专利名称：一种多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及药物递送系统，具体涉及一种新型多肽修饰的肝肿 瘤靶向纳米给药系统及其制备方法。
背景技术：
对抗肿瘤药物递送的研究是近年来引人注目的热点，抗肿瘤药物不同于普通小分 子药物，其毒副作用大，由于缺乏靶向性，常对机体正常器官造成非常大的损害。构建肿瘤 靶向给药系统，有效专一地将抗肿瘤药物运输到肿瘤部位，发挥抗肿瘤药物的疗效，同时减 少全身毒副作用，降低由此引起的经济损失，是目前肿瘤治疗的瓶颈。肝肿瘤是我国位居第二的癌症，发病率比西方国家高2-3倍，其恶性度高、病情发 展快以及生存期短的特点，使得肝肿瘤的治疗迫在眉睫。肝肿瘤靶向给药系统的构建主要 有两种策略被动靶向和主动靶向，目的都是靶向输送抗肿瘤药物到肿瘤组织。被动靶向主 要是基于肿瘤组织部位血管特有的Era效应，而主动靶向则是利用特定的头基修饰给药系 统，特异性结合肿瘤细胞表面过度表达的受体以达到靶向输送的作用。研究显示，肝肿瘤细胞表面过度表达一系列受体，其中转铁蛋白受体被用作靶点 已有较长的研究历史。但是，内源性转铁蛋白浓度很高，约为25 μ M，可与以转铁蛋白作为靶 向头基的给药系统竞争肿瘤细胞表面的转铁蛋白受体，从而影响肿瘤靶向效率。近期研究 公开了使用噬菌体展示技术筛选出一种新型多肽——Τ7肽，其序列为HAIYPRH，对转铁蛋白 受体的亲和力和转铁蛋白相当；Τ7肽与转铁蛋白受体的结合位点与转铁蛋白不同，不会与 转铁蛋白竞争抑制且不影响转铁蛋白本身的生理功能，相反转铁蛋白与转铁蛋白受体的结 合会促进Τ7肽的入胞效率；此外，Τ7为小分子多肽，可化学合成，稳定性好，作为靶向头基 空间位阻小，临床应用前景好。阳离子高分子材料如聚酰胺-胺树状分枝物(polyamidoamine，简称PAMAM)和聚 赖氨酸(dendri-graft polylysines，简称DGL)是近年来出现的一类新型纳米级的合成高 分子，高度分枝，呈单分散性，其末端氨基丰富，强正电性，并易于经过适当的修饰连接抗体 等生物活性物质以增加载体的靶向性，同时内部具有大量的疏水性空腔，具有包载疏水性 抗肿瘤药物的潜力，有望成为良好的药物载体。
发明内容
本发明的目的是针对现有肝肿瘤靶向给药系统存在的不足，提供一种新型多肽修 饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统。本发明使用新型多肽为靶向头基，阳离子高分子材料为基础高分子载体，包载抗 肿瘤药物，制成肝肿瘤靶向纳米给药系统。本发明选用通过噬菌体展示技术筛选出的新型多肽修饰高分子材料，以内吞方式 进入细胞，提高肿瘤细胞对药物的摄取，并且安全。本发明具有转铁蛋白作为靶向头基的优点，并且有效避免内源性转铁蛋白的干扰，靶向和治疗效率高、制备简捷，并且可以应用于其它肿瘤组织的靶向治疗。本发明的目的通过以下技术方案实现本发明的肝肿瘤靶向纳米给药系统由新型多肽修饰树枝状高分子材料后再包载 抗肿瘤药物制备而成，本发明以高分子材料、聚乙二醇、多肽和抗肿瘤药物为组分，所述组 分配比为高分子材料与聚乙二醇的摩尔比是1 2 1 40，高分子材料与多肽的摩尔 比是1 1 1 5，高分子材料与抗肿瘤药物的摩尔比是1 3 1 40。所述高分子材料选自下列高分子聚酰胺-胺型树状分枝物和聚赖氨酸。所述聚乙二醇选自下列高分子马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺 (MAL-PEG3500-NHS)。所述多肽选自噬菌体展示技术筛选出的新型多肽T7肽，序列为HAIYPRH。所述抗肿瘤药物选自临床上一线和二线药物，包括盐酸阿霉素(DOX)和紫杉醇 (PTX)，柔红霉素。本发明靶向纳米给药系统适用于靶向人体来源和动物来源的肝肿瘤细胞及其它 肿瘤细胞。本发明按下述方法制备肝肿瘤靶向纳米给药系统将高分子材料溶于适量适当的溶剂中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干，称 取适量的聚乙二醇溶解到ρΗ值7. 8 8. 2的磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度的溶液，加入 到上述容器中，与高分子材料摩尔比为1 2 1 40，一定温度下搅拌反应数小时即可， 再将多肽溶于适量磷酸盐缓冲液里，配制成适当浓度的多肽溶液，加入到高分子-聚乙二 醇溶液中，与高分子材料摩尔比为1 1 1 5，一定温度下反应Mh，制得肝肿瘤靶向纳 米载体，转移到MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7 肽，再与抗肿瘤药物以摩尔比1 3 1 40搅拌反应12h，转移到MWCO 3000超滤离心管 中以12000rpm超滤30min去除未包封的药物，即得肝肿瘤靶向纳米给药系统。本发明具备下述突出优点及特征利用可特异性结合肝肿瘤细胞表面转铁蛋白受体的新型多肽T7肽修饰阳离子高 分子材料，包载抗肿瘤药物后制成肝肿瘤靶向纳米给药系统，将多肽的特性赋予纳米给药 系统，使纳米给药系统的分布具有了更高的肝肿瘤靶向特征和细胞摄取特征，提高对肝肿 瘤细胞的摄取效率和肝肿瘤的治疗效率；另外，选用聚酰胺-胺树状分枝物和聚赖氨酸等高分子为载体材料，与多肽共价 连接，采用物理法制备多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统；本发明制备方法简单，不需要特殊的处理，可直接用于细胞和动物试验。本发明的 肝肿瘤靶向纳米给药系统由于系统中多肽修饰的作用，改进了纳米粒进入细胞的途径。多 肽的修饰使肝肿瘤靶向纳米给药系统具有了高效的入胞能力，肝肿瘤靶向纳米给药系统可 在相对较短的时间内得到较高的肝肿瘤细胞摄取效率，并且较有效避免了其他正常细胞的 摄取，提高了纳米给药系统对肝肿瘤的治疗效率。
图1是氢核磁共振表征肝肿瘤靶向纳米载体PAMAM-PEG-T7。图2是两种ρΗ条件下抗肿瘤药物DOX的释放情况。
图3是小角度散射法考察两种PH条件下载体的表面结构特性。图4是原子力显微镜观测纳米给药系统的外观形态及粒径。图5是动态光散射法测定纳米给药系统的粒径分布。图6是采用单纯PAMAM-PEG-T7/D0X纳米粒和游离DOX分别孵育人肝肿瘤细胞，并 设立血浆转铁蛋白对照组，用OLYMPUS IX 71显微镜观察摄取结果并拍照，其中，A是空白对照，B是游离D0X，C是PAMAM-PEG-T7/D0X纳米粒无转铁蛋白，D 是PAMAM-PEG-T7/D0X纳米粒转铁蛋白浓度25 μ Μ。图7是采用单纯PAMAM-PEG-T7/D0X纳米粒和游离DOX分别4 孵育人肝肿瘤细 胞，并设立血浆转铁蛋白对照组，MTT法测定各组对人肝肿瘤细胞的毒性。图8是采用单纯PAMAM-PEG-T7/D0X纳米粒、PAMAM-PEG/D0X纳米粒、游离DOX尾 静脉注射人肝肿瘤细胞皮下移植裸鼠模型，活体成像法测定各组的体内的分布。图9是采用单纯PAMAM-PEG-T7/D0X纳米粒、PAMAM-PEG/D0X纳米粒、游离DOX尾 静脉注射人肝肿瘤细胞皮下移植裸鼠模型，高效液相法测定4h后各组织分布。
具体实施例方式实施例1.将聚酰胺-胺(pamam)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺(mal-PEG3500-NHS)溶于适量的 0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲液中配制成lmg/ml工作液。取242 μ 1 mal-PEG3500-NHS工作 液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEg2)复合物 溶液，再将Τ7肽溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲液，配制成lmg/ml的多肽溶液，取34. 6 μ 1加 入到ΡΑΜΑΜ-ΡΕ&复合物溶液中，于室温搅拌反应Mh，生成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽 (Pamam-PEG2-TT1)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和 T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。实施例2.将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将MAL-PEG3500-NHS溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲液中配制成Img/ ml工作液。取607 μ 1 MAL-PEG3500-NHS工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成 聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG5)复合物溶液，再将Τ7肽溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲 液，配制成lmg/ml的多肽溶液，取34. 6 μ 1加入到ΡΑΜΑΜ-ΡΕ&复合物溶液中，于室温搅拌 反应Mh，生成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG5-TT1)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。实施例3.将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西林 瓶中吹干，将MAL-PEG3500-NHS溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲液中配制成lmg/ml 工作液。取1. 214ml MAL-PEG3500-NHS工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚 酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7肽溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲 液，配制成lmg/ml的多肽溶液，取34. 6 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌 反应Mh，生成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEGici-TT1)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。实施例4.将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，2. 428ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGJ复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取34. 6 μ 1加入到PAMAM-PEG2ci复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(Pamam-PEG2ci-TT1)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。实施例5.将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，4. 856ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG4ci)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取34. 6 μ 1加入到PAMAM-PEG4ci复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(Pamam-PEG4ci-TT1)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。实施例6.将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。实施例7.将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。取Img产 物500 μ 1重水溶解于核磁管中考察聚乙二醇及多肽修饰的比例。实施例8.将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液，配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙 酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生 理盐水溶液0. 8ml，室温搅拌反应12h，MWC0 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统。实施例9.将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙 酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生 理盐水溶液0. ^il，室温搅拌反应12h，MWC0 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统。实施例10将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙酸 盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生理 盐水溶液0. 2細1，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统。实施例11将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙酸 盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生理 盐水溶液0. 12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统。7
实施例12将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙酸 盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生理 盐水溶液0. 06ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统。实施例13 将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙酸 盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生理 盐水溶液0. 12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统，加入到MWCO 1000透析袋中，于pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液和PH 5. 5乙酸盐缓冲溶液中测量阿霉素的释放。实施例14将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙 酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，SAXS小角度散射法测定pH 7. 4条件下随角度不同粒子的散射强度情况。实施例15将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应824h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1Q-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以 12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH4. 5乙酸盐 缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至5. 5，SAXS小角度散射法测定pH 5.5 条件下随角度不同粒子的散射强度情况。实施例16将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙酸 盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生理 盐水溶液0. 12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统，取适量于云母片上自然晾干，原子力显 微镜观测。实施例17将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙酸 盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生理 盐水溶液0. 12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统，取适量于PSS 380粒径管中，利用光散 射法表征纳米粒的粒径。实施例18将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙酸 盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生理 盐水溶液0. 12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统。另外，采用单纯PAMAM-PEG-T7/D0X纳米粒和游离DOX分别孵育人肝肿瘤细胞，并设立血浆转铁蛋白对照组，用OLYMPUS IX 71显 微镜观察摄取结果并拍照。实施例19将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙酸 盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生理 盐水溶液0. 12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统。另外，采用单纯PAMAM-PEG-T7/D0X纳 米粒和游离DOX分别48h孵育人肝肿瘤细胞，并设立血浆转铁蛋白对照组，MTT法测定各组 对人肝肿瘤细胞的毒性。实施例20将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙酸 盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生理 盐水溶液0. 12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统。另外，采用单纯PAMAM-PEG-T7/D0X纳 米粒、PAMAM-PEG/D0X纳米粒、游离DOX尾静脉注射人肝肿瘤细胞皮下移植裸鼠模型，活体 成像法测定各组的体内的分布。实施例21将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1Q-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以 12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙酸盐 缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生理盐 水溶液0. 12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未 包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统，另外，采用单纯PAMAM-PEG-T7/D0X纳米粒、10PAMAM-PEG/D0X纳米粒、游离DOX尾静脉注射人肝肿瘤细胞皮下移植裸鼠模型，活体成像法 测定各组的体内的分布。实施例22将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77. 35mg/ml的溶液，取Img于西 林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0. 035M pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液中配制成 lmg/ml工作溶液，1. 214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应池制成聚酰 胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7. 0磷酸盐缓冲溶液， 配制成lmg/ml的多肽溶液，取173 μ 1加入到PAMAM-PEGici复合物溶液中，于室温搅拌反应 24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG1C1-T75)，MWCO 5000超滤离心管中 以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4. 5乙酸 盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，IN氢氧化钠调节pH至7. 4，加入lmg/ml盐酸阿霉素生理 盐水溶液0. 12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去 除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药系统。另外，采用单纯PAMAM-PEG-T7/D0X纳 米粒、PAMAM-PEG/D0X纳米粒、游离DOX尾静脉注射人肝肿瘤细胞皮下移植裸鼠模型，高效 液相法测定4h后各组织分布。
权利要求
1.一种多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统，其特征在于由高分子材料、聚乙二醇、多 肽和抗肿瘤药物组成，其中，所述多肽修饰高分子材料形成纳米粒，所述高分子材料与聚乙 二醇的分子比为1 2 1 40;所述的高分子材料与多肽的分子比为1 1 1 5;所 述的高分子材料与抗肿瘤药物的分子比为1 3 1 40。
2.按权利要求1所述的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统，其特征在于所述的高分 子材料为具有内部空腔的树枝状高分子材料。
3.按权利要求1所述的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统，其特征在于所述的高分 子材料选自聚酰胺-胺型树状分枝物和聚赖氨酸。
4.按权利要求1所述的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统，其特征在于所述聚乙二 醇选自马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺。
5.按权利要求1所述的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统，其特征在于所述多肽是 序列为HAIYPRH的T7肽，所述T7肽通过噬菌体展示技术筛选得到。
6.按权利要求1所述的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统，其特征在于所述抗肿瘤 药物选自盐酸阿霉素或紫杉醇或柔红霉素。
7.按权利要求5所述的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统，其特征在于所述的多肽 特异性结合转铁蛋白受体。
8.权利要求1所述的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征是通过 下述步骤将高分子材料溶于适量适当的溶剂中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干，称取适 量的聚乙二醇溶解到pH值7. 8 8. 2的磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度的溶液，加入到上 述容器中，与高分子材料摩尔比为1 2 1 40，一定温度下搅拌反应数小时后，将多肽 溶于适量磷酸盐缓冲液里，配制成适当浓度的多肽溶液，加入到高分子-聚乙二醇溶液中， 与高分子材料摩尔比1 1 1 5，一定温度下反应Mh，制得肝肿瘤靶向纳米载体，转移 到MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，再与抗肿瘤 药物以摩尔比1 3 1 40搅拌反应12h，转移到MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm 超滤30min去除未包封的药物，即得肝肿瘤靶向纳米给药系统。
9.权利要求1的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统在制备靶向治疗人体来源或动 物来源的肝肿瘤细胞或其它癌细胞药物中的用途。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及药物递送系统，具体涉及一种新型多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药系统及其制备方法。本发明针对现有肝肿瘤靶向给药系统存在的不足，使用新型多肽为靶向头基，阳离子高分子材料为基础高分子载体，包载抗肿瘤药物，制成肝肿瘤靶向纳米给药系统。本发明选用通过噬菌体展示技术筛选出的新型多肽修饰高分子材料，以内吞方式进入细胞，提高肿瘤细胞对药物的摄取，并且安全。本发明具有转铁蛋白作为靶向头基的优点，并且有效避免内源性转铁蛋白的干扰，靶向和治疗效率高、制备简捷，并且可以应用于其它肿瘤组织的靶向治疗。
文档编号A61P35/00GK102048694SQ200910198450
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月6日 优先权日2009年11月6日
发明者柯伟伦, 蒋晨, 韩亮, 黄容琴 申请人:复旦大学