抗细菌组合物的制作方法

专利名称：抗细菌组合物的制作方法
抗细菌组合物1.发明领域
本发明涉及治疗或预防病原细菌感染的抗细菌组合物和方法。更具体来说，本发 明涉及用于治疗或预防细菌感染和与其相关的疾病的抗细菌药物组合物。本发明的其它方 面、目的和优势从下面的描述来看是显而易见的。
2.发明背景
肠上皮围圈住肠腔中的细菌，从而允许宿主收获其自身无法合成的原核生物代谢 产物，同时保护宿主免遭感染。由于上皮细胞经常暴露于胃肠道的微生物群，其也是很多病 原体的主要进入点。为了防止宿主感染，上皮细胞表达各种模式识别受体(PRR)如Nod2来 提供抵御入侵的第一道防线。PRR是先天免疫系统的基本组分。它们识别存在于细菌、卵菌、 线虫、真菌、病毒和昆虫中的保守基序，并在宿主中触发对入侵微生物直接的可测且靶向的 反应(Ting JPY 和 Davis BK, 2005)
包括Nod、Nalp和植物R蛋白家族在内的许多PRR的一个共有元件是富亮氨酸重 复序列(LRR)结构域。该保守富亮氨酸重复序列为LRR结构域的马蹄铁图样形状提供了结 构支架，而PRR侧翼区是变化多样的多肽片段，赋予对共同微生物基序的识别(Matsushima N.等人，2005)。LRR结构域存在于从植物到人类的PRR中，并且对宿主抗病原体的抗性是 必不可少的。某些含LRR蛋白的缺失或自发突变造成宿主对感染的易感性(Dangl几和 Jones JDG, 2001) 0无颚鱼类利用LRR结构域作为支架基于不同LRR肽序列的重组，发育新 的适应性免疫系统(Pancer Z等人，2004，Alder MN等人，2005，Nagawa F等人，2007)。
在人类中，基因研究已在很多LRR中鉴定了与各种疾病(包括传染性或炎症性起 源的那些疾病)易感性相关的单核苷酸多态性(SNP) (Matsushima N.等人，2005)。Nod2可 能是获得最广泛研究的与疾病相关的含LRR蛋白。其赋予克罗恩病易感性，并且在许多独 立的研究中已经证实其与该疾病的联系(Hugot JP等人，2001，Ogura Y等人，2001，Hampe J 等人，2007，Libioulle C 等人，2007，Raelson JV 等人，2007，The Wellcome Trust Case Control Consortium, 2007)。Nod2的LRR结构域中的突变赋予克罗恩病易感性，而Nod2的 相邻NACHT结构域中的特定突变是Blau综合征(一种少见的常染色体显性紊乱，其特点是 早发肉芽肿性关节炎、葡萄膜炎和皮疹伴先天性指屈曲)的遗传原因(Miceli-Richard C 等人，2001)。这表明Nod2 LRR结构域的特定分子功能造成对肠病的易感性。
大多数围绕Nod2的研究集中于其响应于推定配体对信号转导途径的激活。与克 罗恩病最通常相关的三个Nod2 SNP在其对MDP (细菌蛋白聚糖衣外被的组分)的响应上均 存在缺陷，表现出缺少NFkB易位和细胞因子的产生(Barnich N等人，2005)。相反地，克罗 恩病的特征在于升高的NFkB-依赖性细胞因子产生。关于克罗恩病相关Nod2 SNP是功能 突变的获得还是失去的辩论正在进行(Watanabe T等人，2004，Kobayashi KS等人，2005， Maeda S，2005)。
在利用Nod2敲除小鼠株的研究中也已经突显Nod2在保护宿主免遭细菌感染中 的作用(Kobayashi KS等人，2005)。Nod2敲除对由单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)引起的口腔(但不是全身性)感染更敏感。这是个重要的发现，因为已报道克罗恩病患者显示出其胞内细菌及上皮相关细菌的实质性增加(Swidsinski A等人， 2002, Darfeuille-Michaud A，2002，Liu Y 等人，1995)。一些报告已经提示 Nod2 在预防 细胞的细菌感染中的作用(Hisamatsu T等人，2003)。这些研究表明克罗恩病相关Nod2 3020insC蛋白在作为防御因子对抗胞内细菌方面的缺陷。同一组的随访研究表明抗沙门 氏菌(Salmonella)感染的Nod2_依赖性保护作用依赖于线粒体蛋白griml9 (Barnich N等 人，2005)。Nod家族的其它成员(Nodl)也已经显示抗胞内细菌的保护功能(Zilbauer M等 人，2007，Travassos LH 等人，2005)。与 Nod2 不同，Nodl 与 griml9 没有关系(Barnich N 等人，2005)，表明Nod蛋白阻止细胞感染的机理仍有待于确定。
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3.发明概述
本发明至少部分基于含有富亮氨酸重复序列(LRR)基序的蛋白具有直接抗细菌 活性的发现。
在本发明的一个方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)式⑴的LRR的 分离蛋白质
(FlLxxLxLxxZF2)(I)
其中
Fl和F2独立地是1至30个残基的连续氨基酸序列；
χ可以是任何氨基酸、
L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ；
Z 可以是 NxL 或 CxxL ；
N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ；
C 是 078或^51·。
在本发明的另一方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)两个或两个以上 (例如2至50个)串联的式(I)LRR的分离蛋白质。
在本发明的另一方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)两个或两个以上 (例如2至50个)衍生自天然含LRR蛋白的式(I)LRR(例如串联)的分离蛋白质。
在本发明的另一方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)核苷酸结合位点 (NBS) -LRR、例如 NOD-LRR (例如 N0D2-LRR 或 N0D1-LRR，特别是人 N0D2-LRR 或人 N0D1-LRR) 的分离蛋白质。在其它方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)CIITA-LRR、Toll受 体-LRR(例如TLR2，4，5，7，8，9-LRR结构域)、NAIP-LRR的分离蛋白质。
在本发明的一个方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)核苷酸结合寡聚 化结构域(NOD)、氨基端效应子结构域和羧基端富亮氨酸重复序列(LRR)结构域的分离蛋 白质。
在本发明的另一方面，提供了组合物(特别是具有抗细菌活性的药物组合物)，其 包含(例如作为其唯一活性成分)分离的蛋白质，所述分离蛋白质包含(或基本上组成是， 或组成是)NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如CARD、Pyrin、死亡结构域或死亡效应 子结构域)和羧基端LRR结构域。
在本发明的另一方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)NOD结构域、氨基端胱天蛋白酶募集结构域(CARD)和羧基端LRR结构域的分离蛋白质。
在本发明的另一方面，提供了组合物，其包含(例如作为其唯一活性成分)分离的 蛋白质，所述分离蛋白质包含NOD结构域、氨基端CARD结构域和羧基端LRR结构域，或基本 上由NOD结构域、氨基端CARD结构域和羧基端LRR结构域组成。
在本发明的又一个方面，提供了组合物，特别是药物组合物，其包含(例如作为其 唯一活性成分)分离的NOD蛋白、特别是NOD1和/或N0D2、更特别是人NOD1和/或人N0D2。
在本发明的又一个方面，提供了组合物，特别是药物组合物(例如杀细菌药物组 合物)，其包含(例如作为其唯一活性成分)分离的TLR蛋白、特别是哺乳动物TLR蛋白、更 特别是人TLR蛋白例如人TLR2和/或人TLR4和/或人TLR5。
在另一方面，提供了抗细菌(例如杀细菌)组合物(特别是药物组合物)，其包含 (例如作为其唯一活性成分)分离的N0D2蛋白(特别是人N0D2)。
在本发明的另一方面，提供了包含分离蛋白质和可药用载体的药物组合物，所述 分离蛋白质包含(或基本上组成是，或组成是)NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如 CARD结构域)和羧基端LRR结构域。
在本发明的另一方面，提供了药物组合物(特别是杀细菌药物组合物)，其包含 (例如作为其唯一活性成分)分离的NOD蛋白(例如人NODl或人N0D2)、特别是分离的人 N0D2和可药用载体。
在本发明的另一方面，提供了治疗或预防病原体感染(特别是细菌感染)的方法， 所述方法包括提供包含分离蛋白质的组合物，所述分离蛋白质包含(或基本上组成是，或 组成是)NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如CARD结构域)和羧基端LRR结构域。
在本发明的另一方面，提供了治疗或预防病原体感染(特别是细菌感染)的方法， 所述方法包括提供包含分离蛋白质的组合物，所述分离蛋白质包含(或基本上组成是，或 组成是)NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如CARD结构域)和羧基端LRR结构域。
在本发明的另一方面，提供了治疗或预防病原体感染(例如细菌感染)的方法，所 述方法包括提供包含分离的NOD蛋白、例如分离的人NODl和/或人N0D2的组合物。
在本发明的另一方面，提供了治疗或预防人类患者的病原体感染、特别是细菌感 染的方法，所述方法包括向所述患者施用(药物组合物，其包括)治疗有效量的分离NOD蛋 白、特别是分离人NODl和/或人N0D2。
在本发明的另一方面，提供了包含NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如 CARD)和羧基端LRR结构域的分离蛋白质在医药、特别是人类医药中的用途。
在本发明的另一方面，提供了包含NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如 CARD)和羧基端LRR的分离蛋白质(例如分离人N0D2)在制备用于治疗或预防病原体感染、 特别是细菌感染、更特别是革兰氏阳性菌感染的药物中的用途。
在本发明的另一方面，提供了包含NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如 CARD)和羧基端LRR结构域的分离蛋白质在制备用于治疗克罗恩病、炎性肠病、败血病的药 物中的用途。
在本发明的另一方面，提供了分离NOD蛋白(例如人NODl或人N0D2)在制备用于 治疗克罗恩病、炎性肠病的药物中的用途。
在本发明的另一方面，提供了包含蛋白和可药用载体的杀细菌药物组合物，所述蛋白包含(或基本上组成是，或组成是)LRR结构域(例如作为其唯一活性成分)。在一 个实施方案中，LRR结构域是人N0D-LRR，例如人NODl-LRR或人N0D2-LRR。在其它实施方 案中，LRR 结构域是 TLR-LRR 结构域例如人 TLR-LRR，例如 TLR2-LRR、TLR4-LRR、TLR5-LRR、 TLR7-LRR、TLR8-LRR、TLR9-LRR。
本发明还包括该蛋白和/或本发明的蛋白杀细菌、特别是革兰氏阳性菌的用途。
在另一个实施方案中，提供了用于治疗和/或预防非人哺乳动物的病原细菌感染 的分离的非人哺乳动物LRR蛋白(例如NOD或TLR蛋白)，其中该LRR蛋白源自该非人哺乳 动物。
在本发明的另一方面，提供了鉴定杀细菌蛋白的方法，所述方法包括将细菌、特别 是哺乳动物例如人的病理性细菌，与分离的LRR蛋白相接触，如果该蛋白表现出杀细菌活 性则鉴定所述蛋白。在一些实施方案中，细菌是需氧的；在其它实施方案中，是厌氧的；在 另外的其它实施方案中，细菌是革兰氏阳性或革兰氏阴性菌。
4.附图简述


图1 结肠上皮中Nod2表达的免疫组织化学测定。图A 大鼠和人结肠的福尔马林 固定的石蜡包埋块用亲和纯化的兔抗_Nod2抗体(AB5 ；左)或作为阴性对照的兔IgG (右) 探测。紫色显示DAPI染色。图B:将大鼠结肠直接提取至SDS-PAGE样品缓冲液中，并使用 AB5通过蛋白质印迹来分析。鉴定到与Nod2相关的约IOOkDa的单个蛋白。
图2:在用大肠杆菌孵育SW480肠上皮细胞之后进行Nod2的免疫定位。以 10000 1的Μ0Ι，将SW480细胞与或不与大肠杆菌孵育4小时。固定细胞，并用抗-Nod2(绿 色)、鬼笔环肽(红色)和DAPI (紫色)染色。与大肠杆菌孵育之后，Nod2从细胞溶胶转移 至细胞质中的点状结构。
图3 在肠上皮细胞中大肠杆菌和Nod2的免疫定位。以10000 1的Μ0Ι，用大 肠杆菌将Caco2肠上皮细胞的汇合单层孵育2小时。固定细胞，并使用共聚焦显微镜使用 抗-Nod2 (AB5)和抗-LPS抗体通过免疫荧光来分析。
图4 用重组Nod2 LRR结构域孵育之后大肠杆菌的体外聚集。用20 μ g/ml BSA或 纯化的重组Nod2 LRR结构域将Iml PBS中的大肠杆菌(106)孵育12小时。将培养物的等 份试样接种在带盖玻片的载玻片上，并使用63X物镜通过光学显微镜分析。
图5 表达Nod2的293细胞的肺炎链球菌感染。自相同染色体基因座稳定表达氯 霉素乙酰转移酶(对照)、Nod2或克罗恩病相关Nod2突变体(Nod2-3020inSC)的293细胞 用肺炎链球菌(ATCC 49619)感染，10 1的Μ0Ι。将经庆大霉素保护的细菌铺在巧克力琼 脂上，观察每个细胞系的胞内细菌数目。
图6 加入金黄色葡萄球菌之前，用200 μ g/ml所示细菌组分预孵育纯化的Nod2 LRR结构域(Nod2 :30 μ g/ml)。加入BSA作为蛋白对照。使用商品化蛋白聚糖提取物(sPGN 可溶性蛋白聚糖，iPGN 不溶性蛋白聚糖)、脂磷壁酸(LTA 脂磷壁酸粗提取物，upLTA 超纯 脂磷壁酸提取物)或加热灭活的金黄色葡萄球菌(HKSA)。对照指示仅BSA存在时细菌的生长。
图7 :Nod2 LRR抗细菌靶(大肠杆菌)的纯化。将大肠杆菌(ATCC)在LB肉汤中 生长过夜，沉淀，并通过弗氏细胞压碎器(French press)提取细菌沉淀。进行竞争试验，监 控相对于金黄色葡萄球菌(ATCC 29233)的Nod2 LRR结构域活性。在每个步骤，将级分的7体积补至等体积，将样品加至抗细菌分析试验。最终在去污剂(NP40)不溶性级分中发现抑 制性级分。用盐酸胍提取该级分，通过凝胶过滤分离，收集级分，评价Nod2 LRR活性对金黄 色葡萄球菌的抑制。级分5(冊)含有抑制LRR活性(通过对蛋白酶K的敏感性确定)的蛋白。
图8 :Nod2抗细菌靶的LRR亲和纯化以及质谱法鉴定。图A 图7中用盐酸胍提取 的去污剂不溶性大肠杆菌级分进行凝胶过滤而得的级分5，加样到Nod2 LRR结构域亲和柱 上。通过NaCl梯度洗脱结合的蛋白。图B:考马斯亮蓝染色的凝胶，显示在Nod2 LRR结构 域亲和纯化之前的级分5 (F5)以及来自亲和柱的盐洗脱级分(E)。图C:在图B所示的提取 条带中的质谱蛋白质鉴定。
图9 来自大肠杆菌的野生型和3020insC LRR结构域亲和纯化的去污剂不溶性蛋 白的分离。通过弗氏细胞压碎器分级分离大肠杆菌，离心，用盐酸胍提取沉淀。将溶解的沉 淀分成两份，每个级分分别在Nod2LRR(WT)或Nod2 3020insC LRR(3020)亲和柱上分离。 用盐洗脱结合在两柱上的蛋白，用冰冷丙酮或TCA/丙酮沉淀，并通过SDS PAGE凝胶电泳分 离。选择、切割并处理凝胶的各区域，以用于蛋白的质谱鉴定(如表4、表5所示)。
图10 :TLR2和Nalp3 LRR结构域抑制单核细胞增生性李斯特菌生存力(由ATP-偶 联的发光分析试验显示)。用渐增浓度的所示重组LRR结构域在37°C孵育单核细胞增生性 李斯特菌(5X105个细菌/100μ 1)6小时，并通过发光分析(BacTiter-Glo =Promega)评价 ATP水平。所示的值是相对于在缺少LRR结构域下进行孵育的对照(100%)的值。结果代 表TLR2和Nalp3的两个实验。
图11:纯化的Nod2 LRR结构域的杀细菌作用在携带克罗恩病相关Nod2 3020insC 突变的蛋白中是缺陷的。所示结果代表若干实验。图A和B:Nod2 LRR结构域影响大肠杆 菌(图A)和枯草芽孢杆菌(图B)的膜极性。以所示的浓度将蛋白加入5X IO5个细菌的 100 μ L生长培养基中，并在37°C孵育2小时。在该过程结束前15分钟，将50 μ 1 10 μ g/ ml DiBAC4溶液加至每个孔中。用750 μ 1冰冷PBS/孔将板洗涤两次。通过流式细胞术测 定吸取染料的去极化细菌的百分比。图C 来自一系列模式识别受体的LRR结构域影响枯草 芽孢杆菌膜极性。如针对图A和B所描述的，用所示LRR结构域处理细菌，定量其对该细菌 的膜极性的影响。图D 通过琼脂扩散分析试验证实，Nodl和Nod2而不是Nod2 3020insC LRR结构域显示抗细菌活性。琼脂板接种所示细菌的菌苔。用无菌玻璃吸管在琼脂中穿出 约0.5cm直径孔，将所示蛋白(BSA蛋白对照或所示LRR结构域)或抗生素(氨苄西林或卡 那霉素)以在无菌PBS中的0. 5mg/ml浓度加至各孔。
图12 :Nod2 SNP (全长)抑制枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李 斯特菌和粪肠球菌的生存力(由ATP-偶联的发光分析显示)。该活性在携带克罗恩病相关 Nod2 3020insC和G908R突变的蛋白中是缺陷的。
图13 于35°C、37°C和39°C在细菌胁迫的条件下测试了 Nod2对金黄色葡萄球菌 生存力(通过ATP-偶联的发光分析试验显示)的影响。Nod2的抗细菌活性随细菌胁迫而 增加。
图14 渐增浓度的Nod2抑制枯草芽孢杆菌(图A)和金黄色葡萄球菌(图B)的 生长。所示的值是相对于在缺少LRR结构域下进行孵育的对照(100%)的值。
图15 :NAIP抑制嗜麦芽窄食单孢菌(S. maltophilia)的生长(图A)。Nodl抑制大8肠杆菌生长(图B)，单核细胞增生性李斯特菌生长被Nodl、Nod2、Nod2 3020insC和CIASl 抑制(图C)。
图16 :Nod2抑制金黄色葡萄球菌的生长。这种抑制不受共施用MDP、LPS或PGN的影响。
5.发明详述
依据本发明，因此提供了用作抗微生物剂的分离蛋白质，其包含多个LRR(富亮氨 酸重复序列)结构域。在例如下文所描述的本发明的使用中，已经发现这些蛋白可有效杀 死多种细菌且具有与已知抗生素相当的效力。
在本发明优选的实施方案中，有LRR在蛋白的C端。已经发现这可增加该蛋白的 抗微生物活性。
进一步优选，每个LRR结构域独立地包含式(I)的氨基酸序列或者基本上由式(I) 的氨基酸序列组成
(FILxxLxL (xxZ)YF2)(I)
其中
Fl和F2独立地是1至30个残基的连续氨基酸序列；
χ可以是任何氨基酸；
L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ；
Z 可以是 NxL 或 CxxL ；
N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ；
C 是〔78或％1·;且
Y = 0 或 1。
富亮氨酸重复序列(LRR)通常是形成α / β马蹄形褶(horseshoe folds)的蛋白 结构基序。每个LRR通常由重复的20-30个氨基酸的段组成，所述氨基酸段异乎寻常地富含 亮氨酸残基，尽管这些残基可被其它疏水残基取代。每个重复单元可具有β链-转角 螺旋结构，以致于由多个此LRR组成的组装区具有马蹄形或弧形，具有内部平行β折叠和 外部螺旋阵列(helix array)。β折叠的一面和螺旋阵列的一侧暴露于溶剂，因此，典型地 亲水残基占优势。螺旋与折叠之间的区域通常形成疏水核，通常与亮氨酸残基紧密地在空 间上压在一起。在本发明的备选实施方案中，其它疏水氨基酸残基例如异亮氨酸、缬氨酸、 苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸或半胱氨酸可取代亮氨酸残基。
—般而言，在本发明的蛋白中，所有LRR结构域均形成单个连续结构，采用弧形或 马蹄形。弧或马蹄的内部凹面可主要由平行β-链组成，而外部凸面可包括多种二级结构， 例如α-螺旋、31(|-螺旋、聚脯氨酸II螺旋或β-转角的串联排列。在本发明的实施方案 中，凹面上的β-链与凸面的主要螺旋的元件通过短环或β-转角连接。
本发明的蛋白包含足够LRR以具有抗微生物活性，并且本发明的蛋白适宜地包括 3至20个LRR结构域。本发明的具体实施方案包含至少3个LRR、至少5个LRR或至少7 个LRR。在本发明的其它实施方案中，该蛋白可包含至少4个、至少6个、至少8个、至少9 个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少 17个、至少18个、至少19或至少20个LRR结构域。
在形成本发明的实施方案的一类蛋白中，存在高比例的亮氨酸残基。因此，每个LRR中至少2个L残基是Leu，或每个LRR中至少3个L残基是Leu。在某些实施方案中，基 本上所有的L残基均是Leu。本发明的蛋白进一步优选是水溶性的。
本发明蛋白的一个具体的亚类包含5个或5个以上的LRR(富亮氨酸重复序列) 结构域，其用作抗细菌剂，其中该蛋白的C端是LRR结构域，并且每个LRR结构域包含式(I) 的氨基酸序列
(FILxxLxL (xxZ)YF2)(I)
其中
Fl和F2独立地是1至30个残基的连续氨基酸序列；
χ可以是任何氨基酸；
L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ；
Z 可以是 NxL 或 CxxL ；
N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ；
C 是 078或％1·;且
Y = 0 或 1。
在蛋白的该亚类中，每个LRR中至少2个L残基优选为Leu。
本文所用的术语“分离的”是指本发明的蛋白和多核苷酸，根据具体情况而定，存 在于不同于其天然环境的物理环境中。例如，分离的蛋白或多核苷酸，相对于其天然存在的 复杂的细胞环境，可以是基本上分离的(例如纯化的)。然而，应注意到，尽管本发明的蛋白 可以在本文中描述成“分离的”，但是这并不意味着该蛋白必须天然存在。
术语“源自，，和“源于”指所讨论的蛋白或多核苷酸时，不管其物理起源。因此，举 例来说，“源自天然含LRR蛋白的式(I)LRR(例如串联的)”是指具有如下一级氨基酸序列 的LRR，所述一级氨基酸序列与存在于天然含LRR蛋白中的相同但不必纯化自该天然来源。
术语“死亡折叠结构域(death fold domain) ”是指一个结构域家族，其特征在 于六个紧压在一起的α螺旋，所述α螺旋在程序性细胞死亡(细胞凋亡)中起显著的作 用。该家族的成员包括胱天蛋白酶募集结构域(CARD)、热蛋白结构域(PYD)、死亡结构域 (DD)和死亡效应子结构域(DED)。对于该家族的更多信息，读者尤其可以参考Lahm A等人 (2003) ；Cell dead and Differentiation, 10,10-12 以及其中所引用的参考文献。
术语“LRR”或“LRR基序”及其语法变异是指式(I)的富亮氨酸重复序列基序。
术语“LRR结构域”是指包含(或基本上组成是，或组成是)两个或两个以上(多 达约50个)，通常串联的，式(I)LRR的蛋白质结构域。
术语“NOD蛋白”是指含有中央核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)、氨基端CARD结 构域和羧基端LRR结构域的蛋白。读者尤其可以参考^iohara N.等人(2005)，Armu. Rev. Biochem 74 :355-383的第361页的表I，获得有关人NOD家族成员的细节(不必是毫无遗 漏的)。
后缀“-LRR”是指该后缀之前的蛋白质的天然LRR结构域，因此，“N0D-LRR”是指 存在于天然NOD家族成员中的LRR结构域。
“LRR蛋白”表示蛋白包含至少一个LRR结构域。
“TLR”是指toll样受体家族。Toll-样受体(TLR)是一类单跨膜非催化性受体， 其结构性地识别源自微生物的保守分子。参见Mitchell JA (2007), J Endocrinol 193(3)；323-30，其全部内容通过引用并入本文并且尤其可以被读者参考。
“蛋白”包括多肽。
“人 N0D2” 是指 SEQ ID NO 1 的蛋白。
“人 N0D1” 是指 SEQ ID N0:2 的蛋白。
“人 N0D2-LRR” 是指 SEQ ID NO :3 的蛋白。
“人 NODl-LRR"是指 SEQ ID NO 4 的蛋白。
“人 CIITA-LRR” 是指 SEQ ID NO 5 的蛋白。
“人 TLR2-LRR” 是指 SEQ ID NO 6 的蛋白。
“人 Nalp3-LRR” 是指 SEQ ID NO 7 的蛋白。
“抗细菌药物组合物”是指在施用至个体之前尤其具有抗细菌活性的药物组合物。
5.1蛋白质
本发明至少部分基于令人惊讶的发现含有LRR基序(式(I))的蛋白质具有抗细 菌(特别是杀细菌)活性。尽管我们证明了包含LRR结构域和其它结构域(例如NOD家族 蛋白质中见到的结构域)的天然蛋白质具有显著的抗细菌活性，但是我们也证明LRR结构 域自身具有抗细菌活性。
在一些实施方案中，该分离蛋白质包含2至100个、更特别是2至50个、例如2至 45个串联排列的式⑴的LRR基序。
在典型的实施方案中，该LRR基序为15至50个残基长，例如20至30个残基长。 因此，在一些实施方案中，该分离蛋白质包含2至100个(例如2至50个)串联排列的式 (I)的LRR基序，每个基序由15至50个连续氨基酸残基(例如20至30个残基)组成。
在一些实施方案中，蛋白质是人工的，其具有不存在于自然界中的排列。在这些实 施方案中，蛋白质可包含中央核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)、羧基端LRR结构域(包含例 如人为数量的LRR结构域，优选串联排列)和氨基端效应子结构域。该效应子结构域例如 可以促进杀死(例如通过细胞凋亡)靶细胞，例如病原细菌。该效应子结构域的实例是死 亡折叠结构域，例如CARD、热蛋白质、死亡结构域和死亡效应子结构域。
在本发明的其它方面，提供了分离的蛋白质，其包含源自天然蛋白质的LRR结构 域。在本发明的这个方面的一些实施方案中，该分离蛋白质是包含LRR结构域的天然蛋 白质(本文有时称为“LRR蛋白质”)。该天然LRR蛋白质可以是“RI-样”、“CC”、“细菌 的”、“SDS22-样”、“植物特异性”、“典型的”或“TpLRR”，参见 Kajava Α. V. (1998)，J. Mol. Biol. 277，519-527 和 Ohyanagi T 等人(1997)，FASEB J 11 :A949，这两篇文献全部内容通 过引用并入本文并且尤其可以被读者参考。该天然蛋白质的实例是动物源性蛋白质并且包 括NOD家族的成员，特别是人类(或其它灵长类动物)N0D蛋白质(例如人NODl或人N0D2)。 其它成员包括Toll-样受体(TLI )家族并且包括TLR 2，4，5，7，8和9，特别是其人类和其它 哺乳动物直系同源物。其它进一步的实例包括成员CIITA和NAIP。
在一些实施方案中，分离蛋白质选自SEQ ID N0:l、2、3或4。
在本发明的其它方面，提供了分离的LRR结构域，S卩，由分离的LRR结构域组成的 蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质可以是分离的LRR结构域。
在本发明的其它方面，提供了分离的LRR蛋白质，条件是该LRR蛋白质不是包含N 端富亮氨酸重复序列、一个或多个富亮氨酸重复序列、C端富亮氨酸重复序列以及包含α螺旋的连接肽的分离多肽。
5. 2多核苷酸
在本发明的其它方面，提供了编码本发明蛋白质的分离多核苷酸(例如RNA或 cDNA)。此多核苷酸可用于制备本发明的分离蛋白质的方法中，例如用于制备包含本发明的 分离蛋白质的药物(例如药物组合物)。在其它方面，编码本发明蛋白质的多核苷酸可掺入 载体例如质粒、病毒、微型染色体、转座子等中，作为治疗性或预防性免疫原性组合物(例 如疫苗、例如DNA疫苗)的一部分，以增加宿主对病原体例如病原细菌的防御。
因此，在本发明的一个方面，提供了分离多核苷酸例如DNA(例如cDNA)或RNA，其 编码包含(或基本上组成是，或组成是)式(I)的LRR的蛋白质。
在本发明的另一方面，提供了分离多核苷酸例如DNA(例如cDNA)或RNA，其编码 包含LRR结构域的蛋白质。在这个方面的一些实施方案中，提供了编码天然LRR结构域例 如NOD LRR结构域、特别是人NOD LRR结构域例如SEQ ID NO :2或3的蛋白质的分离多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供了分离多核苷酸例如DNA(例如cDNA)或RNA，其编码 LRR蛋白质、特别是动物源性天然LRR蛋白质例如NOD蛋白质、更特别是人类或其它灵长类 动物NOD蛋白质。其中的实例包括编码人NOD 1或人N0D2的分离多核苷酸。其它实例包 括编码Toll样受体(TLR)例如TLR2，7，8或9和CIITA或NAIP的分离多核苷酸。
5. 3制备方法
技术领域：
本发明的某些方面涉及制备本发明的分离蛋白质和蛋白质、特别是第5. 1节中提 及的那些蛋白质的方法。
本发明的分离蛋白质和蛋白质通常可使用本领域技术人员众所周知的重组细胞 培养技术来制备。将编码该蛋白质的多核苷酸分离并插入到复制型载体例如质粒，以用 于进一步克隆(扩增)或表达。一种有用的表达系统是谷氨酸合成酶系统(例如Lonza Biologies公司出售的)，特别在宿主细胞是CHO或NSO时(参见下文)。使用常规操作(例 如寡核苷酸探针)可以方便地对编码多核苷酸或蛋白质的多核苷酸进行分离和测序。可以 使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微型染色体，其中质粒是典型的实施方案。一 般来说，此类载体还包括信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和 转录终止序列，与多核苷酸可操作地连接以便促进表达。
5. 3.1信号序列
本发明的蛋白质可被制备成带有异源信号序列的、在成熟蛋白质的N末端具有特 异性切割位点的融合蛋白质。该信号序列应为宿主细胞所识别和加工。对于原核宿主细胞， 该信号序列可以是碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定性肠毒素II的前导序列(leader)。对 于酵母分泌，该信号序列可以是酵母转化酶前导序列，[α]因子前导序列或酸性磷酸酶前 导序列，参见例如W090/13646。在哺乳动物细胞系统中，病毒分泌性前导序列例如单纯疱 疹gD信号和天然免疫球蛋白信号序列是可获得的。通常，该信号序列与编码本发明抗体的 DNA在阅读框内连接。
5. 3. 2复制起点
复制起点是本领域众所周知的，其中pBR322适于大多数革兰氏阴性菌、2μ质粒 适于大多数酵母、各种病毒起点，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV适于大多数哺乳动物细胞。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分，但是SV40包含早期启动子，所以 可以被使用。
5. 3. 3选择标记
典型的选择基因编码这样的蛋白质，其(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄 西林、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)的抗性，或(b)弥补营养缺陷或提供复合培养基中没有 的营养素。选择方案可包括停滞宿主细胞的生长。已用编码本发明的治疗性抗体的基因成 功地转化的细胞，由于例如选择标记所赋予的药物抗性而存活。另一个实例是所谓的DHFR 选择标记，其中在存在氨甲蝶呤下培养转化体。在典型的实施方案中，在存在渐增量的氨甲 蝶呤下培养细胞以扩增感兴趣的外源基因的拷贝数。CHO细胞是对于DHFR选择特别有用的 细胞系。其它的实例是谷氨酸合成酶表达系统(Lonza Biologies)。适用于酵母的选择基 因是 trpl 基因，参见 Stinchcomb 等人 Nature 282，38，1979。
5. 3. 4 启动子
用于表达本发明蛋白质和多核苷酸的适宜启动子与编码该抗体的DNA/多核苷酸 可操作地连接。用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β -内酰胺酶和乳糖启动子系统、 碱性磷酸酶、色氨酸和杂合启动子，例如Tac。适用于在酵母细胞中表达的启动子包括3-磷 酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，例如烯醇酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧 酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶和葡糖激酶。可诱导的酵 母启动子包括醇脱氢酶2、异细胞色素CGsocytochrome C)、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负 责氮代谢或麦芽糖/半乳糖利用的酶。
用于在哺乳动物细胞系统中表达的启动子包括病毒启动子，例如多瘤病毒、禽痘 病毒和腺病毒(例如腺病毒幻、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(特别是立即早 期基因启动子)、反转录病毒、乙型肝炎病毒、肌动蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和早期 或晚期猿猴病毒40。当然，启动子的选择是基于与用于表达的宿主细胞的合适相容性。因 此，在一个实施方案中，提供了包含RSV和/或SV40和/或CMV启动子、编码本发明的轻链 V区(VL)、KC区的DNA、以及新霉素与氨苄西林抗性选择标记的第一质粒，以及包含RSV或 SV40启动子、编码本发明的重链V区(VH)的DNA、编码[γ 1]恒定区的DNA、DHFR和氨苄西 林抗性标记的第二质粒。
5. 3. 5增强子元件
在合适的情况下(例如用于在高等真核生物中表达时)，可以使用在载体中与启 动子元件可操作地连接的增强子元件。合适的哺乳动物增强子序列包括来自珠蛋白、弹性 蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素的增强子元件。或者，可使用来自真核细胞病毒的增强 子元件，例如SV40增强子(在bpl00-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强 子、杆状病毒增强子或鼠IgGh基因座(参见W004/00982;3)。增强子优选在载体上位于启 动子上游。
5. 3. 6宿主细胞
对于编码本发明分离蛋白质的克隆或表达载体，合适的宿主细胞是原核、酵母 或高等真核细胞。合适的原核细胞包括真细菌，例如肠杆菌科(entercAacteriaceae)， 如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(例如ATCC 31，446 ;31，537 ;27，325))、肠 杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Slmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、 沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属 (Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆 菌(B. Iicheniformis)(参见DD 266 710)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)例如铜绿假单胞 杆菌(P. aeruginosa)和链霉菌属(Str印tomyces)。酵母宿主细胞中，还可以考虑酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、克鲁维 酵母(Kluyveromyces)(例如 ATCC16, 045 ； 12，424 ；24178 ；56，500)、耶氏酵母(yarrowia) (EP402, 226)、巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris) (EP183, 070，还参见 Peng 等人 J. Biotechnol. 108 Q004) 185-192)、假丝酵母(Candida)、里氏木霉(Thchoderma reesia) (EP244, 234)、青霉(Penicillin)、弯颈霉(Tolypocladium)和曲霉(Aspergillus)宿主，例 如构巢曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。
本发明的宿主细胞可以是高等真核细胞。合适的高等真核宿主细胞包括哺乳动物 细胞例如 COS-I (ATCC No. CRL 1650)、COS-7 (ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞系 293、幼仓鼠 肾细胞(BHK) (ATCC CRL. 1632)、BHK570 (ATCC NO CRL 10314) ,293 (ATCC NO. CRL 1573)、 中国仓鼠卵巢细胞CHO(例如CHO-KU ATCC NO =CCL 61)、DHFR-CHO细胞系例如DG44(参 见 Urlaub 等人(1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12，555-556))，特别是那些适应于悬浮 培养的CHO细胞系、小鼠塞尔托利细胞(Sertoli cell)、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞(ATCC CRL-1587)、HELA 细胞、犬肾细胞(ATCC CCL 34)、人肺细胞(ATCC CCL 75), Hep G2 和骨髓 瘤或淋巴瘤细胞例如NSO(参见US 5，807，715)、Sp2/0，Y0。因此，在本发明的一个实施方 案中，提供了稳定转化的宿主细胞，其包含编码分离蛋白质的载体，所述分离蛋白质包含两 个或两个以上的式(I)的LRR、LRR结构域或LRR蛋白质。
5. 3. 7细菌发酵
细菌系统可以用于制备本发明的蛋白质。通常，它们被制备成不溶性周质蛋白 质，其可根据本领域技术人员已知方法被提取和再折叠以形成活性蛋白质，参见Sanchez 等人(1999) J. Biotechnol. 72，13-20 和 Cupit PM 等人(1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277。
5.3.8细胞培养方法
可以通过本领域技术人员已知的任何方法，培养用编码本发明的蛋白质或其抗 原结合片段的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以在转瓶、滚瓶或中空纤维系统中培养， 但是对于大规模生产，优选使用搅拌釜反应器，特别是用于悬浮培养。优选，使用例如喷 头(sparger)、挡板或低剪切涡轮使搅拌釜适应于通气。对于鼓泡塔和气升式反应器，可 以用空气或氧气泡直接通气。当宿主细胞在无血清培养基中培养时，优选该培养基补充有 细胞保护剂(例如pluronic F-68)，以帮助避免由通气操作造成的细胞损伤。根据宿主 细胞的特点，对于贴壁依赖性细胞系，使用微载体作为生长基底，或可以对细胞进行悬浮培 养(典型的情况)适应化。宿主细胞、特别是无脊椎动物宿主细胞的培养可以使用多种操 作模式例如补料-分批、重复的分批工艺(参见Drapeau等人(1994) cytotechnology 15 103-109)、延长的分批工艺或灌流培养。虽然可以在含有血清例如胎牛血清(FCS)的培 养基中培养重组转化的哺乳动物宿主细胞，但是，优选地在合成的无血清培养基(例如在 Keen等人(199 Cytotechnology 17 :153-163中公开的培养基)或市售可得的培养基例14如ftx)CH0-CDM或UltraCHO(TM) (Cambrex NJ,USA)中培养此类宿主细胞，如果需要，可以在 培养基中补充能源例如葡萄糖和合成的生长因子例如重组胰岛素。宿主细胞的无血清培养 可能要求对那些细胞进行在无血清条件下生长的适应化。一种适应化方法是在含有血清的 培养基中培养此宿主细胞，然后反复地将80%的培养基换成无血清培养基，以使宿主细胞 学习适应无血清条件(参见例如Scharfenberg K等人(19卯)动物细胞技术面向21世纪 的发展(Animal Cell technology !Developments towards the 21st century) (Beuvery E. G.等人编辑)，第 19-623 页，KluwerAcademic publishers)。
可以使用多种技术回收和纯化分泌到培养基中的本发明蛋白质，从而提供适合于 所需用途的纯化程度。例如，本发明的治疗性蛋白质用于治疗人类患者的用途通常要求至 少95%纯度、更常见地要求98%或99%或更高的纯度(与粗培养基相比)。首先，通常利 用离心去除培养基中的细胞碎片，随后使用例如微滤、超滤和/或深层过滤进行上清液的 澄清化步骤。还可以使用多种其它技术，例如透析和凝胶电泳和层析技术，例如羟基磷灰 石(HA)层析、亲和层析(任选地涉及亲和标签体系如多组氨酸)和/或疏水相互作用层析 (HIC，参见US 5, 429, 746) 0通常，还可以使用各种去除病毒的步骤(例如，纳米过滤，使用 例如DV-20滤器进行)。经过各种这些步骤，可以提供纯化制品，其包含至少35mg/ml或更 多(例如100mg/ml或更多)的本发明的分离蛋白质，从而构成本发明的一个实施方案。适 宜地，此类制品基本上不含聚集形式的本发明的蛋白质。
5.4.药物组合物
在某些实施方案中，将本发明的分离蛋白质和多核苷酸掺入药物组合物中，以用 于治疗和/或预防病原细菌感染。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗和/或预防对人 具有致病性的细菌的感染。在其它实施方案中，药物组合物用于治疗和/或预防对非人动 物具有致病性的细菌的感染，例如兽医用。用于治疗和/或预防特定病原细菌感染的实施 方案在下面更详细地描述。读者可以想到第3节、第5. 1节和第5. 2节中描述的每种和所 有蛋白质或多核苷酸方面或实施方案旨在单独地且具体地在此处考虑并入药物组合物中。
通常地，本发明的药物组合物包含(或基本上组成是)治疗有效量的(例如 以单位剂量的形式)的本发明分离蛋白质和公认的药学实践所已知且要求的可药用载 体。用于药学用途的蛋白质制剂是熟知的，读者尤其可以参考Hovgaard L(2000) “肽和 蛋白质的药学制剂发展(Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins) CRC Press, ISBN :0748407456 ；Nail S.等人(2002) “蛋白质制剂的发展 禾口 3a (Development and manufacture of protein pharmaceuticals)，，，Springer, ISBN :0306467453 ；McNal Iy Ε. J. (1999) “蛋白质配制与递送(protein formulation and delivery)(Drugs & the Pharmaceutical Sciences), Marcel Dekker Ltd, ISBN 08M778839。还参见Oslo等人编辑的雷明顿药物科学(Remington' s Pharmaceutical kiences)，第16版，1980，Mack Publishing Co.，所述公开物由此通过引用并入本文。可 以根据希望治疗的根本性疾病或状态，使本发明的药物组合物适用于通过任何便利或必需 的途径施用。因此在一些实施方案中，提供了可静脉内施用的药物组合物，其包含治疗有效 量的本发明的蛋白质。在其它实施方案中，提供了适用于皮下施用治疗有效量的本发明蛋 白质的药物组合物。
通过将具有所需的纯化程度的本发明蛋白质与药理学上可接受的载体、赋形剂或15稳定剂混合，可以将本发明的蛋白质制备用于贮存或施用。此类材料在所用的剂量和浓度 下对接受者是无毒的。如果本发明的蛋白质是水溶性的，那么它可在缓冲液(优选PH为约 7至8)例如磷酸盐或其它有机酸盐中配制。如果蛋白质在水中仅部分可溶，那么可以通过 用0. 04-0. 05% (w/v)量的非离子表面活性剂例如Tween、Pluronics或PEG(例如Tween 80)对蛋白质进行配制，将其制备成微乳，从而增加蛋白质的溶解度。
任选地，可以加入其它成分，例如抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约10个 残基)多肽，如聚精氨酸或三肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合 物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和 其它碳水化合物(包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精类；螯合剂例如EDTA ；和 糖醇例如甘露醇或山梨醇。
用于治疗施用的本发明蛋白质必须是无菌的。可以通过过滤穿过无菌滤膜(例如 0.2微米膜)容易地实现无菌。本发明的蛋白质通常以冻干形式，或者如果它具有高度的热 和氧化变性稳定性，以水溶液形式贮存。本发明的蛋白质制品的PH通常为约6至8，尽管在 某些情况中较高或较低的PH值也可以是合适的。应理解，使用某些前述赋形剂、载体或稳 定剂将会导致本发明蛋白质的盐的形成。
如果胃肠外使用本发明的蛋白质，则可以将含有本发明蛋白质的治疗性组合物置 于具有无菌取用孔的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的瓶塞的静脉溶液袋或小瓶。
一般来说，当疾病/病症允许时，技术人员应该对本发明的蛋白质进行配制并确 定剂量以用于位点特异性递送。这在创伤和溃疡的情况下是方便的。例如，本发明的蛋白 质可以掺入凝胶(例如水凝胶)中并施用至创伤或溃疡床。
还可制备持续释放制剂，包括微囊颗粒和可植入品的形成。对于制备持续释放组 合物，优选将本发明的蛋白质掺入可生物降解的基质或微囊中。适用于此意图的材料是 聚乳酸，尽管可以使用聚-(a_羟基羧酸)的其它聚合物，例如聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133，988A)。其它可生物降解的聚合物包括聚(内酯)类、聚(缩醛)类、聚(原酸酯)类 或聚(原碳酸酯)类。这里最初的考虑必须是载体本身或其降解产物在靶组织中是无毒 的，并且不会进一步加重病状。这可通过在靶紊乱的动物模型中，或如果此类模型是得不到 的，在正常动物中的常规筛选来确定。很多科学出版物记载此类动物模型。
对于持续释放组合物的实例，参见U. S.专利号3，773，919、EP 58，481A、U. S.专 利号 3，887，699、EP 158，277A、加拿大专利号 1176565、U. Sidman 等人，Biopolymers 22， 547 [1983]和 R. Langer 等人，Chem. Tech. 12，98 [1982]。
当局部应用时，本发明的蛋白质适于与其它成分例如载体和/或助剂组合。对此 类其它成分的性质没有限定，除了它们必须是可药用的并且对于其预期的施用是有效的， 并且不会降低该组合物的活性成分的活性。合适赋形剂的实例包括含有或不含纯化胶原的 软膏、乳膏、凝胶或悬液。还可将该组合物充入透皮贴片、硬膏剂和绷带中，优选以液体或半 液体形式。
为了获得凝胶制剂，可将配制于液体组合物中的本发明蛋白质与有效量的水溶性 多糖或合成聚合物例如聚乙二醇混合，以形成可局部应用的适宜粘度的凝胶。可以使用的 多糖包括例如纤维素衍生物，例如醚化纤维素衍生物，包括烷基纤维素、羟烷基纤维素和烷 基羟烷基纤维素，例如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素；淀粉和分级淀粉(fractionated starch)；琼脂；海藻酸和藻酸盐；阿拉伯胶； 普鲁兰多糖(pullullan)；琼脂糖；角叉菜胶；右旋糖酐类；糊精类；果聚糖类；菊粉；甘露 聚糖类；木聚糖类；阿拉伯聚糖；壳聚糖；糖原；葡聚糖类；和合成生物聚合物；以及胶类例 如黄原胶；瓜尔胶；刺槐豆胶(locust bean gum)；阿拉伯胶；西黄蓍胶；和刺梧桐树胶；及 其衍生物和混合物。本文优选的胶凝剂对生物系统惰性、无毒、易于制备且不太松软或粘 稠，并且不会使包含于其中的本发明蛋白质不稳定。
优选，多糖是醚化纤维素衍生物，更优选是成分明确的、纯化的并记载于USP中的 多糖，例如甲基纤维素和羟烷基纤维素衍生物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基 甲基纤维素。本文最优选的是甲基纤维素。
用于胶凝的聚乙二醇通常是为获得适宜粘度的低分子量和高分子量聚乙二醇的 混合物。例如，当分子量为400-600的聚乙二醇和分子量为1500的聚乙二醇的混合物以适 宜比率混合而获得糊剂时，该混合物对此目的是有效的。
用于多糖和聚乙二醇的术语“水溶性的”意指包括胶体溶液和分散液。通常地，纤 维素衍生物的溶解度由醚基的取代程度决定，并且本文有用的稳定衍生物应在纤维素链中 具有足够量的此类醚基/脱水葡萄糖单元以使衍生物具有水溶性。至少0. 35醚基/脱水 葡萄糖单元的醚取代程度通常是足够的。此外，该纤维素衍生物可以是碱金属盐的形式，例 如Li盐、Na盐、K盐或Cs盐。
如果在凝胶中使用甲基纤维素，则优选它包含约2-5%、更优选约3%的凝胶，本 发明的蛋白质以约300-1000mg/ml凝胶的量存在。
所使用的剂量取决于上述的各因素。作为一般的建议，配制本发明的蛋白质，并以 能在组织中建立有效但并未过分有毒的大于约0. lng/cc (最高至最大剂量)的水平的剂量 递送至靶点或组织。如果可能的话，通过连续输注、持续释放、局部应用或以凭经验而定的 频率注射，应保持这种组织内浓度。
特别适合于此本发明实践中所用的本发明蛋白质的临床施用的组合物包括，例如 无菌水溶液或无菌可水合粉末例如冻干蛋白质。通常期望在制剂中还包括适宜量(一般以 足以使制剂等渗的量)的可药用盐。通常也包括足够量的PH调节剂例如精氨酸碱和磷酸 以维持适宜的PH，一般为5. 5至7. 5。而且，为了提高含水制剂的货架期或稳定性，还可期 望包括其它试剂，例如甘油。照这样，使制剂适于胃肠外施用，特别是静脉内施用。
本发明的药物组合物的剂量和所需药物浓度可随所展望的特定用途而变化，并且 在主治医师/健康护理专业人士的视野内。
因此，在某些实施方案中，提供了抗细菌(例如杀细菌)药物组合物，其包含分离 的NOD蛋白质，特别是分离的人NOD蛋白质，例如人NODl或人N0D2 (例如作为其唯一活性 成分)。
在其它实施方案中，提供了药物组合物、特别是抗细菌药物组合物的制备方法，所 述方法包括提供分离NOD蛋白质，特别是分离人NOD蛋白质，例如人NODl和/或人N0D2。
因此，在一些其它实施方案中，提供了抗细菌(例如杀细菌)药物组合物，其包含 分离NOD-LRR结构域，特别是分离人NOD-LRR结构域，例如人NODl-LRR或人N0D2_LRR(例 如作为其唯一活性成分)。
因此，在一些其它实施方案中，提供了包含蛋白质作为其唯一活性成分的药物组合物(例如抗细菌如杀细菌药物组合物)，所述蛋白质由分离的LRR结构域例如分离的 NOD-LRR结构域，特别是分离人NOD-LRR结构域例如人NODl-LRR或人N0D2_LRR(例如作 为其唯一活性成分)，或分离的人TLR-LRR结构域例如TLR2-LRR、TLR4-LRR，TLR5-LRR、 TLR9-LRR 组成。
在其它实施方案中，提供了药物组合物、特别是抗细菌药物组合物的制备方法，所 述方法包括提供分离LRR蛋白质例如分离人LRR蛋白质，例如分离NOD-LRR结构域，特别是 分离人NOD-LRR结构域例如人NODl-LRR和/或人N0D2-LRR。
在其它实施方案中，提供了抗细菌(例如杀细菌)药物组合物，其包含(例如作为 其唯一活性成分)分离的TLR蛋白质，例如分离的哺乳动物TLR蛋白质，例如人TLR 4，5。
在其它实施方案中，提供了抗细菌(例如杀细菌)药物组合物，其包含(例如作 为其唯一活性成分)分离的TLR-LRR，例如分离的哺乳动物TLR-LRR，例如人TLR4-LRR、人 TLR5-LRR、人 TLR2-LRR。
在其它实施方案中，提供了抗细菌(例如杀细菌)药物组合物的制备方法，所述方 法包括提供(例如作为其唯一活性成分)分离的TLR-LRR，例如分离的哺乳动物TLR-LRR， 例如人 TLR4-LRR、人 TLR5-LRR 或人 TLR2-LRR。
5. 4. 1其它组合物和物品
在一些实施方案中，有效量的本发明分离蛋白质(例如上文第3节和5. 1中详述) 被掺入用于对有需要的表面或物品进行消毒的消毒剂组合物，例如含水消毒剂组合物中。 读者可以想到第3节和第5. 1节中所述的所有方面或实施方案可以单独且明确地被考虑 用于本节中。此类表面的实例包括通常见于临床环境的那些表面，例如医院病房、手术表面 等，以及希望减少与病原细菌接触的其它表面。本发明的消毒剂组合物还可以用于对物品 例如医疗物品(例如导管或手术器械)进行消毒，任选与其它良好临床实践中所已知且所 要求的灭菌技术联合。本发明的蛋白质还可用于对被病原细菌污染的水进行消毒，本发明 包括对被细菌、特别是对人和/或其它哺乳动物有致病性的细菌，污染的水进行消毒的方 法，所述方法包含将所述污染水与本发明的蛋白质混合。
在其它实施方案中，还提供了包含(或基本上组成是)本发明蛋白质的创伤和/ 或手术敷料。
5. 5病原细菌
在本发明的某些实施方案中，组合物例如药物组合物可用于治疗和/或预防病原 细菌的感染。如前所述，细菌可以对人和/或其它哺乳动物具有致病性。在一些实施方案 中，该病原细菌是革兰氏阳性的，在其它实施方案中，该病原细菌是革兰氏阴性的。在其它 预期的实施方案中，该病原细菌是对宿主(例如人)具有致病性的厌氧细菌。病原细菌的 实例包括
Ififtf 云力禾干胃(Acinetobacter baumanii)、方-M 禾中(Actinobacillis spp)、放射菌类(Actinomycetes)、放线菌属(Actinomyces)(例如以色列放线 菌(Actinomyces israelii)、内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)、放线菌属 物种(Actinomyces spp))、气单胞菌属物种(Aeromonas spp)(例如嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)、温禾口气单胞菌(Aeromonas sobria)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas Caviae))、厌氧球菌(Anaerobic Cocci)例如消化链球菌属(Peptostreptococus)、韦荣球菌属(Veillonella)、革兰氏阳性厌氧杆菌(Anaerobic Bacilli)例如动弯杆 菌属物种(Mobiluncus spp)、痤疫丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、乳杆菌属 (Lactobacillus)、真细菌属(Eubacterium)、双岐杆菌属物种(Bifidobacterium spp)、革 兰氏阴性厌氧杆菌例如拟杆菌属(Bacteroides)、普雷沃菌属物种(Prevotella spp)、紫单 胞菌属(Porphyromonas spp)、梭杆菌属(Fusobacterium spp)、芽孢杆菌属物禾中(Bacillus spp)(例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯 草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearthermophilus))、 拟杆菌属物种(Bacteroides spp)(例如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))、博 德特菌属物种(Bordetella spp)(例如百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、 副百日咳博德特菌(Bordetella parapertussis)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchis印tica))、疏螺旋体属物种(Borrelia spp)(例如回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌属物种(Brucella spp)(例如流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布氏杆菌(Brucella canis)、马尔他 布鲁氏菌(Brucella melintensis)、猪布氏杆菌(Brucella suis)伯霍尔德杆菌属物 种(Burkholderia spp)(例如类鼻疽伯霍尔德杆菌(Burkholderia pseudomallei)、洋 葱伯霍尔德杆菌(Burkholderia c印acia))、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)(例如 空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、红嘴 鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus))、柠檬酸 杆菌属物种(Citrobacter spp)(例如弗氏柠檬酸杆菌属(Citrobacter freundii)、 多变柠檬酸杆菌(Citrobacter diversus))、梭菌属物种(Clostridium spp)(例如产 气荚膜梭菌(Clostridium perfingens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭 菌(Clostridium botulinum))、棒杆菌属物种(Corynebacterium spp)(例如白喉棒杆 菌(Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeum)、角军月尿棒 If |if (Corynebacterium urealyticum)) > jHI^S^^ 1 lif (Edwardsiella tarda) > 1 If 菌属物禾中(Enterobacter spp)(例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、聚团肠 杆菌(Enterobacter agglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterbacter cloacae))、大肠杆菌 (Escherichia coli)(例如肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Ε. coli)、肠侵袭性大 肠杆菌(enteroinvasive Ε· coli)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E. coli)、肠 IfiI ；JSff (enterohemorrhagic Ε. coli) > ^ ^ fii；Jgff^ (uropathogenic Ε. coli))、克雷伯菌属物种(Klebsiella spp)(例如肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca))、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、变形菌属物种(Proteus spp)(例如奇异变形菌(Proteus mirabilis)、普通 变形菌(Proteus vulgaris))、普罗威登斯菌属物种(Providencia spp)(例如产碱普罗 ^ Ι " (Providencia alcalifaciens) >|| 1 1(Providencia rettgeri) >斯氏普罗威登斯菌(Providenciastuartii))、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)(例 如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、肠炎 沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerauis)、鼠 伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属物种(Serratia spp)(粘质沙 雷氏菌(Serratia marcesans)、液化沙雷氏菌(Serratia liquifaciens))、志贺菌属物种(shigella spp)(例如痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、宋氏志贺菌(Shigella sonnei))、耶尔森菌 属物种(Yersinia spp)(例如小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫 耳口尔森菌(Yersinia pestis)、假结核病耳口尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)) > 肠球菌属物禾中(Enterococcus spp)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠 球菌(Enterococcus faecium)) > Erysipelothrix rhusopathiae> 土拉热弗 Il月西丝 胃(Francisella tularensis)、Hf il 木干胃 M 禾中(Haemophilus spp) ( M1 ^ Bf ifil ff ^ (Haemophilus influenzae) > ft 3 W Bf il ff ^ (Haemophilus dureyi) > Bf ifil ff ^ (Haemophilus aegyptius)、畐Ij流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、畐Ij溶血性 嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus))、螺杆菌属物种(Helicobacter spp)(例如 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、芬纳尔螺 杆菌(Helicobacter fennelliae))、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺 旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞±曾生j■生李斯特菌(Listeria monocytogenes) > 微球菌属物种(Micrococcus spp)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、麻风分 枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、奴 卡菌属物种(Nocardia spp)(例如星状诺卡尔菌(Nocardia asteroides)、巴西诺卡 菌(Nocardia brasiliensis)、奈瑟球菌属物种(Neisseria spp)(例如淋病奈瑟球菌 (Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Nesseria meningitides))、多杀巴斯德菌 (Pasteurella multocida)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、铜绿假单 胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、红球菌属物禾中(Rhodococcus spp)、葡萄球菌属物禾中 (Staphylococcus spp)(例如金黄色葡萄球菌(Maphylococcus aureus)、特别是抗甲氧 苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)和抗万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA))、表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)、腐生j"生葡萄王求菌(Staphylococcus saprophyticus))、B誉 麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、链球菌属物禾中(Streptococcus spp) (例如酉良脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、 咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、似马链球菌(Streptococcus equismilis)、 牛链球菌(Streptococcus bovis)、咽峡炎链球菌、变形链球菌(Streptococcus mutans)、 唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、缓症链 王求胃(Streptococcus mitis)、:^ ! (Streptococcus milleri))、11 ·禾中 (Streptomyces spp)、密螺旋体属物种(Ti^ponema spp)(例如苍白密螺旋体CTi^ponema pallidum)、地方性密螺旋体(Treponema endemicum)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、品他病密螺旋体CTi^ponema carateum)、弧菌属物种(Vibrio spp)(例如霍 乱弧菌(Vibrio cholerae)，包括其致病血清型例如01和0139)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、 最小孤菌(Vibrio minicus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、鸡霍乱弧菌(Vibrio metchnikovii)、海鱼弧菌(Vibrio damsela)、弗尼其jf弧菌(Vibrio furnisii)。
因此，本发明提供了用于治疗和/或预防任何一种上述病原细菌的感染(特别是 在人类患者中)的药物组合物(和与其有关的治疗方法)，所述组合物包含(或基本上组成 是)第3节和/或第5. 1节中所述的任一种蛋白质实施方案。读者可以想到第3节和第205. 1节中所述的蛋白质的所有可能组合都明确且单独地考虑用于治疗和/或预防本节中所 述的任一种病原细菌的感染，以及所有这些组合各自形成本发明的独立实施方案。但是特 别可以提及的是包含人LRR蛋白质例如人NOD蛋白质(例如人NODl或人N0D2)或人TLR 蛋白质或基本上由其组成的药物组合物，该组合物用于在人中治疗和/或预防正在形成或 已经形成对常用药物具有抗性的病原细菌(例如其菌株)例如MRSA和VRSA的感染。
5. 6临床疾病
根据本文公开物，对阅读本说明书的本领域技术人员显而易见的是组合物(特 别是药物组合物)可用于治疗和/或预防多种疾病(特别是人类疾病)。因此，可以使用包 含和/或基本上组成是上文第3节和第5. 1节中的任何蛋白质的药物组合物，治疗和/或 预防(特别是在人中)任何一种下述感染性疾病
炭疽、细菌性脑膜炎、肉毒中毒、布鲁氏菌病、弯曲菌病、猫抓病、霍乱、白喉、流 行性斑疹伤寒、食物传播疾病例如食物中毒、淋病、脓疱病、军团杆菌病、麻风病(汉森氏 病)、钩端螺旋体病、李斯特菌病、莱姆病、类鼻疽、MRSA感染、脑膜炎、诺卡菌病、百日咳 (Whooping Cough)、鼠疫、肺炎球菌性肺炎、鹦鹉热、Q热、洛基山斑疹热(RMSF)、沙门氏菌 病、猩红热、志贺氏菌病、梅毒、破伤风、沙眼、肺结核、兔热病、伤寒、斑疹伤寒、泌尿道感染。
在一些实施方案中，药物组合物可用于治疗和/或预防易感患者例如人(例如在 囊性纤维化和/或免疫抑制的人中)的机会性感染。
读者可以想到上文第3节和第5. 1节中所述的蛋白质的所有可能组合均明确且 单独地考虑用在治疗和/或预防上文所述的任何一种感染性疾病的组合物例如药物组合 物中。
在其它实施方案中，提供了包含如上文第3节和第5. 1节中所述的蛋白质的药物 组合物在治疗和/或预防细菌可以在其中起病理学作用的疾病中的用途。其实例包括消化 性溃疡病和其它胃肠道疾病，例如炎性肠病(IBD)如克罗恩病和溃疡性结肠炎、肠易激综 合征(IBS)，以及血液疾病例如败血病。
在其它实施方案中，提供了包含如第3节和第5. 1节中所述的蛋白质的药物组合 物在治疗炎性疾病或病症中的用途。其实例包括关节炎病症，例如银屑病性关节炎。
6.实施例
通过下文非限定实施例的方式描述本发明。
6.1缩略词列表
权利要求
1.一种用作抗微生物剂的分离蛋白质，其包含多个LRR(富亮氨酸重复序列)结构域。
2.权利要求1的蛋白质，其中所述蛋白质的C端是LRR结构域。
3.权利要求1或2的蛋白质，其中每个LRR结构域独立地基本上由式(I)的氨基酸序 列组成(FILxxLxL (xxZ)YF2)(I)其中Fl和F2独立地是1至30个残基的连续氨基酸序列； χ可以是任何氨基酸； L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ； Z可以是NxL或CxxL ； N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ； C是Cys或kr ；且 Y = 0 或 1。
4.权利要求3的蛋白质，其中每个LRR中至少2个L残基是Leu。
5.权利要求4的蛋白质，其中每个LRR中至少3个L残基是Leu。
6.权利要求1至5中任一项的蛋白质，其包含至少3个LRR结构域。
7.权利要求1至6中任一项的蛋白质，其包含至少4个LRR结构域。
8.权利要求1至7中任一项的蛋白质，其包含至少5个LRR结构域。
9.权利要求1至8中任一项的蛋白质，其包含至少6个LRR结构域。
10.权利要求1至9中任一项的蛋白质，其中所述蛋白质是抗细菌的。
11.权利要求10的蛋白质，其用于革兰氏阳性菌。
12.权利要求10的蛋白质，其用于革兰氏阴性菌。
13.权利要求10至12中任一项的蛋白质，其用于治疗人类的细菌感染。
14.权利要求1至13中任一项的蛋白质，其选自NOD,TLR, CIITA0
15.权利要求14的蛋白质，其中所述NOD是NODl或N0D2。
16.权利要求14的蛋白质，其中所述TLR选自；TLRUTLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、 TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、TLR13。
17.权利要求16的蛋白质，其中TLR是TLR2、TLR4或TLR5.
18.权利要求1至17中任一项的蛋白质，其中所述蛋白质本身具有直接抗微生物活性。
19.权利要求18的蛋白质，其中所述直接抗微生物活性在体外条件下是有效的。
20.任何前述权利要求的蛋白质，其包含5个或5个以上的LRR(富亮氨酸重复序列) 结构域，用作抗细菌剂，其中所述蛋白质的C端是LRR结构域，且每个LRR结构域独立地包 含式(I)的氨基酸序列(FILxxLxL (xxZ)YF2)(I)其中Fl和F2独立地是1至30个残基的连续氨基酸序列； χ可以是任何氨基酸； L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ； Z可以是NxL或CxxL ；N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ； C是Cys或kr ；且Y= 0 或 1。
21.权利要求20的蛋白质，其中每个LRR中至少2个L残基是Leu。
22.—种药物组合物，其包含根据任何前述权利要求的分离蛋白质。
23.权利要求20的药物组合物，其用作抗细菌剂。
24.权利要求22或23的药物组合物，其用在易于感染的宿主中治疗和/或预防细菌感染。
25.权利要求对的组合物，其中所述宿主是哺乳动物，例如人。
26.权利要求M的组合物，其中所述人患有胃肠道疾病，例如克罗恩病、IBD或IBS。
27.一种治疗人微生物感染的方法，其包括向该人施用有效量的包含多个LRR(富亮氨 酸重复序列)结构域的分离蛋白质。
28.权利要求27的方法，其中所述蛋白质的C端是LRR结构域。
29.权利要求27或观的方法，其中每个LRR结构域独立地基本上由式⑴的氨基酸序 列组成(FILxxLxL (xxZ)YF2)(I)其中Fl和F2独立地是1至30个残基的连续氨基酸序列； χ可以是任何氨基酸； L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ； Z可以是NxL或CxxL ； N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ； C是Cys或kr ；且Y= 0 或 1。
30.权利要求四的方法，其中每个LRR中至少2个L残基是Leu。
31.权利要求四的方法，其中每个LRR中至少3个L残基是Leu。
32.权利要求27至31中任--项的方法，其中所述蛋白质包含至少3个LRR结构域。
33.权利要求27至31中任--项的方法，其中所述蛋白质包含至少4个LRR结构域。
34.权利要求27至31中任--项的方法，其中所述蛋白质包含至少5个LRR结构域。
35.权利要求27至31中任--项的方法，其中所述蛋白质包含至少6个LRR结构域。
全文摘要
本发明公开用作抗微生物剂的分离蛋白质，其包含多个LRR(富亮氨酸重复序列)结构域，每个LRR结构域独立地包含式(I)的氨基酸序列(F1LxxLxL(xxZ)YF2)，其中F1和F2独立地是1至30个残基的连续氨基酸序列；x可以是任何氨基酸；L可以是Leu、Ile、Val或Phe；Z可以是NxL或CxxL；N是Asn、Thr、Ser或Cys；C是Cys或Ser；且Y＝0或1。
文档编号A61P31/04GK102037006SQ200980102302
公开日2011年4月27日 申请日期2009年1月13日 优先权日2008年1月15日
发明者L-H·佩雷兹, S·帕金森 申请人:诺瓦提斯公司