用于检测和治疗低血糖症的方法和测定法的制作方法

专利名称：用于检测和治疗低血糖症的方法和测定法的制作方法
用于检测和治疗低血糖症的方法和测定法关于政府权益的声明本发明享受由NIH 颁发的授权号 M01RR16587、IRO1-DK55347-IU42RR016603 的政 府支持。美国政府享有本发明的某些权益。
背景技术：
血糖稳态(homeostasis)受来自胰腺的内分泌部分、胰岛中的多种细胞类型的胰 腺激素的协调分泌所控制。分别来自胰脏的β和α-细胞的胰岛素和胰高血糖素的分泌 受营养素以及自分泌、旁分泌和神经信号的调节。虽然参与胰岛素分泌的分子机制是比较 公知的，但对调节胰高血糖素分泌的那些机制不是这样清楚。例如，研究者目前正在研究， 在正常条件下普遍存在的血糖浓度相对适度的变化之后，胰高血糖素如何可以如此有效地 释放。胰高血糖素从α-细胞中的分泌在血糖浓度降低时增加(Unger，1985 ;Zhou et al.，2004)，但是作用于α-细胞以诱发胰高血糖素释放的潜在分子机制尚未知晓。已经提 出，高葡萄糖水平通过对α-细胞直接作用而抑制胰高血糖素释放(Gopel et al. ,2000 ； Unger, 1985) 0机械地说，这已通过α -细胞中有助于产生神经元样动作电位的电压敏感的 Na+通道的选择性表达来解释，其通过延长的细胞膜去极化而失活(Gopel et al.，2000)。 根据此模型，在高葡萄糖水平时，这些Na+通道的失活抑制了 α -细胞活性。然而，其它研究已表明，葡萄糖通过反映β -细胞中的刺激_分泌偶联的机制来 活化α-细胞，g卩，葡萄糖同样地刺激α-细胞和β-细胞(Olsen et al. ,2005 ；Wendt et al.，2004)。因此，已经表明抑制性旁分泌信号例如β -细胞中释放的胰岛素、GABA和 Zn2+，而不是改变葡萄糖浓度本身，涉及胰高血糖素释放的直接调节(Franklin et al., 2005 ；Gromada et al. ,2007 ；Ishihara et al. , 2003 ；Kisanuki et al. , 1995 ；Ravier and Rutter,2005 ；Rorsman et al. ,1989)。然而，抑制性旁分泌信号的缓解不能完全解释葡萄糖浓度相对较小的降低是如何 有效地促进胰高血糖素释放。引人注目的是谷氨酸盐(glutamate)，其是中枢神经系统中 的一种主要的兴奋性神经递质，原因在于与大多数其它信号不同，其可以刺激而非抑制胰 岛中的胰高血糖素分泌(Bertrand et al.，1993 ；Hayashi et al.，2003c)。有助于谷氨酸 盐摄取进入囊泡(vesicle)的囊泡性(vesicular)谷氨酸盐运载体是通过α -细胞表达 的(Hayashi et al.，2001)，并且谷氨酸盐是与胰高血糖素一起分泌的(Hayashi et al.， 2003c)。
在啮齿动物模型中的研究显示胰岛中谷氨酸盐发信号的巨大复杂性(Moriyama and Hayashi, 2003) 0文献中的结果是不一致的，并且在一定程度上谷氨酸盐的作用仍 然是难以理解的。例如，已经报道，谷氨酸盐通过离子型(ionotropic)谷氨酸盐受体 (glutamate receptor) (iGluRs)刺激胰高血糖素分泌(Bertrand et al.，1993)，其通过代 谢型(metabotropic)谷氨酸盐受体(mGluRs)抑制胰高血糖素分泌(Ueharaet al. ,2004)， 并且其活化β -细胞中的mGluRs和iGluRs以增加胰岛素分泌(Bertrand et al.，1992 ；Bertrand et al.，1995 ；Storto et al.，2006)。本发明人已阐明了谷氨酸盐的作用，并基于此发现开发了测定法和方法。此外，本 发明人已发现，α “细胞需要正反馈回路以产生完全的胰高血糖素应答。本申请要求于2008年3月12日提交的美国临时申请号61/064，564的优先权，其 通过引用并入本文。

发明内容
本文描述的本发明涉及用于检测和调节胰高血糖素释放的方法和测定法，以及治 疗低血糖症的方法和测定法。在一些实施方案中，这此方法已用于检测和治疗糖尿病。相应地，本发明的一个目的是提供治疗低血糖症的方法，其包括给有治疗需求的 受试者施用有效量的化合物，该化合物活化离子型谷氨酸盐受体以刺激胰高血糖素释放。在一个实施方案中，所述化合物通过活化谷氨酸盐受体亚单位GluR6来实现此作 用。所述离子型谷氨酸盐受体例如可以是AMPA/红藻氨酸盐(kainate)型受体。期望在该治疗方法中有效的化合物的实例是红藻氨酸盐、AMPA和(2S，4R) -4-甲 基谷氨酸、(RS)-2-氨基-3-(4-氯-3-羟基-5-异ρ恶唑基)丙酸、4，6-双(苯甲酰基氨 基)-1，3-苯二羧酸、(士)-4- (4-氨基苯基)-1，2- 二氢-1-甲基-2-丙基氨基甲酰基-6， 7-亚甲二氧基酞嗪、1-(4'-氨基苯基)-3，5- 二氢-7，8- 二甲氧基-4H-2，3-苯并二氮杂 罩-4-酮、1，4- 二氢-6- (1H-咪唑-1-基)-7-硝基-2，3-喹喔啉二酮盐酸盐、GABA、荷包 牡丹碱(Bicuculline)、胰岛素。在一个优选的实施方案中，所述化合物是谷氨酸盐类似物。术语"谷氨酸盐类似物"欲意包括，例如，结构上与谷氨酸盐充分相似以结合谷 氨酸盐受体产生类似于谷氨酸盐的作用的任何化合物。通常，待施用的有效剂量期望是约5mg/kg/天至约200mg/kg/天。然而，有效剂量 可以在不进行过多的试验的情况下通过本领域技术人员来确定。在一个优选的实施方案中，该低血糖症与糖尿病相关。因此，提供了治疗1型或2 型糖尿病的方法。还提供了活化离子型谷氨酸盐受体以刺激胰高血糖素释放的化合物在制备治疗 低血糖症的药物中的用途。另一目的是提供刺激胰高血糖素释放的方法，其包括施用活化离子型谷氨酸盐受 体的谷氨酸盐受体亚单位GluR6以刺激胰高血糖素释放的化合物。例如，所述离子型谷氨 酸盐受体可以是AMPA/红藻氨酸盐型受体。期望有用的化合物的实例包括红藻氨酸盐、 AMPA、GABA和胰岛素。在一个优选的实施方案中，所述化合物是谷氨酸盐类似物。约5mg/ kg/天至约200mg/kg/天的剂量是期待有效的。然而，有效剂量可以在不进行过多的试验的 情况下通过本领域技术人员来确定。另一目的是提供用于体外筛选可用于治疗糖尿病的调节剂的测定法，其包括在 两个组中提供胰岛细胞，其中第一组是对照，第二组施用足以破坏存在的β细胞的剂量的 链脲霉素(str印tozotocin)；将测试化合物施用于第一组和第二组；以及测量第一组和 第二组中胰高血糖素释放的增强作用，以确定该测试化合物的作用，其中细胞质钙活动化(mobilization)和/或胰高血糖素释放的减少指示化合物可用作调节剂。本领域技术人员 理解，此方法可用于针对体内应用的有效性和安全性鉴定有待进一步测试的化合物。


图IA-F显示了人胰岛中离子型谷氨酸盐受体的活化诱发胰高血糖素分泌的实 例。图I(A)显示了谷氨酸盐诱发胰高血糖素应答，其可受CNQX(IOyM)所阻断。红藻氨酸 盐和AMPA(均为100 μ M)亦会引起强烈的胰高血糖素分泌。图I(B)显示了显示于图I(A) 的量化结果(η = 5个胰岛标本(pr印aration))。图1 (C)显示了代谢型谷氨酸盐受体拮 抗剂CPPG(IOOyM)不会影响谷氨酸盐-诱发的胰高血糖素应答。代谢型谷氨酸盐受体激 动剂tACPDdOOyM)和ACPT-I (100 μ M)不会引起胰高血糖素分泌的改变。图1 (D)显示了 C中所示的量化结果(η = 3个胰岛标本)。图1 (E)显示了胰岛素释放受高葡萄糖(llmM， 11G)诱导，但不受红藻氨酸盐诱导(6个胰岛标本的代表)。图I(F)显示了人胰岛中谷氨酸 盐诱发的浓度依赖性[Ca2Ii应答(η = 4个胰岛标本)。将数据作曲线拟合(Hill方程)。 所有图中的结果显示为均值士s. e.m。图2A-B显示了人胰岛中α -细胞表达AMPA/红藻氨酸盐型的功能性离子型谷氨 酸盐受体(iGluRs)的实例。图2(A)显示了 3个连续图像(上面)，其显示了在分散的人胰 岛细胞中对3G、IlG和谷氨酸盐的[&21应答(假色彩标度(pseudocolor scale))。下面 左侧图像显示了胰高血糖素(绿)和胰岛素(红)免疫染色。胰高血糖素免疫反应性细胞 2和3对谷氨酸盐应答但不对IlG应答。胰岛素免疫反应性细胞1和4对IlG应答但不对 谷氨酸盐应答。这些细胞的[Ca2Ii应答的迹线(trace)显示于下面右侧。箭头显示了摄 取图像的时间点。迹线下面的棒显示施用刺激。比例尺棒=50μπι。ImM葡萄糖(lG)、3mM 葡萄糖(3G)和IlmM葡萄糖(IlG)。结果是4个人胰岛标本的代表。图2 (B)显示了来自人 胰岛(红色标记)和猴胰岛(黑色标记)的单独α-细胞(左)和β-细胞(右)的基因 表达图。每行表示单个细胞，每列表示不同的谷氨酸盐受体基因。标记(黑色或红色实心 圆)表示检测到RT-PCR产物。
图3A-C显示，α -细胞对红藻氨酸盐的应答需要通过电压依赖性Ca2+通道的Ca2+ 流入。图3(A)显示了人胰岛细胞中iGluRs活化引起向内电流。典型的全-细胞电流由 红藻氨酸盐(100 μ M)弓丨起(上面左格)。这些电流的振幅(amplitude)是4个细胞的平 均(右格)。红藻氨酸盐_引起的电流可用AMPA/红藻氨酸盐受体拮抗剂NBQXdO μ Μ)阻 断。保持电位=_70mV。电流迹线上面的棒表示施用红藻氨酸盐。图3(B)显示了表面灌流 (perifusion)测定法证实红藻氨酸盐(IOOyM)刺激胰高血糖素分泌大量增加(左侧的应 答)，其在缺乏细胞外Ca2+(0Ca2++lmM EGTA)时消除(abolished)，在存在Ca2+通道阻滞剂 La3+(100 μ Μ)或者特异性Ca2+通道抑制剂尼莫地平(10 μ Μ)、芋螺毒素GVIA (1 μ Μ)、美洲蜘 蛛毒素(agatOXin)IVA(0. ΙμΜ)和米贝拉地尔(IyM)的组合均显著减少。显示的是平均 迹线(士 s.e.m.，η = 3人胰岛标本)。箭头表示转换到新溶液。图3 (C)显示了平均的迹 线(士 s. e.m.，η = 9个细胞；3个猴胰岛标本)，其显示对红藻氨酸盐的[Ca2^i应答在标称 零(nominal zero) Ca2+下消除。(D)对红藻氨酸盐的[Ca2+] 士应答被CNQX (10 μ Μ，η = 7个 细胞)以及Ca2+通道阻滞剂La3+(30 μ Μ，η = 14个细胞)和尼非地平(10μΜ，η = 18个细 胞；学生t-检验，P <0.05)抑制。显示了对红藻氨酸盐的[&21应答(于340/380荧光发射比的变化)的峰值振幅的均值士S. e.m.。数据来自3个分离的猴胰岛标本。图4A-D显示了在刺激的灵长类动物α-细胞中谷氨酸盐释放的实例。图4㈧显 示了含有胰岛的猴胰腺切片的共聚焦图像。该图还显示了用胰高血糖素但不用胰岛素免疫 染色共定位(colocalized)的囊泡性谷氨酸盐运载体1 (vGluTl)的免疫反应性。结果是3 个人胰腺的代表。图4(B)显示了在使用荧光酶测定法以检测谷氨酸盐释放的试验中胰岛 的典型图像。在此测定法中，释放的谷氨酸盐是一种酶链反应中的底物，其产生荧光产物试 卤灵(Resorufin)。将试卤灵荧光颜色编码；从低(蓝色；静息(rest))到高(黄色；红藻 氨酸盐)增加表明在对红藻氨酸盐的应答中谷氨酸盐释放增加。在缺乏谷氨酸盐氧化酶时 有少许或者没有荧光增加(-G0 ；底格)。图4(C)和(D)显示缺乏酶谷氨酸盐氧化酶(-G0) 时，施用红藻氨酸盐和KCl不会增加试卤灵荧光。低葡萄糖(lmM，IG ;P = 0.005)、红藻氨酸盐(100yM，kain ；P < 0. 001)和 KCl (30mM ；P < 0. 001)去极化，但不是高葡萄糖(llmM， IlG ；P = 0. 289)诱发谷氨酸盐从胰岛中显著释放，其是与红藻氨酸盐而无GO相比较(-G0 ； η = 3个猴胰岛标本；单因素AN0VA，接着多重比较程序，Student-Newman-Keuls法)。A中 的比例尺棒=20 μ m，B中的为50 μ m。任意单位(a. u.)。图5显示了有效的胰高血糖素释放需要刺激性自分泌谷氨酸盐反馈回路的实例。 图5(A)显示了使用胰高血糖素-敏感的生物传感器细胞实时测定胰岛胰高血糖素分泌的 试验方法说明。图5(B)显示了外源性谷氨酸盐诱发的来自人胰岛的胰高血糖素分泌，其通 过在单独胰高血糖素生物传感器细胞中的[Ca2+] i应答测定的(左格中的迹线)。在缺乏人 胰岛时在胰高血糖素生物传感器细胞中未见到应答(在右格中的迹线)。图5(C)和(D)显 示使葡萄糖浓度从6mM降低至ImM(箭头)会诱导胰高血糖素分泌，其通过在生物传感器细 胞中的[Ca2Ii应答测定的(n-6个感兴趣的区域)。漂洗引起生物传感器细胞中[&2+几的 急剧降低。AMPA/红藻氨酸盐iGluR拮抗剂CNQX(IOyM)显著抑制葡萄糖降低对胰高血糖 素释放的作用，降低54% (在降低葡萄糖浓度后8分钟测定；η = 3个胰岛标本，学生t-检验，P=0.042)。图6A-D显示了在类似于灵长类动物胰岛中的小鼠胰岛中谷氨酸盐发信号的实 例。图6(A)显示了小鼠胰岛的表面灌流测定法，其显示谷氨酸盐(ΙΟΟμΜ)刺激胰高血糖 素释放，该释放被DNQX (10 μ Μ)阻断(左；η = 6个表面灌流)。红藻氨酸盐和AMPA (均为 ΙΟΟμΜ)亦刺激胰高血糖素分泌(右；η = 3个表面灌流)。图6 (B)显示了代谢型谷氨酸 盐受体激动剂tACPD (100 μ Μ)和ACPT-I (100 μ Μ)不会引起胰高血糖素分泌的改变(左)。 代谢型谷氨酸盐受体拮抗剂CPPG (ΙΟΟμΜ)不影响谷氨酸盐-诱发的胰高血糖素应答(右； η = 3个表面灌流)。图6(C)显示，在来自缺乏代谢型谷氨酸盐受体mGluR4的小鼠的胰岛 中，胰高血糖素对谷氨酸盐(ΙΟΟμΜ)的应答不同于对照小鼠胰岛的那些(η = 4个胰岛标 本/组)。图6(D)显示了胰岛素释放被高葡萄糖(llmM，llG)诱导但不被红藻氨酸盐(左)、 AMPA或谷氨酸盐(右)诱导。试验显示了3个胰岛标本的代表。图7A-D显示了 iGluRs的体内活化以刺激胰高血糖素分泌的实例。图7 (A)显 示，用谷氨酸盐(30mg/kg ；i. p. ；η = 7只小鼠)或AMPA(15mg/kg，η = 8只小鼠)全身 治疗的小鼠显示血浆胰高血糖素浓度增加(左；AN0VA，P < 0.05)。血浆胰岛素浓度不 会变化(中间)。注射AMPA 30分钟之后，小鼠显示血浆葡萄糖浓度增加(右；实心标 记，η = 8只小鼠，学生t-检验，P < 0. 05)。空心标记=PBS-注射的小鼠(η = 4)。图7(B)显示，以 3mM血糖浓度(左)提供持续低血糖性刺激的高胰岛素性-低血糖性钳 (hyperinsulinemic-hypoglycemic clamp)是用胰岛素灌注(infusion)诱导的(中间)。 与盐水灌注小鼠(黑色标记；η = 3 ；重复测定AN0VA，P < 0. 05)相比，在对低血糖症应答 中的胰高血糖素分泌在NBQX灌注之后的小鼠中显示减少(IOmg而/kg ；红色标记，n = 7)。 棒显示药物灌注。图7(C)显示了药物灌注之后维持糖血所需的葡萄糖灌注速率在NBQX-治 疗小鼠(红色棒；η = 7)中显著大于盐水-治疗小鼠(黑色棒；n = 3;学生t-检验，P <0.05)。图7(D)显示了提出用于调节胰高血糖素分泌的模型。α-细胞的活化取决于初 始刺激以及正反馈。当葡萄糖水平下降时，少量抑制来自细胞-产生的GABA、Zn2+或 胰岛素(=初始刺激)。谷氨酸盐的正反馈剧烈地增大了胰高血糖素分泌。一旦葡萄糖水 平增加，胰高血糖素分泌就被胰岛素、Zn2+、GABA或者此三者组合抑制。没有谷氨酸盐反馈， α -细胞未完全活化，并且胰高血糖素分泌不足。图8显示了所进行的胰岛素耐受试验(ITT)的实例，以在缺乏AMPA/红藻氨酸盐 受体亚单位6(GluR6)的小鼠中评价葡萄糖反-调节。两组小鼠均在t = 0:00时注射胰岛 素以诱发低血糖症。与野生型小鼠相比，GluR6缺乏小鼠更快地发展且更深地成为低血糖 症，显示这种亚单位的存在在葡萄糖反_调节期间是重要的。注意，从GluR6缺乏小鼠受限 制的时间(-2:00)到它们被注射胰岛素的时间(0:00)，血糖有升高。此作用可能与葡萄糖 反_调节无关，其原因在于在此葡萄糖浓度下，葡萄糖反_调节的机制未运转。注意，GluR6 缺乏小鼠更快地发展成低血糖症，如葡萄糖漂移曲线(excursion curve)的斜率所示的。 施用胰岛素45分钟以后，小鼠进入老实的(frank)低血糖状态，此时葡萄糖反-调节的机 制开始起效以重建正常血糖水平。在GluR6缺乏小鼠和野生型小鼠中，在45分钟之后血糖 水平持续减少，但是野生型小鼠的血糖在1:45之后快速恢复，并且在施用胰岛素3小时之 后，在比GluR6缺乏小鼠显著更高的水平下亦是如此。误差棒表示η = 8(野生型小鼠)和 η = 10(GluR6缺乏小鼠)的平均值的标准误。图9显示了胰高血糖素释放通过谷氨酸盐的增强作用在β细胞缺乏时减少(一 种模拟糖尿病的情形)的实例。此试验用小鼠胰岛进行。将两个样品平行(“a"和"b") 地表面灌流。在"a"(蓝色曲线和蓝色棒)中，而不是在"b"(红色曲线和红色棒)中， 用链脲霉素选择性破坏β细胞。这种β细胞的缺乏在体外产生1型糖尿病-样病症。"k" 格中的胰高血糖素释放图是通过使用此模型获得的。在β细胞缺乏下时，红藻氨酸盐不会 如β细胞存在时那样有效加强胰高血糖素释放(在"B"格中定量)。注意，非特异性刺 激物精氨酸不能在β细胞缺乏下区分功能损害的α细胞。这些数据显示，在1型糖尿病 中，胰高血糖素释放通过红藻氨酸盐的增强作用的减少与低血糖症期间胰高血糖素释放的 缺乏有关。在t = 5min时，两个样品均用100 μ M红藻氨酸盐刺激5min。葡萄糖增加至IlmM 达10分钟，在表面灌流期间再次减少到3mM。在t = 45min时，两个样品(ν)均用5mM精氨 酸刺激。应答红藻氨酸盐-诱发的胰高血糖素释放的振幅减少了 55%。应答精氨酸-诱发 的胰高血糖素释放的振幅无统计学地变化。红藻氨酸盐是一种谷氨酸盐类似物，其是不可 被代谢的，并因此是一种优选的AMPA/红藻氨酸盐受体的激动剂。误差棒表示η = 3个表 面灌流的标准偏差。通过独立的t-检验进行比较。发明详述
来自胰脏α细胞的胰高血糖素分泌对于葡萄糖稳态是重要的，并且避免危及生命的低血糖症。本发明人证实，谷氨酸盐对于胰高血糖素释放是正自分泌信号(positive autocrine signal) 0如本文所示，本发明人亦已证实，人和小鼠α细胞表达针对谷氨酸盐 的受体，其形成对离子可渗透的膜通道(离子型谷氨酸盐受体)。这些受体通过谷氨酸盐的 活化导致胰高血糖素分泌。该结果进一步显示，α细胞中的谷氨酸盐发信号的重要组分之 一是谷氨酸盐受体亚单位GluR6。这些研究已显示，谷氨酸盐受体亚单位GluR6有助于葡萄 糖反调节(counterregulation)，这使其成为用于治疗或预防低血糖症的期望的药理学靶 标。此外，本方法可用于治疗患有糖尿病的人。在患有糖尿病的个体中，葡萄糖反调节 减弱。据信这是由于对血糖变化的应答性的α细胞的缺乏，但是该机制仍然是未知的。然 而，如本文所公开的，在功能性β细胞缺乏时(如在1型糖尿病中的情况)，谷氨酸盐发信 号减弱，导致较少有效的胰高血糖素分泌。葡萄糖稳态的重要特征是从胰脏α-细胞中的有效胰高血糖素的释放。调节胰 高血糖素分泌的分子机制仍然是不十分清楚的。我们现已证明，人α-细胞表达离子型谷 氨酸盐受体(iGluRs)，其是胰高血糖素释放所必需的。由于葡萄糖浓度降低，谷氨酸盐从 α-细胞中释放。然后谷氨酸盐作用于AMPA/红藻氨酸盐型的iGluRs，导致膜去极化、开 放电位门控的Ca2+通道、增加细胞质游离Ca2+浓度、以及增强胰高血糖素释放。在小鼠中， iGluRs的体内阻断减少了胰高血糖素分泌并加重了胰岛素-诱发的低血糖症。因此，谷氨 酸盐自分泌反馈回路赋予α-细胞具有有效加强其自身分泌活动的能力。尽管在生理条件 下有相对适中的血糖浓度变化，但这是保证充分的胰高血糖素释放的前提条件。公开的结果确立了谷氨酸盐作为一种真正的α-细胞中的自分泌发信号分子，在 人胰岛中为胰高血糖素分泌提供正反馈。例如，已显示谷氨酸盐是通过α-细胞分泌，并且 α -细胞而非β -细胞表达AMPA/红藻氨酸盐型的iGluRs。这些受体通过α -细胞衍生的 谷氨酸盐的活化产生针对α-细胞功能的正反馈，并增加了胰高血糖素分泌。这种新颖的 自分泌发信号途径可以解释适度降低血糖浓度是如何有效诱发从胰脏α“细胞中释放胰 高血糖素。本文下面的结果证实谷氨酸盐提供针对胰高血糖素释放的正反馈，该结果显示与 谷氨酸盐刺激胰高血糖素分泌的研究(Bertrand etal. , 1993)相符，但是与一些表明谷氨 酸盐的作用是抑制性的并由mGluR4受体介导的报道(Moriyama和Hayashi，2003)相佐。 谷氨酸盐在我们的所有生理学试验(例如，[Ca2Ii成像、动态激素分泌测定法以及体内血 浆胰高血糖素检测)中是兴奋性的(excitatory)，并且应答可由AMPA/红藻氨酸盐受体拮 抗剂阻断，显示胰高血糖素释放通过iGluRs的刺激作用是谷氨酸盐自分泌反馈回路的占 优势的作用。我们的发现显示代谢型谷氨酸盐受体的激动剂和拮抗剂不会影响胰高血糖 素分泌，该发现证实在人α-细胞中这些受体与谷氨酸盐发信号无关。由于对谷氨酸盐的 胰高血糖素应答在mGluR4受体缺乏小鼠中未改变，我们进一步断定，此受体可能不会促成 α-细胞对谷氨酸盐的应答，这正如在以前所提出的(Uehara et al.，2004)。用抗体识别AMPA受体亚单位GluR2和GluR3的胰岛细胞免疫染色不是特异性的， 即，它不能通过抗体的肽预吸附(preadsorption)来阻断。由于在以前的研究中谷氨酸盐 受体配体对胰岛素分泌的适度影响以及谷氨酸盐_应答的β-细胞的低发生率，作者已提请注意要归因于谷氨酸盐受体在胰岛素分泌的调节中的主要的功能作用(Molnar etal., 1995)。这与我们的单细胞RT-PCR结果相符，所述结果显示β-细胞不表达iGluRs。我们 的发现显示，β “细胞活性和胰岛素分泌不能用谷氨酸盐受体激动剂刺激，这进一步显示谷 氨酸盐发信号并且特别是iGluRs与胰岛素分泌的调节无直接关系。与旁分泌或自分泌发信号有关，谷氨酸盐在对生理刺激的应答中从胰岛细胞中释 放。使用啮齿动物胰岛的研究已显示，α-细胞表达囊泡性谷氨酸盐运载体，其促进谷氨 酸盐摄取进入分泌囊泡中(Hayashiet al.，2001)，并且谷氨酸盐存在于胰高血糖素分泌颗 粒中，且与胰高血糖素共同释放(Hayashi et al. , 2003c) 0在本研究中，我们发现，人和猴 α -细胞表达囊泡性谷氨酸盐运载体vGluTl。本发明人在对α -细胞的特异性刺激的应答 中检测了谷氨酸盐分泌，证实在灵长类动物胰岛中α-细胞是谷氨酸盐的主要来源。尽管 神经元或神经末梢亦能释放谷氨酸盐，使用培养分离的胰岛获得的本发明人的结果，所述 胰岛不含有神经元组分(亦参见Karlsson et al.，1997)。由于本发明人发现α -细胞分泌谷氨酸盐并且由于iGluRs唯一表达于α -细胞 中，因此认为谷氨酸盐是一种自分泌发信号分子。我们的结果显示iGluRs的阻断减少了胰 高血糖素对葡萄糖浓度降低的应答(参见图5)，此结果表明谷氨酸盐是内源性释放的并且 确证谷氨酸盐发信号提供了正自分泌反馈回路。具有正反馈的自分泌回路的概念还有助于解释α-细胞如何适当地对血浆中葡 萄糖浓度降低的应答。通过在小鼠中使用低血糖性钳，我们刺激胰高血糖素体内分泌并且 发现胰高血糖素应答通过iGluRs的药理学阻断而显著减少。在这些小鼠中，低血糖症加重 了，表明在葡萄糖反调节的背景下，对于完全的胰高血糖素应答而言iGluRs需要被活化。 虽然我们不能排除谷氨酸盐可能具有对中枢和外周神经元的任何附加效应(其会间接影 响α-细胞)，但我们的体外数据证实，α-细胞是谷氨酸盐的主要的直接靶，并且内胰岛 (intraislet)谷氨酸盐发信号可以不依赖于神经输入而工作。因此，这些结果证实，谷氨酸 盐自分泌反馈回路在α-细胞中被活化以使得胰高血糖素分泌。我们现在提出一种模型，其至少部分地解释胰高血糖素释放如何可以有效地在 人胰岛中被调节(图7D)。当血糖浓度降低时，β-细胞对α-细胞的负旁分泌影响减少 (‘关闭，假设；(Cryer et al.，2003 ；Hope etal.，2004 ；Zhou et al. ,2004) 在此阶段， 葡萄糖浓度太低而不抑制(Macdonald et al. ,2007 ；MacDonald和Rorsman，2007)，但是仍 然足够高以驱动(Olsen et al. ,2005)部分胰高血糖素释放和并行谷氨酸盐释放，产生通 过iGluRs的正反馈回路，其使α-细胞有分泌活性。这与我们的结果一致，我们的结果显 示iGluRs的药理学阻断加剧了胰岛素_诱发的低血糖症并减少了体内胰高血糖素分泌。
相应地，一个目的是提供用于检测和调节胰高血糖素释放的方法和测定法以及治 疗低血糖症的方法。在一些实施方案中，这些方法可用于检测和治疗糖尿病。然而，所述方 法应当还可用于任何胰岛素诱发的低血糖症。术语"低血糖症"是指低于血糖的正常水平。低于正常水平的确切范围将由于例 如以下因素而取决于受试者年龄、健康、以及受试者的平均基线葡萄糖水平。在一些实施 方案中，低血糖性葡萄糖血糖水平包括低于70mg/dl或3. 9mmol/L的那些。本文描述的方法特别期待用于治疗人类的糖尿病，包括1型和2型糖尿病。术语"受试者"欲意包括哺乳动物，其容易受糖尿病折磨，特别是人类，并且还包括其中期望治疗低血糖症的任何哺乳动物。本发明的一些实施方案涉及通过施用直接或间接活化离子型谷氨酸盐受体 (iGluR)以刺激胰高血糖素释放的化合物治疗低血糖症的方法。在一些实施方案中，所述化 合物活化谷氨酸盐受体亚单位GluR6。施用的该化合物可以是，例如，(2S，4R)-4-甲基谷氨酸。该化合物可以以由医生 确定的有效剂量施用。在一些实施方案中，该剂量范围可以为约5mg/kg/天至约200mg/kg/ 天，这取决于患者低血糖症的程度以及其它患者特定因素例如年龄、一般健康、和存在的其 它疾病。作为所述方法的一部分施用的该化合物可以是iGluR的激动剂或部分激动剂。在 一些实施方案中，该化合物是谷氨酸盐受体亚单位GluR6的激动剂或部分激动剂。针对 iGluR的激动剂的实例是红藻氨酸盐。本发明的一些实施方案涉及用于测试胰高血糖素释放的调节的测定法。例如在一 些实施方案中，本发明涉及一种体外模型，在该模型中我们用例如链脲霉素选择性破坏β 细胞，由此创造一种模拟1型糖尿病情形。该处理的胰岛主要由α细胞组成。当这些α 细胞用精氨酸(一种针对胰高血糖素分泌的非特异性刺激物)刺激时，它们的胰高血糖素 应答类似于在对照的完整胰岛中的α细胞那样。为了检测β细胞衰竭的胰岛中的α细 胞是否已减弱谷氨酸盐发信号，我们用红藻氨酸盐(一种针对离子型谷氨酸盐受体的激动 剂)来刺激它们。β细胞缺乏的胰岛中的α细胞强烈地减少胰高血糖素对红藻氨酸盐的 应答。这些结果显示，在具有减少的β细胞量的糖尿病中的胰岛中，α细胞中的谷氨酸盐 发信号被特别地下调节或减弱。下面的实施例进一步说明本发明，但不应解释成限制本发明的范围。 实施例材料和方法胰岛分离和培养将人(η= 12，年龄=48士7 岁)、猴(Macacca fascicularis ；η = 15 ； > 4 岁 的年龄)和小鼠(C57B1/6 ；η = 15)胰岛如别处所述(Cabrera et al.，2006)分离并 培养。缺乏代谢型谷氨酸盐受体mGluR4的突变体小鼠(C57B1/6背景)购自Jackson Laboratories (Bar Harbor,Maine)。使用猴和小鼠的所有试验方案经迈阿密大学动物养护 禾口应用委员会(University of Miami Animal Care and Use Committee)批准。细胞质游离的Ca2+的测定[Ca2+] i的成像是如别处所述(Cabrera et al.，2006)进行的。使胰岛或分散 的胰岛细胞浸于 HEPES-缓冲溶液(mM :125NaCl，5. 9KC1，2. 56CaCl2, IMgCl2, 25HEPES ； 0.1% BSA ；pH 7.4)。加入葡萄糖得到3mM的终浓度。使胰岛或分散的胰岛细胞孵育于 Fura-2AM(2 μ M ;1小时)，再置于封闭的小容积成像室(Warner Instruments, Hamden, CT)。用该浸浴(bathing)溶液施加刺激。将加载了 Fura-2的胰岛用单色器光源(Cairn Reseach Optoscan Monochromator, Cairn Research Ltd，Faversham，UK)在二选一的 340 和380nm处激发。用Hamamatsu照相机(Hamamatsu Corp, Japan)获得图像，该照相机与 Zeiss Axiovert 200 显微镜(Carl Zeiss，Jena, Germany)相连。使用 Kinetic ImagingAQM Advance软件(Kinetic Imaging, NC)，在单独的胰岛和分散的细胞中分析340/380荧光发射比经时间的变化。荧光比的峰值变化组成了应答振幅。胰高血糖素和胰岛素分泌的动态测定开发高容量、自动化表面灌流系统以动态测定来自胰岛的激素分泌。低博动指数 螺动泵推动 HEPES-缓冲溶液(mM :125NaCl，5. 9KC1，2. 56CaCl2, IMgCl2, 25HEPES 和 0· 1 % BSA ；pH 7. 4 ；表面灌流速率100 μ L/min)通过含有在Bio-Gel P_4 Gel中固定的100胰岛 的柱(BioRad，Hercules，CA)。除非另有说明，针对所有试验将葡萄糖浓度调节至3mM。用表 面灌流缓冲液施加刺激。将表面灌流液收集到针对96孔板形式设计的自动分级收集器中。 将含有胰岛和表面灌流溶液的柱子保持于37°C，并将在收集板中的该表面灌流液保持在 <4°C。每一分钟收集表面灌流液。表面灌流液中释放的激素用人或小鼠内分泌LINCOplex 试剂盒根据制造商的说明书(Linco research, St. Charles, MO)测定。用生物传感器细胞实时测定胰高血糖素释放使用来自BD Biosciences (San Jose, CA)的稳定地表达人胰高血糖素受体(胰 高血糖素生物传感器细胞)的HEK293H-CNG细胞，以实时测定胰高血糖素释放。使胰高血 糖素生物传感器细胞在Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中生长，该培养基中补充了 胎牛血清(10% ) (Invitrogen)、嘌罗霉素(10mg/ml) (BD Biosciences)和 G418 硫酸盐 (500mg/ml) (Mediatech，VA)。使胰高血糖素生物传感器细胞加载Fura_2AM(2 μ M ；30分钟， 于37°C)。洗去过量的Fura-2 AM后，使胰岛置于胰高血糖素生物传感器细胞的顶部，并封 装在一个封闭的、小体积成像室(Warner Instruments)中以测定[Ca2+] 如上文所述。添 加刺激物之后中止胰岛的表面灌流，使胰岛分泌产物蓄积，然后在10分钟之后重新开始。 用此技术获得的胰高血糖素应答模式类似于在表面灌流研究中获得的那些，但是该生物传 感器细胞测定法更为灵敏并且显示出较低的变异性。内源性谷氨酸盐释放的显微荧光测定从胰岛的内源性谷氨酸盐释放是用Amplex Red谷氨酸测定试剂盒(Molecular Probes)测定的，该试剂盒适用于显微镜微量荧光检测(Akagi et al.，2003)。在此测定法 中，释放的谷氨酸盐是酶链反应中的底物，其产生高荧光产物试卤灵(Molecular Probes, Eugene，OR)。L-谷氨酸盐通过谷氨酸盐氧化酶而被氧化以产生α -酮戊二酸盐、NHjP H2O2。 在通过辣根过氧化物酶催化的反应中，过氧化氢与Amplex Red试剂反应以产生试卤灵。使 胰岛附着于先前用聚-D-赖氨酸包裹的玻璃盖玻片。使该盖玻片封装在封闭的小体积成像 室(Warner Instruments)中，再用含有刺激物的HEPES-缓冲溶液表面灌流。在510nm处 激发试卤灵荧光，使用相同成像系统在590nm处记录的发射用于测定[Ca2^i (参见上文)。膜片钳电生理学使用分散的人胰岛细胞的全细胞膜片钳记录测定膜电流。使用EPC10膜片钳放大 器将所有记录放大，并使用 Patchmaster 软件(Heka Elektronik, Lambrecht, Germany)数 字化和分析。在水平程控拔出器(Puller) (DMZ Universal Puller, Zeitz-Instrumente, Augsburg, Germany)中从硼酸硅玻璃毛细管拉制吸量管。具有5-7ΜΩ电阻的吸量管充 以含有(以 mM 表示):150NMG(N-甲基-D-葡萄糖胺)，10EGTA，lMgCl2，2CaCl2，5HEPES 禾口 3Mg-ATP(pH 7. 15)的吸量溶液。该浴液含有(以 mM 表示):138NaCl，5. 6KC1，1. 2MgCl2， 2. 6CaCl2, 5HEPES 禾口 10TEA (ρΗ7· 4)。于 _70mV 对细胞进行电压钳(voltage-clamped)。使用 SF-77B Perfusion Fast-Step 系统(WarnerInstruments, Hamden, CT)施力口配体(例如红藻氨酸盐)，其使浸浴附着于碎片电极的单细胞或膜片的溶液迅速改变。我们没有尝试基 于电生理学特征来鉴别细胞类型，因为在我们的[Ca2+] i成像试验中>75%的红藻氨酸盐 敏感性细胞是胰高血糖素免疫反应性细胞。因此，最有可能在我们的电生理学试验中对红 藻氨酸盐应答的细胞是α-细胞。RT-PCR使用Qiagen (Valencia, CA)的RNA Easy试剂盒分离来自> 90%纯的人和猴胰岛 的总 RNA0 使用 SuperScriptTM First-Strand SynthesisSystem(Invitrogen)从 500ng 的 总RNA合成cDNA。对于用LightCycler和Roche扩增试剂盒的PCR反应(35次循环)，使 用cDNA(2yl)而未进一步纯化。人AMPA/红藻氨酸盐的引物(GluRl_7，Kal和KA2)以及 囊泡性谷氨酸盐运载体(vGluTl-3)购自Qiagen并以供货商建议的浓度使用。单细胞RT-PCR将人或猴胰岛分散成单个的细胞。使用玻璃微量吸管( 20 μ m)收集单细胞并置 于离心管中。使用 SuperScript First Strand SynthesisSystem(Invitrogen)将 mRNA 逆 转录。使用 TaqMan Fast UniversalPCR Master Mix 以及 7500 或 7900HT Fast Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems)进行实时PCR。选择TaqMan测定法以跨越外显子接界 (exon junction)，并因此不检测基因组DNA。我们首先用对胰岛素、胰高血糖素、生长抑素 和胰脏多肽特异性的TaqMan探针扩增了各自的cDNA。将表达唯一一种胰腺激素的细胞用 于进一步的PCR以检测谷氨酸盐受体单位GRIA 1-4 (AMPA受体亚单位)和GRIK 1-5 (红藻 氨酸盐受体亚单位)，以及代谢型谷氨酸盐受体4和5 (GRM4和GRM5)。免疫荧光免疫荧光操作法如在其它地方描述的(Cabrera et al.，2006)。使人、猴或小鼠 胰腺的切块(0.5cm3)或者分离的胰岛在4%多聚甲醛中固定(4-6h)，冷冻。在恒冷切片 机中切取切片(14 μ m)。用OptiMax洗涤缓冲溶液(Biogenex, San Ramon, CA)漂洗之后， 使切片在通用封闭试剂(Universal Blocker Reagent)中孵育(5-10分钟；Biogenex)，再 次在OptiMax洗涤缓冲溶液中漂洗，再在蛋白封闭剂(Protein Block)中孵育(20分钟， Biogenex) ο 此后，使切片与抗-姨岛素(1 500,AccurateChemical&Scientific Corp., NY)、抗-胰高血糖素(1 2000 ；Sigma, StLouis M0)、抗-生长抑素(1 500 ；Serotec, NC)和抗-胰脏多肽(1 100，Serotec)抗体孵育过夜。为了使囊泡性谷氨酸盐运载体 (vGluTs)显影，使切片在抗-vGluTl(l 20，000 ;Chemicon)、抗 _vGluT2 (1 10, 000 ； Chemicon)或抗_vGluT3 (1 20, 000 ；Chemicon)中与抗胰岛素和胰高血糖素的抗血清一 起孵育。为了使神经元组分显影，使分离的人胰岛在兔抗-突触蛋白1/2(1 500 ；Synaptic Systems, Gottingen, Germany)、小鼠抗-神经元特异性烯醇化酶(1 500，Chemicon)、兔 抗-神经微丝200(1 100，Sigma)或鸡抗-神经微丝H(1 200，Neuromix)中免疫染 色。使用Alexa缀合第二抗体(1 400 ；Molecular Probes,Eugene,OR)使免疫染色显影。 使细胞核用 DAPI (Molecular Probes)染色。使载玻片用 ProLong Anti Fade (Molecular Probes)固定并加上盖玻片。作为阴性对照，我们以用于使此产生抗体的动物的血清取代 该初级抗体。在这些条件下未观察到染色。针对不同内分泌标记物和vGluTs的表达使用 Zeiss LSM 510扫描共聚焦显微镜(Zeiss，Jena, Germany)检查含有胰岛的胰脏切片。对于所有的图像采集我们选择了 Iym的光学切面。所有图像是以数字获得的，并且未进一步 处理。以 20 和 40X 放大率观察切片。使用 Adobe Photoshop 7. 0 (Adobe Systems Inc., San JoseCA)编辑数字图像。仅调节亮度和对比度。体内研究 通过用PBS (η = 4)、谷氨酸一钠(30mg/kg ；η = 7)或AMPA (15mg/kg ；η = 8) i. p.注 射C57BL/6小鼠，我们检查了对iGluR激动剂的体内应答。为了确定阻断iGluRs是否会 加重胰岛素-诱发的低血糖症，在小鼠用胰岛素处理以诱发低血糖症之前30分钟，我们以 20mg/kgi. p.注射 AMPA/ 红藻氨酸盐 iGluR 拮抗剂 NBQX(Tocris, Ellisville，MO)。在清醒小鼠中的高胰岛素性_低血糖性钳为了提供标准化的低血糖性刺激物，我们使用高胰岛素性-低血糖性钳进一步进 行了研究。试验前至少4天，用异氟烷使小鼠麻醉，再将留置导管插入左侧颈静脉，再通过 头后部皮瓣中的切口达到表面。使小鼠禁食4小时，再置于单个塑料容器以用于切尾取 样。试验开始前取尾血样(20 μ 1)，以用于基础血浆胰高血糖素和胰岛素分泌的测定。施 用初次剂量的胰岛素(100mU/kg)，接着以20mU/kg/min的速率恒量灌注(Actrapid，Novo Nordisk)。使用One Touch Ultra葡萄糖计量仪以IOmin的间隔测定血浆葡萄糖浓度。以 可变速率灌注葡萄糖(30% )以维持血浆葡萄糖浓度在低血糖水平( 3mM)。在50min时， 达到高胰岛素性-低血糖性钳。使血糖水平保持在稳定状态(3mM)并且在60min时以推注 (10mg/kg)施用NBQX，接着灌注(10mg/kg)直到试验结束。使用盐水(0.9% NaCl)进行对 照试验，接着同样的方案用于NBQX。在若干时间点取尾血样(20μ 1) :0、50、75和90min，以 用于测定血浆胰高血糖素和胰岛素分泌。通过过量戊巴比妥使动物麻醉。统计学分析为了本文所述的统计学比较，使用了学生t-检验、单因素ANOVA或者反复测定 ANOVA接着用Student-Newman-Keuls法多重比较处理。实施例1 人胰岛中离子型谷氨酸盐受体的活化诱导胰高血糖素分泌。通过在分离的人和猴胰岛中进行RT-PCR，我们可以检测AMPA受体类型的iGluR 亚单位GluRl、GluR2、GluR3和GluR4，以及红藻氨酸盐受体类型的GluR5、GluR6、GluR7 和KA2的转录物(未显示)。这些结果与β细胞协会数据库(http:zVww.betacell.org/ resources/data/印condb/)公布的那些相符。iGluR亚单位在胰岛中的表达是通过用抗 GluR2/3抗体的免疫印迹分析法确证的(未显示)。GluRl和GluR4亚单位不能检测。当该 GluR2/3抗体被预吸附时，适当大小的带从免疫印迹中消除，但是在胰腺切片中的免疫染色 没有如此，表明用该GluR2/3抗体获得的免疫荧光信号不是特异性的。为了研究iGluRs的 细胞特异性表达，我们因此决定使用另一种技术(见下文)。与以前在啮齿动物胰岛中的结果(Moriyama和Hayashi，2003)相比，我们发现功 能性AMPA/红藻氨酸盐iGluRs仅存在于人和猴胰岛的α -细胞中(图1、2)。通过使用体 外表面灌流技术以检测激素分泌，我们确定了谷氨酸盐(IyM-ImM)刺激大量的、浓度依赖 性增加的胰高血糖素释放(图1Α，B)。胰高血糖素释放的增加亦可通过iGluR激动剂红 藻氨酸盐(100 μ M)禾口 ΑΜΡΑ(100μΜ ;Fig. ΙΑ, B)引起。CNQX(IOyM)禾口 DNQX(10 μ M ；未显 示)是两种针对AMPA/红藻氨酸盐型的iGluRs的拮抗剂，它们抑制谷氨酸盐-诱发的胰高 血糖素释放超过90% (图1A，B)。已报道代谢型受体介导对大鼠胰岛中胰高血糖素分泌的负自分泌作用(Uehara et al.，2004)。然而，使用人胰岛，我们发现代谢型受体激动剂反 式-ACPD (100 μ Μ)和ACPT-I (100 μ Μ)以及代谢型拮抗剂CPPG (100 μ Μ)不会影响基础胰高 血糖素分泌或者胰高血糖素对谷氨酸盐的应答(图1C，D)。红藻氨酸盐(100 μ Μ)、谷氨酸盐(100 μ Μ)和AMPA (100 μ Μ)均未刺激人(图1Ε) 和猴胰岛(未显示)中胰岛素释放的增加。iGluRs激动剂的这些作用在全部试验的葡萄糖 浓度是类似的(lmM、3mM和IlmM)。实施例2 α细胞表达AMPA/红藻氨酸盐型的功能化iGluRs。加载有Ca2+指示剂Fura-2的人和猴胰岛以及分散的单个胰岛细胞显示在对谷氨 酸盐(ΙΟΟμΜ)的应答中增加了细胞质游离的Ca2+浓度([Ca2+]i)。对谷氨酸盐的[&2+几应 答是浓度依赖性的(图1F)，并且可通过CNQX(IOyM)阻断(参见下文)。产生[&2+1应答 的谷氨酸盐浓度的范围与中枢神经系统中针对神经元所报道的(Hollmarm和Heinemarm， 1994 ；Seeburg,1993)类似。对谷氨酸盐应答的细胞亦对红藻氨酸盐(ΙΟΟμΜ)应答，[Ca2+] i大量增加(12个细胞中有12个)。就[Ca2+] i增加来说，对谷氨酸盐应答的细胞对高葡萄 糖浓度没有应答(1 ImM ；η = 43个细胞中有43个；图2Α)，而对高葡萄糖应答的细胞对谷氨 酸盐没有应答(η = 64个细胞中有64个；图2Α)。[Ca2+]i成像之后使用免疫荧光，我们发 现大多数谷氨酸盐_应答性细胞是胰高血糖素_免疫反应性的(η = 37个细胞中有34个； η = 4个人标本；图2Α)。没有胰岛素免疫反应性细胞对红藻氨酸盐应答(η = 8)，但是大 多数胰高血糖素免疫反应性细胞(9个细胞中有7个)对其应答。用猴胰岛获得了类似结 果(未显示)。单细胞RT-PCR试验显示，AMPA/红藻氨酸盐基因GRIA2、GRIA3和GRIK2的转录 物(图2Β)可以持续地在鉴定为α-细胞的细胞中检测(对胰高血糖素呈阳性，但对胰岛 素、生长抑素或胰脏多肽则不是；η = 7个人细胞，η = 5个猴细胞)。相比之下，在鉴定的 β-细胞中(仅对胰岛素呈阳性)，我们不能检测AMPA/红藻氨酸盐基因的转录物(图2Β)。 代谢型谷氨酸盐受体4基因(GRM4)的转录物在7个人α-细胞中的2个中发现，但是在猴 α -细胞中或者在两个物种的β -细胞中均未发现(图2Β)。检测的细胞不含有代谢型谷 氨酸盐受体5基因(GRM5)的转录物。这些数据显示，人和猴α-细胞(但不是β _细胞) 表达AMPA/红藻氨酸盐型的功能性iGluRs。实施例3 经由通过电压-门控的Ca2+通道的Ca2+流入AMPA/红藻氨酸盐受体的 活化引起胰高血糖素分泌。本发明人检查了 AMPA/红藻氨酸盐iGluRs的活化如何可以导致胰高血糖素分泌。 在分离的人胰岛细胞上的全-细胞膜片钳记录显示红藻氨酸盐(ΙΟΟμΜ)的应用引起内向 电流，其可通过NBQX (10 μ Μ)这种AMPA/红藻氨酸盐受体拮抗剂阻断(图3Α)。对红藻氨酸 盐的[Ca2+] 答通过CNQX(IOyM)被阻断，并且在细胞外Ca2+缺乏时以及通过La3+(30 μ M) 这种电压-门控的Ca2+通道有效阻滞剂消除(图3C，D)。L-型Ca2+通道阻滞剂尼非地平 (IOyM)降低 60%的红藻氨酸盐-诱发的[Ca2+] i应答(图3D)。我们进一步研究了这些 机制是否与红藻氨酸盐_诱发的胰高血糖素分泌有关。使用表面灌流测定法以检测激素分 泌，我们发现在细胞外Ca2+缺乏时，红藻氨酸盐-刺激的胰高血糖素分泌被消除(图3B)。 La3+(30 μ M)以及选择性Ca2+通道抑制剂的组合大大减少(>90%) 了对红藻氨酸盐的胰 高血糖素应答。这些结果表明，红藻氨酸盐通过激活穿过AMPA/红藻氨酸盐iGluRs的内向电流而引进胰高血糖素分泌(Hollmann和Heinemann，1994 ；Mayer和Armstrong，2004)，其 使该α “细胞浆膜(plasma membrane)去极化，导致通过电压-门控的Ca2+通道的Ca2+流 入，因此[Ca2Ii增加。
实施例4 灵长类动物α -细胞分泌谷氨酸盐。胰岛中有若干假定的谷氨酸盐的来源，例如神经末梢和内分泌细胞。因此我们研 究了谷氨酸盐是否是从含有胰高血糖素的α-细胞中释放的。具有谷氨酸盐的囊泡释放能 力的细胞表达囊泡性谷氨酸盐运载体[vGluTs ； (Fremeau et al.，2004)]。我们的RT-PCR 结果表明，灵长类动物胰岛表达vGluTl和vGluT2(未显示)。为了研究灵长类动物胰岛中 vGluTs的定位，我们针对人和猴胰脏切片进行重复免疫染色(图4A)。与以前的大鼠研究 一致(Hayashi et al. ,2003a ；Hayashi et al.，2003b)，我们发现 α -细胞(而不是含有 胰岛素的β _细胞)对VGluTl是有免疫反应性的(图4A)。这些结果表明，α -细胞是灵 长类动物胰岛中谷氨酸盐的主要来源。为了直接使谷氨酸盐释放显影，我们修改了用于细胞外谷氨酸盐显微荧光检测的 酶测定法(Akagi et al.，2003)，并使用分离、培养的胰岛进行此测定法(图4B)。当葡萄糖 浓度从6mM降低到ImM时，荧光强度显著增加，表明谷氨酸盐释放(图4C，D)。与之相比，用 高浓度葡萄糖(IlmM)刺激不会诱发谷氨酸盐分泌(图4C，D)。当用红藻氨酸盐(100 μ M) 这种对α _细胞特异性的刺激物(参见上文)刺激时，胰岛强烈地释放谷氨酸盐(图4B-D)。 KCl (30mM)去极化亦引起谷氨酸盐释放大量增加(图4D)。在缺乏谷氨酸盐-敏感的酶谷 氨酸盐氧化酶时荧光信号微弱(图4B-D)，表明此测定法中荧光强度的大量增加取决于谷 氨酸盐的释放。为了测定神经元组成是否能够有助于谷氨酸盐信号，我们针对存在的神经元标记 物突触蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经微丝200或神经微丝H检测了分离的胰岛。我们 发现如果有的话很少的标记纤维、小结(boutons)或细胞(未显示)，这与以前的研究相符， 以前的研究中显示非常少的神经末梢在胰岛培养物中存活过夜(Karlsson etal.，1997)。 由于我们使用培养的胰岛进行了我们的试验，我们断定内胰岛谷氨酸盐主要来自刺激的灵 长类动物α-细胞。实施例5 谷氨酸盐发信号提供胰高血糖素分泌的正反馈。本文公开的结果显示α-细胞表达iGluRs并且分泌谷氨酸盐，表明谷氨酸盐是一 种自分泌信号。我们猜测葡萄糖浓度降低激活了可使胰高血糖素分泌的谷氨酸盐反馈回 路。如果是这样的话，应用iGluR拮抗剂将会降低胰高血糖素应答。没有用表面灌流测定 法测试此设想，该方法对检测低浓度葡萄糖的直接应答不敏感(Hope et al.，2004)，我们 决定使用一种更敏感的测定法，即通过生物传感器细胞的胰高血糖素释放检测法。我们将 人胰岛置于表达胰高血糖素受体生物传感器细胞层中(Llorente et al.，2006)(胰高血糖 素的EC5tl = 30pM)(图5A)。该生物传感器细胞表达环核苷酸-门控通道，其通过在刺激胰 高血糖素受体之后升高的cAMP的细胞内水平而被激活，导致膜去极化和Ca2+内流。通过记 录来自加载有[Ca2Ii指示剂Fura-2的生物传感器细胞的[Ca2+]i应答，实时监测胰高血糖 素从胰岛释放。在缺乏胰岛时，生物传感器细胞对谷氨酸盐(100 μ M)(图5Β)或者葡萄糖 浓度变化(未显示)无应答。当将人胰岛置于生物传感器细胞上，该生物传感器细胞显示 对谷氨酸盐应用的大量[Ca2Ii应答(图5B)，表明诱发了胰高血糖素释放。使葡萄糖浓度从6mM降低到ImM亦诱发胰高血糖素释放，这是通过生物传感器细胞中的[Ca2+],应答测定 的(图5C)。对葡萄糖浓度降低的胰高血糖素应答是通过CNQX(IOyM)抑制的(减少54%; 图5D)。因此，我们断定当葡萄糖浓度减少时，α -细胞中iGluRs的活化对于迅速的胰高血 糖素分泌是必需的。实施例6 α -细胞中的iGluRs有助于体内葡萄糖稳态。例如，我们已发现，AMPA/红藻氨酸盐受体的活化是体外胰高血糖素分泌中的最强 刺激。为了测定α-细胞中的iGluRs的活化是否有助于体内葡萄糖稳态，我们在小鼠中进 行了试验。在对AMPA/红藻氨酸盐iGluR活化的应答中，小鼠胰岛体外分泌胰高血糖素，而 不是胰岛素(图6A，D)。代谢型受体激动剂反式-ACPD (100 μ Μ)和ACPT-I (100 μ Μ)以及 代谢型受体拮抗剂CPPGdOO μ Μ)不会影响基础的或者谷氨酸盐_诱发的胰高血糖素分泌 (图6Β)。此外，对谷氨酸盐的胰高血糖素应答在野生型和mGluR4 KO小鼠中是难以区分的 (图6C)。因此，小鼠α-细胞(但非β-细胞)对谷氨酸盐的应答主要是通过iGluRs的 活化。这些结果表明小鼠胰岛中的谷氨酸盐发信号于人胰岛中的相似。为了测定AMPA/红藻氨酸盐受体的体内活化是否影响胰高血糖素分泌，我们给 小鼠注射谷氨酸盐和AMPA受体特异性激动剂AMPA。在治疗之后30分钟，注射谷氨酸盐 (30mg/kg ； i.p.)和AMPA(15mg/kg ； i.p.)的小鼠显示血浆胰高血糖素浓度增加(图7A)。血 浆胰岛素浓度不受影响。同时，这些小鼠葡萄糖水平增加(图7A)，这应当是胰高血糖素分 泌增加的结果。谷氨酸盐和AMPA极有可能不具有中枢效应，因为谷氨酸盐没有渗透血_脑 屏障(Beyreuther et al.，2007)，并且在使用的浓度下，AMPA不会诱发预示中枢神经渗透 的惊厥(Arntet al.，1995)。尽管我们不能排除对外周神经元的作用，但我们的结果的共同 解释强烈地表明我们确实直接活化了 α “细胞中的AMPA/红藻氨酸盐受体，从而刺激小鼠 体内胰高血糖素分泌。从内分泌胰腺中的α-细胞中增加的胰高血糖素分泌在葡萄糖反调节中发挥主 要作用(Banarer et al. ,2002 ；Rizza et al.，1979)。我们提出疑问，α -细胞是否需要 谷氨酸盐正反馈回路以对葡萄糖浓度降低产生完全的胰高血糖素应答。在初始试验中，给 小鼠注射胰岛素(1.5U/kg;i.p.)以诱发低血糖症。在这些小鼠中，用AMPA/红藻氨酸盐 iGluR拮抗剂NBQX (20mg/kg，i.p.)的全身治疗增加了胰岛素-诱发的葡萄糖血浆水平下 降(未显示)。在此浓度下，NBQX不会产生镇静作用，表明该治疗减弱了葡萄糖反调节，而 对自主功能无中枢作用(LeeS，2000)。为了检测阻断AMPA/红藻氨酸盐受体是否会减少对全身低血糖症的反调节应答， 我们使用了高胰岛素性_低血糖性钳技术(图7B)。此技术提供了标准化的低血糖性刺激 物，其中血浆葡萄糖浓度可以维持期望的糖血水平(在我们的研究中为 3mM)。用AMPA/ 红藻氨酸盐iGluR拮抗剂NBQX全身治疗的小鼠(10mg/kg ;iv ；η = 7)需要更大的葡萄糖灌 注速率以维持期望的糖血水平，这表明，与注射PBS小鼠(η = 4)的对照相比，反调节应答 减少(图7C)。事实上，我们发现，胰高血糖素血浆水平在NBQX-处理的小鼠中较低，表明对 低血糖症应答的有效的胰高血糖素分泌需要iGluRs的活化(图7B)。这些实施例说明了本发明可能的实施方案。虽然本发明已参考它的一些实施方案 进行了部分说明和描述，本领域技术人员理解，它们仅是以示例的方式提供而非限制，各种 形式和细节的变化可在此实施而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明的宽度和范围不应限于任何上述示例性的实施方案，而应当仅根据下面的权利要求及其等价形式所确 定。本文所用任何标题仅提供用于组织的目的，而不是要进行任何划分或表示此文件，除非 作了特别说明。本文引用的全部文献，包括网址、期刊论文或摘要、公开的或相应的美国或外国专 利申请、公告的或外国的专利或者任何其它文献各自通过引用完全并入本文，包括全部数 据、表格、图、以及存在于该引用文献中的正文。文献以下文献各自以其全部内容并入本文· Akagi, Y.，Hashigasako, A.，Degenaar, P.，Iwabuchi, S.，Hasan，Q.，Morita, Y. ， andTamiya， Ε. (2003).Enzyme-linked sensitive fluorometric imaging of glutamaterelease from cerebral neurons of chick embryos. J Biochem(Tokyo)134, 353-358.· Arnt, J.，Sanchez, C.，Lenz，S. M.，Madsen，U.，and Krogsgaard-Larsen, P. (1995).Differentiation of in vivo effects of AMPA and NMDA receptor ligands using drugdiscrimination methods and convulsant/anticonvulsant activity. Eur J Pharmacol285，289-297.· Banarer，S.，McGregor，V. P.，and Cryer，P. E. (2002). Intraislet hyperinsulinemiaprevents the glucagon response to hypoglycemia despite an intact autonomicresponse. Diabetes 51,958-965.· Bertrand，G.，Gross，R.，Puech，R.，Loubatieres-Mariani , Μ. Μ.，and Bockaert， J. (1992).Evidence for a glutamate receptor ο f the AMPA subtype which mediatesinsulin release from rat perfused pancreas. British Journal of Pharmacology 106，354-359.
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权利要求
治疗低血糖症的方法，其包括施用有效量的活化离子型谷氨酸盐受体以刺激胰高血糖素释放的化合物。
2.权利要求1的方法，其中所述化合物活化谷氨酸盐受体亚单位GluR6。
3.权利要求1的方法，其中所述离子型谷氨酸盐受体是AMPA/红藻氨酸盐型受体。
4.权利要求1的方法，其中所述化合物选自红藻氨酸盐、ΑΜΡΑ4Π(2S，4R)-4-甲基谷 氨酸、(RS) -2-氨基-3- (4-氯-3-羟基-5-异场悉唑基)丙酸、4，6-双(苯甲酰基氨基)~1， 3-苯二羧酸、(士)-4- (4-氨基苯基)-1，2- 二氢-1-甲基-2-丙基氨基甲酰基-6，7-亚甲二 氧基酞嗪、1-(4'-氨基苯基)-3，5- 二氢-7，8- 二甲氧基-4H-2，3-苯并二氮杂革-4-酮、 1，4- 二氢-6- (1H-咪唑-1-基)-7-硝基-2，3-喹喔啉二酮盐酸盐、GABA、和荷包牡丹碱。
5.权利要求1的方法，其中所述化合物是谷氨酸盐类似物。
6.权利要求1的方法，其中所述化合物是以约5mg/kg/天至约200mg/kg/天的剂量施用。
7.前述权利要求之一的方法，其中所述低血糖症与糖尿病有关。
8.活化离子型谷氨酸盐受体以刺激胰高血糖素释放的化合物在制备用于治疗低血糖 症的药物中的用途。
9.刺激胰高血糖素释放的方法，其包括施用活化离子型谷氨酸盐受体的谷氨酸盐受体 亚单位GluR6以刺激胰高血糖素释放的化合物。
10.权利要求9的方法，其中所述离子型谷氨酸盐受体是AMPA/红藻氨酸盐型受体。
11.权利要求9的方法，其中所述化合物选自红藻氨酸盐、AMPA和GABA。
12.权利要求9的方法，其中所述化合物是谷氨酸盐类似物。
13.权利要求9的方法，其中所述化合物是以约5mg/kg/天至约200mg/kg/天的剂量施用。
14.用于体外筛选可用于治疗糖尿病的调节剂的测定法，其包括在两个组中提供胰 岛细胞，其中第一组是对照，第二组施用足以破坏存在的β细胞的剂量的链脲霉素；将测 试化合物施用于第一组和第二组；以及测量第一组和第二组中胰高血糖素释放的增强作 用，以确定该测试化合物的作用，其中细胞质钙活动化和/或胰高血糖素释放的减少指示 化合物可用作调节剂。
全文摘要
用于调节胰高血糖素释放的方法和治疗低血糖症的方法，以及筛选用于治疗低血糖症的候选药物的方法。所述方法可用于治疗糖尿病以及筛选潜在效力的候选药物。
文档编号A61K31/197GK101990431SQ200980112577
公开日2011年3月23日 申请日期2009年3月12日 优先权日2008年3月12日
发明者A·凯瑟多, O·卡布雷拉, P·博格伦 申请人:迈阿密大学