专利名称：一种柿叶提取物质量的检测方法
技术领域：
本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种柿叶提取物质量的检测方法。
背景技术：
柿叶提取物用做药物早在600多年前的《滇南本草》中就有记载，其良好的止咳 喘、肺账、内出血、以及降血压的功效使得其在中药大家庭中拥有重要的位置。
在现有技术中，柿叶提取物按照如下方法制备取干柿叶，加水煎煮二次，第一次 2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮至相对密度为1. 12 1. 15 (60°C )，加乙醇 至含醇量达85wt^，静置过夜，滤取上清液，备用；过滤得到的沉淀物用65wt^乙醇洗涤两 次，合并洗涤液，静置过夜，滤取上清液，合并两次上清液，回收乙醇，加入适量的水，混匀， 滤过，滤液用乙酸乙酯提取四次，合并乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯并浓縮成稠膏，低温干燥， 即得到柿叶提取物。由柿叶提取物加辅料制成的中药制剂，是广州白云山和记黄埔中药有 限公司独家中药保护品种，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第二十 册第294页。 按照上述方法制备柿叶提取物时，由于多次使用乙酸乙酯，因此在成品柿叶提取 物中会残留乙酸乙酯。在现有技术下，对柿叶提取物中的乙酸乙酯残留量并没有明确的检 测方法，因此无法确认柿叶提取物中的残留的乙酸乙酯的量，导致柿叶提取物质量不能准 确的进行评价。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于，提供一种柿叶提取物的检测方法，以确 定柿叶提取物待测品中乙酸乙酯的残留量。 为了解决以上技术问题，本发明提供一种柿叶提取物质量的检测方法，包括
取柿叶提取物待测品与N， N- 二甲基甲酰胺混合，得到的混合液作为供试品溶液；
取乙酸乙酯对照品与N， N- 二甲基甲酰胺混合，得到的混合液作为对照品溶液；
按照气相色谱法，使用以氰丙基苯基-二甲基聚硅氧烷为固定液的色谱柱，将所 述供试品溶液和对照品溶液分别注入气相色谱仪，测定所述供试品溶液中乙酸乙酯的残留 优选的，所述按照气相色谱法测定所述供试品溶液中乙酸乙酯残留量的步骤中 所述色谱柱升温的起始温度为49°C 5rC，保温时间为4min 6min ;然后再将色谱柱以 每分钟34°C 36。C的速率升至218°C 222。C，保温lmin 3min。 优选的，所述按照气相色谱法测定所述供试品溶液中乙酸乙酯残留量的步骤中 气相色谱仪中的火焰离子化检测器的检测温度为245°C 255t:、进样口温度为215°C 225"、顶空温度为75°C 85"、保温时间为28 32min。 优选的，所述氰丙基苯基_ 二甲基聚硅氧烷的组成为6wt %氰丙基苯基_94wt %二 甲基聚硅氧烷。
优选的，所述检测方法进一步包括使用高效液相色谱法测定所述柿叶提取物待测 品中山柰素和槲皮素含量的步骤 取山柰素和槲皮素与甲醇混合，得到的混合液作为高效液相色谱用对照品溶液； 提供含有柿叶提取物待测品的高效液相色谱用供试品溶液； 使用高效液相色谱法测定所述柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素含量。
优选的，所述提供含有柿叶提取物待测品的高效液相色谱用供试品溶液具体为 取所述柿叶提取物待测品粉末用甲醇定容，得到第一混合液，过滤； 取过滤所述第一混合液得到的过滤液加入甲醇和盐酸溶液得到第二混合液，摇匀
并加热回流，放冷，然后将所述第二混合液转移至量瓶中，过滤取滤液，得到供试品溶液。 优选的，所述取所述柿叶提取物待测品粉末用甲醇定容具体为 取所述柿叶提取物待测品粉末与甲醇混合并置于具塞容器中，密封瓶塞，将所述
具塞容器中的混合液称定重量并经过超声处理，放冷，再次称定重量，用甲醇补足所述具塞
容器中混合液缺失的重量，摇匀后过滤得到所述第一混合液。 优选的，所述使用高效液相色谱法测定所述柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素 含量所用的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶、流动相为甲醇-0. 2wt^磷酸溶液。
优选的，所述使用高效液相色谱法测定所述柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素 含量的检测波长为360nm。 优选的，所述使用高效液相色谱法测定所述柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素 含量的理论板数按槲皮素峰计算不低于2500。 本发明提供了一种柿叶提取物质量的检测方法，该检测方法中，用柿叶提取物待 测品与N，N-二甲基甲酰胺混合，得到供试品溶液，用乙酸乙酯对照品与N，N-二甲基甲酰胺 混合得到对照品溶液，再用氰丙基苯基-二甲基聚硅氧烷为固定液的色谱柱，通过气相色 谱法测定其中的乙酸乙酯残留量。本发明选择N， N-二甲基甲酰胺作为溶剂分别与待测品 和对照品混合制备样品溶液，然后选择氰丙基苯基-二甲基聚硅氧烷为固定液的色谱柱， 按照气相色谱法可以准确的检测柿叶提取物中乙酸乙酯的残留量，从而对柿叶提取物质量 进行准确的评价。 在一种优选的实施方式中，本发明提供的检测方法进一步包括使用高效色谱测定 柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素含量步骤，本发明以山柰素和槲皮素溶于甲醇作为对 照品溶液，可以对柿叶提取物待测品中的山柰素和槲皮素进行测定，这样可以进一步确定 所述柿叶提取物待测品中的药物有效含量。
图1 ;本发明实施例公开的对照品液气相色谱图；
图2 ;本发明实施例公开的供试品溶液气相色谱图；
图3 ;本发明实施例公开的对照品溶液的高效液相色谱图；
图4 ;本发明实施例公开的供试品溶液的高效液相色谱图。
具体实施例方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是
4应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的 限制。 首先对专用名词进行一下解释
附录指2005版中国药典的附录。 高效液相色谱法(HPLC，High Performance Liquid Chromatography)采用高效液 相色谱仪对样品的化学成分进行定性、定量分析的一种技术方法。 气相色谱法(GC，Gas Chromatography)采用气液相色谱仪对样品的化学成分进行
定性、定量分析的一种技术方法。
实施例1 由于在柿叶提取物的提取过程中多次用到了乙酸乙酯，所以在柿叶提取物中会残 留有乙酸乙酯影响柿叶提取物的质量，而本发明通过气相色谱法来检测柿叶提取物待测品 中的乙酸乙酯残留量。 具体步骤为精密称取柿叶提取物待测品0. 2g，研磨，然后置于第一空瓶中，再精
密称取N， N- 二甲基甲酰胺2ml，置于第一空瓶中，摇匀，密封后，得到供试品溶液。 精密量取乙酸乙酯对照品2ml，用N， N_ 二甲基甲酰胺稀释制成每1ml中含0. 5ml
的溶液，精密量取上述稀释液2ml，置于第二空瓶中，密封作为对照品溶液。 按照气相色谱法(附录V E)测定，用6wt^氰丙基苯基_94^%二甲基聚硅氧烷
为固定液的毛细管柱，毛细管柱规格为O. 25mmX30m ;柱温起始温度为50°C ，保持5min，然
后将保温后的毛细管柱以每分钟35t:的速率升至22(TC，保持2min。火焰离子化检测器的
检测温度为25(TC，进样口温度为220°C。顶空温度为8(TC，保温时间为30min，进样时间
lmin。对照品气相色谱图如图l所示，供试品溶液气相色谱图如图2所示，按外标法以峰面
积计算，含乙酸乙酯未超过O. 5wt%。 实施例2 黄酮类化合物是柿叶提取物中的主要有效成分，而柿叶提取物黄酮又以槲皮素和 山柰素的苷元及其苷类为主。柿叶提取物水解后的槲皮素和山柰素的苷元总量能基本反映 柿叶提取物中的总黄酮含量，同样的也可以反映柿叶提取物中的总黄酮含量，所以在本发 明中还包括了使用高效液相色谱法测定柿叶提取物待测品中柿叶提取物山柰素和槲皮素 含量的测定方法。具体步骤如下 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇和0.2wt^磷酸按照重量比为50 : 50 的比例混合作为为流动相。 分别取山柰素和槲皮素，精密称定，与甲醇混合，配置成每lml含山柰素和槲皮素 各50ii g的混合溶液，得到的混合液作为高效液相色谱用对照品溶液。 取柿叶提取物待测品粉末0. lg，精密称定后置于具塞锥形瓶中，向所述具塞锥形 瓶内精密加入甲醇20ml，密封后称定重量，经功率250W、频率40kHz的超声处理30分钟，然 后室温放置冷却，再次称定重量，如有不足使用甲醇补足缺失的重量。 将定容的混合液摇匀，过滤后，精密量取续滤液10ml至锥形瓶，加入甲醇10ml、体 积百分数为25%的盐酸溶液5ml后，摇匀加热回流30分钟，室温冷却放置，转移至50ml的 容量瓶中。用甲醇将所有配置容器洗涤后，将洗液转移至所述容量瓶，加入甲醇至刻度，密 封摇匀过滤，取滤液，即得到柿叶提取物待测品的高效液相色谱用供试品溶液。
高效液相色谱测定方法为分别精密吸取所述供试品溶液和对照品溶液各 10iU，注入液相色谱仪，测定，检测波长为360nm，理论板数按槲皮素峰计算应均不低于 2500。对照品溶液的高效液相色谱图如图3所示，供试品溶液的高效液相色谱图如图4所 示，按柿叶提取物干燥品计算，以槲皮素(C15H1Q07)计大于3. 8wt%，以山柰素(C15H1Q06)计大 于4. 8wt%。
实施例3 本发明除了柿叶提取物的气相色谱法测定乙酸乙酯残留量和高效液相色谱法测 定柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素含量外，还包括使用薄层色谱法鉴定柿叶提取物的 步骤。 具体步骤为取柿叶提取物待测品0. 2g，研细，与25ml甲醇混合，超声处理30分 钟，将上述甲醇混合液过滤，滤液蒸干，剩余的残渣加15ml水，充分搅拌使溶解，过滤，滤液 加盐酸0. 5ml，用无水乙醚30ml振摇提取，分取乙醚层，挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为 供试品溶液。 另取柿叶提取物对照药材8g，按照与供试品溶液的相同的配制方法制成对照药材 溶液。 再取原儿茶酸对照品，与甲醇混合制成每1ml含lmg的溶液，作为对照品溶液。照 薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各10 1，分别点于同一硅胶GF254薄层板
上，以重量比为io : 0.3 : 0.3的二氯甲烷-甲醇-甲酸混合液为展开齐U，展开，取出，晾
干，置波长为254nm的紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的 位置上，观察柿叶提取物待测品是否显相同颜色的斑点，如果是，则可以确认柿叶提取物待 测品为柿叶提取物，并且含有原儿茶酸。
实施例4 对柿叶提取物使用薄层色谱法鉴定还可以使用其它对照品。 具体步骤为精密称取柿叶提取物待测品0. 2g，研细，与25ml甲醇混合，超声处理 30分钟，将上述甲醇混合液过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
另取柿叶提取物对照药材2g，按照与供试品溶液的相同的配制方法制成对照药材 溶液。 再取齐墩果酸对照品，与甲醇混合制成每1ml含lmg的溶液，作为对照品溶液。照 薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10iU，分别点于同一硅胶G薄层板上， 以重量比为7 : 2 : 0.3的甲苯-乙酸乙酯-甲酸混合液为展开齐IJ，展开，展距12cm，取出， 晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105t:加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药 材及对照品色谱相应的位置上，观察柿叶提取物待测品是否显相同颜色的斑点，如果是，则 可以确认柿叶提取物待测品为柿叶提取物，并且含有齐墩果酸。
实施例5 本本发明除了柿叶提取物的气相色谱法测定乙酸乙酯残留量和高效液相色谱法 测定柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素含量外，还包括柿叶提取物的乙酸乙酯浸出物的 测定，具体步骤为 取本品，研成粗粉，取约0. 5g，精密称定，用乙酸乙酯为溶剂，照醇溶性浸出物测定 法中的热浸法(附录X A)测定，未超过75wt^。
实施例6 本发明还提供了柿叶提取物的水分含量的测定步骤。 照水分测定法(附录IX H第一法)测定，含水量不得超过5. 0wt % 实施例7 本发明还提供了柿叶提取物中重金属含量的测定步骤。 步骤为取待测品品lg，依法检查(附录IX E第二法)，不得超过以重量计小于 百万分之二十。 以上对本发明提供的一种柿叶提取物质量的检测方法进行了详细的介绍。本文中
应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助 理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱
离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本 发明权利要求的保护范围内。
权利要求
一种柿叶提取物质量的检测方法，其特征在于，包括取柿叶提取物待测品与N，N-二甲基甲酰胺混合，得到的混合液作为供试品溶液；取乙酸乙酯对照品与N，N-二甲基甲酰胺混合，得到的混合液作为对照品溶液；按照气相色谱法，使用以氰丙基苯基-二甲基聚硅氧烷为固定液的色谱柱，将所述供试品溶液和对照品溶液分别注入气相色谱仪，测定所述供试品溶液中乙酸乙酯的残留量。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述按照气相色谱法测定所述供试 品溶液中乙酸乙酯残留量的步骤中所述色谱柱升温的起始温度为49°C 5rc，保温时间 为4min 6min ;然后再将色谱柱以每分钟34°C 36。C的速率升至218°C 222°C ，保温 lmin 3min。
3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述按照气相色谱法测定所述供试品溶液中乙酸乙酯残留量的步骤中气相色谱仪中的火焰离子化检测器的检测温度为245°C 255t:、进样口温度为215°C 225。C、顶空温度为75°C 85。C、保温时间为28 32min。
4. 根据权利要求l所述的检测方法，其特征在于，所述氰丙基苯基-二甲基聚硅氧烷的 组成为6wt^氰丙基苯基_94^%二甲基聚硅氧烷。
5. 根据权利要求1至4任意一项所述的检测方法，其特征在于，进一步包括使用高效液 相色谱法测定所述柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素含量的步骤取山柰素和槲皮素与甲醇混合，得到的混合液作为高效液相色谱用对照品溶液；提供含有柿叶提取物待测品的高效液相色谱用供试品溶液；使用高效液相色谱法测定所述柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素含量。
6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述提供含有柿叶提取物待测品的 高效液相色谱用供试品溶液具体为取所述柿叶提取物待测品粉末用甲醇定容，得到第一混合液，过滤； 取过滤所述第一混合液得到的过滤液加入甲醇和盐酸溶液得到第二混合液，摇匀并加 热回流，放冷，然后将所述第二混合液转移至量瓶中，过滤取滤液，得到供试品溶液。
7. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述取所述柿叶提取物待测品粉末 用甲醇定容具体为取所述柿叶提取物待测品粉末与甲醇混合并置于具塞容器中，密封瓶塞，将所述具塞 容器中的混合液称定重量并经过超声处理，放冷，再次称定重量，用甲醇补足所述具塞容器 中混合液缺失的重量，摇匀后过滤得到所述第一混合液。
8. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述使用高效液相色谱法测定所述 柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素含量所用的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶、流动相 为甲醇-O. 2wt^磷酸溶液。
9. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述使用高效液相色谱法测定所述 柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素含量的检测波长为360nm。
10. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述使用高效液相色谱法测定所述 柿叶提取物待测品中山柰素和槲皮素含量的理论板数按槲皮素峰计算不低于2500。
全文摘要
本发明提供一种柿叶提取物质量的检测方法，包括取柿叶提取物待测品与N，N-二甲基甲酰胺混合，得到的混合液作为供试品溶液；取乙酸乙酯与N，N-二甲基甲酰胺混合，得到的混合液作为对照品溶液；按照气相色谱法，使用氰丙基苯基-二甲基聚硅氧烷为固定液的色谱柱，将所述供试品溶液和对照品溶液分别注入气相色谱仪，测定所述供试品溶液中乙酸乙酯的含量。本发明选择N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂分别与待测品和对照品混合制备样品溶液，然后选择氰丙基苯基-二甲基聚硅氧烷为固定液的色谱柱，按照气相色谱法可以准确的检测柿叶提取物中乙酸乙酯的残留量，从而对柿叶提取物质量进行准确的评价。
文档编号A61P9/12GK101703557SQ20091022569
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者利幼, 尹仁杰, 张小雪, 李楚源, 林挺, 梁敬仪, 王德勤, 罗杰, 陈薇 申请人:广州白云山和记黄埔中药有限公司