专利名称：抗癌剂感受性的判定方法
技术领域：
本发明涉及用于判定作为对象的患者的癌对于欲使用的抗癌剂是否具有治疗反 应性的抗癌剂感受性判定标记及其应用。
背景技术：
抗癌剂中包括烷基化剂、钼制剂、代谢拮抗剂、抗癌性抗生素、抗癌性植物生物碱 等种类。这些抗癌剂中，根据癌的种类不同，有时显示效果，有时不显示效果。但是，已知即 使是认为有效的种类的癌，也因各个患者而异有时显示效果，有时不显示效果。这种抗癌剂 对于各个患者的癌是否显示效果称为抗癌剂感受性。奥沙利钼(SP-4-2)_[ (1R，2R)-环己烷-1，2_ 二胺-κ N，κ N，][乙 二酸络 (2-)-κ01, κΟ2]钼(IUPAC)是第3代钼配位化合物类抗恶性肿瘤药。据认为，其作用机理 与先前的药剂顺钼(⑶DP)和卡钼(CBCDA)同样，通过与DNA碱基形成交联而导致DNA合成 抑制、蛋白合成抑制，但奥沙利钼(L-OHP)即使对于CDDP和CBCDA无效的大肠癌而言也表 现出抗肿瘤效果，表现出和以往的钼配位化合物类抗恶性肿瘤药不同的抗肿瘤谱。美国已 经在2004年1月承认其与氟尿嘧啶(5-FU)/左亚叶酸盐(LV)的并用作为转移性结肠-直 肠癌的第一线治疗，在日本，在2005年4月在国民健康保险的药价中也收载了对于不能切 除治愈的晚期、复发的结肠-直肠癌，其与左亚叶酸盐和氟尿嘧啶的静脉内持续给药法的 并用(F0LF0X4法)。对于晚期复发大肠癌的治疗而言，在二十世纪90年代前半叶之前一直 采用的5-FU/LV疗法的生存率是10 12个月，与此相对，加入了奥沙利钼的FOLFOX疗法 的生存期为19. 5个月，达到几乎2倍。另外，在以II /III期的病例为对象的试验中，也报告 了在术后辅助疗法中，FOLFOX疗法相比于5-FU/LV疗法的有用性，虽然尚未承认，但奥沙利 钼是能够期待今后对大肠癌术后辅助疗法的扩大和对患者的有益性的药剂。但是，尽管如此，FOLFOX疗法对于晚期复发的大肠癌发挥的效率也仅为50%左 右，换言之，意味着接受治疗的患者中有半数得不到效果。另外，因奥沙利钼的使用而导致 中性粒细胞减少症，此外呈现高频率的末梢神经损伤，尽管这些并不是致死的副作用，但都 是导致难以继续治疗的因素。因此，如果在治疗开始前能够预测、诊断可以期待效果的患者 (应答)和不能期待效果的患者(非应答)，就可实现有效性和安全性高的化学疗法。而且， 由于一般而言癌化学疗法的治疗过程需要经过长期的时间，所以在治疗过程中对于抗癌剂 的感受性的经时监控能够判定是否继续治疗，这不仅与减轻患者负担和副作用相关，而且 从医疗经济的观点出发也是有用的。确立一种用于预测在各个患者中的治疗反应性、选择 适当的治疗的“个体化医疗”的治疗反应性预测生物标记是当务之急。作为与奥沙利钼的治疗反应性关联的因素，认为主要与下述1) 3)等相关，作为 在以大肠癌患者为对象的奥沙利钼+5-FU并用疗法中的治疗反应性和预后预测因素，正在 进行与1) 3)相关的临床研究。1)奥沙利钼引起损伤的DNA的切除、修复能力的增强、2)在细胞内的奥沙利钼(活性体)的失活(解毒)、
3)奥沙利钼的细胞内积蓄量的降低。关于1)，对于在核苷酸切除修复(nucleotide excision r印air :NER)中发挥 重要作用的切除修复交叉互补基因1 (excision repair cross-complementing group 1, ERCC1)而言，有报告肿瘤内ERCC1的基因表达量是预后因素(非专利文献1)，对于作为 ERCC1的单核苷酸多态性(SNP)之一的C118T而言，有报告具有C/C纯合子的患者比具有 至少1个以上的T等位基因的患者具有良好的生存率(非专利文献2)。有报告在着色性 干皮病基因 D (xeroderma pigmentosum D，XPD，也作为 ERCC2 已知)中，伴有 Lys751Gln 的 氨基酸突变的遗传多态性与肿瘤缩小率和生存期相关(非专利文献2、3)。有报告报告了 X 射线修复交叉互补基因 1 (X-ray repair cross-complementing group 1，XRCC 1)的伴有 Arg399Gln的氨基酸突变的遗传多态性与肿瘤缩小效果的关系，其中，该X射线修复交叉互 补基因1编码据认为在碱基切除修复(base excision repair :BER)中与有效修复因暴露 于烷基化剂等形成的DNA单链切断的蛋白质相关(非专利文献4)，但是有报告，根据以同一 个患者为对象的后续分析，其对临床预后没有影响(非专利文献2)。尽管据认为DNA错配 修复(DNA mismatch repair :MMR)也参与对顺钼的感受性下降，但是有报告，在体外的研究 中，MMR不参与由奥沙利钼导致的DNA损伤部位的修复(非专利文献5)。关于2)，谷胱苷肽硫转移酶(Glutathione-S-transferase，GST)是承担解毒、代 谢的第II相反应的酶之一，通过催化DNA钼加成物与谷胱苷肽形成抱合体而将药剂失活。 有报告在GST亚型中，GSTP1在大肠癌中的表达量增高，伴随I lel05Val的氨基酸突变的 遗传多态性与生存期相关(生存期中间值I le/I le为7.9个月、1 le/Val为13. 3个月、 Val/Val为24. 9个月)(非专利文献6)。关于3)，有报告在使用培养细胞进行的研究中，有机阳离子转运体(OCTs)与奥沙 利钼向细胞内输送和感受性相关(非专利文献7)，此外，也有报告ATP7A、ATP7B等与铜或 重金属的输送相关的转运体与感受性的相关(非专利文献8、9)。但是，关于它们的表达与 奥沙利钼治疗反应性的关联，尚未进行临床研究。在以接受了 F0LF0X疗法的晚期大肠癌患者为对象的最近的临床研究中，报告了 ERCC1的遗传多态性(Asnll8Asn)和XPD的遗传多态性(Lys751Gln)独立地与无进展生存 期(PFS)相关，但对于GSTPl(Ilel05Val)而言，没有发现与PFS的关联，而确认与奥沙利钼 诱发神经毒性关联的倾向(非专利文献10)。在体外研究中，关于钼配位化合物类的先前药剂顺钼的耐性相关因素有大量报 告，关于奥沙利钼，也报告了与FAS/FASL、Bcl-xL等凋亡相关因素的关联(非专利文献11、 12)。但是，除了奥沙利钼因癌种类而异而表现出与顺钼不同的治疗反应性以外，癌细胞对 于担负奥沙利钼的细胞损伤活性的钼DNA加成物的细胞应答几乎尚未阐明，对于使用奥沙 利钼的化学疗法能够预测治疗反应性的明确的生物标记尚未确立。非专利文献1 J. Clin. Oncol. 19，4298-4304(2001)非专利文献2 :Br. J. Cancer 91，344-354 (2004)非专利文献3 :Cancer Res 61，8654-8658 (2001)非专利文献4 Anticancer Res. 21，3075-3079 (2001)非专利文献5 :Cancer Res. 56，4881-4886 (1996)非专利文献6 :J. Natl. Cancer Inst. 94，936-942 (2002)
非专利文献7 =Cancer Res. 66，8847-8857 (2006)非专利文献8 :Mol. Pharmacol. 66，25-32 (2004)非专利文献9 :Clin. Cancer Res. 10，4661-4669 (2004)非专利文献10 :J. Clin. Oncol. 25，1247-1254(2007)非专利文献11 :Clin. Cancer Res. 11，4770-4774(2005)非专利文献12 J. Biol. Chem. 279,46113-46121(2004)
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够判别各个患者的治疗反应性的抗癌剂感受性判 定标记以及利用该抗癌剂感受性判定标记的新的癌治疗手段。为此，本发明的发明人培养人癌细胞株，对于这些细胞的细胞内蛋白质，使用表面 增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(SELDI-TOF MS)进行抗癌剂感受性判定标记的探索后， 发现伴随对抗癌剂的感受性下降而表达量上升的蛋白质，该蛋白质是在质谱仪中作为m/ ζ 10，800 11，400的峰被检出的3种蛋白质。然后，进一步对该蛋白质进行研究，发现这 些蛋白质是作为具有钙结合EF-hand基序的SlOO蛋白质家族的一员已知的钙结合蛋白质 S100A7、S100A8 和 S100A10。基于该见解进一步进行研究，结果发现，如果测定来自癌患者机体试样中的该 S100A7、S100A8或S100A10的浓度，就能够判定该癌患者的癌是否具有对抗癌剂的感受性， 而且，如果以该物质的表达抑制作为指标，旧能够筛选抗癌剂感受性增强剂，如果进一步并 用该抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂，则该抗癌剂的治疗效果就能够 飞跃性地提高，从而完成了本发明。S卩，本发明提供一种抗癌剂感受性判定标记，其含有钙结合蛋白质S100A7、S100A8 或 S100A10。另外，本发明提供一种抗癌剂感受性的判定方法，其特征在于，测定检测体中的上 述 S100A7、S100A8 或 S100A10。另外，本发明提供一种用于实施抗癌剂感受性的判定方法的试剂盒，其特征在于， 包含用于测定检测体中的上述S100A7、S100A8或S100A10的方案。本发明还提供一种抗癌剂感受性增强剂的筛选方法，其以上述S100A7、S100A8或 S100A10的表达抑制作为指标。另外，本发明还提供一种由上述筛选方法得到的抗癌剂感受性增强剂。本发明还提供一种癌治疗用组合物，其含有上述抗癌剂感受性增强剂和作为感受 性增强对象的抗癌剂的组合。本发明还提供上述抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂的组合 在癌治疗药物制造中的使用。本发明还提供一种癌治疗方法，其特征在于，投与上述抗癌剂感受性增强剂和作 为感受性增强对象的抗癌剂。发明的效果如果使用本发明的抗癌剂感受性判定标记，就能够在治疗开始前准确判定各个患 者的抗癌剂感受性，从而能够选择治疗效果高的抗癌剂。而且，由于能够避免使用不能得到效果的抗癌剂，因此能够避免不必要的副作用。另外，由于使用抗癌剂的治疗过程需要经过 长期的时间，所以，通过在治疗过程中在每个疗程中也判定抗癌剂感受性，就能够经时地评 价该癌对抗癌剂的感受性，从而能够判定是否应该继续治疗。其结果，能够防止不能得到治 疗效果的抗癌剂的继续给药所导致的癌进展、副作用增大，还能够有助于减轻患者的负担， 减少医疗费。而且，如果使用该标记，就能够筛选增强抗癌剂感受性的药剂，如果将作为其对象 的抗癌剂与抗癌剂感受性增强剂并用，就能够飞跃性地提高癌治疗效果。
图1是表示在各癌细胞株中的奥沙利钼(L-0HP)感受性的图。图2是表示在各癌细胞株中对奥沙利钼(L-0HP)的感受性和蛋白质A1的峰强度 变化的图。图3是表示蛋白质A1的峰强度与在各癌细胞株中的奥沙利钼(L-0HP)感受性的 相关的图。图4是表示蛋白质A1的峰强度与在各癌细胞株中的顺钼(CDDP)感受性的相关的 图。图5是表示蛋白质A1的峰强度与在各癌细胞株中的顺钼(CDDP)感受性的关系的 图(以10yM为甄别阈，将对于顺钼的IC5Q值分两组进行比较)。图6是表示蛋白质A1的峰强度与在各癌细胞株中的SN-38感受性的关系的图(以 20nM为甄别阈，将对于SN-38的IC5(1值分两组进行比较)。图7是表示通过使用蛋白质芯片进行的SELDI-TOF MS分析得到的蛋白质A1的分 子量的图。图8是表示2种大肠癌细胞株HT_29(蛋白质A1高表达)和C0L0320 (蛋白质A1 低表达)的双向电泳展开图和用于LC/MS/MS分析的点选择。图9是表示蛋白质A2的峰强度与在各癌细胞株中的奥沙利钼感受性的相关的图。图10是表示蛋白质A3的峰强度与在各癌细胞株中的奥沙利钼感受性的关系的图 (以5.0PM为甄别阈，将对于奥沙利钼的IC5(I值分两组进行比较)。图11是表示通过使用蛋白质芯片的SELDI-TOF MS分析得到的蛋白质A2 (蛋白质 S100A8, S100钙结合蛋白质A8)和蛋白质A3 (蛋白质S100-A7，S100钙结合蛋白质A7)的 图。图12是表示S100A9的峰强度与在各癌细胞株中的奥沙利钼感受性的关系的图 (以5. 0 y M为甄别阈，将对于奥沙利钼的IC5(I值分两组进行比较)。图13是表示HT-29(S100A10高表达)和C0L0320 (S100A10低表达)中使用蛋白 质印迹法检出S100A10的图。
具体实施例方式本发明中的抗癌剂感受性判定标记包含S100A7、S100A8或S100A10。这些蛋白 质是在表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(SELDI-TOF MS)中，作为m/z10，800 10，900(S100A8)、m/z 11，000 11，100 (S100A10)和 m/z 11，300 11，400 (S100A7)的峰分别检出的蛋白质。这些蛋白质S100A7、S100A8和S100A10 (以下也称为蛋白质A)，如在后述实施例 中所示，使用SELDI TOF MS研究培养癌细胞的细胞内蛋白质表达的结果为，与奥沙利钼感 受性(IC5tl值)、顺钼感受性(IC5tl值)、伊立替康感受性或SN-38感受性(IC5tl值)具有显著 的相关性。即，在奥沙利钼、顺钼、伊立替康或SN-38高感受性的癌细胞中，蛋白质A的表达 量低，在奥沙利钼、顺钼、伊立替康或SN-38低感受性的癌细胞中，蛋白质A的表达量高。因 此，蛋白质A作为抗癌剂感受性判定标记，进而作为钼配位化合物类抗癌剂或植物生物碱 类抗癌剂的感受性判定标记，特别是作为奥沙利钼、顺钼、伊立替康、SN-38或它们的盐的感 受性判定标记是有用的。在这里，因为已知S100A8和S100A7具有与S100A10结合的可能性(Journal of Proteome Research 2005 ；4 1717-1721)，所以，对于抗癌剂感受性而言，它们也存在任意 的相互作用的可能性，另外，它们的结合体也存在能够作为抗癌剂的感受性标记使用的可 能性。而且，由于还已知S100A10自身的二聚体与膜联蛋白A2(膜联蛋白-2、膜联蛋白II、 脂皮质蛋白II、依钙结合蛋白I重链、嗜铬粒结合蛋白_8、p36、蛋白I、胎盘抗凝蛋白类IV、 PAP- IV )的二聚体形成异四聚体，所以，膜联蛋白A2也和S100A10同样地存在能够作为抗 癌剂感受性的判定标记使用的可能性。作为本发明的抗癌剂感受性判定标记对象的抗癌剂，没有特别限定，例如， 可以列举奥沙利钼、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异磷酰胺(ifosfamide)、噻替哌 (thiotepa)、美法仑(melphalan)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫 司汀(ranimustine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴胼(procarbazine)、替莫唑胺 (temozolomide)、Jl质 白(cisplatin)、卡 白(carboplatin)、奈达 白(nedaplatin)、甲氛蝶 吟(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氣尿啼 (fluorouracil)、替力口氣 / 尿啼 (tegaful/uracil)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、替加氟/吉美拉西/奥替拉西(tegaful/ gimeracil/oteracil)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、依诺他滨 (enocitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、6_ 巯基口票呤(6-mercaptopurine)、氟达拉滨 (fludarabin)、喷司^tkt丁 (pentostatin)、克拉屈 宾(cladribine)、g基月尿(hydroxyurea) > 多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、佐柔比星(daunorubicin)、依 达比星(idarubicine)、口比柔比星(pirarubicin)、米托惠酉昆(mitoxantrone)、M 柔 比星(amurubicin)、放线菌素 D (actinomycin D)、博来霉素(bleomycine)、派来霉 素(ρ印leomycin)、丝裂霉素 C(mytomycin C)、阿柔比星(aclarubicin)、净司他丁 (zinostatin)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春碱(vinblastine)、 长春瑞滨(vinorelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、伊立替康 (irinotecan)、伊立替康活性代谢物(SN-38)、托泊替康(nogitecan, topotecan)、依 托泊苷(etoposide)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、他莫昔 芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、甲轻孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲唑 (anastrozole)、依西美坦(exemestane)、来曲唑(Ietrozole)、禾丨J妥昔(rituximab)、伊马 替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、 硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗 (bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)、帕尼单抗(panitumumab)、门冬酰胺酶(asparaginase)、维甲酸(tretinoin)、三氧化二砷 (arsenic trioxide)、或它们的盐、或它们的活性代谢物等。其中，优选钼配位化合物类抗 癌剂和植物生物碱类抗癌剂，特别优选奥沙利钼、顺钼、伊立替康、SN-38或它们的盐。在使用本发明的抗癌剂感受性判定标记判定抗癌剂感受性时，测定检测体中的蛋 白质A即可。在这里，作为检测体，可以列举来自患有癌的被检验者(癌患者)机体的试 样，例如，可以列举血液、血清、血浆、癌组织活检样本、癌摘除手术标本、便、尿、腹水、胸水、 脑脊液、痰等，但特别优选血清。另外，作为本发明对象的癌，可以列举以喉癌为代表的唇、口腔和喉癌、以食道癌、 胃癌、结肠-直肠癌等为代表的消化器官癌、以肺癌为代表的呼吸器官和胸腔内脏器官癌、 骨骼及关节软骨癌、皮肤的恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌及其它皮肤癌、以间皮瘤为代表的间 皮和软组织癌、以乳腺癌、子宫癌，卵巢癌为代表的女性性器官癌、以前列腺癌为代表的男 性性器官癌、以膀胱癌为代表的尿路癌、以脑肿瘤为代表的眼、脑和中枢神经系统癌、甲状 腺和其它内分泌腺癌，以非何杰金氏淋巴瘤和淋巴细胞性白血病为代表的淋巴组织、造血 组织和关联组织癌、以及以这些癌为原发病灶的转移组织的癌等，但特别是能够对胃癌和 结肠-直肠癌适合地利用。对于测定检测体中的蛋白质A的方法而言，例如，能够利用SELDI-TOF MS、免疫学 测定法等测定。在这里，利用SELDI-TOF MS的测定可以采用后述实施例中记载的方法进行。另 外，在免疫学测定法中，优选使用抗蛋白质A抗体的免疫学测定法。所使用的抗蛋白质A 抗体既可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。更具体而言，例如，可以列举放射免疫分 析、酶免疫分析、荧光免疫分析、发光免疫分析、免疫沉降法、免疫比浊法、蛋白质印迹、免疫 染色、免疫扩散法等，但优选蛋白质印迹或酶免疫分析，特别优选蛋白质印迹、酶联免疫吸 附法(enzyme-linked immunosorbent assay EL ISA)(例如，夹心酶联免疫分析(sandwich ELISA))。在判定对作为对象的抗癌剂的感受性时，测定来自抗癌剂给药前的癌患者机体的 试样中的蛋白质A浓度，在蛋白质A的浓度判断为高于规定的标准浓度时，能够判定该癌对 于作为对象的抗癌剂没有感受性。另外，通过在每一个疗程中测定并监控来自抗癌剂给药 过程中的癌患者机体的试样中的蛋白质A浓度，就能够经时地评价该癌对作为对象的抗癌 剂的感受性，从而成为是否应该继续治疗的判定标记。在对作为对象的抗癌剂没有感受性时，可以认为不能期待其药效而仅表现由抗癌 剂产生的副作用，因此，本发明中的抗癌剂感受性判定标记也可以作为用于避免表现出不 必要的副作用或避免无效治疗的继续所导致的癌进展和副作用增大的标记使用。另外，在蛋白质A的浓度判断为低于规定的标准浓度时，能够判定该癌对作为对 象的抗癌剂具有感受性，因此，也可以作为用于积极地选出能够期待治疗效果的患者的标 记使用O如果以蛋白质A为指标，还能够筛选抗癌剂。即，在体外，例如，如果将蛋白质A的 浓度高的各种癌细胞株暴露于某种物质后出现杀细胞效果，则该物质对于对奥沙利钼等钼 配位化合物类抗癌剂、伊立替康等植物生物碱类抗癌剂和上述的现有抗癌剂的感受性低的 癌而言，也是有效的抗癌剂。另外，在体内，例如，如果将某种物质投与其机体试样中的蛋白质A的浓度高的荷癌动物后，出现肿瘤缩小的效果，则该物质对于对奥沙利钼等钼配位 化合物类抗癌剂、伊立替康等植物生物碱类抗癌剂和上述的现有抗癌剂的感受性低的癌而 言，也是有效的抗癌剂。通过使用蛋白质A高浓度的各种癌细胞株以及其机体试样中的蛋 白质A浓度高的荷癌动物进行以蛋白质A为指标的筛选，就能够判定该物质是否对于对奥 沙利钼等钼配位化合物类抗癌剂、伊立替康等植物生物碱类抗癌剂和上述的现有抗癌剂的 感受性低的癌而言，也作为显示抗肿瘤效果的抗癌剂有用。从减少抗癌剂开发伴随的劳力 和费用方面出发，也能够期待大的效果。在实施本发明的抗癌剂感受性的判定方法时，优选使用包含用于测定检测体中的 蛋白质A的方案的试剂盒。在该试剂盒中，包含蛋白质A测定试剂、测定试剂的使用方法以 及用于判定抗癌剂感受性的有无的基准等。在该基准中，包含蛋白质A的标准浓度、判断为 高的浓度、判断为低的浓度、对测定结果有影响的主要因素及其影响程度等，这些浓度能够 根据作为对象的每个抗癌剂设定。使用该基准，能够如上所述进行判定。如果以蛋白质A的表达抑制为指标，就能够筛选抗癌剂感受性增强剂。S卩，在体外 或在体内，抑制蛋白质A表达的物质增强抗癌剂感受性。例如，在体外，在各种癌细胞株中， 在抗癌剂不存在下或存在下，使蛋白质A的浓度下降的物质是增强该抗癌剂的感受性的物 质(抗癌剂感受性增强剂)。另外，在体内，在荷癌动物中，在抗癌剂给药前或给药中，使 蛋白质A的浓度下降增强的物质，就是增强该抗癌剂的感受性的物质(抗癌剂感受性增强 剂)。如果并用这样得到的抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂，则该 抗癌剂的治疗效果就能够飞跃性地提高。作为组合抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强 对象的抗癌剂的方式，既可以是包含这两种成分的一个组合物，也可以是各自制剂的组合。 另外，这些成分也可以分别采用各自的给药途径。作为在这里所使用的作为对象的抗癌剂，与上述同样，可以列举奥沙利钼、 环磷酰胺(cyclophosphamide)、异磷酰胺(ifosfamide)、噻替哌(thiot印a)、美法仑 (melphalan)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、 达卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴胼(procarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、顺钼 (cisplatin)、卡 白(carboplatin)、奈达 白(nedaplatin)、甲 M1 蝶吟(methotrexate) > 培美曲塞(pemetrexed)、氟尿嘧啶(f luorouracil)、替加氟/尿嘧啶(tegaful/ uracil)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、替加氟/吉美拉西/奥替拉西(tegaful/ gimeracil/oteracil)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、依诺他滨 (enocitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、6_ 巯基口票呤(6-mercaptopurine)、氟达拉滨 (fludarabin)、喷司^tkt丁 (pentostatin)、克拉屈 宾(cladribine)、g基月尿(hydroxyurea) > 多柔比星(doxoeubicin)、表柔比星(epirubicin)、佐柔比星(daunorubicin)、依 达比星(idarubicine)、口比柔比星(pirarubicin)、米托惠酉昆(mitoxantrone)、M 柔 比星(amurubicin)、放线菌素 D (actinomycin D)、博来霉素(bleomycine)、派来霉 素(ρ印leomycin)、丝裂霉素 C(mytomycin C)、阿柔比星(aclarubicin)、净司他丁 (zinostatin)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春碱(vinblastine)、 长春瑞滨(vinorelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、伊立替康 (irinotecan)、伊立替康活性代谢物(SN-38)、托泊替康(nogitecan, topotecan)、依托泊苷(etoposide)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、他莫昔 芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、甲轻孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲唑 (anastrozole)、依西美坦(exemestane)、来曲唑(letrozole)、禾丨J妥昔(rituximab)、伊马 替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、 硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗 (bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)、 帕尼单抗(panitumumab)、门冬酰胺酶(asparaginase)、维甲酸(tretinoin)、三氧化二砷 (arsenic trioxide)、或它们的盐、或它们的活性代谢物等。其中，优选钼配位化合物类抗 癌剂和植物生物碱类抗癌剂，特别优选奥沙利钼、顺钼、伊立替康、SN-38或它们的盐。实施例以下，列举实施例更详细地说明本发明。实施例1(1)方法(a)使用细胞11 种人大肠癌细胞株(C0L0201、C0L0205、C0L0320、DLD-1、HCT-15、HT-29、 LS174T、SW480、SW620、SW1116、WiDR)，由以下(表 1)获得。培养如下进行贴壁细胞培养在①lOOmm/Tissue Culture Dish(IWAK I)中， 悬浮细胞培养在①lOOmm/Non-Treated Dish(IWAK I)中，使用培养基(RPMI 1640, 2mM Glutamine, 10% Fetal Bovine Serum)，在 37°C、5% C02 的条件下培养。[表 1]11种人大肠癌细胞株 (b)药剂奥沙利钼(L-OHP)整装散剂从株式会社益力多总部处获得。(c)对奥沙利钼的感受性的评价在各细胞中，以MTS assay (CellTiter96 AQueous One Solution CellProliferation Assay,Promega)评价在 O 1000 μ mol/L 奥沙利钼中暴露 48 小时后 的细胞生存率，算出IC5tl值(相对于奥沙利钼未处理孔，将细胞数抑制50%的浓度)，作为 各细胞对奥沙利钼的感受性。感受性的评价在不同传代数的细胞中进行4次，算出其平均 值和标准偏差。(d)细胞内蛋白质的提取对于贴壁细胞而言，从培养皿中除去培养基，以冰冷PBS清洗3次后，由橡胶刮子 剥离收集；对于悬浮细胞而言，将细胞悬浮液在PBS中重悬，利用离心的方式清洗3次，将清 洗后的细胞悬浮液移入1. 5mL微量离心管中。在4°C以1，200 X g离心10分钟收集细胞，除 去上清液后，加入40 μ L细胞溶解缓冲液(9mol/L尿素，2% CHAPS，lmM DTT，蛋白酶抑制剂 混合物(Sigma))，在冰冷下进行超声波破碎处理后，在4°C以16，000 X g离心20分钟，将上 清液在液氮中迅速冷冻后，在-80°C中保存，直至进行分析。使用一部分上清液进行蛋白质 定量(DC Protein Assay Kit，Bio-Rad)。(e)用于蛋白质表达分析的样品调整和蛋白质芯片的制做、细胞内蛋白质的表达 分析以细胞溶解缓冲液(除去蛋白酶抑制剂)调整为5mg/mL，将100 μ L以ρΗ4. 5的 稀释/清洗缓冲液(50mM醋酸钠缓冲液)(以下称为缓冲液)调整为lmg/mL的样品加在以 相同缓冲液进行了前处理的阳离子交换芯片阵列(CM10，Bio-Rad)的点上，孵化1小时使其反应后，以缓冲液清洗3次，以milliQ水冲洗2次。风干后，将能量吸收分子(EAM:由50% ACN/0. 5% TFA溶液得到的芥子酸的饱和溶液)1. 0 y L以每次0. 5 y L分2次加在各点上， 点表面干燥后，进行蛋白质芯片阵列的分析。蛋白质表达分析以表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(surface-enhanced laser desorption/ionization time—of—flight mass spectrometry :SELDI-T0F MS)进 行。作为分析仪器，使用ProteinChip Reader (Model PBSIIC，Bio-Rad)，在mass-to-charge ration (m/z)的 opitimization range 2，000 30，OOODaltons、Laser intensity 220、 Detector sensitivity^h^B^^if 104shots 白勺^>tlf。sign￡il_to_noise ratio (S/N比)5以上的峰的抽出和蛋白质表达比较分析使用CiphergenExpress Data Manager 3.(f)蛋白质表达与奥沙利钼感受性的相关分析针对由SELDI-T0F MS检出的所有蛋白质峰，进行各细胞的IC5(1值与峰强度的关系 的相关分析。对于IC5(I值的对数值和峰强度的关系，进行线性回归分析，将满足P值<0. 05、 决定系数(r2 ；r，Pears0n相关系数)>0. 5的峰作为奥沙利钼感受性关联候补蛋白质选出。 相关分析和线性回归分析以SPSS 15. 0J for Windows (注册商标)(版本15. 0. 1)进行。(2)结果(a) 11种人大肠癌细胞株的奥沙利钼感受性的评价各细胞的IC5Q值为0. 84士0. 20 29. 7 士 13. 6 y M，确认其感受性处于宽的范围内 (图 1)。(b)蛋白质表达分析通过使用SELDI-T0F MS以上述分析条件进行的表达分析，检出全部42个峰。(c)蛋白质表达与奥沙利钼感受性的相关分析通过相关分析和线性回归分析，发现作为m/z在11，000 11，100所检出的峰与 奥沙利钼感受性(IC5(I值)具有显著的相关性(图2、图3)。实施例2(1)方法使用细胞是7 种人大肠癌细胞株(DLD-1、HCT-15、HT-29、LS174T、SW480、SW620、 WiDR)，药剂使用顺钼(cis-Diammin 印 latinum( II )dichrolide, SIGMA)，与实施例 1 同样 地以MTS assay评价在0 1000iimol/L中暴露48小时后的细胞生存率，算出IC5Q值。细 胞内蛋白质的提取、蛋白质表达分析以及顺钼(⑶DP)感受性的相关分析与实施例1同样地 进行。(2)结果(a) 7种人大肠癌细胞株的顺钼感受性的评价各细胞的IC5Q值为3. 33士0.80 26. 9士 11.6 iiM，确认该感受性处于宽的范围内。(b)蛋白质表达与顺钼感受性的相关分析通过相关分析和线性回归分析，确认作为m/z在11，000 11，100中所检出的峰 与顺钼感受性(IC5(I值)显示相关的倾向(图4)。如果再根据在顺钼给药时的总钼的药代 动力学参数(根据Briplatin 注射液的interview form)，在每1次临床使用顺钼时投与 最高给药量(100mg/m2)时的峰血浓度(Cmax)计算为大致9. 5 11. 0 y M(将日本人的体表面积计算为1. 50-1. 73m2)，所以，对于各癌细胞株对顺钼的IC50值，以10 μ M为甄别阈，分 类为高感受性和低感受性两组。其结果，作为m/z在11，000 11，100检出的峰的峰强度， 在低感受性组中确认显著的上升(图5)。实施例3(1)方法使用的细胞是5种人大肠癌细胞株(C0L0320、HCT-15, HT-29、LS174T、HCT 116(HCT116的来源库是ECACC))，药剂使用伊立替康活性代谢物(SN-38，由株式会社益 力多总部获得)，与实施例1同样地以MTS assay评价在0 1000 μ mol/L中暴露72 小时后的细胞生存率，算出IC5tl值。与实施例1同样地进行细胞内蛋白质的提取、样品 调整和蛋白质芯片的制做，分析使用ProteinChip Reader (Model PCS4000 Personal Edition, Bio-Rad), ^ Mass Range 0 ~ 70, 000 Daltons> Focus Mass 11，000 Dalton> Energy 3000nJ、每一个样品合计265 shots的条件下进行分析。蛋白质表达比较分析使用 Ciphergen Express Data Manager 3. 0。(2)结果(a) 5种人大肠癌细胞株中的SN-38感受性的评价各细胞的IC5tl值是3. 39 33. 7nM，确认该感受性处于宽的范围内。(b)蛋白质表达与SN-38感受性的相关分析根据SN-38的药代动力学参数(根据Campto 的interview form)，根据大肠 癌治疗方案(180mg/m2/日)在第1次投与伊立替康时得到的SN-38的血浓度曲线下面积 (AUCsn_38)计算为1449nmol.h/L，算出能够与本研究中使用的72小时药剂暴露同等暴露量 的SN-38的浓度为20nM，所以，对于各癌细胞株对SN-38的IC5tl值，以20nM为甄别阈，分类 为高感受性和低感受性两组。其结果，作为m/z在11，000 11，100检出的峰的峰强度，在 低感受性组中确认显著的上升(图6)。实施例4在实施例1中，为了调查作为m/z 11，000 11，100的峰检出的蛋白质(蛋白质 Al)的性质，对伴随pH变化的峰强度变化、以及采用与CMlO芯片阵列的不同的在芯片表面 施加化学修饰的蛋白质芯片阵列是否可以检出进行了研究。(1)方法(a)研究中使用的蛋白质芯片阵列和缓冲液条件对于相对阳离子交换芯片阵列(CM10，Bio-Rad)和阴离子交换芯片阵列(Q10， Bio-Rad)，使用 pH3. 0 (50mM 甘氨酸-HCl 缓冲液)、pH3. 5 (50mM 醋酸钠缓冲液)、pH4. 0 (50mM 醋酸钠缓冲液)、PH4. 5 (50mM醋酸钠缓冲液)、pH5. 0 (50mM醋酸钠缓冲液)、pH5. 5 (50mM醋 酸钠缓冲液)、ρΗ6· 0 (50mM磷酸盐缓冲液)、ρΗ6· 5 (50mM磷酸盐缓冲液)、ρΗ7· 0 (50mM磷 酸盐缓冲液)、ρΗ7· 5 (50mM 磷酸盐缓冲液)、ρΗ8· 0 (50mM Tris-HCl 缓冲液)、ρΗ8· 5 (50mM Tris-HCl缓冲液)、pH9. 0(50mM甘氨酸-NaOH缓冲液)、pH9. 5 (50mM甘氨酸-NaOH缓冲液)、 pH10.0(50mM甘氨酸-NaOH缓冲液)的15种缓冲液，对于金属修饰(Immobilized Metal Affinity Capture 固相金属螯合)芯片阵列(IMAC30、Bio-Rad)，使用磷酸盐缓冲生理盐 /K (phosphate buffered saline, PBS)。(b)用于使用CMlO和QlO芯片阵列进行分析的样品调整和蛋白质芯片的制作与分析条件用于使用CM10和Q10芯片阵列进行分析的样品调整和蛋白质芯片的制作，使用 (a)的各缓冲液，根据实施例1的(1)方法的上述(e)实施。其中，作为分析仪器，使用 ProteinChip Reader(Model PCS4000Personal Edition, Bio-Rad),^ Mass Range 0 ~ 70，OOODaltons、Focus Mass 11,000 Dalton、Energy 3000nJ、每个样品合计 265 shots 的 条件下进行分析。(c)用于使用IMAC30芯片阵列进行分析的样品调整和蛋白质芯片的制作与分析 条件IMAC30芯片阵列以50mM NiS04进行点表面的活化，由milliQ水冲洗1次后，以 PBS进行前处理。样品调整和向芯片加入样品以后的操作，使用上述(a)的PBS作为缓冲 液，根据实施例1的(1)方法的上述(e)实施。其中，作为分析仪器，使用ProteinChip Reader (Model PCS4000 Personal Edition, Bio-Rad), ^Mass Range 0 70，OOODaltons、 Focus Mass 11,000 Dalton、Energy 6000nJ、每个样品合计 265shots 的条件下进行分析。(2)结果在实施例1中，使用了 CM10芯片阵列在pH4. 5的分析条件下，作为m/z 11，000 11，100的峰检出的上述候补蛋白质，在CM10芯片阵列和Q10芯片阵列中，均在pH7. 0 7. 5 中确认显著的峰下降，该候补蛋白质的等电点(pi)推定为？17.0 7.5。另外，确认在由 NiS04将芯片表面活化的IMAC30芯片阵列中也检出上述候补蛋白质。实施例5 (候补蛋白质A1的鉴定)(1)候补蛋白质A1的分子量的推定对于细胞内蛋白质提取样品，将分子量已知的牛胰岛素(5733. 51Da)和马细胞色 素c(12360. 96Da)作为标准(Calibrant)使用，使用SELDI-T0F MS，在与蛋白质表达分析时 同样的分析条件下(CM10芯片阵列和50mM醋酸钠缓冲液，pH4. 5)，进行内校准(Internal Calibration).其结果，推定候补蛋白质A1峰的分子量为11072Da(图7)。(2)候补蛋白质A1的精制和鉴定(精制)以候补蛋白质A1的精制和鉴定为目的，从在蛋白质表达分析中候补蛋白质显示 高表达的细胞株HT-29和显示低表达的细胞株C0L0320的2株细胞株中，采用与表达分 析时同样的方法提取了细胞内蛋白质。根据蛋白质定量的结果，从两个样品中分别取出等 量样品，进行TCA沉淀后，将回收的沉淀在冷乙醇/乙醚溶剂中清洗并在室温干燥。在该 沉淀中加入 IEF lysis buffer (6M 尿素，2M 硫脲，3% CHAPS，Triton X-100, DeStreak reagent, GE Healthcare Biosciences)，在室温下进行搅拌并进行超声波处理。将调整后的IEF样品溶液离心，将上清液加入Immobiline DryStrip gel (pH3 lOnon-linear, 13cm, GE Healthcare Biosciences)中，进行凝胶膨润后，进行等电点电泳 (5000V,15hr)。等电点电泳结束后，将Immobiline DryStrip gel在双向电泳用的样品缓冲 液(6M尿素，20%甘油，2% DTT，2% SDS，100mM Tris_HClpH8. 8)中平衡，将平衡结束后 Immobiline DryStrip gel在25mA的恒定电流下进行电泳。凝胶使用10 18%、16X 16cm 的聚丙烯酰胺梯度凝胶(BIO CRAFT)，电泳后的凝胶以CBB G-250染色后，在5%醋酸中进行脱色。双向电泳的图象获取使用 GS-800calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad), 图象分析使用PDQuest软件(Bio-Rad)进行比较分析。(鉴定)根据使用蛋白质芯片的SELDI-TOF MS分析得到的候补蛋白质Al相关的信息 (分子量11072，pI7. O 7. 5)，以在双向电泳中展开的凝胶上的分子量10 15kDa和大 约PI6.5 8.0范围(中性附近)内分离的点为对象，从其中选择了与C0L0320相比较在 HT-29中显示高表达的4个点(图8)。切出这些点，按照公知的方法将蛋白质进行凝胶内 胰蛋白酶消化后，使用LCMS-IT-T0F (液相色谱质谱仪，Shimadzu)进行分析(MS/MS测定)， 对所得到的结果进行MASCOT数据库检索。在进行了分析的4个点中，由图8中所示的点4所鉴定的蛋白质Al (分子量 11，072，ρΙ7· 3)和使用蛋白质芯片阵列的SELDI-TOF MS分析得到的结果(分子量11072, pI7. O 7. 5) —致。由此，显示与奥沙利钼感受性相关的作为m/z 11，000 11，100的峰 检出的候补蛋白质Al鉴定为S100A10(S100钙结合蛋白A10，依钙蛋白-1轻链，依钙蛋白I 轻链，PlO蛋白，pll，膜联蛋白II的细胞配体)。实施例6(S100A7 和 S100A8)使用CMlO蛋白质芯片阵列、50mM Tris-HCl缓冲液(ρΗ8· 0)，在与实施例1的(1) 方法的上述(e)同样的条件下，分析癌细胞株的细胞内蛋白质提取样品，结果发现显示与 奥沙利钼感受性的关联的2个蛋白质峰，蛋白质A2和蛋白质A3。蛋白质A2的峰强度显示与各癌细胞株的奥沙利钼(L-OHP)感受性(IC5tl值)显著 的相关性(图9)。另外，若根据各癌细胞株对奥沙利钼的IC5tl值，以几乎相当于奥沙利钼临床使用 时的峰血浓度的5. 0 μ M作为甄别阈，将癌细胞株分类为高感受性和低感受性的两组，则确 认蛋白质A3的峰强度在低感受性组中显著的上升(图10)。另外，细胞株LS174T由于S/N 比小于5，所以从分析对象中排除。蛋白质Α2和蛋白质A3的峰存在于S100A10的附近，使用牛胰岛素(5733. 51Da) 和马细胞色素c(12360. 5IDa)作为标准(Calibrant)，进行标准化(Calibrantion)，结果推 定蛋白质A2为10835Da，推定蛋白质A3为11340Da。再和实施例2同样地，分别对CMlO芯片阵列和QlO芯片阵列使用pH3. 0 10. 0 的15种缓冲液，由SELDI-TOF MS分析各峰强度的变化，结果确认表示10835Da的峰在 pH6. 5 7. 0中显著的峰下降，表示11340Da的峰在pH6. 0 6. 5中剧烈的峰上升，所以，各 自的Pl被推定为6. 5 7. 0和6. 0 6. 5。根据这些结果检索数据库(ExpasyTagIdent tool :http://www. expasy. ch/ tools/tagident. html)，结果显示，在1083OTa显示的峰是S100A8(S100钙结合蛋白A8，钙 粒蛋白-A，迁移抑制因子相关蛋白8，MRP-8，p8等)，在11340Da显示的峰是S100A7 (S100 钙结合蛋白A7、Psoriasin)(图11)。比较例1和实施例6同样操作，对于由SELDI-TOF MS推定分子量13，242的S100A9+-的峰， 研究与奥沙利钼感受性的关联。其结果，在S100A9表达量和奥沙利钼感受性之间不能确认显著的关联(图12)。因此，判明S100A9与抗癌剂感受性之间没有关联性。实施例7(1)方法使用作为m/z在11，000 11，100检出的峰的高表达细胞HT-29和低表达细胞 C0L0320，采用与实施例1同样的方法提取细胞内蛋白质后，在16. 5%聚丙烯酰胺凝胶中， 每一个泳道中加入lOiig蛋白质量，在100V恒定电压下进行SDS-PAGE。电泳后，使用干 转印系统(iBlot , invitrogen)在PVDF膜上点上蛋白质，进行封闭后，针对S100A10使 用抗S100A10单克隆抗体(纯化小鼠抗膜联蛋白II轻链单克隆抗体，BD Transduction Laboratories)，针对内源性蛋白质，使用抗GAPDH单克隆抗体(抗GAPDH单克隆抗 体，Ambion)，进行一次抗体反应。与碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG抗体进行二次抗体 进行反应后，添加CDP-Star 化学发光底物作为反应底物，使其发光，由Luminoimage analyzer (LAS-4000mini，FUJIFILM)进行检测。密闭试剂、二次抗体和反应底物使用 Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit(WesternBreeze , invitrogen)。(2)结果在使用了蛋白质芯片阵列的蛋白质表达分析(实施例1)中，作为m/z在11，000 11，100检出的峰的高表达细胞HT-29和低表达细胞C0L0320中，S100A10的表达通过使用 了抗S100A10单克隆抗体的蛋白印迹法(Western blot)得到确认(图13)。
权利要求
一种抗癌剂感受性判定标记，其特征在于含有钙结合蛋白质S100A7、S100A8或S100A10。
2.如权利要求1所述的抗癌剂感受性判定标记，其特征在于 抗癌剂是钼配位化合物类抗癌剂或植物生物碱类抗癌剂。
3.如权利要求1或2所述的抗癌剂感受性判定标记，其特征在于 抗癌剂是奥沙利钼、顺钼、伊立替康、SN-38或它们的盐。
4.一种抗癌剂感受性的判定方法，其特征在于测定检测体中的权利要求1 3中任一项所述的抗癌剂感受性判定标记。
5.如权利要求4所述的判定方法，其特征在于 检测体是来自患有癌的被检验者机体的试样。
6.如权利要求4或5所述的判定方法，其特征在于检测体是来自被投与了抗癌剂的患有癌的被检验者机体的试样。
7.一种用于实施权利要求4 6中任一项所述的判定方法的试剂盒，其特征在于 包含用于测定检测体中的权利要求1 3中任一项所述的抗癌剂感受性判定标记的方案。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于 检测体是来自患有癌的被检验者机体的试样。
9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于检测体是来自被投与了抗癌剂的患有癌的被检验者机体的试样。
10.一种抗癌剂感受性增强剂的筛选方法，其特征在于以权利要求1 3中任一项所述的抗癌剂感受性判定标记的表达抑制作为指标。
11.一种由权利要求10所述的方法得到的抗癌剂感受性增强剂。
12.—种癌治疗用组合物，其特征在于含有权利要求11所述的抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂的组1=1 o
13.权利要求11所述的抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂的组合 在癌治疗药物制造中的使用。
14.一种癌治疗方法，其特征在于投与权利要求11所述的抗癌剂感受性增强剂和作为感受性增强对象的抗癌剂。
全文摘要
本发明提供一种能够判别各个患者的治疗反应性的抗癌剂感受性判定标记以及利用该抗癌剂感受性判定标记的新的治疗手段。该抗癌剂感受性判定标记含有钙结合蛋白质S100A7、S100A8或S100A10。
文档编号A61P35/00GK101932338SQ20098010393
公开日2010年12月29日 申请日期2009年1月30日 优先权日2008年1月31日
发明者杉本伸二, 谷川原祐介, 铃木小夜 申请人:学校法人庆应义墪;株式会社益力多本社