专利名称：一种规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法
技术领域：
本发明涉及一种规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，属于生物医用材料领域。
背景技术：
在伤口急救以及外科手术中，创面出血与渗血是经常遇到的难题，血液的大量流 失会危及生命，同时，血液是天然的微生物培养基，出血或渗血都会增加感染的几率，从而 降低手术的成功率。良好的止血技术成为手术成功的关键，所以外科止血是手术技术的核 心之一。暂时性控制出血、尽快覆盖包扎伤口，将伤口与外界隔离以减少感染机会，为清创 创造良好的创面条件。平时严重交通伤、战时火器伤、恐怖袭击、抢险救灾以及塌方、台风、 地震、泥石流等自然灾害可造成短时间内同时出现大批伤员。对这些伤员伤口的院前急救 历来是创伤急救医学甚为关注的问题。理想的止血材料应该具有止血迅速、无剌激性、无急 性毒性、无慢性毒性、无致畸致癌性等特点，并且要有满足不同需求的可控的降解速度，优 异的生物相容性。 胶原蛋白，又称为胶原，是脊椎动物体内含量最丰富、分布最广泛的一组硬蛋白， 是组成脊椎动物身体结构的重要材料，也是在哺乳动物中含量最丰富的蛋白。胶原由多糖 蛋白分子组成，是结缔组织的主要蛋白成分，占机体总蛋白的20 30%。机体中大约一半 的胶原蛋白存在于皮肤中，胶原蛋白占真皮和筋腱干重的70%，相当于体重的6%。类人胶 原蛋白是将人体已知序列胶原蛋白的一段mRNA逆转录生成cDNA后，经过特定序列重复和 修饰，转化于大肠杆菌中，并经过高密度发酵、分离提取及纯化而得，由西安巨子生物基因 技术股份有限公司发明并独家生产。它从根本上解决了动物提取胶原蛋白的水不溶性和病 毒隐患(疯牛病、猪瘟疫、禽流感)等问题，并且具有良好的生物学特性和功能，促新细胞形 成和促上皮细胞、成纤维细胞生长功能相比动物体提取胶原蛋白优良，免疫排异反应低。
壳聚糖是目前已知存在于自然界中的唯一一种带阳离子能被生物降解的分布极 其广泛的高分子材料，大量存在于昆虫、甲壳纲动物外壳及真菌的细胞壁中，是地球上仅次 于纤维素的第二大可再生资源，其不溶于水及有机溶剂，很难被人体利用。其脱乙酰基所得 产物称为壳聚糖(化学名P (l-4)-氨基-2-脱氧氨基-D-葡萄糖)，则能被人体吸收利用。 这类多糖既可生物合成，又可生物降解，与动物的器官组织及细胞有良好的生物相容性，无 毒，降解过程中产生的低分子寡聚糖在体内不积累，几乎无免疫原性。 虽然胶原蛋白和壳聚糖都具有良好的生物相容性，但是单纯用胶原蛋白或者壳聚 糖止血材料机械性能较差，止血效果不理想，不能满足临床手术的要求，经过反复试验，发 明得到了理想的复合止血材料。
发明内容
本发明提供了一种规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，该方法工艺简单，所 制备的止血海绵机械性能良好、生物相容性优异，彻底杜绝了动物胶原蛋白止血材料所不可避免的病毒隐患，保证了止血材料的安全性。
本发明内容如下 —种规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，包括以下步骤
1)将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1. 0% 2. 0%的溶液；
2)将壳聚糖用稀酸溶解成0. 5% 1. 0%的溶液； 3)将上述两种溶液混合均匀，加入混合液总量2. 0% 5. 0%的甘油或山梨醇，混 合搅拌、过滤后真空脱泡； 4)将上述混合液注入不同规格的模具中，_40°C _80°〇预冻2 10h，然后真空 冷冻干燥； 5)将上述完成冷冻干燥的海绵使用O. 1% 1.0%的戊二醛溶液在25°〇 451:温 度下进行交联10 20h ; 6)将交联完成的类人胶原蛋白止血海绵使用蒸馏水进行多次洗涤，洗涤完成后再 次真空冷冻干燥； 7)上述冻干完成后的海绵密封后Co-60灭菌得到类人胶原蛋白止血海绵成品。
上述溶液浓度为质量百分比浓度。 上述步骤中，所用的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密度发酵生产的一 种人源型胶原蛋白，该蛋白与人体免疫排异反应更弱，促进受损组织修复能力更强，而且不 存在病毒隐患。 上述步骤中，所用的壳聚糖的脱乙酰度为70% 95%。
上述步骤中，所用的壳聚糖分子量为105 5X105Da。 上述步骤中，类人胶原蛋白和壳聚糖混合过程中干重质量比为(5 20) : l，所用 的稀酸为稀盐酸、稀醋酸或稀乳酸中的任意一种。 上述步骤中，使用的模具可以根据临床手术的要求做出任意大小或形状，对海绵 的理化性能、止血效果和生物相容性不造成影响。 本发明提供的止血材料具有适宜的微观结构和空隙率，具有优良的机械强度和可 控的降解速率，对于各种体表和体内创伤止血迅速、生物相容性良好。与目前临床广泛应用 的止血材料相比，类人胶原蛋白止血海绵具有显著的优点它的免疫排异反应更弱，而且彻 底杜绝了动物胶原蛋白所不可避免的病毒隐患，质量更加稳定、成本更低。
具体实施例方式
下面通过具体实施实例对本发明作进一步说明。
实施例1 : 将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1.0%的溶液，将脱乙酰度为70%、分子量为20 万道尔顿的壳聚糖用1.0%乙酸溶解成1.0%的溶液，然后将两者按5 : l(类人胶原蛋白 与壳聚糖干重质量比为(5 20) : 1)混合，加入溶液总量的2.0%的甘油，搅拌均匀后，过 滤后真空脱泡，注入适当形状的模具中，并于-4(TC真空冷冻干燥后使用0. 1%的戊二醛溶 液在室温下交联10h，交联完成后使用蒸馏水洗涤数次，再次真空冷冻干燥成型，密封后使 用Co-60灭菌得到类人胶原蛋白止血海绵成品。
实施例2 :
将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成2. 0%的溶液，将脱乙酰度为95%、分子量为50 万道尔顿的壳聚糖用0.5%乙酸溶解成0.5%的溶液，然后将两者按10 : l(质量比)混 合，加入溶液总量的1.0X的丙三醇，搅拌均匀后，并于-5(TC真空冷冻干燥后使用0.5%的 戊二醛溶液在37t:下交联20h，交联完成后使用蒸馏水洗涤数次，再次真空冷冻干燥成型， 密封后使用Co-60灭菌得到类人胶原蛋白止血海绵成品。
实施例3 : 将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1. 0%的溶液，将脱乙酰度为90%、分子量为30 万道尔顿的壳聚糖用0.5%盐酸酸溶解成1.0%的溶液，然后将两者按15 : l(质量比)混 合，加入溶液总量的1. 2%的山梨醇，搅拌均匀后，并于-S(TC真空冷冻干燥后使用0. 8%的 戊二醛溶液在45t:下交联12h，交联完成后使用蒸馏水洗涤数次，再次真空冷冻干燥成型， 密封后使用Co-60灭菌得到类人胶原蛋白止血海绵成品。
实施例4 : 将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成2. 0%的溶液，将脱乙酰度为80%、分子量为40 万道尔顿的壳聚糖用1.0%稀乳酸溶解成0.5%的溶液，然后将两者按12 : l(质量比)混 合，加入溶液总量的1. 0%的山梨醇，搅拌均匀后，并于-S(TC真空冷冻干燥后使用0. 4%的 戊二醛溶液在37t:下交联10h，交联完成后使用蒸馏水洗涤数次，再次真空冷冻干燥成型， 密封后使用Co-60灭菌得到类人胶原蛋白止血海绵成品。
实施例5 : 将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1. 5%的溶液，将脱乙酰度为85%、分子量为10 万道尔顿的壳聚糖用0.5%盐酸溶解成0.5%的溶液，然后将两者按16 : l(质量比)混 合，加入溶液总量的1.5X的甘油，搅拌均匀后，并于-8(TC真空冷冻干燥后使用0.3%的戊 二醛溶液在室温下交联20h，交联完成后使用蒸馏水洗涤数次，再次真空冷冻干燥成型，密 封后使用Co-60灭菌得到类人胶原蛋白止血海绵成品。
实施例6 : 将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1. 8%的溶液，将脱乙酰度为95%、分子量为50 万道尔顿的壳聚糖用1.0%稀乳酸溶解成1.0%的溶液，然后将两者按8 : l(质量比)混 合，加入溶液总量的1. 0%的山梨醇和0. 5%的甘油，搅拌均匀后，并于-S(TC真空冷冻干燥 后使用1.0%的戊二醛溶液在4(TC下交联15h，交联完成后使用蒸馏水洗涤数次，再次真空 冷冻干燥成型，密封后使用Co-60灭菌得到类人胶原蛋白止血海绵成品。
权利要求
一种规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，其特征在于包括以下步骤1)将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1.0％～2.0％的溶液；2)将壳聚糖用稀酸溶解成0.5％～1.0％的溶液；3)将上述两种溶液混合后再加入甘油和/或山梨醇搅拌均匀，过滤后真空脱泡；4)将上述混合液注入不同规格的模具中，-40℃～-80℃预冷冻后进行真空冷冻干燥；5)上述干燥完成后的海绵使用0.1％～1.0％的戊二醛溶液交联；6)交联完成后使用蒸馏水洗涤数次后再次冻干成型；7)上述冻干完成后的海绵密封后Co-60灭菌得到类人胶原蛋白止血海绵成品。
2. 根据权利要求1所述规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，其特征在于所用的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密度发酵生产的一种人源型胶原蛋白。
3. 根据权利要求1所述规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，其特征在于所用的壳聚糖的脱乙酰度为70% 95%。
4. 根据权利要求3所述规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，其特征在于所用的壳聚糖分子量为105 5X 105Da。
5. 根据权利要求1至4任意之一所述规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，其特征 在于所用的稀酸为稀盐酸、稀醋酸或稀乳酸中的任意一种。
6. 根据权利要求1至4任意之一所述规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，其特征 在于类人胶原蛋白与壳聚糖混合过程中质量比为(5 20) : 1。
7. 根据权利要求1至4任意之一所述规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，其特征 在于在类人胶原蛋白和壳聚糖混合溶液中加入了重量百分比为2. 0% 5. 0%的甘油和/ 或山梨醇。
8. 根据权利要求1至4任意之一所述规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，其特征在于所用的模具可以根据临床需求制成任意形状。
全文摘要
本发明公开了一种规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，包括以下步骤将类人胶原蛋白用溶解成1.0％～2.0％的溶液；将壳聚糖用稀酸溶解成0.5％～1.0％的溶液；将上述两种溶液混合均匀，加入甘油和/或山梨醇，混合搅拌、过滤后真空脱泡；将上述混合液注入模具中于-40℃～-80℃预冻，冷冻干燥后使用0.1％～1.0％的戊二醛溶液交联，交联完成后使用蒸馏水洗涤数次后再次真空冷冻干燥，然后Co-60灭菌后得到类人胶原蛋白止血海绵成品。与目前临床广泛应用的止血材料相比，所制备的止血海绵机械性能良好、生物相容性优异，彻底杜绝了动物胶原蛋白止血材料所不可避免的病毒隐患，保证了止血材料在临床使用中的安全性。
文档编号A61L15/42GK101695581SQ20091021851
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月26日 优先权日2009年10月26日
发明者朱晨辉, 段志广, 范代娣, 马晓轩 申请人:西北大学;