—\0.18g.kg—、0.36g.kg—1组，另以同样步骤分离但不结扎腹主动脉制备假手术组。造模后第3d开始给水给药，连续5w后，测定大鼠血压和心肌肥厚指数，血清TNF-a、心肌AngII、ANP、Hyp的含量。取左室心肌病理切片，经HE染色测量心肌细胞横断面面积(myocardiumcellcrosssection,MCCS);经苦味酸天狼猩红染色测量心肌组织和血管周围I、III型胶原的分布沉积情况；免疫组织化学法(SABC法)测定心肌匪P-2、匪P-9蛋白表达，RT-PCR法测定心肌MMP-2、匪P-9mRNA表达。3.2统计学分析应用SPSS11.5forWindows统计分析软件进行处理，所有数据以3^i5D表示，多组间比较采用ANOVA(analysisofvariance,AN0VA)，组间两两比较用q检验，方差不齐时采用Tamhane检验，P<0.05为差异有显著性。4.实验结果4.1对ISO致小鼠心室重构心肌肥厚指数的影响与正常组比较，模型组心脏肥厚指数显著增加(P<0.05)。与模型组比较，美托洛尔组和TFC0.50g.kg—1组、0.25g.kg—1组心肌肥厚指数显著降低(P<0.05)。结果见表1。表1TFC对ISO致小鼠心室重构心肌肥厚指数的影响(n=10)组别剂量(g.kg")LVWI(mg.g-')薩(mg.g")正常组NS3.05±0.184.10±0.21模型组NS3.51±0.19##4.50±0.17##TFC小组0.253.30土0.165154.32±0.16*TFC大组0.503.30±0.17*4.31±0.16*美托洛尔组0.063.18±0.19"4.12±0.14**注与正常组比较<0.05，#<0.01;与模型组比较*<0.05，，<0.01(下同)4.2对IS0致小鼠心室重构左室心肌AnglI含量的影响与正常组比较，模型组心肌AngII显著升高(P<0.05)。与模型组比较，美托洛尔组和TFC0.50g.kg—1组、0.25g.kg—1组心肌AngII显著降低(P<0.05)。结果见表2。表2TFC对ISO致小鼠心室重构左室心肌AngII含量的影响(±^),n=10)5组别剂量(g.kg—1)_AngII(pg.mgprof1)正常组模型组TFC小组TFC大组美托洛尔组NSNS0.250.500,0658.71±7.3365.73±6.87#55,39±12.20*56.96±11.30*58.05±6.80*4.3对压力超负荷大鼠心肌肥厚指数的影响与假手术组比较，模型组心肌肥厚指数LVWI和HWI显著增加(P<0.01);与模型组比较，卡托普利组和TFC0.18g.kg—^O.36g.kg—1组HWI和LVWI显著降低(P<0.05)。TFC0.09g.kg—1组HWI和LVWI略呈下降趋势，但无明显差异。结果见表3。表3TFC对压力超负荷大鼠心肌肥厚指数的影响(5±5仏n=10)组别剂量(g.kg")LVWI(mg.gyHWKmg.g-1)假手术组模型组TFC小组TFC中组TFC大组卡托普利组NSNS0.090.180.360.042.50±0,213.07±0,50##2.89±0.272.67±0,28*2.70±0.17*2.52±0.17**3.09±0.253.68±0.49##3,51±0.293.27±0.30*3.29±0.18*3.08土0.19"4.4对压力超负荷大鼠血压的影响与假手术组比较，模型组的收縮压(SBP)，舒张压(DBP)，平均动脉压(MAP)均明显升高(P<0.01);与模型组比较，卡托普利组、TFCO.18g.kg—36g.kg—1组SBP、DBP、MAP显著性降低(P<0.05)，TFC0.09g.kg—1组SBP、DBP、MAP略呈下降趋势，但无明显差异。结果见表4。表4TFC对压力超负荷大鼠血压的影响(±5￡),n=8)组别剂量(g.kg")SBP(njmHg)DBP—Hg)MAP(mmHg)假手术组NS118.09±16.17100.57±16.81106.58±16.56模型组NS160.59±20.34##133.44±13.00#*142.78±15.25**TFC小组0.09144.17±25.78121.67±13.64128.94±17.16TFC中组0.18127.57±36.88*109.77±25.80*115.70±29.17*TFC大组0.36124.18±19.20**100.48±19.55**108.38±18.98**卡托普利组0.04123.41±11.84**106.51±9.64**112.15±10.32**4.5对压力超负荷大鼠神经内分泌因子的影响与假手术组比，模型组AngII、ANP、TNF-a含量明显升高(P<0.05);与模型组比较，卡托普利组和TFCO.36g.kg—1组ANP含量显著降低(P<0.05);卡托普利组、TFCO.18g.kg—1和0.36g.kg—1组AngII含量显著降低(P<0.05);所有给药组TNF-a含量均显著降低(P<0.05)。结果见表5。表5TFC对压力超负荷大鼠左室心肌AngII、ANP和血清TNF-a含量的影响(3^±5D,n=10)6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4.6对压力超负荷大鼠左室心肌Hyp含量的影响与假手术组相比，模型组大鼠左室心肌Hyp含量显著升高(P<0.05);与模型组比较，卡托普利组、TFCO.18g.kg—'和0.36g.kg—1组心肌组织Hyp含量显著降低(P<0.05)，结果见表6。表6TFC对压力超负荷大鼠左室心肌Hyp含量的影响(无士SZ),n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4.7对压力超负荷大鼠左室心肌细胞横截面积的影响与假手术组相比，模型组心肌细胞横截面积(单位pixel)明显增高，差异具有显著意义(P<0.01);与模型组相比，各治疗组心肌细胞横截面积均明显降低，差异有显著意义(P<0.05)。结果见图1，表7。表7TFC对压力超负荷大鼠左室心肌细胞横截面积的影响(i±SO,n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4.8对压力超负荷大鼠左室心肌胶原分布的影响在偏振光显微镜下，苦味酸天狼猩红染色使心肌间质I型胶原纤维呈现红色或黄色，排列紧密，具强双折光性，III型胶原纤维呈现绿色、细纤维、具弱双折光性。假手术组较少见红色或黄色I型胶原纤维和绿色III型胶原纤维沉积，模型组可见大量红色或黄色的I型胶原纤维和绿色III型胶原纤维沉积；各给药组心肌I、III型胶原纤维含量较模型组为轻。结果见图2-3。4.9对压力超负荷大鼠左室心肌匪P-2、匪P-9蛋白表达的影响SABC法使心肌细胞胞膜和胞浆匪P-2、匪P-9蛋白呈棕色表达，苏木素复染使细胞核为淡蓝色。假手术组较少见棕色匪P-2、匪P-9蛋白表达，模型组可见较多的棕色匪P-2、匪P-9蛋白表达；各给药组的心肌匪P-2、匪P-9蛋白阳性表达较模型组为轻。见图4-5，表8-9。表8TFC对压力超负荷大鼠左室心肌匪P-2蛋白表达的影响(5±SZ),n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表9.TFC对压力超负荷大鼠左室心肌匪P-9蛋白表达的影响(3^±5仏n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4.10对压力超负荷大鼠左室心肌匪P-2、匪P-9mRNA表达的影响以P-actin为管家基因，RT-PCR法检测目的基因匪P-2和匪P-9的相对表达量。与假手术组相比，模型组心肌匪P-2、匪P-9mRNA的相对表达明显增高，差异具有显著意义(P<0.01);与模型组比较，卡托普利组、TFC0.18g.kg—36g.kg—'组心肌组织匪P-2mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)，所有给药组匪P-9mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。见图6_7表10。表10TFC对压力超负荷大鼠左室心肌匪-2、匪P-9mRNA表达的影响(5n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>5结论野菊花总黄酮(TFC)具有防治多种原因引起的实验性心室重构的作用，其作用机制可能是一通过降低血压以减轻心脏的负荷，从而避免因超负荷而损伤心肌；二通过影响AngII、TNF-a、ANP等神经内分泌因子的表达，从而抑制过度激活的交感神经系统和肾素_血管紧张素_醛固酮系统；三调节匪P-2、匪P-9等心肌肥厚、纤维化相关蛋白、mRNA的异常表达。以上几方面共同作用，降低心肌肥厚指数、抑制心肌细胞肥大，减少左室心肌羟脯氨酸(Hyp)的含量及心肌细胞间质I、III型胶原的沉积，防止心肌肥大、心室重构。图1大鼠左室心肌细胞图，光镜下，400倍拍摄。图2大鼠左室心肌横截面，苦味酸天狼猩红染色，偏振光下，400倍拍摄图3大鼠左室心肌横截面，苦味酸天狼猩红染色，偏振光下，400倍拍摄图4大鼠左室心肌横截面，免疫组化检测匪P-2的结果，光镜下，400倍拍摄。图5大鼠左室心肌横截面，免疫组化检测匪P-9的结果，光镜下，400倍拍摄。图6电泳图左右两边孔道为maker(DL2000)，P-actin大小为116bp;匪P-2为340bp。图7电泳图左右两边孔道为maker(DL2000)，P-actin大小为116bp;匪P-9为420bp。图1-5中A为假手术组；B为模型组；C为卡托普利组；D为TFC0.09g.kg—1组；E为TFC0.18g.kg—1组;F为TFCO.36g.kg—1组。图6-7中1-5为假手术组；6-10为模型组；11-15为卡托普利组；16-20为TFCO.36g.kg—1组；21-25为TFC0.18g.kg—1组；26-30为TFC0.09g.kg—1组。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。实施例1(野菊花总黄酮的制备)野菊花用70%的乙醇(1:10比例)，8(TC回流2h，滤液浓縮后用石油醚萃取5_7次后浓縮合并水层得浸膏，用蒸馏水溶解浸膏后上样D101大孔树脂柱，蒸馏水洗净杂质后用70%乙醇洗脱，收集洗脱液后挥发浓縮干燥即得样品野菊花总黄酮。此法提取获得总黄酮纯度为50-80%之间。9权利要求野菊花总黄酮在制备防治心肌肥大、心室重构药物中的应用。2.野菊花总黄酮在制备降低小鼠心肌肥厚指数和心肌AngII含量药物中的应用。3.野菊花总黄酮在制备降低压力超负荷大鼠心肌肥厚指数药物中的应用。4.野菊花总黄酮在制备降低压力超负荷大鼠血压药物中的应用。5.野菊花总黄酮在制备降低压力超负荷大鼠神经内分泌因子药物中的应用。6.野菊花总黄酮在制备降低压力超负荷大鼠心肌Hyp含量药物中的应用。7.野菊花总黄酮在制备降低压力超负荷大鼠左室心肌细胞横截面积药物中的应用。8.野菊花总黄酮在制备减少压力超负荷大鼠左室心肌胶原沉积药物中的应用。9.野菊花总黄酮在制备降低压力超负荷大鼠左室心肌匪P-2、匪P-9蛋白表达药物中的应用。10.野菊花总黄酮在制备降低压力超负荷大鼠左室心肌匪P-2、匪P-9mRNA表达药物中的应用。全文摘要本发明属于医药
技术领域：
，具体地说，涉及野菊花总黄酮在制备防治心肌肥大、心室重构药物中的应用。野菊花总黄酮能够降低小鼠心肌肥厚指数和心肌AngII含量。野菊花总黄酮能够降低压力超负荷大鼠心肌肥厚指数、血压、神经内分泌因子、心肌Hyp含量、缩小压力超负荷大鼠左室心肌细胞横截面积、减少心肌胶原沉积、调节心肌MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的异常表达。文档编号A61P9/12GK101721447SQ200910198410公开日2010年6月9日申请日期2009年11月6日优先权日2009年11月6日发明者吴琦,陈长勋,顾伟梁申请人:上海中医药大学