专利名称：一种重组j亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及禽白血病病毒感染性克隆领域，具体涉及一种重组J亚群禽白血病病 毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用。
背景技术：
禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)属于正逆转录病毒亚科、D逆转录病 毒属(Fauquet et al，2005)。禽白血病(Avian leukosis, AL)是由ALV引起的禽类多种 肿瘤性疾病的总称，该病在临床上表现形式多样，其中包括淋巴细胞性白血病、成红细胞性 白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病等(Ewert, 1988 ；Coffin, 1992 ；Payne et al， 1997 ；Payne,1998 ；Fadly et al，2003)。20世纪80年代以前，ALV亚群的变异都很小，主要是六十年代鉴定出的5个亚 群(Levy，1992)。之后，美国、以色列、法国等国家的肉鸡陆续发生J亚群禽白血病流行 (Payne，1991)，并迅速扩散至世界各国，造成了巨大的经济损失，成为全世界家禽业所面临 的一个主要问题。自从杜岩等(1999)在我国商品肉鸡中首次发现J亚群禽白血病病毒 (subgroup J avian leukosis virus, ALV-J)以来，各主要养鸡地区均有J亚群禽白血病 病例出现，并且，ALV-J在中国的流行范围及对宿主的危害有扩大的趋势(杨玉莹，2003 ；Xu et al，2004 ；成子强等，2005 ；邱玉等，2007)。A、B、C、D等亚群禽白血病病毒主要引起鸡的淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukosis, LL)，而J亚群禽白血病病毒则主要引起25 55周龄肉鸡的髓细胞性白血病 (myeloid leukosis，ML)，致死率可达 6% (Payne et al, 1998) ALV-J 原型株 HPRS-103 接种11日龄鸡胚可使肉鸡出壳后142 143天出现髓细胞瘤或肾瘤并造成死亡(Payne et al, 1992)。然而，后来从临床和实验性的ALV-J病例中分离到的一些急性转化型毒株可迅 速转化骨髓细胞，其诱发肉用型鸡ML死亡周龄提早到9周龄，且表现出很高的传染性和发 病率(Arshad et al，1997)，可见，在ALV-J发现后的近20年内，其致病性发生了重大的演 化。Chesters (2002)通过研究替换了 A和J亚群的囊膜蛋白的嵌合病毒的致瘤性 发现，病毒的囊膜蛋白是致瘤谱系的一个主要决定因素。一般认为，骨髓细胞性白血病是 ALV-J作用于骨髓细胞系前体细胞的结果，因此，ALV-J也常被描述为骨髓细胞瘤型禽白血 病病毒，实际上，ALV-J同时也可引起其他类型的肿瘤，例如淋巴细胞瘤、神经胶质瘤和成红 细胞性白血病等，这可能和病毒与不同品系或个体宿主细胞的相互作用以及发生转化的细 胞外整体因素有关，其中癌基因在特定时间、特定位点的表达是造成不同肿瘤发生的原因。 尽管如此，一直以来，临床及国内实验感染引起的J亚群禽白血病病理变化都主要表现为 骨髓细胞瘤。辛朝安等(2006)首次在中国发现疑似ALV-J引起的蛋鸡血管瘤病变型白血 病，此后各地不断有ALV-J相关的蛋鸡及肉种鸡血管瘤病例出现，证明这一新病变型ALV-J 正在中国鸡群中不断蔓延感染。
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ALV-J的强致病性、高变异性及灭活病毒诱导中和抗体的能力低下严重阻碍了 ALV-J疫苗的研制。E亚群禽白血病病毒(ALV-E)是在鸡体内极普遍存在的低致病性或无致 病性的内源性白血病病毒，研究表明不同亚群ALV的致病力不同的主要原因在于其非编码 区LTR =ALV-J LTR起到一种强启动子和增强子的作用，其通过整合在宿主的原癌基因位点 附近促发原癌基因的表达，最终导致肿瘤的发生；此外，ALV的病毒蛋白如囊膜糖蛋白等对 ALV的致病性也有一定的影响。而ALV-E的LTR启动子和增强子的作用很弱，这是ALV-E 低或无致病力的主要原因，但鸡基因组中ALV-E基因大都存在缺陷，不能自发产生有感染 性的病毒粒子，给ALV-E感染性克隆带来很大困难。Yang等(2007)发现LTR可以激活细胞 的端粒末端转移酶活性以开启或增强肿瘤的发展。此外，肿瘤的产生也可能和ALV-J与其 受体NHEl的相互作用有关，NHEl受各种的胞内或胞外信号调控，可提升细胞分裂和增殖并 且减少细胞粘着、增加细胞移行，这些也是肿瘤发生和侵袭所必需的，因此，ALV-J感染可能 激活NHEl，影响其下游信号途径，导致被感染细胞的转化。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的不足，提供一种重组J亚群禽白血病病 毒克隆质粒。本发明另一目的在于提供上述重组J亚群禽白血病病毒克隆质粒的制备方法。本发明还有一个目的在于提供上述重组J亚群禽白血病病毒克隆质粒的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒，该感染性病毒克隆质粒所包含J 亚群禽白血病病毒前病毒全长基因两端的长末端重复序列(LTR)被替换为E亚群禽白血病 病毒的LTR，该感染性病毒克隆的基因序列如SEQ ID N0:1所示。本发明重组J亚群禽白血病病毒感染性病毒克隆的制备方法，是将J亚群禽白血 病前病毒基因两端的长末端重复序列替换为E亚群禽白血病前病毒两端的长末端重复序 列，得到重组J亚群禽白血病病毒基因序列，并以此构建了重组J亚群禽白血病病毒感染性 克隆质粒，通过转染入细胞后得到重组J亚群禽白血病病毒；所述J亚群禽白血病病毒前病 毒基因序列如SEQ ID NO :15所示，所述E亚群禽白血病病毒前病毒两端的长末端重复序列 如 SEQ ID NO 16 17 所示。本发明是参考GenBank公开的序列，以及前期获取的国内J亚群禽白血病病毒株 及E亚群禽白血病病毒株的基因组序列，运用DNAStar软件包中MapDraw功能分析保守酶 切位点分布信息，结合载体PGEM-T Easy和pGEM-7zf(+)的酶切位点情况进行比较分析后， 将J亚群禽白血病病毒前病毒基因组分为3个长2. (Γ3. 5kb的片段，利用Primer Premier 5. 0专业引物设计软件设计引物，确保引物扩增出的3个片段间有约200bp的重叠区域，同 时还设计了针对E亚群禽白血病病毒的基因组两端长末端重复序列的引物，将所设计引物 按照PAGE级别合成。本发明利用扩增得到的J亚群禽白血病病毒前病毒基因组目的片段 中的酶切位点BstEII、MluI、KpnI、EcoRI及E亚群禽白血病病毒前病毒基因组目的片段中 的 MluI、pGEM-T Easy 中的 Sail、pGEM-7zf(+)中的 HindIII、KpnI、EcoRI、Xba I，对上述 各质粒进行一系列的酶切连接，最终获得含有上述重组J亚群禽白血病病毒前病毒全长基 因组的感染性克隆质粒。
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本发明重组J亚群禽白血病病毒克隆质粒的具体制备方法如下(1)设计引物，引物序列按照先上游引物后下游引物的形式，如SEQ IDN0:2 7所 示，以感染J亚群禽白血病病毒的鸡胚成纤维细胞DNA为模板，扩增J亚群禽白血病病毒前 病毒DNA片段按照从左至右的方向如SEQ ID NO :8 10所示，分别单独克隆入载体pGEM_T Easy中，得到相应的重组质粒A、B和C ；(2)设计引物，引物序列按照先上游引物后下游引物的形式，如SEQ ID NO : Γ 4 所示，以携带E亚群禽白血病病毒的鸡组织DNA为模板扩增E亚群禽白血病病毒前病毒DNA 两端的长末端重复序列所在片段并分别单独克隆入载体PGEM-T Easy中，得到相应的重组 质粒D和E ；(3)将经酶切的A与D、C与E分别连接，得到重组片段F和G ；(4)酶切后的载体pGEM_7zf(+)与G连接，得到的片段再经酶切后与F连接，得到 重组质粒M ；(5)重组质粒M经酶切，与B连接，得到重组J亚群禽白血病病毒克隆质粒。上述制备方法中，载体pGEM-T Easy可以被具有Sail、MluI单酶切位点，但不含 BstEII、Xba I、EcoRI、HindIII、KpnI 的克隆载体替代。载体pGEM_7zf(+)可以被如下单酶切位点排序分布(正反方向不限)的克隆载 体HindIII、KpnI、EcoRI、Xba I。上述制备方法中，所述A中插入片段上的BstEII与SalI单酶切位点之间间隔 353bp ；C中插入片段上的KpnI与载体上的MluI单酶切位点之间间隔574bp ；D中插入片段 上的BstEII与SalI单酶切位点之间间隔304bp ；E中插入片段上的MluI与载体上的MluI 酶切位点之间间隔51bp。上述制备方法中，步骤(3)中所述C与E的酶切连接方法是C和E分别经MluI酶 切后，回收片段，将两个片段连接起来，再经KpnI、HindIII酶切，得到重组片段G;步骤(4) 中，载体的酶切位点是KpnI和Hindlll，与G连接后的片段的酶切位点是Xba I和EcoRI ； 步骤(5)中所述重组质粒M的酶切位点是KpnI和EcoRI。上述制备方法中，所述连接是用T4DNA连接酶连接。上述制备方法中，质粒的大量扩增是通过转化大肠杆菌感受态细胞实现的，该大 肠杆菌可以是任意一种本领域技术人员所常用的大肠杆菌，如DH5ci、Τ0Ρ10或JM109细胞。本发明重组J亚群禽白血病病毒克隆质粒可以用于制备J亚群禽白血病病毒疫 苗，还可以为禽白血病病毒的研究提供理论和实践依据。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)本发明利用反向遗传操作技术将J亚群禽白血病病毒的LTR替换为E亚群禽 白血病病毒的LTR，并成功得到重组病毒克隆质粒，为J亚群禽白血病病毒疫苗的研制、J亚 群禽白血病病毒的致病机理、基因结构以及功能的关系、病毒的复制、遗传变异规律提供了 借鉴；(2)本发明利用J亚群禽白血病病毒及E亚群禽白血病病毒前病毒基因组中保 守的酶切位点以及特定克隆载体上的特定酶切位点，加强了本发明方法的通用性和可重复 性。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1感染性克隆质粒的构建1. ALV-J与ALV-E前病毒目的基因片段的获得1. IALV-J与ALV-E前病毒目的基因片段的扩增引物参考ALV-J及ALV-E的全基因序列分别设计5对引物对ALV-J与ALV-E前病毒目 的基因片段进行扩增，同时在部分引物5’端引入必要的酶切位点，5对引物序列如SEQ ID NO :2 7、11 14所示。1. 2ALV-J目的基因片段的PCR扩增以已感染ALV-J的CEF细胞DNA为模板，用PrimeSTARTM HS DNA聚合酶(TaKaRa) 及以下3对引物进行ALV-J前病毒DNA目的片段的扩增第一对引物对的PCR 反应条件为98°C 3min ；98°C 15s，55°C 10s，72°C 3min，进行 30个循环；72°C延伸8min后置4°C保存。第二对引物对的Touch down PCR 反应条件为98°C 3min ；98°C 15s，64°C (每个 循环降 1°C )10s，72°C 3min 进行 9 个循环；98°C 15s，55°C 10s，72°C 3min，进行 30 个循环； 72°C延伸8min后置4°C保存。第三对引物对的PCR反应条件为98 V 3min ；98 V 15s，69 V (每个循环降 rc )10s,72°C 3min 进行 18 个循环；98°C 15s，51°C 10s，72°C 3min，进行 30 个循环；72°C延 伸Smin后置4°C保存。1. 3ALV-E目的基因片段的PCR扩增 以感染ALV-E的SPF鸡组织DNA为模板，利用PrimeSTARTM HS DNA聚合酶 (TaKaRa)及以下2对引物扩增ALV-E前病毒DNA目的片段两对引物的PCR反应条件为98°C 3min ；98°C 15s，68°C (每个循环降1°C ) 10s， 72°C 3min 进行 15 个循环；98°C 15s，53°C 10s，72°C lmin，进行 30 个循环；72°C延伸 8min 后置4°C保存。1. 4各目的基因片段重组质粒的构建各PCR产物分别利用TIANGEN 超薄DNA产物纯化试剂盒进行纯化后，利 用ExTaqTM DNA聚合酶(TaKaRa)进行加A尾以便进行T-A克隆，加A尾反应条件为 72°C45min。之后通过琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。参照普洛麦格公司(Promega) pGEM -T EASY载体的使用说明书进行目的片段与载体的连接。IOyL连接体系中 包括以下各组分2XRapid Ligation Buffer 5 μ L, pGEM -T Easy Vector (50ng/ UL)0. 5yL,目的DNA 3. 5 μ L，T4DNA连接酶1 μ L。各组分混勻后，16°C连接2h，转化DH5 α 感受态宿主菌，通过菌液PCR将初步鉴定为阳性的克隆用自动序列测序仪测序。将测序结 果通过基因分析软件包DNASTAR中的EditSeq与SeqMan程序进行序列比对和拼接。鉴定 为按正确方向插入上述产物片段的阳性质粒分别命名为Α、B、C、D和Ε，其中A与D分别以 插入片段上的BstEII与SalI单酶切位点之间间隔353bp和304bp为正确插入阳性质粒；C 以插入片段上的KpnI与载体上的MluI单酶切位点之间间隔574bp为正确插入阳性质粒；E 以分别位于插入片段与载体上的两个MluI酶切位点之间间隔51bp为正确插入阳性质粒。
2感染性克隆质粒的构建2. 1重组F片段的构建A经BstEII与SalI双酶切，回收约5. 3kb的载体片段，命名为rCHNA ；D经BstEII 与SalI双酶切，回收约300bp的载体片段，命名为rE5LTR。rCHNA与rELTR利用T4DNA连 接酶连接，连接产物转化DH5 α感受态细胞，将阳性克隆菌液用自动序列测序仪测序鉴定， 得到的阳性重组质粒，先后经Xba I与EcoRI酶切，回收约2. 5kb的片段，命名为F。2. 2重组G片段的构建C经MluI酶切回收约2. 6kb的载体片段，命名为rCHNC ；E经MluI酶切回收约 3. 3kb的载体片段，命名为rE3LTR。rCHNC与rE3LTR利用T4DNA连接酶连接，连接产物转 化DH5 α感受态细胞，最终得到的重组质粒进行测序鉴定，插入目的片段上的的KpnI与 HindIII单酶切位点间隔2353bp为正确插入阳性质粒，阳性质粒先后经KpnI与HindIII 双酶切，回收约2. 4kb的片段，命名为G。2. 3L克隆的构建pGEM-7zf (+)先后经KpnI与HindIII双酶切，回收约3. Okb的载体片段与G利用 T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5 α感受态细胞，经测序鉴定最终得到的阳性重组质粒 先后经Xba I与EcoRI酶切，回收约5. 3kb的片段与F利用T4DNA连接酶连接，连接产物转 化DH5a感受态细胞，经测序鉴定最终得到的阳性重组质粒命名为Μ。M经KpnI与EcoRI 双酶切，回收约7. Skb的片段；B经KpnI与EcoRI双酶切，回收约2. 7kb的片段，两个片段 利用T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5 α感受态细胞，经测序鉴定最终得到的阳性重组 质粒命名为L。本实施例所涉及的双酶切、连接和转化等步骤，均采用本领域的常规操作。实施例2细胞转染与病毒收获1.转染用质粒及细胞的准备参照OMEGA去内毒素质粒提取试剂盒说明书，具体如下用1.5mL离心管收集 3-5mL 菌液，8000r/min 离心 3min。弃去上清液,加入 250 μ L SolutionI 液(含 RNase Α)， 涡旋振荡使菌体重悬混勻；然后加入250yL Solution II液，轻柔颠倒混勻6次；若此时溶 液已比较澄清，则立即加入350 μ L Solution III液，若仍比较混浊，可作用2 5min后加入 350 μ L Solution III液，颠倒混勻6次。12000r/min离心15min。将上清液转移到离心柱 中，10000r/min离心30s，弃去收集管中的滤液。加入500 μ L HB Buffer于柱中，IOOOOr/ min离心30s，弃收集管中的滤液。加入700 μ L DNA Washing Buffer洗涤，10000r/min离 心30s，弃收集管中的滤液，重复此步骤一次后，将离心柱空离心lmin。取下离心柱置于灭 菌的1. 5mL EP离心管中，加入适量的TE Buffer，室温静止5min，10000r/min离心lmin，洗 脱可疑重组质粒DNA，直接测序或-20°C备用。在转染前1天按常规方法制作DF-I细胞或鸡胚成纤维细胞CEF，控制每孔的细胞 数量，使得细胞培养板中各孔中的细胞在第2天转染时可长满约90%。2.转染参考invitrogen 公司Lipfectamine 2000说明书的方法，按照6孔细胞培养板 的规格，每个细胞培养孔对应4 μ g的感染性克隆质粒L和10 μ L的Lipfectamine 2000， 将其分别与250 μ L的Opti-MEM IMedium轻轻混合；室温孵育5min后，继续将两混合液轻轻混合在一起，室温孵育20min后加入6孔细胞培养板中使混合液完全覆盖细胞，将转染的 细胞置于37°C的CO2培养箱中孵育。3.病毒的收获转染24h后，弃上清，加入等体积的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续生长，待细 胞活力恢复后用含1 %胎牛血清的DMEM作为维持液，转染后第6天将细胞冻融一次即得到 含有致弱的J亚群禽白血病病毒的细胞培养物，分装置于-70°C冰箱中保存备用。本实施例所涉及的细胞培养和转染等步骤，均采用本领域的常规操作。一种重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用序列表SEQUENCE LISTING<110>华南农业大学<120> 一种重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用<130><160>17<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>10506<212>DNA<213>人工序列<400>1gggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcctctagatgtagtcaaatagagccagaggca60
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21CN [0601<211>1033[0602<212>DNA[0603<213>人工序列[0604<400>16[0605tctagatgtagtcaaatagagccagaggcaacttgaaaagtctaaagaccaaataaggaa60[0606aaagcaagacattccatatgctcattggtggcgactagataaggaaggaatgacgcaagg120[0607acatatgggcgtagacgaagctatgtacgattatataagctgttgccgccatcaaataaa180[0608cgccattttaccatccaccacattggtgtgcacctgggtagatggacagaccgttgagtc240[0609cctaacgattgcgaacacctgaatgaagcagaaggcttcatttggtgaccccgacgtgat300[0610cgttagggaatagtggtcggccaccggcggcgtggcgatcctgccctcatccgtcccgct360[0611taacggggagcgggcgatgaccctagtagagggggctgcggcttaggagggcagaagctg420[0612agtggcgtcggggggagctctactgcagggagcccacataccctaccgagcactcagagg480[0613gtcgttggaagacgaggaggaagcccgacgactgagtggtccgcaccaggCgCggttCCg540[0614gttgctctgcgtgattctggtcgccctgtggatcaagcatggaagccgtcataaaggtga600[0615tttcgtccgcgtgtaaaacctattgcgggaaaacctctccttctaagaaggaaatagggg660[0616ccatgttgtccctcttacaagatgaagggttgcttatgtccccctcagacttatattccc720[0617cggggtcctgggatcccattaccgcggcgctctcccagcgggctatggtgcttgggaaat780[0618cgggagagttaaaaacctggggattgattttgggggcattgaaggcggctcgagaggaac840[0619aggctacatctgagcaagcaaagttttggttcgggctagggggagggggggtctctcccc900[0620caggtccggagtgtatcgaaaaaccagcaacggagcggcggatcggcaaaggggaggaag960[0621cgagagagacaactgcgcagcgagatgcgaagatggcgccggaggaagcggccacaccta1020[0622aaaccgttggcac1033[0623<210>17[0624<211>305[0625<212>DNA[0626<213>人工序列[0627<400>17[0628acgcgtttgcatagggagggggaaatgtagtcaaatagagccagaggcaacttgaatagt60[0629ctaaagaccaaataaggaaaaagcaagacattccgtatgctcattggtggcaactagata120[0630aggaaggaatgacgcaaggacatatgggcgtagacgaagctatgtacgattatataagct180[0631gttgccacca CclclcltclclclCgccattttaccatccaccacattggtgtgcacctgggtag240[0632atggacagaccgttgagtccctaacgattgcgaacaactgaatgaagcagaaggcttcaa300[0633agctt305
2权利要求
一种重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒，其特征在于所述病毒感染性克隆质粒的基因序列如SEQ ID NO1所示。
2.权利要求1所述重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒的制备方法，其特征在于 所述制备方法如下(1)设计引物，引物序列如SEQID NO :2 7所示，以感染J亚群禽白血病病毒的鸡胚成 纤维细胞DNA为模板，扩增J亚群禽白血病病毒前病毒DNA片段如SEQ ID NO :8 10所示， 分别单独克隆入载体中，得到相应的重组质粒A、B和C ；(2)设计引物，引物序列如SEQID NO :1广14所示，以携带E亚群禽白血病病毒的鸡组 织DNA为模板扩增E亚群禽白血病病毒前病毒DNA两端的长末端重复序列所在片段并分别 单独克隆入载体中，得到相应的重组质粒D和E ；(3)将经酶切的A与D、C与E分别连接，得到重组片段F和G；(4)酶切后的载体与G连接，得到的片段再经酶切后与F连接，得到重组质粒M；(5)重组质粒M经酶切，与B连接，得到重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒。
3.根据权利要求2所述重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒的制备方法，其特征 在于所述A中插入片段上的BstEII与SalI单酶切位点之间间隔353bp ；C中插入片段上的 KpnI与载体上的MluI单酶切位点之间间隔574bp ；D中插入片段上的BstEII与SalI单酶 切位点之间间隔304bp ；E中插入片段上的MluI与载体上的MluI酶切位点之间间隔51bp。
4.根据权利要求2所述重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒的制备方法，其特征 在于步骤(3)中所述A与D的酶切连接方法是A和D分别经BstEII与SalI双酶切，回收 片段，将两个片段连接起来，再经Xba I>EcoRI酶切，得到重组片段F。
5.根据权利要求2所述重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒的制备方法，其特征 在于步骤(3)中所述C与E的酶切连接方法是C和E分别经MluI酶切后，回收片段，将两 个片段连接起来，再经KpnI、HindIII酶切，得到重组片段G ；步骤(4)中，载体的酶切位点 是KpnI和Hindlll，与G连接后的片段的酶切位点是Xba I和EcoRI ；步骤(5)中所述重组 质粒M的酶切位点是KpnI和EcoRI。
6.根据权利要求2所述重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒的制备方法，其特 征在于步骤(1)和(2)中所述载体为具有Sail、MluI单酶切位点，但不含BstEII、Xba I、 EcoRI、HindIII、KpnI 的克隆载体。
7.根据权利要求2所述重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒的制备方法，其特 征在于步骤(4)中所述载体为具有如下单酶切位点排序分布的克隆载体HindIII、KpnI、 EcoRI、Xba I。
8.根据权利要求3 7中任意一条权利要求所述重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质 粒的制备方法，其特征在于所述连接是用T4DNA连接酶连接。
9.权利要求1所述重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒的应用，其特征在于所述 重组J亚群禽白血病病毒作为一种带人工标记的J亚群禽白血病病毒弱毒，用于研究禽白 血病病毒的复制、致弱、免疫保护机制以及J亚群禽白血病病毒弱毒活疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用。本发明是将J亚群禽白血病病毒前病毒基因两端的长末端重复序列替换为E亚群禽白血病病毒前病毒基因两端的长末端重复序列，将其插入载体中，以此构建了重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒，得到序列如SEQ ID NO1所示。本发明重组J亚群禽白血病病毒克隆质粒经转染得到的重组病毒株的复制能力和致病性明显弱于自然的J亚群禽白血病病毒，但可表达J亚群禽白血病病毒的结构蛋白，具备J亚群禽白血病病毒的抗原性，可被J亚群禽白血病病毒特异性单克隆抗体JE9所识别。本发明病毒克隆质粒为制备J亚群禽白血病病毒弱毒性活疫苗提供了材料和方法借鉴。
文档编号A61P31/14GK101899465SQ200910213800
公开日2010年12月1日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者廖明, 张贺楠, 曹伟胜, 赖汉漳, 辛朝安 申请人:华南农业大学