由类二十烷酸介导的疾病和病症的治疗的制作方法

专利名称：由类二十烷酸介导的疾病和病症的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗由类二十烷酸介导的疾病和病症的组合物，尤其是涉及用于 治疗白三烯和羟基类二十烷酸介导的疾病和病症的蜱源性补体抑制剂。
背景技术：
类二十烷酸是通过3种主要酶促途径环氧合酶(COX)、脂肪氧合酶(LO)和 细胞色素P450单加氧酶(CYP450)而源自于20碳脂肪酸花生四烯酸酯(AA)的氧化的 生物活性脂质介质家族。类二十烷酸包括来自于COX途径的前列腺素类(包括前列腺 素(即PG)和血栓素(即TXB))、来自于LO途径的白三烯以及来自于LO和P450单加氧 酶途径的羟基二十碳四烯酸(HETE)和环氧二十碳三烯酸(EET) (Curtis-Prior, 2004 ； Peters-Golden&Henderson Jr.，2007)。类二十烷酸针对各种细胞类型和器官介导许多效 应。这些效应包括调节毛细血管和小静脉的血管紧张度和渗透性(PG、TBX、LK)、肌肉的收 缩或松弛(PG、TBX、半胱氨酰LK)、血小板功能的刺激或抑制(TBX、PG)、肾血流及矿物质代 谢的调控(Imig，2000 ；Hao和Breyer，2007)、恶性细胞生长和/或扩散的控制(Schwartz 等，2005 ；Aya，2006)、以及白细胞的活化，尤其是白细胞在自身免疫性及炎性病症中的活化 (LK> HETE) (Samuelsson, 1983 ；Kim&Luster, 2007)。LTB4和羟基类二十烷酸通过BLTl和BLT2G-蛋白偶联受体介导它们的效 应(Yokomizo等，1997，2000)。人类BLTl是对LTB4具有特异性的高亲和力受体(Kd 0. 39nM 1. 5nM ；Tager和Luster，2003)，在竞争结合研究中，只有20-羟基LTB4和12-表 LTB4 (12-epi LTB4)能够置换 LTB4 (Yokomizo 等，2001)。人类 BLT2 对 LTB4 的亲和力 (Kd 23nM)比BLTl低20倍，通过结合多种类二十烷酸(包括12-表LTB4、20_羟基LTB4、 12 (S)-和 15 (S)-HETE 以及 12 (S)-和 15 (S)-HPETE)而激活(Yokomizo 等，2001)。人类 BLT2与人类和小鼠BLTl具有45. 2%和44. 6 %的氨基酸同一性，而人类与小鼠BLT2具有 92. 7% 的同一性(Yokomizo 等，2000)。人类LBTl主要在白细胞表面表达，不过最近其被描述为可存在于内皮细胞和血 管平滑肌细胞中。人类BLT2在更多组织和细胞类型中表达。BLTl和BLT2的许多特异性拮 抗剂已经有所描述，它们可抑制人类中性粒细胞的激活、外渗和凋亡(Kim和Luster，2007) 并且在小鼠炎性关节炎模型(Kim等，2006)和肾缺血再灌注(Noiri等，2000)中减轻由中 性粒细胞浸润引起的症状。越来越多的研究表明，BLTl和BLT2均能够通过LTB4和羟基类 二十烷酸介导病理效应(Lundeen等，2006)，不过LBTl确实在一些病变(如小鼠中胶原诱 导的关节炎(Siao等，2006)中具有主要的作用。BLTl-/-缺陷小鼠还突出了 BLTl在炎性 应答中指导中性粒细胞转移方面的重要性。具体地说，利用5L0缺陷小鼠株显示了中性粒 细胞的BLTl自分泌激活为它们向关节炎性关节中的募集所需要(Chen等，2006)。LTB4是所描述的最强的趋化性和化学增活性类二十烷酸，并通过整联蛋白的上调 而促进中性粒细胞与血管内皮的粘附(Hoover等，1984)。它还是中性粒细胞的完全促分 泌素，诱导它们的聚集并增加微血管的渗透性。LTB4募集并激活自然杀伤细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。它增加超氧化物自由基的形成(Harrison等，19%)并调控基因表达，包 括许多促炎细胞因子和可以加重并延长组织炎症的介体的生成(Ford-Hutchinson，1990 ； Showell等，1995)。LTB4越来越多地被证明为在诱导和控制适应性免疫应答中发挥作用。 例如，调节树突细胞向引流淋巴结中的输送(trafficking) (Klaas等，2006 ；Del Prete等， 2007)、Th2细胞因子IL-13由肺T细胞的生成(Miyahara等，2006)、抗原特异性效应子 ⑶8+T细胞的募集(Taube等，2006)和人类B淋巴细胞的活化与增殖(Yamaoka等，1989)。LTB4的氧化异构衍生物如B4异白三烯也具有生物活性(Harrison等，1995)。作 为羟基类二十烷酸，例如5 (S) -HETE是嗜酸性粒细胞的高效化学引诱剂(Powell和Rokach，
2005)。衍生自LTA4的半胱氨酰LK与哮喘的病理生理学有关，包括衬着气道的平滑肌收缩 导致的支气管收缩；由血管渗漏导致的粘膜水肿；粘液分泌增加；和嗜酸性粒细胞中丰富 的炎性细胞浸润的出现(Bisgaard等，1985 ；Drazen等，1988)。许多上市药物靶向类二十烷酸。这些药物包括调控磷脂酶A2 (PLA2)从而抑制类 二十烷酸前体AA的释放的糖皮质激素(Sebaldt等，1990)。非甾体抗炎药(NSAID)和其他 防止前列腺素和血栓素合成的C0X2抑制剂(Curry等，2005)。还有许多抑制LTB4合成所 需的5-L0酶(Zileuton ；Dube等，1998)或拮抗介导半胱氨酰白三烯效应的CysLTi受体的 LK 调节物(扎鲁司特(Zafirlukast)和孟鲁斯特(Montelukast)) (Sharma 和 Mohammed，
2006)。LK调节物可以口服获得并且已经被FDA批准用于治疗慢性哮喘。孟鲁斯特已经收 到FDA批准用于季节过敏性鼻炎(2003年1月)的和运动诱导的支气管收缩(EIB) (2007 年4月)的许可。孟鲁斯特的静脉内剂型与口服剂型相比具有迅速起效的临床效果，正在 被开发用于治疗急性哮喘。孟鲁斯特还没有被批准用于囊性纤维化，但是有一些治疗效果 的证据(Stellmach 等，2005)。W02004/106369描述了通过与补体组分C5直接结合而同时抑制补体经典途 径和补体旁路途径的软蜱源性补体(C)抑制剂OmCI。OmCI来自于吸血性节肢动物 (haemotophagous anthropods)的唾液腺。其已被证明具有治疗潜力Ofepburn等，2007)。

发明内容
现已表明OmCI可与类二十烷酸结合。具体地说，本发明涉及先前未被证明的OmCI 结合类二十烷酸尤其是LK、特别是白三烯B4(LTB4)和羟基类二十烷酸12(S)_羟基二十碳 四烯酸(HETE)的能力。未修饰形式或修饰形式的OmCI还可以与12-表LTB4、20_羟基LTB4 和其他羟基类二十烷酸(包括15 (S)-羟基二十碳四烯酸(HETE)和12 (S)-和15 (S)-过氧 化氢二十碳四烯酸(HPETE))结合。本发明还涉及OmCI在治疗和预防病理学涉及到白三烯 尤其是LTB4和羟基类二十烷酸的疾病中的应用。OmCI结合并笼罩LK和羟基类二十烷酸。 这可以阻止配体与BLTl和BLT2受体相互作用并减轻脂肪酸的促炎效应(其常被证明依赖 于通过两个受体的信号转导)。因此，根据本发明的一个方面，提供了用于治疗由白三烯或羟基类二十烷酸介导 的疾病或病症的OmCI多肽或编码OmCI多肽的多核苷酸。根据本发明的一个优选实施方式，OmCI多肽包含(a) SEQ ID NO 3 的氨基酸序列；(b)具有与所述SEQ ID NO :3的氨基酸序列的至少60%同一性和白三烯(LK/E)
5结合活性的其变体；或(c)它们中任意一个的片段，所述片段具有LK/E结合活性。本发明的多肽或多核苷酸可以用于治疗炎性疾病或病症以及由白三烯或羟基类 二十烷酸介导的其它疾病或病症。根据本发明可以治疗的疾病和紊乱的实例包括葡萄 膜炎、特应性皮炎、接触性过敏、溃疡性结肠炎、食道腺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、痤疮、动脉 瘤、牙周病、囊性纤维化、前列腺癌、哮喘、动脉粥样硬化、银屑病、细支气管炎和炎症性肠 病。在本发明的另一个方面，提供了一种治疗或预防有需要的受试对象中由白三烯或 羟基类二十烷酸介导的疾病或病症的方法，所述方法包括对受试对象施用治疗有效量的 OmCI多肽或编码OmCI多肽的多核苷酸。在本发明的又一方面，提供了一种组合物，所述组合物包含OmCI多肽和脂肪酸。 所述脂肪酸优选为治疗性脂肪酸并提供用于对个体进行递送。


图1 与棕榈油酸结合的细菌表达的OmCI (bOmCI)的晶体结构的细节(图片中 央)。图2 显示在有或没有PBS、OmCI、RaHBP2的情况下将12500pg/mL12 (S) -HETE预温 育20分钟后的溶液中的12 (S) -HETE (pg/mL)，41. 2 μ gbOmCI对12 (S) -HETE结合的酶免疫 测定(EIA)。图3 在用12500pg/mL 12 (S) -HETE与3个浓度的bOmCI温育后的溶液中的 12 (S) -HETE, bOmCI对12 (S)-HETE结合的剂量依赖性。 图4 :b0mCI与12⑶-HETE的预温育时间的效果，更长的预温育时间对 12 (S)-HETE与bOmCI的结合没有效果。图 5 12 (S)-HETE 与 41. 2mcg 的 bOmCI、yOmCI 和 RaHBP2 的结合，EIA 显示 bOmCI 比等效量的酵母表达yOmCI捕获更多的12(S)-HETE。图6 在OmCI和RaHBP2与3333pg/mL TXB2温育之后在溶液中的TXB2，EIA显示 血栓素化与bOmCI没有结合。图7 在bOmCI和RaHBP2与750pg/mL LTB4温育后溶液中的表观LTB4，EIA显示 在bOmCI存在下的LTO4的表观浓度。图8 :b0mCI对LTB4-AP结合的剂量依赖性，其中用LTB4-AP偶联物对bOmCI进行 系列稀释。图9 等效浓度的bOmCI和yOmCI (8. 6mg/mL母液)对LTB4-AP的结合比较，yOmCI 和bOmCI对LTB4结合的剂量依赖性类似。图10 过量12⑶-HETE和与8. M μ g bOmCI结合的LTB4-AP的结合的效果，过量 的12 (S) -HETE没有与结合于bOmCI的LTB4竞争。图11 除去填充在袋(Z23与E41和F36的主链羰基H-键结合)底部的水分子Z23 后，对接在OMCI模型PDB ID 2CM4 (棍)的LTB4 (球)。图12 =OmCI使由于施加于皮肤上的IOOng LTB4而形成的损伤消除。照片在施加 后23小时拍摄。显示有比例尺。
图13 :bOMCI和LTB4的吸收光谱。㈧在添加OmCI之前，溶液中的LTB4(上方线 条)和添加然后通过超滤除去b0mCI:LTB4复合物后对同一溶液的再次测量结果(下方线 条)；(B)仅在通过超滤浓缩到200 μ 1后的bOmCI :LTB4复合物(上方线条)和bOmCI (下 方线条)。图14 与LTO4结合的bOmCI的晶体结构的细节(图片中央)。显示了 LTB4中在 C-5和C-12的羧基和羟基的氧原子。这些基团与结合腔中的氨基酸形成氢键(虚线)(请 参见实施例7的文字)。图15:在4 1至1 1摩尔比时，OmCI (而不是预装载有LTB4的OmCI)消除了 由于施加于皮肤的IOOng LTB4而形成的损伤。照片在施加后48小时拍摄。显示有比例尺。图16 静脉内施用50 μ g OmCI (图16中称为EV576)减少了肺内中性粒细胞募集， 并降低了血管渗透性和由鼻内施用150g抗卵清蛋白(Ova)抗体引起的蛋白质渗出。
具体实施例方式序列说明SEQ ID NO 1是毛白钝缘蜱(Ornithodoros moubata)的OmCI的多核苷酸和所编 码的蛋白序列。SEQ ID NO 2是毛白钝缘蜱的OmCI的氨基酸序列。SEQ ID NO 3是SEQ ID NO 2中所示的19至168位氨基酸的氨基酸序列，并且是 没有SEQ ID NO 2的蛋白的开始氨基酸序列(信号序列)的OmCI的氨基酸序列。SEQ ID NO 4和5分别是经修饰使Asn78变为Gln并且Asn 102变为Gln的OmCI 的多核苷酸和所编码的蛋白序列与蛋白序列，其中密码子分别由AAT和AAC变为CAA，以在 酵母表达中避免高糖基化。因此，本发明提供了一种用于治疗由白三烯或羟基类二十烷酸介导的疾病或病症 的OmCI多肽或编码OmCI多肽的多核苷酸。OmCI蛋白可以是蜱源性补体抑制剂，分离自毛 白钝缘蜱的唾液，或者可以是其功能等同物，包括其同源物和它们中任意一个的片段。本发明的OmCI蛋白优选是来自毛白钝缘蜱的OmCI。该蛋白首次分离自蜱的唾液 腺，并且已经发现可抑制补体经典途径和补体旁路途径。该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。根据本发明的多肽可以包括SEQ ID NO :2中所示的完全序列。作为选择，提供 了不包括所述蛋白序列的形成信号序列的前18个氨基酸的多肽。因此，根据本发明的多肽 可以是SEQ ID NO 3的多肽，即SEQ ID NO 2的氨基酸序列的19至168位氨基酸。根据本发明，还提供了诸如来自于毛白钝缘蜱的OmCI蛋白的同源物或片段等变 体。这些同源物可以包括在SEQ ID N0:2或3给出的OmCI序列的共生同源物(paralogue) 和直向同源物(orthologue)，包括例如来自其他蜱种的OmCI蛋白序列，所述其他蜱种包 括具尾扇头蝶(Rhipic印halusappendiculatus)、血红扇头蝶(R. sanguineus)、囊形扇 头蜱(R. bursa)、美洲花蜱(A. americanum)、卡延钝眼蜱(A. cajennense)、希伯来钝眼 蜱(A. hebraeum)、微小牛蝶(Boophilusmicroplus)、具环牛蜱(B. annulatus)、消色牛蜱 (B· decoloratus)、网纹革_ (Dermacentor reticulatus)、安氏革_ (D· andersoni)、边缘 革蝶(D. marginatus)、变异革蝶(D. variabilis)、长角血蝶(Haemaphysalis inermis)、 MSifiI^ (Ha. Leachii)(Ha. Punctata)、/j、i^|目艮@ (Hyalomma anatolicumanatolicum)、嗜马它璃目艮蝶(Hy. Dromedarii)、边缘璃目艮蝶(Hy. marginatum marginatum) > 蓖子硬蜱(Lxodesricinus)、全沟硬蜱(I. persulcatus)、黑脚硬蜱(I. scapularis)、六角 形硬蜱(I.hexagonus)、波斯锐缘蜱(Ar gas persicus)、鸽锐缘蜱(A. ref lexus)、锉锯 钝缘蜱(Ornithodoros erraticus)、纯化非洲钝缘蜱(0. moubata moubata)、猪乳突钝缘 蜱0). m. porcinus)和沙氏钝缘蜱(0. savignyi)。术语“同源物”还指包括来自蚊物种的 OmCI蛋白序列，包括库蚊属(Culex)、按蚊属(Anopheles)和伊蚊属(Aedes)，尤其是致倦 库岐(Culex quinquefasciatus)、埃及伊岐(Aedes aegypti)禾口 R 比亚按岐(Anopheles gambiae)；蚤物种，例如猫栉首蚤(Ctenoc印halides felis)(猫蚤)；马蝇；白蛉；黑蝇；采 采蝇；虱、螨、水蛭以及扁形动物。在一个实施方式中，OmCI多肽包含(a) SEQ ID NO 3 的氨基酸序列；(b)具有与所述SEQ ID NO 3的氨基酸序列的至少60%同一性并且具有LK/E结 合活性的其变体；或(c)它们中任意一个的片段，所述片段具有LK/E结合活性。变体多肽是氨基酸序列变化自SEQ ID NO :2或3的氨基酸序列但是保留与OmCI 相同的LK/E结合的必要特性或基本功能的那些多肽。在此处使用的LK/E结合活性是指与白三烯和羟基类二十烷酸结合的能力，所 述白三烯和羟基类二十烷酸包括但不限于LTB4、B4异白三烯及其任何羟基化的衍生物、 HETE、HPETE 禾口 EET。因此，变体多肽可以显示出LK/E结合活性。通常，与SEQ ID NO :2或3的氨基酸 序列具有大于约50%、55%或65%同一性，优选至少70%、至少80%、至少90%，并且特别 优选至少95%、至少97%或至少99%同一性的多肽被认为是所述蛋白的变体。这些变体 可以包括等位基因变体和在蛋白序列中缺失、修饰或增加单独的一个氨基酸或一组氨基酸 的变体，只要该肽保留OmCI的基本功能即可。SEQ ID NO :3的变体的同一性可以在SEQ ID NO 3中所示的序列的至少50个、至少100个、至少130个或至少140或更多个相连氨基酸 的区域内测得，更优选在SEQ IDNO 3的全长内测得。尤其可能为LK/E结合所需的氨基酸包括(参见SEQ ID NO. 2) :Phe36, Arg54, Leu57、Gly59、Val72、Met74、Phe76、Thr85、Trp87、Phe89、Glnl05、Argl07、Hisll9、Aspl21、 Trp133 ο可以使用任何适合的算法来计算氨基酸同一性。例如，UWGCG包提供了可以用来计 算同源性(例如按其默认设置使用)的BESTFIT程序(Devereux等，(1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395) 0 PILEUP和BLAST算法可以用来计算同源性或对齐序列(例如鉴 定等同或对应序列)(通常采用其默认设置)，例如如Altschul S. F. (1993) J MoI Evol36 290-300 ；Altschul, S，等(1990) J MoI Biol 215 :403-10 中所述。用于进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/))公开获得。该算法 包括通过鉴定在与数据库序列中同一长度短语比对时，匹配或满足一些正值阈得分T的查 询序列中长度为W的短语来首先鉴定出高得分序列对(HSP)。T是指相邻短语得分阈值 (Altschul等，supra)。这些初始相邻短语命中记录起到启动检索以找到包含它们的HSP的
8种子的作用。短语命中记录沿着每条序列在两个方向上延伸直至可以增加累积比对得分。 每个方向的短语命中记录的延伸在以下情况下停止累积比对得分从其所得到的最大值下 降X量；由于一个或多个负得分残基比对的累积而导致累积得分降为0或以下；或达到任 意一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感度和速度。BLAST程序使用的默 认值为短语长度(W)为11，BL0SUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915-10919)比对(B)为 50，期望值(E)为 10，M = 5、N = 4，并 且对两条链都进行比较。BLAST算法在两条序列之间进行相似性的统计分析；参见例如Kar 1 in和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787。BLAST 算法提供的一种相似性 量度是最小和值可能性(smallest sum probability (P(N))，其提供了两条多核苷酸或氨 基酸序列之间偶然发生匹配的可能性指示。例如，如果在第一条序列与第二条序列的比较 中的最小和值可能性小于约1，优选小于约0. 1，更优选小于约0. 01，最优选小于约0. 001， 则该序列被认为与另一条序列相似。变体序列通常有至少1、2、3、5、10、20、30、50或更多突变(其可以是氨基酸的取 代、缺失或插入)的差异。例如，可以进行1至50、2至40、3至30或5至20个氨基酸取代、 缺失或插入。取代优选是例如根据下表的保守取代。在第2列同一区中并且优选在第3列 同一行中的氨基酸可以相互取代。
脂肪族非极性GAPILV极性-不带电CSTMNQ极性-带电DEKR芳香族HFWY本发明所用的OmCI多肽的片段在长度上通常为至少50个氨基酸，例如至少80个 以上的氨基酸，至多在长度上为90、100、120、130或140个氨基酸，只要其保留OmCI的LK/
E结合活性。本发明的多肽还可以作为包含通过遗传方法或化学方法与另一条肽融合的OmCI 多肽的融合蛋白提供。另一条肽的目的在于辅助该蛋白的检测、表达、分离或纯化。作为选 择，所述蛋白可以与诸如Fc肽等肽融合以增加该蛋白的循环半衰期。其它融合伴侣的实例 包括半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶或荧光素酶。本发明所使用的多肽可以进行化学修饰，例如翻译后修饰。例如，它们可以糖基 化、PEG化、磷酸化或包含经修饰的氨基酸残基。它们可以通过增加组氨酸残基以辅助对其 的纯化或通过增加信号序列以促进插入到细胞膜中来进行修饰。这些经修饰的多肽落在此 处使用的术语“多肽”的范围内。通常，用于本发明用途的多肽显示出LK/E结合活性。实际上OmCI具有与任何长度 为16至20个碳原子的非环状脂肪酸结合的倾向性。某些脂肪酸尤其是LTB4比其他脂肪 酸结合为紧密。本发明的多肽可以结合的其他脂肪酸包括花生四烯酸、12-表LTB4、20-羟 基LTB4和羟基类二十烷酸，包括12 (S)-羟基二十碳四烯酸(HETE)和12 (S)-过氧化氢二十碳四烯酸(HPETE)。所述多肽的LK/E结合活性或与其他脂肪酸的结合活性可以通过适当的 测试手段例如本领域技术人员熟悉的酶免疫测定、质谱或放射性配体或荧光标记配体结合 测试进行确定。一种这样的结合测试在实施例中举例说明。在一些实施方式中，可以优选 选择优先与特定脂肪酸如LTB4结合的多肽。这种优先结合活性可以通过适当测试例如在 实施例中举例说明的竞争性测试进行确定。根据本发明的一些方面，优选的是，用于本发明用途的多肽保留毛白钝缘蜱的 OmCI所示的补体抑制剂活性。优选的是，所述多肽抑制补体激活经典途径和补体激活旁 路途径。“抑制”是指降低补体激活旁路和经典途径的效应。分子降低补体经典途径和补 体旁路途径的效应的能力可以通过本领域已知的常规溶血测试进行测定，如在Giclas等 (1994)以及在W02004/106369所述的那些常规溶血测试。优选的是，与没有补体抑制剂多 肽的常规测试相比，本发明的补体抑制剂多肽的存在降低了在用于补体激活经典和旁路途 径的常规溶血测试中红细胞裂解至少20 %，更优选降低至少30 %、40 %、50 %、60 %、70 % 或 80%。优选的是，补体抑制剂多肽抑制经典途径中C5转化酶对C5的切割和旁路途径中 C5转化酶对C5的切割。通过C5转化酶进行的C5至C5b的转化在补体旁路途径和补体经 典途径中均出现。经典途径中的C5转化酶是C4b3t32a，替代途径中的C5转化酶是C!3b2Bb。 因此，抑制这两种C5转化酶对C5的切割将同时抑制补体激活经典途径和补体激活旁路途 径。分子抑制经典途径和旁路途径中C5转化酶对C5的切割的能力可以通过常规体外测试 确定。优选的是，与没有补体抑制剂多肽的常规测试相比，补体抑制剂多肽的存在降低经 典途径和旁路途径中C5转化酶对C5的切割至少20%，更优选降低至少30%、40%、50%、 60%、70%或80%。优选的是，本发明多肽的补体抑制剂活性抑制众多哺乳动物物种的经典 途径和旁路途径中C5转化酶对C5的切割。在本发明的另一个方面，选择本发明所用的OmCI多肽使得补体抑制剂活性降低 或消失。例如，OmCI多肽可以在132至142环(参见SEQ IDNo :1，为β -H至C末端α 2螺 旋)进行突变。例如，对该环中一个或多个或所有氨基酸可以进行缺失或者用例如TSGP2 的氨基酸取代以减少或去除对C5的结合，因此降低补体抑制剂活性。本发明所用的多肽可以为基本分离的形式。应当理解的是，所述多肽可以与不干 扰多肽的目标用途的载体或稀释剂混合而仍被认为是基本分离的。本发明所用的多肽还可 以为基本纯化形式，在这种情况下，在制剂中一般包含所述多肽，在制剂中超过50重量％， 例如超过80重量％、90重量％、95重量％或99重量％的多肽是本发明的多肽。本发明使用的多肽可以分离自产生OmCI多肽或OmCI多肽变体的任何蜱。本发明使用的多肽还可以作为所述分离多肽的片段进行制备。而且，OmCI多肽还 可以通过合成或通过重组手段制备。例如，可以通过以下方法来制备重组OmCI多肽用表 达载体转染培养中的哺乳动物、真菌、细菌或昆虫细胞，该表达载体包含可操作连接到适当 控制序列上的编码多肽的核苷酸序列；培养细胞、提取并纯化由该细胞生成的OmCI多肽。本发明使用的多肽的氨基酸序列可以修饰而包含非天然存在的氨基酸或增加该 化合物的稳定性。当所述多肽通过合成手段制备时，可以在制备过程中导入这样的氨基酸。 所述多肽还可以在合成或重组制备后进行修饰。本发明使用的多肽还可以使用D-氨基酸制备。在这种情况下，氨基酸将以从C至N的方向连接到反向序列中。这在制备这样的多肽的领域中是常见的。在本领域中，许多侧链修饰是已知的，并且可以使用于OmCI多肽的侧链，只要所 述多肽保留LK/E结合活性。多核苷酸编码OmCI多肽或变体的多核苷酸可以用来治疗或预防由白三烯或类二十烷酸介 导的疾病或病症。具体地说，所述多核苷酸可以包含或由以下序列组成(a)SEQ ID N0:1的 编码序列；(b)由于遗传密码而与(a)中所限定的序列简并的序列；(c)与(a)或(b)中所 限定的序列具有至少60%同一性并编码具有LK/E结合活性的多肽的序列；或(d) (a)、(b) 或(c)中限定的序列中任意一个的片段，所述片段编码具有LK/E结合活性的多肽。所述多核苷酸通常为DNA。然而，多核苷酸可以为RNA多核苷酸。多核苷酸可以是 单链或双链，并且在其中可以包括合成的或修饰的核苷酸。本发明的多核苷酸通常可以以显著高于背景的水平与SEQ ID NO :1的编码序列或 该编码序列的互补序列杂交。背景杂交可以出现，例如由于在DNA文库中存在的其他DNA 的缘故而出现。通过本发明多核苷酸与SEQ ID NO :1的编码序列或该编码序列的互补序列 之间的相互作用而产生的信号水平通常是其他多核苷酸与SEQ ID NO :1的编码序列之间 的相互作用强度的至少10倍，优选至少100倍。相互作用强度可以测量，例如通过用如32P 对探针进行放射性标记来测量。一般可以使用中度至高度严格性条件来实现选择性杂交。 然而，这样的杂交可以在本领域已知的任意适合条件下进行(参见Sambrook等，Molecular Cloning =ALaboratory Manual, 1989)。例如，如果需要高严格性，则适当的条件包括在60°C 至65°C，0. 1至0. hSSC。如果需要低严格性，则适当的条件包括在60°C，2xSSC。SEQ ID NO 1的编码序列可以通过核苷酸取代，例如从1、2或3至10、25、50或 100个取代而进行修饰。SEQ ID NO :1的多核苷酸可以选择性或另外通过一个或多个插入 和/或缺失和/或通过在任意一个或两个末端延伸进行修饰。还可以包含额外序列，诸如 信号序列，或者编码另一条肽或蛋白的序列以帮助该蛋白的检测、表达、分离或纯化，或者 可以是编码诸如Fc肽等肽的序列以增加该蛋白的循环半衰期。其他融合伴侣的实例包括 β -半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶或荧光素酶。经修饰的多核苷酸通常编码具有LK/E结合活性的多肽。可以进行简并取代，或者 可以进行在修饰序列翻译时导致保守氨基酸取代(例如上表所示)的取代。能够与SEQ ID NO 1的DNA编码序列的互补序列选择性杂交的核苷酸序列一般与 SEQ ID NO 3的编码序列在至少20个、优选至少30个例如至少40个、至少60个、至少100 个、至少200个、至少420个或最优选在SEQ ID NO :1全长上或SEQ ID NO :1编码具有SEQ ID NO 1中所示序列的多肽的长度上具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少 95%、至少98%或至少99%的序列同一性。序列同一性可以通过任意适当的方法来测定， 例如如以上所述的方法。可以用上述序列同一性程度与最小长度的任意组合来限定本发明的多核苷酸，优 选更严格的组合(即，在更长的长度上更高的序列同一性)。因此，例如在60个，优选在100 个核苷酸上具有至少90%的序列同一性的多核苷酸形成本发明的一个方面，在420个核苷 酸上具有至少95%的序列同一性的多核苷酸一样也形成本发明的一个方面。多核苷酸片段在长度上优选为至少20个，例如至少25个、至少30个或至少50个核苷酸。它们在长度上一般至多为100个、150个、250个或400个核苷酸。片段可以在长 度上长于400个核苷酸，例如比SEQ IDNO 1的编码序列短至多数个核苷酸，如5个、10个 或15个核苷酸。本发明使用的多核苷酸可以通过重组、合成或通过本领域技术人员可以得到的任 何手段来制备。它们还可以通过常规技术进行克隆。多核苷酸通常以分离和/或纯化形式 提供。—般而言，短多核苷酸将通过合成手段来制备，包括按一次一个核苷酸逐步制备 所需核酸序列。采用自动化技术实现这种制备的技术在本领域中很容易得到。较长多核苷酸一般使用重组手段制备，例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技 术。这将包括针对OmCI基因的需要克隆的区域制备引物对(例如约15至30个核苷酸)， 使引物与从节肢动物细胞中获得的DNA接触，在可进行所需区域扩增的条件下进行聚合酶 链式反应，分离所扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上对反应混合物进行纯化)并回收 所扩增的DNA。引物可以设计成包含适当的限制酶识别位点使得可以将所扩增的DNA克隆 到适当的克隆载体中。可以使用适当的技术来获得全部或部分本文所述的OmCT基因序列。尽管一般来 说本文提到的技术在本领域中是熟知的，但是可以具体参考Sambrook等(1989)。本文所述的OmCI多核苷酸可以用于制备本发明中使用的多肽，这可以在体外、体 内或离体进行。多核苷酸可以单独用作治疗剂，或者可以涉及到重组蛋白合成。本发明使用的多核苷酸一般引入到重组复制性载体中。该载体可以用来在相容性 宿主细胞中复制核酸。因此，本发明使用的多核苷酸可以通过将OmCI多核苷酸导入到复制 性载体中，将该载体导入到相容性宿主细胞中并使该宿主细胞在能够实现载体复制的条件 下生长来制备。宿主细胞可以是例如大肠杆菌细胞。优选载体是包含编码OmCI多肽的核酸序列的表达载体。在分子生物学领域这样 的表达载体可以常规构建，并且可以例如包括使用质粒DNA和适当的起始区(initiator)、 启动子、增强子和其他元件，例如可能需要的并且以正确方向定位以允许蛋白表达的聚腺 苷化信号。还可以选择编码序列来提供适合于所使用的宿主生物体的优选密码子使用。 其他适当的载体对于本领域技术人员而言是显而易见的。在这方面的其它实例可以参考 Sambrook 等(1989)。优选的是，在载体中本发明使用的多核苷酸可操作性地连接到能够使编码序列由 宿主细胞表达的控制序列，即，载体是表达载体。术语“可操作性地连接”是指其中所述组 分处于允许它们按其指定方式发挥作用的关系的并置。与编码序列“可操作性地连接”的 诸如启动子等调节序列定位的方式使得在与调节序列相容的条件下实现编码序列的表达。载体可以是例如质粒、病毒或噬菌体载体，其提供有复制原点、可选的用于表达所 述多核苷酸的启动子和可选的启动子的调节子。载体通常被改造在体内使用。启动子和其他表达调节信号可以选择为与为其设计表达的宿主细胞相容。可以使 用诸如肌动蛋白启动子等哺乳动物启动子。特别优选的是组织特异性启动子。也可 以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复序列(MMLV LTR)、劳斯肉瘤病毒 (RSV) LTR启动子、SV40启动子、人类巨细胞病毒(CMV) IE启动子、腺病毒、HSV启动子(例 如HSV IE启动子)或HPV启动子，尤其是HPV上游调控区(URI )。在本领域中，病毒启动子容易获得。载体可以进一步包括位于多核苷酸侧翼的序列，形成包含与真核基因组序列(优 选哺乳动物基因组序列)同源的序列的多核苷酸。这将允许通过同源重组来将本发明的 多核苷酸导入到真核细胞的基因组中。具体地说，可以使用包含以病毒序列为侧翼的表达 盒的质粒载体来制备适合将本发明的多核苷酸递送到哺乳动物细胞中的病毒性载体。适当 的病毒性载体的其他实例包括单纯疱疹病毒载体和逆转录病毒，包括慢病毒、腺病毒、腺相 关病毒和HPV病毒。使用这些病毒的基因转移技术对于本领域技术人员而言是已知的。逆 转录病毒载体例如可用于稳定地将形成所述多核苷酸的多核苷酸整合到宿主基因组中。相 反，复制缺陷型腺病毒载体保持为游离型，因此允许瞬时表达。疾病和病症本发明人已经发现，OmCI具有与LTB4和羟基类二十烷酸12⑶-HETE结合的能力。 LTB4是所描述的最强大的趋化性和化学增活性类二十烷酸并通过整联蛋白的上调来促进 中性粒细胞与血管内皮的粘附。LTB4诱导中性粒细胞的聚集并通过多种过程在炎症中发挥 作用。LTB4已被证明在诱导和控制适应性免疫应答中发挥作用。因此，具有结合并笼罩白 三烯和羟基类二十烷酸的能力的OmCI可以阻止这些配体与BLTl和BLT2受体相互作用，并 且能够用来减轻脂肪酸的促炎效应。可以根据本发明进行治疗的具体紊乱的实例包括葡萄膜炎、特应性皮炎、接触性 过敏、溃疡性结肠炎、食道腺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、痤疮、闭塞性细支气管 炎、动脉瘤、牙周病、囊性纤维化、前列腺癌、炎症后色素沉着、纤维肌痛、系统性红斑狼疮、 肿瘤转移、硬皮病、多发性硬化、结节病、辐射诱发性胃肠道炎症和痛风。根据本发明可以治疗的其它的病症和紊乱包括哮喘、支气管炎、动脉粥样硬化、银 屑病、银屑病关节炎、炎症性肠病(包括克罗恩病)、败血症、动脉炎、心肌梗塞、中风和冠心 病、缺血再灌注损伤、肾炎、和包括类风湿性关节炎、脊椎关节病、骨关节炎和幼年性关节炎 在内的关节炎。根据本发明能够治疗的已知由LTB4介导的病症包括闭塞性细支气管炎、硬皮病 肺间质疾病(scleroderma interstitial lung disease)、牙周病、慢性B淋巴细胞白血病、 前列腺癌和动脉粥样硬化。根据本发明能够治疗的已知由LTB4和补体介导的病征包括肾炎、各类关节炎、葡 萄膜炎、癌症、败血症、缺血再灌注损伤、中风和心肌梗死。根据本发明可以通过OmCI递送的抗炎脂肪酸(诸如脂氧素和脂解素(resolvin) 已知在其中发挥作用的病症包括硬皮病肺间质疾病、纤维化、牙周病、关节炎、哮喘、动脉粥 样硬化和结肠炎。治疗和预防本发明提供了 OmCI多肽和多核苷酸在治疗或预防由白三烯和类二十烷酸介导的 疾病或病症中的应用。治疗可以是医疗性的或预防性的。可以对个体施用OmCI多肽或多核苷酸以防止疾病或病症的一种或多种症状的发 作。在该实施方式中，受试对象可以是无症状的。受试对象可以对该疾病具有遗传易感性。 向这样的个体施用预防有效量的多肽或多核苷酸。预防有效量是防止疾病或病症的一种或 多种症状发作的量。
OmCI多肽或多核苷酸的治疗有效量是有效减轻疾病或病症的一种或多种症状的 量。优选的是，待治疗的个体是人类。OmCI多肽或多核苷酸可以通过任何适当的手段施用于受试对象。多肽或多核苷酸 可以通过肠内或肠胃外途径施用，如通过口服、口腔、肛门、肺、静脉内、动脉内、肌肉内、腹 腔内、关节内、局部或其他适当的施用途径施用。OmCI多肽或多核苷酸可以施用于受试对象以对特定部位进行靶向治疗。本文提到的任何多肽和多核苷酸的制剂将取决于诸如多肽或多核苷酸的性质和 受治疗病症等因素。所述多肽或多核苷酸可以以各种剂型进行施用。其可以通过以下方 式施用口服(例如作为片剂、锭剂、含片(lozenge)、水性或油性悬浮液、分散性粉末或颗 粒)、胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、胸骨内、透皮、局部或输注技术。所述多核苷酸或多肽还 可以作为栓剂施用。医生将能够针对每一个具体患者决定所需的施用途径。通常，所述多肽或多核苷酸配制成与药学上可接受的载体或稀释剂一起使用，这 可以使用药学领域的常规方法进行。药用载体或稀释剂可以是例如等渗溶液。例如，固体 口服形式除了含有活性化合物之外还可以含有稀释剂，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、玉米 淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二 醇；粘合剂，如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩 解剂，如淀粉、藻酸、藻酸盐或淀粉羟乙酸钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；润湿剂，如卵磷 脂，聚山梨酸酯、月桂基硫酸酯；以及通常在药物配制中使用的无毒性和无药理学活性的物 质。这种药物制剂可以以已知的方式制造，例如，通过混合、制粒、压片、糖衣或膜衣工艺制 造。用于口服的分散液可以是糖浆、乳剂和悬浮剂。糖浆可以包含载体，例如蔗糖或蔗 糖甘油(saccharose with glycerine)和/或甘露醇和/或山梨醇。悬浮剂和乳剂可以包含载体，例如天然树胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧 甲基纤维素或聚乙烯醇。用于肌肉内注射的悬浮剂或溶液除了包含活性化合物之外还可以 包含药学上可接受的载体，如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇类如丙二醇，并且如果需要， 还可以包含适量的利多卡因盐酸盐。用于静脉注射或输注的溶液可以包含载体，如无菌水，或者优选它们可以是无菌、 水性、等渗的盐水溶液的形式。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可以包括例如聚烷撑二醇或甘油三酯；这些栓剂 可以由含有0.5%至10%，优选为至2%活性成分的混合物形成。口服制剂包括通常采用的赋形剂，例如制药等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、 糖精钠、纤维素和碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊剂，缓释制剂或 粉末剂的形式，并含有10%至95%、优选25%至70%的活性成分。在药品组合物是冻干的 情况下，冻干的材料可在施用前重建，例如悬浮。重建优选在缓冲液中进行。用于患者口服施用的胶囊剂、片剂和丸剂可以提供有肠衣，所述肠衣包含例如 Eudragit Eudragit “L”、醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素或羟丙基甲基纤维素。也可以使用适合于经无针注射来递送(例如透皮使用)的药物组合物。根据本发 明的组合物可以以所有常用于局部施用的剂型存在，尤其是以如下形式存在水溶液、含醇 水溶液或油性溶液；洗液或浆液型分散剂；无水或亲脂性凝胶；通过将脂相分散到水相(0/W)或将水相分散到脂相(VV/0)中获得的乳型液体或半固体稠度的乳剂；或膏型或凝胶型 软、半固体稠度的悬浮剂或乳剂；或者可选地为微乳、微胶囊、微粒或离子型和/或非离子 型囊泡分散剂。这些组合物按照常规方法制备。它们也可以以如下形式用于头皮(scalp):水溶液、醇溶液或含醇水溶液、膏剂、 凝胶剂、乳剂、泡沫剂；或者为还含有加压推进剂的气溶胶组合物形式。根据本发明的组合物的不同的组分的量为本领域所常规使用的量。施用治疗有效量的多肽或多核苷酸。剂量可以根据各种不同参数来确定，尤其是 根据所使用的多肽或多核苷酸；受治疗患者的年龄、体重和病症；施用途径和所需方案来 确定。同样的，医生将能够针对任何特定的患者确定所需的施用途径和剂量。根据多肽的 活性、受治疗对象的年龄、体重和病症，疾病的类型和严重性以及施用的频率和施用途径， 通常的日剂量为约0. OOlmg/kg体重至50mg/kg体重，优选为约0. 01mg/kg体重至10mg/kg 体重。优选的是，日剂量水平为0.5mg至2g。局部施用可以使用较低的剂量。还可以将上述的OmCI核苷酸序列和含有这些序列的表达载体用于上文概述的药 物制剂。优选的是，核酸如RNA或DNA、尤其是DNA以表达载体的形式提供，所述表达载体可 以在受治疗个体的细胞中表达。所述制剂可以包含裸核苷酸序列或与阳离子脂质、聚合物 或靶向系统组合。制剂以通过任何可利用技术来递送。例如，核酸可以通过针注射法(优 选为皮内、皮下、肌肉内注射)来导入。作为选择，核酸可以使用诸如颗粒介导的基因递送 等核酸递送装置跨皮肤直接递送。核酸可以局部施用于皮肤，或例如通过鼻内、口服、阴道 内或直肠内施用而施用于粘膜表面。可以通过若干种已知的转染技术，例如包括使用转染剂的那些技术来提高对核酸 构建体的吸收。这些试剂的实例包括阳离子试剂，例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖和脂质转染 剂(Iipofectant)，如脂染安(Iipofectam)和转染安(transfectam)。可以改变所施用的 核酸的剂量。通常，对于颗粒介导基因递送，可以以Ipg至lmg，优选Ipg至10 μ g施用核 酸，对于其他途径，可以以IOyg至Img施用核酸。已经表明OmCI多肽可以与长度为16至20个碳原子的任何非环状脂肪酸结合。然 而，LTB4比其它脂肪酸结合得更为紧密。本发明的OmCI多肽也可以用来递送其他脂肪酸， 例如具有治疗活性的脂肪酸。本发明的OmCI多肽可以用来将这些脂肪酸靶向到存在LTB4 的炎症部位。具体地说，OmCI多肽在LTB4存在的情况下将释放所结合的脂肪酸。因此， OmCI可以用来将目标脂肪酸靶向到炎症部位。例如，已发现在酵母中表达的OmCI在其结合袋中含有蓖麻油酸(Roversi等， 2007)，而在细菌中表达的OmCI结合棕榈油酸(图1)。因此，可以将抗炎脂肪酸装载到本 发明的OmCI多肽中。与含有LTB4的炎症部位接触时，所结合的脂肪酸可以通过被与OmCI 多肽结合更为紧密的LTB4置换而释放。根据本发明的这一方面可以使用的治疗性脂肪 酸的实例包括脂氧素A4、脂氧素B4、脂解素、保护素、15 6)-HETE、二十二碳三烯、13-羟基 十八碳二烯酸、15-羟基二十碳三烯酸、15-羟基二十碳五烯酸、17-羟基二十二碳六烯酸、 蓖麻油酸和硝化脂肪酸以及所有这些物质的类似物(Barmenberg等，2005 ；Cui等，2006 ； McMahon 和 Godson，2004 ；Papayianni 等，1996 ；Serhan 等，2000 及 2002 ；Serhan 和 Savill, 2005 ；Ternowitz等，1989 Jakata等，1994)。例如，脂氧素是内源产生抗炎剂，其调节白细 胞输送(trafficking)并刺激非炎症巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬作用，这促进了炎症的解除。在一个优选的实施方式中，被选择用于由OmCI靶向的脂肪酸在碳链的C15上没 有羟基。作为选择，可以使用修饰的OmCI，例如其中SEQ ID NO. 2的Arg 107被修饰，例如 修饰为Gly，以避免在与于C15上具有羟基的脂肪酸结合时或与脂氧素结合时在结合袋内 发生位阻影响。实施例实施例1 在竞争ELISA中OmCI结合12 (S)-HETE (12 (S)-羟基二十碳四烯酸)背景OmCI与脂肪酸结合(图1)。质谱分析表明，蓖麻油酸(C18H34O3)和棕榈油酸 (C16H30O2)分别是甲醇毕赤酵母(P.methanolica)和大肠杆菌中表达的OmCI中所见的主要 形式。然而，真实的生理学配体更加有可能是许多源于宿主细胞膜的介导炎症、氧化胁迫和 细胞信号转导的类二十烷酸中的一种或多种。可以利用来自Assay Designs Inc.的竞争酶免疫测定(EIA)来对多种类二十烷 酸进行定量。一种这样的EIA试剂盒使用抗12 (S)-HETE的多克隆抗体与标记有碱性磷酸 酶的12(S)-HETE、以及样品中或浓度已知的标样中未标记的竞争性12(S)-HETE结合。在 室温下同时温育并且将抗体捕获在培养板上之后，洗掉过量的试剂，加入底物并使用酶标 仪(microplatereader)对反应进行测量。样品或标样中的12 (S)-HETE浓度越高，吸光度 读数就越低，这是因为未标记的脂肪酸与碱性磷酸酶标记的分子竞争结合。本发明人推测，OmCI将与免疫测定所用的类二十烷酸特异性抗体竞争结合。选择 12(S)_羟基二十碳四烯酸(126)-HETE)来检测这种想法，这是因为其(可能)是物理化学 特性与蓖麻油酸(根据本发明人的结晶学数据预测，其比棕榈油酸结合得更加紧密)最为 相似的类二十烷酸。除了其他效应之外，12( -HETE已表明对多形核白细胞和血管平滑肌 细胞具有趋化性和化学增活性。方法12 (S) -HETE EIA 试剂盒来自于 Assay Designs (Cat. No. 900-050)。所使用的 OmCI 母液在酵母(yOmCI)或细菌(bOmCI)中表达。两种母液的纯度都≥98%,以8. :3mg/mL溶 于PH 7. 2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。阴性对照蜱组胺结合蛋白RaHBP2(也是一种脂钙蛋白 (Paesen等，1999))在细菌中表达，纯度也≥98%，以8. 3mg/mL溶于PBS0将12 (S) -HETE标 样在随试剂盒提供的测试缓冲液中稀释至50000pg/mL、12500pg/mL、3125pg/mL、781pg/mL、 195pg/mL。将 100 μ 1 的 12500pg/mL、3125pg/mL、0pg/mL 溶液与≤ 9 μ 1 的磷酸盐缓冲盐水 (pH 7. 2 (PBS))或者OmCI或RaHBP2在PBS中的溶液混合。将混合物在室温下温育20分 钟，然后根据产品说明书用于12 (S)-HETE免疫测定。将经处理样品的吸光度读数与标准曲 线进行比较以估测溶液中可以被抗-12(S)-HETE多克隆抗体结合的12 (S)-HETE的浓度。结果b0mCI(而不是RaHBP2)降低了溶液中可以用于抗体结合的12 (S)-HETE的量，表明 bOmCI与12 (S)-HETE直接结合(图2)。PBS与bOmCI和RaHBP2纯化蛋白制备物似乎含有 一些(≤ 1000pg/mL) 12 (S) -HETE0讨论细菌表达蛋白的这些初步结果表明OmCI能够与较长(C20)的并具有更多数目不 饱和键⑷(相对于棕榈油酸(C16和1个双键)或蓖麻油酸(C18和1个双键))的脂肪酸结合。而且，12 (S)-HETE在C9-C10不具有双键，预测这对于配体结合非常重要。结果还表 明12 (S)-HETE能够将棕榈油酸从bOmCI的结合袋中置换。但是这种假设需要谨慎，因为使 用了摩尔数明显过量的OmCI (约1000倍至4000倍)，可能有一部分纯化bOmCI没有被任何 配体占据。实施例2 影响12⑶-HETE与OmCI结合的参数方法使用与实施例1所述类似的方法。结果与讨论需要对于12 (S)-HETE而言摩尔数明显过量的bOmCI来提供明确证实12 (S)-HETE 结合的结果(图3)。在图3所示的测试中，bOmCI相对于12 (S)-HETE而言过量约634、127 和25. 5摩尔。需要摩尔数明显过量的OmCI可能反映出bOmCI与抗-12 (S) -HETE抗体竞争 结合12 (S) _HETE、b0mCI对12 (S) -HETE的结合亲和力低和/或只与没有被棕榈油酸占据的 bOmCI结合。延长温育(室温过夜)并没有增加与bOmCI结合的12⑶-HETE的比例(图4)等效浓度下，与bOmCI相比，酵母(y)0mCI结合更少的12 (S)-HETE (图5)。在相 对 12 (S) -HETE 而言 OmCI 过量 634 摩尔的情况下，yOmCI 与 12500pg/mL 12 (S) -HETE 中的 约50%结合，而bOmCI与其中的97%结合。在该实验中，不知道何种原因，对照(RaHBP2) 得到约19000pg/mL 12 (S) -HETE估算浓度，而不是预期的12500pg/mL。这些观测结果表明，12 (S) -HETE被空的重组bOmCI捕获，并可以从bOmCI和yOmCI 上置换掉一部分棕榈油酸。占据yOmCI晶体中所有的结合袋的蓖麻油酸似乎被12 (S)-HETE 所置换的程度更加有限。这与本发明人基于蓖麻油酸与OmCI的结合比棕榈油酸更加紧密 的结晶学的预测是一致的。实施例3 =OmCI与LTB4结合，而不是与TXB2或半胱氨酰白三烯结合方法购买用于白三-B4(LTB4)、血栓素K(TXB2)和半胱氨酰白三烯(cys-LK)溶液测量 的Assay Design Inc. EIA试剂盒并根据产品说明书使用。将100 μ 1的标准溶液与彡9 μ 1 的PBS或者OmCI或RaHBP2的稀释母液混合。将混合物在室温下温育20分钟，然后根据产 品说明书用于免疫测定。将经处理样品的吸光度读数与标准曲线比较，估算溶液中可以被 抗-类二十烷酸多克隆抗体结合的类二十烷酸的浓度。结果bOmCI显示没有与环状类二十烷酸TXB2(图6)或氨基酸偶联的Cys-LK结合(数 据未示出)。这符合本发明人结晶学数据，即显示OmCI的结合袋没有大到足以容纳这些配 体的(Roversi 等，2007)。使用LTB4EIA试剂盒的第一次实验(图7)表明，bOmCI与LTB4-碱性磷酸酶(AP) 偶联物直接结合，因为OD读数实际上为零，因此溶液中LTB4的估算浓度(10000pg/mL)远 大于测试中实际添加的LTB4的量(750pg/mL)。在使用对照蛋白RaHBP2的测试中检测到的 LTB4的量为610pg/mL LTB4 ；这与测试中添加的LTB4的实际量相近。为了测定bOmCI与LTB4-AP偶联物直接结合的可能性，只使用50 μ L的LTB4-AP 偶联物作为配体进行分析，并省去未标记的LTB4。图8显示bOmCI与LTB4-AP的剂量依赖型结合。12 (S) -HETE-、TXB2-和cys-LK-AP偶联物不与bOmCI直接结合(数据未示出)。试剂盒制造商不知道他们所销售的试剂盒中的LTB4-AP的浓度。然而，如果假设， 100%偶联效率(不切实际地高)并假设IC50=1 1的结合，那么根据标准曲线，LTB4-AP 的浓度可能约为110pg/mL。由图8可见，0. 33 μ g的bOmCI可结合约50%的LTB4-AP。由 此可以算出，结合50%的LTB4-AP需要1200倍过量的bOmCI。这似乎显著过量，但结合是 在抗-LTB4抗体的存在下进行并且与偶联物的结合可能受到连接子的影响。LTB4-AP与yOmCI和bOmCI的结合非常类似(图9)，这表明与12⑶-HETE (图5) 不同，LTB4-AP能够适度有效地从结合袋上置换蓖麻油酸。过量的12 (S)-HETE没有竞争过 LTB4-AP与bOmCI结合(图10)。在这个实验中，如果过量的12 (S) -HETE从bOmCI上置换 掉LTB4-AP，那么与捕获在培养板上的LTB4特异性抗体结合的LTB4-AP的％将会升高，但是 这并没有发生。实施例4 理论模拟表明LTB4完全配合到OmCI的结合袋中方法通过 <吏用 ￠: http://davapc 1. bioch. dundee. ac. uk/programs/prodrg/ 白勺 PRODRG服务器构建LTB4的原子模型。然后将该LTB4模型的前18个原子手动装配到PDB ID 2CM4中的蓖麻油酸分子上，旋转LTB4尾部的2个另外的C原子以指向OmCI袋的底部-在 除去填充在晶体的该空间的水分子Z23后。然后使用程序BUSTER-TNT和CCP4-REFMAC5，仅 以几何学约束条件使该OMCI LTB4模型理想化/优化。结果通过从PDB存储结构(PDB ID 2CM4)上除去水Z23，在OmCI的脂肪酸结合袋内的 LTB4的C20链可以得以容纳。当具有较短的C18链的蓖麻油酸结合时，水显然填充在所述 袋内。水分子与氨基酸E41和F36的羰基形成氢键。在结合袋内将较长脂肪酸换成较短脂 肪酸通过除去水分子而在熵上是有利的。实施例5 局部施用LTB4诱导的局部皮肤反应通过添加重组OmCI而消除背景对人类皮肤局部施用超过5ng LTB4诱导局部红斑和水肿(Greaves，1984)。反应 在12小时后出现并在M小时至48小时达到高峰。方法将2yL LTB4(来自 Biomol hternational，LP 的在纯乙醇中的 50ng/μ L 母液) 与 ^μ L含有约 33X、16X、7X 或 2Χ 摩尔过量的 bOmCI (17kDa)或 15X、7X、3X、1 X 阴 性对照蛋白卵清蛋白(Mr 45kDa)的PBS混合并在室温下温育20分钟。然后将溶液施加到 前臂屈肌表面并风干。还单独施加所使用的最高浓度的蛋白溶液(包含2yL纯乙醇)和 LTB4。将沉积物封闭(occluded)在腔室下，6小时后移除腔室。在12小时至96小时观察 到皮肤反应。结果如图12所示，OmCI消除了由局部施用IOOng LTB4诱导的皮肤反应。反应在施用 后20小时至30小时达到最大。皮肤反应被所检测的所有4个浓度的OmCI所彻底消除。与 单独的LTB4相比，卵清蛋白对损伤形成没有效果。没有LTB4的情况下所施加的蛋白没有 诱导皮肤反应。结果表明，bOmCI与溶液中的LTB4结合并防止其通过完整皮肤吸收。
实施例6 吸收表明LTB4与OmCI结合背景白三烯由于其共轭双键体系(三烯发色团)而具有特征性的强的紫外线(UV)吸 收光谱。在水性介质中，LTB4在271nm具有峰吸光度而在沈211111和观2. 5nm处具有肩。蛋 白峰吸光度在^Onm。和蛋白自身相比，与LTB4结合的OmCI在^Onm附近应当表现出增高 的UV吸光度，以及峰吸光度任意一侧IOnm处的LTB4特征性肩。方法将bOmCI (4. 5mg)与 1. 8mL LTB4(在纯乙醇中的 50ng/ μ L 母液，Biomol International)于39mL PBS中室温震荡温育10分钟。该混合物中OmCI与LTB4之间的 摩尔比为1 1。在Vivaspin(Sartorious) 5kDa截留超滤装置中将混合物浓缩至200 μ L。 另以30mL PBS洗涤渗余物并浓缩至200 μ L。平行地，将同量(4. 5mg)的bOmCI与1. 8ml超 纯乙醇于39mL PBS中温育，然后如上所述浓缩并洗涤。浓缩蛋白的最终体积为200 μ 1。使 用Nanodrop ND-1000分光光度计测定蛋白的UV吸收光谱。结果所得到的光谱显示在图13中。单独的LTB4具有在磷酸盐缓冲盐水(pH 7. 4)中 所预期的特征性吸光度峰，峰位于271nm、261nm和^lnm处(图13A)。与LTB4温育并充分 洗涤以除去残留的LTB4的bOmCI的吸收光谱具有指示LTB4结合的肩，并且峰吸光度明显 高于与纯乙醇温育的bOmCI (图13B)。这表明bOmCI选择性地与LTB4结合并将其从溶液中 除去。实际上，来自初始超滤步骤的流过物中没有检测到LTB4(图13A)，这表明(在检测限 内)所有添加到初始混合物中的LTB4都被bOmCI所结合。观测到与bOmCI结合的LTB4的UV光谱的明显变化。UV最大值显示出+6nm向红频 移(红移)到277nm、267nm和287nm(图13A禾口 B)。该频移很可能由偶联的白三烯和bOmCI 氨基酸之间的色散相互作用(dispersion interaction)引起。这与三烯发色团完全被蛋白 所覆盖是一致的。类似的相互作用会导致三烯发色团的UV吸收的减色效应。这没有直接 测量，但是显然从浓缩至200μ 1 (浓缩蛋白的最终体积)的输入LTB4所预期的峰吸收应该 为55. 8 (根据41. 32ml/0. 2mlX0. 2710mm吸光度计算)，但是与bOmCI结合的LTB4的总峰 吸收约为35. 07 (bOmCI LTB4的峰IOmm吸收减去bOmCI的峰吸收来计算，即61. 19-26. 12)。 假设蛋白损失最小，该计算结果表明有减色效应。实施例7 结晶学结构数据显示在bOmCI的结合袋中的LTB4。方法如上所述(实施例6)制备装载有LTB4的bOmCI，然后浓缩至25mg/mL，缓冲液 交换为iTris-HCl(PHT)JOmM NaCl并用于生长晶体。于2008年7月在BM140ESRF上从 PAOmCI:LTB4单斜晶体(a=41.76 A，b=112.81 A,c=62.40 Α, β = 101.89°，4份/不 对称单位)收集衍射数据组。将该数据加工至2.0人分辨率，结构通过分子置换和所构建 的0mCI:LTB4模型初步确定，并改进为R = 20. 7，RmM= 23. 7，rmsd结合=0. 005，rmsd角= 0. 9。结果图14显示LTB4在bOMCI结合袋中的球棍示意图。以下残基直接参与与LTB4的
结合
.Arg54,Thr85,Trp87 这些残基与LTB4的头部(羧基)氢键结合；这些残基的修 饰可以设计成和与头部基团化学性质不同的配体结合。· LBT4的疏水性主体接触所述袋的疏水性侧链Wie36、Tyr43、Pro6U Leu70、 Val72、Phe76、Leu57、Met74、Argl07、Phe89、Trpl33、Trp87、Gly59。· Argl07 和 Glnl05 识别在 LTB4 碳 5 (C5)的-OH。· Hisl 19 和 Asp 121 识别 LTB4 M 12(C12)的 _0H。蓖麻油酸缺少碳5处的-OH基团，在C9和ClO之间只有单个双键，比LTB4短2个 碳原子。与蓖麻油酸结合的OmCI和与LTB4结合的OmCI相比的主要结构差异位于C5抑制 所必需(Mans和Ribeiro，2008)的132-142环区域。该差异可以总结如下· Glul41和Hisl64侧链翻转(flip) (Hisl64和Glul41处的这些变化通过起自 Arg47和Argl48侧链的两个氢键关联；作为这些侧链翻转的结果，Hisl64:Aspl36盐桥消 失，132-142环通过Hisll7(与G139氢键结合)的侧链翻转和桥接水的消失而被拉入。这 种由LTB4结合诱导的构象变化可能对OmCI与C5的结合动力学产生影响，但是本发明人目 前对此没有任何直接的证据。 显示较小重排的第二区是155-159。在C5抑制区域132-142和所述袋之间不存在直接接触。132-142环结构在非对称 单位的所有4个拷贝中都是相同的，尽管在4个拷贝中132-142环处于3种不同的晶体形 成环境中因此与蓖麻油酸结构相关的差异可能是因为经由具有微小变化的中间层而从配 体到环的结构微妙传递造成的。实施例8 具有LTB4的预装载bOmCI防止蜱蛋白抑制由局部施用LTB4诱导的局 部皮肤反应背景OmCI以高亲和力结合LTB4单个分子(参见以上实施例6和7)。因此，用LTB4使 结合位点饱和应会防止OmCI抑制由局部施用LTB4诱导的皮肤反应(参见以上实施例5)。方法使用结合袋中装载有LTB4或没有装载有LTB4的b0mCI(实施例6)。将IOOng LTB4 (体积为2 μ L的50ng/mL母液)与观μ L含有bOmCI LTB4、b0mCI或阴性对照蛋白卵 清蛋白的PBS混合。将溶液在室温下温育10分钟，然后施加到前臂的屈肌表面上并风干。 还将所使用的浓度最大的蛋白溶液(包含2 μ L纯乙醇)和在PBS中的LTB4分别作为阴性 对照和阳性对照单独施用。将沉积物封闭在腔室下，6小时之后移除腔室。在12小时至96 小时观测皮肤反应。结果如图15所示，OmCI消除了由局部施用IOOng比例为4 1至1 1的LTB4诱导 的皮肤反应。但是，预装载有LTB4的OmCI甚至在以4 1摩尔比使用的情况下也没有防止 皮肤反应。更低摩尔比的OmCI (0.5 1以下)与单独的LTB4相比对损伤形成没有效果。 卵清蛋白对损伤形成没有抑制效果。所施用的没有LTB4的蛋白未诱导皮肤反应。结果表 明，被LTB4所饱和的bOmCI不能够结合溶液中额外的LTB4。实施例9 =OmCI抑制免疫性肺部疾病方法
将重组OmCI按0、50 μ g、100 μ g和250 μ g和含有0. 3 %埃文斯蓝(EB)的 300 μ gOva 一起静脉内施用。OmCI作为表达物或预装载有LTB4 (参见实施例6)使用。MK886 是白三烯合成抑制剂。MK886和含有0.3%埃文斯蓝(EB)的300 μ gOva—起施用作为阳性 对照。在施用OmCI、预装载有LTB4的OmCI或MK886后15分钟，进行抗Ova抗体的鼻内 施用(MOyg/小鼠)。结果在鼻内施用OVA抗体之前15分钟时静脉内注射的IOOyg剂量的OmCI减少了中 性粒细胞在肺中的募集和肺微血管损伤，在支气管肺泡空间内的蛋白渗出减少(图16)。该 效应呈剂量依赖型方式(数据未示出)。在免疫复合物诱导肺部损伤时，局部生成白三烯B4(LTB4)，用MK886抑制LTB4明 显减少了微血管损伤和炎症(图16)。结构数据显示，OmCI具有额外的LTB4结合位点。因此，我们要询问OmCI与LTB4 的结合是否有可能有助于抑制免疫复合物诱导的疾病。实际上，LTB4结合位点的饱和消弱 了 OmCI的抑制效果，但是其并没有消除应答(图16)。讨论OmCI表达功能性C5和LTB4结合位点，并且清除免疫复合物诱导的C5和LTB4有 助于抑制肺部病理学。参考文献Aiello, R. J. , Bourassa P~A. , Lindsey, S. , Weng, W. , Freeman, A. , Showell, H.J. (2002). Leukotriene Β4 Receptor Antagonism ReducesMonocytic Foam Cells in Mice(白三烯B4受体拮抗减少了小鼠中的单核泡沫细胞)。Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 22,443-449. Aoki, H. , Hisada, Τ. , Ishizuka, Τ., Utsugi, Μ. , Kawata, Τ. , Shimizu, Y. , Okajima, F. , Dobashi, K. , Mori, Μ. 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权利要求
1.一种OmCI多肽或编码OmCI多肽的多核苷酸，所述OmCI多肽或多核苷酸用于治疗由 白三烯或羟基类二十烷酸介导的疾病或病症。
2.如权利要求1所述的OmCI多肽或多核苷酸，其中，所述OmCI多肽是毛白钝缘蜱的蜱 源性补体抑制剂或其具有白三烯/羟基类二十烷酸(LK/E)结合活性的功能等同物。
3.如权利要求1或2所述的多肽或多核苷酸，其中，所述OmCI多肽包含(a)SEQ ID NO 3的氨基酸序列；(b)与所述SEQID NO :3的氨基酸序列具有至少60%同一性并且具有LK/E结合活性 的其变体；或(c)它们中任意一个的片段，所述片段具有LK/E结合活性。
4.如权利要求1、2或3中任一项所述的多肽，所述多肽与LTB4结合。
5.如权利要求4所述的多肽或多核苷酸，其中，所述多核苷酸由SEQID N0:2的序列 组成或者由SEQ ID NO 2的19至168位氨基酸组成。
6.如权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含(a)SEQ ID NO 1的编码序列；(b)由于遗传密码而与(a)中所限定的序列简并的序列；(c)与(a)或(b)中所限定的序列具有至少60%同一性并编码具有LK/E结合活性的 多肽的序列；或(d)(a)、(b)或(c)中限定的序列中任意一个的片段，所述片段编码具有LK/E结合活 性的多肽。
7.如权利要求6所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸由SEQID NO :1所示的核酸序 列组成。
8.如前述权利要求中任一项所述的多肽或多核苷酸，其中，所述疾病或病症选自葡 萄膜炎、特应性皮炎、接触性过敏、溃疡性结肠炎、食道腺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、结肠癌、 肺癌、痤疮、闭塞性细支气管炎、动脉瘤、牙周病、囊性纤维化和前列腺癌、炎症后色素沉着、 纤维肌痛、系统性红斑狼疮、肿瘤转移、硬皮病、多发性硬化、结节病、辐射诱发性胃肠道炎 症和痛风。
9.如权利要求1至6中任一项所述的多肽或多核苷酸，其中，所述疾病或病症选自 哮喘、支气管炎、动脉粥样硬化、银屑病、银屑病关节炎、炎症性肠病(包括克罗恩病)、败血 症、动脉炎、心肌梗塞、中风和冠心病、缺血再灌注损伤、肾炎、和包括类风湿性关节炎、脊椎 关节病、骨关节炎和幼年性关节炎在内的关节炎。
10.一种治疗或预防有需要的受试对象中由白三烯或羟基类二十烷酸介导的疾病或病 症的方法，所述方法包括对受试对象施用治疗有效量的OmCI多肽或编码OmCI多肽的多核 苷酸。
11.一种组合物，所述组合物包含OmCI多肽和脂肪酸。
12.如权利要求10所述的组合物，其中，所述OmCI多肽为权利要求2、3、4或5中所限定的多肽。
13.如权利要求11、12或13中任一项所述的组合物，其中，所述组合物用于对个体递送 所述脂肪酸。
14.如权利要求11、12或13中任一项所述的组合物，其中，所述脂肪酸选自脂氧素A4、脂氧素B4、脂解素、保护素、15(Q-HETE、二十二碳三烯、13-羟基十八碳二烯酸、15-羟 基二十碳三烯酸、15-羟基二十碳五烯酸、17-羟基二十二碳六烯酸和硝化脂肪酸以及它们 中任一个的类似物。
15.如权利要求11至14中任一项所述的组合物，所述组合物用于治疗炎症。
16.如权利要求15所述的组合物，所述组合物用于治疗葡萄膜炎、特应性皮炎、接触性 过敏、溃疡性结肠炎、食管腺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、痤疮、闭塞性细支气管 炎、动脉瘤、牙周病、囊性纤维化和前列腺癌、炎症后色素沉着、纤维肌痛、系统性红斑狼疮、 肿瘤转移、硬皮病、多发性硬化、结节病、辐射诱发性胃肠道炎症、和痛风、哮喘、支气管炎、 动脉粥样硬化、银屑病、银屑病关节炎、炎症性肠病(包括克罗恩病)、败血症、动脉炎、心肌 梗塞、中风和冠心病、缺血再灌注损伤、肾炎、和包括类风湿性关节炎、脊椎关节病、骨关节 炎和幼年性关节炎在内的关节炎。
全文摘要
本发明的方法涉及用于治疗由白三烯或羟基类二十烷酸介导的疾病或病症的OmCI多肽或编码OmCI多肽的多核苷酸。
文档编号A61P17/00GK102066412SQ200980104031
公开日2011年5月18日 申请日期2009年2月5日 优先权日2008年2月5日
发明者彼得罗·罗韦尔西, 苏珊·利, 迈尔斯·纳恩 申请人:自然环境研究会