用于红细胞病原体灭活的改进猝灭方法

专利名称：用于红细胞病原体灭活的改进猝灭方法
用于红细胞病原体灭活的改进猝灭方法相关申请的交叉参考本申请要求2008年4月9日提交的发明名称为“用于红细胞病原体灭活的猝灭方 法”的美国临时申请号No. 61/043，666和2008年8月7日提交的发明名称为“用于红细胞 病原体灭活的猝灭方法”的美国临时申请号No. 61/087，034的优先权利益。在此将这两篇 申请的全部内容引入作为参考，如同以下全面陈述一样。发明领域本发明的领域涉及使用于处理血液制品的反应性亲电子化合物猝灭以使可能的 病原体污染物灭活的方法。特别地，使用升高浓度的亲核化合物，如硫醇，以使红细胞组合 物中的反应性亲电子化合物猝灭，然后将浓度降低，以降低红细胞(RBC)脱水。
背景技术：
通过血液制品和其它生物材料传播疾病仍然是严重的健康问题。尽管在供血者筛 选和血液检测方面已经取得了显著进展，但是诸如乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)和人免 疫缺陷病毒(HIV)这类病毒在检测过程中因病毒或病毒抗体的低水平而仍然可能逃脱血 液制品中的检测。除病毒的危害外，目前还没有适当的在指定用于输血的血液中筛选非病 毒微生物(如细菌或原生动物)存在的经许可的测试。还存在如下的风险迄今未知的病 原体可能在供血中很普遍并且呈现出疾病传播的威胁，正如在认识到HIV通过输血传播的 风险前发生的情况。已经将化学试剂引入血液或血浆中，以在血液制品的临床使用前使病原体灭活。 通常，对于几乎没有红细胞内含物的血液制品(如血小板和血浆)，使用光化学活化的化 合物，如补骨脂素。对于含有红细胞的血液制品，已经研发了无需光活化的用于病原体灭 活的化合物。这些化合物通常具有与病原体，更具体地说与病原体核酸反应的亲电子基 团。例如，美国专利US 5，055，485中描述了使用芳基二醇环氧化物使细胞和含蛋白组合 物中的病毒失活。可以使用原位产生亲电子试剂的其它化合物。LoGrippo等评价了氮芥 CH3-N (CH2CH2Cl) 2在病毒灭活中的应用。LoGrippo 等，Proceedings of the Sixth Congress of the International Society of Blood Transfusion (国际输血学会第六次大会记录)， Bibliotheca Haematologica (Hollander 编辑)，1958，pp. 225-230。更有意义的是，美国专 利 5，691，132 ；6, 177，441 ；6, 410，219 ；6, 143，490 和 6，093，725 中描述了使用具有核酸靶 向成分以及与核酸反应的亲电子成分的化合物，以灭活病原体，在此将这些文献的公开内 容引入作为参考。美国专利US 6，093，725和6，514，987中描述了类似的化合物，其中该化 合物的核酸靶向成分通过可水解连接物与反应性亲电子成分连接，在此将这些文献的公开 内容引入作为参考。US专利6，136，586和US 6，617，157中描述了使用乙烯亚胺寡聚体和 相关化合物使病原体灭活，在此将这些文献的公开内容引入作为参考。这些乙烯亚胺衍生 的化合物通常具有提供反应性亲电子成分的氮丙啶基团和提供化合物的核酸靶向的多胺 成分。一般类别的带有与核酸反应的亲电子或类似基团的核酸靶向化合物用于使血液、血 液制品和各种生物来源样品中的病原体灭活。
在一定程度上关注的是，尽管设计这些化合物与目标核酸特异性地反应，但是 它们仍然可能与血液中的其它成分反应，如蛋白质或细胞膜。这些副反应是不利的，并 且可能导致不良作用，如可以由免疫系统识别的蛋白质和细胞膜修饰。当反复使用这类 经处理的血液制品时，它们可能使受血者对经处理的血液制品产生免疫反应。美国专利 6，270，952 ；6, 709，810 ；和7，293，985中描述了使这类灭活病原体的化合物猝灭以便降低 任何这类不良副反应水平的方法，在此将这些文献的公开内容引入作为参考。美国专利公 开No. 2006/0115466描述了这些猝灭条件的改进，其解决了对抗病原体灭活化合物产生的 免疫应答。然而，尽管猝灭有效性得到了提高，但在一些情况中，发现处理过的红细胞由于 提高的细胞脱水而具有降低的寿命，如通过降低的渗透脆性和降低的自选血细胞比容所测 量的。因此，对减少病原体灭活化合物的不利亲电子副反应同时保持病原体灭活化合物 灭活有害病原体的能力并且没有不利地影响经处理血液制品的活力和寿命的方法存在着 需求。具体地，对猝灭红细胞中的病原体灭活化合物的改进方法存在着需求。发明概述本发明提供了用于处理含有病原体灭活化合物的红细胞组合物的各种方法以及 在提供合适的病原体灭活和降低不利副反应(如红细胞的改变)的条件下的猝灭剂，同时 降低或最小化反作用，如降低的细胞脱水。在一些实施方案中，猝灭剂是用适量的碱中和的 谷胱甘肽。在一些实施方案中，该方法涉及在病原体灭活之后降低谷胱甘肽的浓度。在一个方面中，本发明提供了处理红细胞组合物的方法，其包括a)提供i)有效 量的病原体灭活化合物以灭活病原体(如果存在)，其中病原体灭活化合物包括是或形成 反应性亲电子基团的官能团，ii)有效量的包括硫醇基的猝灭剂，其中硫醇能够与病原体灭 活化合物的反应性亲电子基团反应，和iii)包括红细胞的组合物；b)将病原体灭活化合 物和猝灭剂与包括红细胞的组合物混合；和C)将混合物中的猝灭剂浓度充分降低至一定 的量，该量可降低由混合物的贮藏引起的红细胞脱水的水平，该水平是相对于在猝灭剂的 初始浓度下由混合物的贮藏引起的红细胞脱水的水平而言的。在这些实施方案的一些中， 降低猝灭剂浓度包括除去在灭活和添加最终添加剂溶液(例如，在此所述的任何溶液，如 SAG-M，AS-5或表2、3或4的任何溶液)的过程中所用的溶液。在一些实施方案中，步骤(a)进一步包括提供合适的碱，步骤(b)进一步包括将 碱与包括红细胞的组合物混合，并且碱是足量的，以相对于无碱的混合物，降低混合物中病 原体灭活化合物与红细胞的不利反应水平。在一些实施方案中，病原体灭活化合物与红细 胞的不利反应是病原体灭活化合物对红细胞表面的改变。在一些实施方案中，步骤(a)进 一步包括提供合适的碱，步骤(b)进一步包括将碱与包括红细胞的组合物混合，并且碱是 足量的，以相对于无碱的混合物，将所得到混合物中的抗病原体灭活化合物抗体结合经处 理红细胞组合物的水平降低至少约5% (或至少约10%，至少约25%，至少约50%，至少约 75%，或至少约90% )。在一些实施方案中，在将病原体灭活化合物与红细胞组合物混合之 前，同时，或之后不超过约30分钟时，将碱和猝灭剂与红细胞组合物混合。在一些实施方案 中，在将碱或猝灭剂与红细胞组合物混合之前，将碱和猝灭剂混合在一起。在一些实施方案 中，碱是NaOH。在一些实施方案中，碱是碱缓冲液。在一些实施方案中，碱包括约0. 5至1. 5 当量的碱，其中当量意思为等同于混合物中猝灭剂摩尔量的摩尔量。在一些实施方案中，碱包括约0. 75至1. 25当量的碱。在一些实施方案中，碱包括约1当量的碱。在一些实施方 案中，步骤(b)所得到的混合物在37°C下具有约6. 0至7. 5的pH。在一些实施方案中，pH 为约6. 5至7. 1。在一些实施方案中，pH为约6. 8或6. 9。在一些实施方案中，猝灭剂包括半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在一些实施方案中， 猝灭剂是谷胱甘肽或其药物学上可接受的盐。在一些实施方案中，步骤(b)所得到混合物 中的猝灭剂浓度为高于2mM。在一些实施方案中，猝灭剂浓度为约5mM至约30mM。在一些 实施方案中，猝灭剂浓度为约15mM至约25mM。在一些实施方案中，猝灭剂浓度为约20mM。在一些实施方案中，步骤(C)中的降低猝灭剂浓度包括将混合物离心，接着除去 上清液。在一些实施方案中，步骤(c)包括大小排阻分离。在一些实施方案中，步骤(c)所 得到混合物中的猝灭剂为低于约IOmM的浓度。在一些实施方案中，猝灭剂浓度为低于约 8mM。在一些实施方案中，猝灭剂浓度为低于约6mM(或低于约4mM，或低于约2mM)。在一些 实施方案中，混合物的贮藏是混合物在4°C下贮藏超过10天。在一些实施方案中，混合物的 贮藏是混合物在4°C下贮藏超过42天(或观天)。在一些实施方案中，该方法包括添加添 加剂溶液(例如，表2中所述的任何添加剂溶液，和/或包括氯化钠、腺嘌呤、葡萄糖、磷酸 盐、鸟苷、柠檬酸盐和/或甘露醇的添加剂溶液)。在一些实施方案中，将混合物贮藏在添加 剂溶液中(例如，表2中所述的任何添加剂溶液，和/或包括氯化钠、腺嘌呤、葡萄糖、磷酸 盐、鸟苷、柠檬酸盐和/或甘露醇的添加剂溶液)。在一些实施方案中，该方法进一步包括用 添加剂溶液(例如，表2中所述的任何添加剂溶液，和/或包括氯化钠、腺嘌呤、葡萄糖、磷 酸盐、鸟苷、柠檬酸盐和/或甘露醇的添加剂溶液)替代处理溶液(例如，表2、3或4中所述 的任何溶液和/或包括氯化钠、腺嘌呤、葡萄糖、磷酸盐、鸟苷、柠檬酸盐和/或甘露醇的溶 液)。在一些实施方案中，在降低猝灭剂浓度之前组合物的氯化物浓度为低于约IOOmM(或 约75mM)。在一些实施方案中，在降低猝灭剂浓度和/或添加添加剂溶液之后组合物的氯化 物浓度为高于约IOOmM (或约125mM)。在上述每一种方法的一些实施方案中，以及在此所述的其他方法，官能团是芥子， 芥子中间体或芥子等价物。在一些实施方案中，官能团是或能够形成吖丙啶鐺离子。在一些 实施方案中，反应性亲电子基团能够与核酸反应。在一些实施方案中，病原体灭活化合物进 一步包括核酸结合配体。在一些实施方案中，核酸结合配体是嵌入剂。在一些实施方案中， 嵌入剂是吖啶。在一些实施方案中，病原体灭活化合物包括易分裂的连接物，其连接官能团 和核酸结合配体。在一些实施方案中，病原体灭活化合物是β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、 2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在一些实施方案中，步骤(b)所得到混合物中的病原体 灭活化合物的浓度为约0. 1 μ M至约5mM。在一些实施方案中，浓度足以灭活红细胞组合物 中至少Ilog的病原体，如果存在的话。在一些实施方案中，浓度足以灭活至少31og的病原 体。在一些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)之间的时间为约1至48小时。在一些实施方 案中，时间为约10至30小时。在一些实施方案中，时间为约15至25小时。在一些实施方 案中，该处理灭活红细胞组合物中至少Ilog的病原体污染物，如果存在的话。在一些实施 方案中，该处理灭活红细胞组合物中至少31og。在一些实施方案中，该方法进一步包括降低 混合物中病原体灭活化合物的浓度的步骤。在一些实施方案中，降低混合物中猝灭剂浓度 和降低混合物中病原体灭活化合物浓度的步骤同时进行。在上述任一种方法以及在此所述的其他方法的一些实施例中，在步骤(b)后的20小时时，与在相同条件下来自相同方法但没有使用碱的红细胞的ABC值相比，所得到混合 物的红细胞(RBC)具有低65%的抗病原体灭活化合物抗体结合能力(ABC)。在一些实施方 案中，RBC具有低于约50，000的平均ABC。在一些实施方案中，RBC具有低于约40，000的 平均ABC。在一些实施方案中，RBC具有约25，000至70，000的平均ABC。在一些实施方案 中，RBC具有约35，000至45，000的平均ABC。在一些实施方案中，步骤(c)后所得到混合 物的RBC具有低于的溶血现象。在一些实施方案中，在步骤(c)后在4°C下贮藏42天 (或观天)时，RBC具有低于的溶血现象。在一些实施方案中，在步骤(c)后RBC具 有高于50%的收集细胞体积(PCV)。在一些实施方案中，在步骤(c)后在4°C下贮藏42天 (或观天)时，RBC具有高于50%的PCV。在一些实施方案中，在步骤(c)后在4°C下贮藏 42天(或观天)后，所得到混合物的RBC具有高于140(或150)的平均红细胞脆性值。在 一些实施方案中，病原体灭活化合物的含量没有降低和/或病原体灭活化合物没有接触化 合物吸收装置(CAD)。在其他方面中，本发明提供了降低红细胞脱水的方法，其包括a)包括以下物质 的混合物的红细胞组合物i)猝灭剂，其中猝灭剂能够与病原体灭活化合物反应，和ii)红 细胞；和b)将混合物中的猝灭剂浓度(和任选病原体灭活化合物和/或其副产物的浓度) 充分降低至一定的量，该量可降低由混合物的贮藏引起的红细胞脱水的水平，该水平是相 对于在猝灭剂的初始浓度下由混合物的贮藏引起的红细胞脱水的水平而言的。在一些实施 方案中，猝灭剂包括半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在一些实施方案中，猝灭剂是谷胱甘肽或 其药物学上可接受的盐。在一些实施方案中，步骤(b)所得到混合物中的猝灭剂浓度为低 于约10mM。在一些实施方案中，猝灭剂浓度为低于约8mM。在一些实施方案中，猝灭剂浓度 为低于约6mM，或低于约2mM。在一些实施方案中，步骤(b)后所得到混合物的红细胞(RBC) 具有低于的溶血现象。在一些实施方案中，在步骤(b)后在4°C下贮藏42天(或观天) 时，RBC具有低于的溶血现象。在一些实施方案中，在步骤(b)后所得到混合物的RBC 具有高于50%的收集细胞体积(PCV)。在一些实施方案中，在步骤(b)后在4°C下贮藏42 天(或观天)时，所得到混合物的RBC具有高于50%的PCV。在一些实施方案中，在步骤 (b)后在4°C下贮藏42天(或观天)时后，所得到混合物的RBC具有高于140(或150)的 平均红细胞脆性值。在一些实施方案中，混合物的贮藏是混合物在4°C下贮藏超过10天。 在一些实施方案中，混合物的贮藏是在4°C下贮藏超过42天(或观天)。在一些实施方案 中，病原体灭活化合物的含量没有降低和/或病原体灭活化合物没有接触化合物吸收装置 (CAD)。提供了通过上述每一种方法产生的红细胞(RBC)。还提供了通过上述每一种方法 可制备的RBC组合物。在进一步的方面中，本发明提供了一种组合物，其包括a)红细胞，其中红细胞已 经与病原体灭活化合物的亲电子基团发生了共价反应；和b)猝灭剂，其包括能够与病原体 灭活化合物反应的硫醇基团；其中组合物在4°C下贮藏至多42天(或观天)后适于灌输 于人。在一些实施方案中，灭活了至少Ilog的病原体，如果存在的话。在一些实施方案中， 灭活至少31og。在一些实施方案中，亲电子基团是芥子，芥子中间体或芥子等价物。在一些 实施方案中，亲电子基团是或能够形成吖丙啶鐺离子。在一些实施方案中，亲电子基团能够 与核酸反应。在一些实施方案中，亲电子基团与红细胞的细胞表面共价反应。在一些实施10方案中，病原体灭活化合物进一步包括核酸结合配体。在一些实施方案中，核酸结合配体是 嵌入剂。在一些实施方案中，嵌入剂是吖啶。在一些实施方案中，病原体灭活化合物包括易 分裂的连接物，其连接亲电子基团和核酸结合配体。在一些实施方案中，病原体灭活化合物 是3-丙氨酸力-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在一些实施方案中，猝 灭剂包括半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在一些实施方案中，猝灭剂是谷胱甘肽或其药物学 上可接受的盐。在一些实施方案中，猝灭剂浓度足够低，以避免或最小化贮藏过程中的红细 胞脱水。在一些实施方案中，猝灭剂浓度为低于约10mM。在一些实施方案中，猝灭剂浓度为 低于约8mM。在一些实施方案中，猝灭剂浓度为低于约6mM，或低于约2mM。在一些实施方案 中，红细胞(RBC)具有高于55%的收集细胞体积(PCV)。在一些实施方案中，RBC具有高于 60%的PCV。在一些实施方案中，RBC具有低于约50，000的平均抗体结合能力(ABC)。在一 些实施方案中，RBC具有低于约40，000的平均ABC。在一些实施方案中，RBC具有约25，000 至60，000的平均ABC。在一些实施方案中，RBC具有约25,000至70,000的平均ABC。在 一些实施方案中，RBC具有约35，000至45，000的平均ABC。在一些实施方案中，组合物进 一步包括添加剂溶液(例如，表2中所述的任何添加剂溶液，和/或包括氯化钠、腺嘌呤、葡 萄糖、磷酸盐、鸟苷、柠檬酸盐和/或甘露醇的添加剂溶液)。在一些实施方案中，添加剂溶 液和/或组合物的氯化物浓度高于约IOOmM (或约125mM)。在其他方面中，本发明提供了将红细胞输入个体中的方法，其包括a)提供上述 任一种红细胞组合物或通过在此所述的任一种方法制得的红细胞组合物，和b)将红细胞 组合物输入个体中。在一个方面中，本发明提供了处理红细胞组合物的方法，其包括(a)混合以下物 质(i)包括官能团的病原体灭活化合物(例如，有效量的病原体灭活化合物，以灭活病原 体，如果存在的话)，官能团是反应性亲电子基团；(ii)包括硫醇基团的猝灭剂(例如，有效 量的猝灭剂)，其中硫醇基能够与病原体灭活化合物的反应性亲电子基团反应；和(iii)包 括红细胞的组合物；和(b)将混合物中的猝灭剂浓度充分降低至一定的量，该量可降低由 混合物的贮藏引起的红细胞脱水的水平，该水平是相对于在猝灭剂的初始浓度下由混合物 的贮藏引起的红细胞脱水的水平而言的。在这些实施方案的一些中，降低猝灭剂浓度包括 除去在灭活和添加最终添加剂溶液(例如，在此所述的任何溶液，如SAG-M，AS-5或表2、3 或4的任何溶液)的过程中所用的溶液。该方法包括以上和/或在此所示实施方案中的任 何一个或多个。在一些实施方案中，该方法进一步包括将合适的碱与包括红细胞的组合物混合， 并且碱是足量的，以相对于无碱的混合物，降低混合物中病原体灭活化合物与红细胞的不 利反应。在一些实施方案中，病原体灭活化合物与红细胞的不利反应是由病原体灭活化合 物引起的红细胞表面的改变。在一些实施方案中，该方法进一步包括将合适的碱与包括红 细胞的组合物混合，并且碱是足量的，以相对于无碱的混合物，将所得到混合物中的抗病原 体灭活化合物抗体结合经处理红细胞组合物的水平降低至少约5% (或至少约10%，至少 约25 %，至少约50 %，至少约75 %，或至少约90 % )。在一个方面中，本发明提供了降低红细胞组合物脱水的方法，其中组合物是包括 能够与病原体灭活化合物反应的猝灭剂和红细胞的混合物；该方法包括，将混合物中的猝 灭剂浓度充分降低至一定的量，该量可降低由混合物的贮藏引起的红细胞脱水的水平，该水平是相对于在猝灭剂的初始浓度下由混合物的贮藏引起的红细胞脱水的水平而言的。在另一个方面中，本发明提供了红细胞灌输的方法，包括将在此所述的红细胞组 合物输入个体中。附图简述

图1显示了实施例6中所述的，在最初猝灭剂定量给予后在各种碱水平下的红细 胞渗透脆性。图2显示了在培养20小时时，在各种碱水平下的红细胞密度。图3显示了在培养并贮藏36天后，在各种碱水平下的红细胞密度。图4显示了使用和未用降低猝灭剂浓度(即，使用/未用交换步骤)，在培养并贮 藏36天后，红细胞的渗透脆性。图5显示了与适度初始猝灭剂浓度(未用交换步骤)相比，使用改变初始猝灭剂 浓度(使用交换步骤)，在培养并贮藏42天后，红细胞的渗透脆性。图6显示了使用和未用病原体灭活化合物，在培养和贮藏36天后，红细胞的渗透 脆性。图7显示了使用本发明方法的几种红细胞制剂的抗体结合能力(ABC)值。发明详述本发明提供了处理红细胞组合物以灭活可能存在的病原体的方法，同时降低或最 小化不利的副反应(如导致不利免疫应答的红细胞改变)和同时降低或最小化处理之中或 之后对细胞存活力(例如，降低的渗透脆性和/或增加的脱水)和/或寿命的不利作用。我 们发现了在病原体灭活处理过程中适当控制PH并结合适量的猝灭剂可以降低用病原体灭 活化合物处理的红细胞的初始脱水。然后在该处理后，降低初始猝灭剂浓度，以提供能够进 行细胞贮藏而渗透脆性没有明显变化的健康病原体灭活红细胞。这些方法特别适用于制备 其中对于临床使用已经将病原体灭活的红细胞组合物，尤其是在临床使用前将组合物贮藏 一段时间时。因此，在一个方面中，通过(1)将病原体灭活化合物和猝灭剂与包括红细胞的组 合物混合；和( 充分降低猝灭剂的浓度，以降低由混合物的贮藏引起的红细胞脱水的水 平，该水平是相对于在猝灭剂的初始浓度下由混合物的贮藏引起的红细胞脱水的水平而言 的，本发明提供了处理包括病原体灭活化合物和猝灭剂的红细胞组合物的方法。在其他方面中，本发明提供了降低红细胞脱水和/或提高渗透脆性的方法，以及 将红细胞输入人体中的方法。还提供了处理过的红细胞组合物。红细胞本发明的红细胞组合物包括，但不限于，包含红细胞的任何血液制品(例如，人 血)，其中血液制品提供，或进行加工来提供，适于在人、哺乳动物和/或脊椎动物体内使 用的红细胞，如用于灌输。红细胞组合物包括，例如，全血和红细胞浓缩物，如压积红细胞 (pRBC ；例如，具有增加的血细胞比容的红细胞和/或不含添加剂溶液的红细胞)。红细胞 组合物可以通过它们的血细胞比容或收集细胞体积(PCV)来进行描述，血细胞比容或收集 细胞体积是组合物中红细胞浓度的测量。红细胞组合物可以具有约1至100%范围的血细 胞比容，更优选约10至90%，以及约35至80%，或约40至70%。这样的红细胞组合物可 以包括化学物质，如病原体灭活化合物和猝灭剂。它们还可以包括缓冲剂和其他溶液，如红细胞添加剂溶液(例如，在此所述的任何溶液，如SAG-M，AS-5或表2、3或4的任何溶液)， 包括盐或缓冲溶液。在一些实施方案中，在用于在此所述的处理方法之前，在此所述的红 细胞组合物是具有约70至90%，或约75至85%，或约80%范围的血细胞比容的压积红细 胞。在一些实施方案中，在用于在此所述的处理方法之前和/或之中，红细胞组合物是具有 约50至70%，或约55至65%，或约60%范围的血细胞比容的非压积红细胞。在一些实施 方案中，在用于在此所述的处理方法之前和/或之中，用稀释溶液稀释红细胞组合物，并且 其具有约30至50%，或约35至45%，或约40%范围的血细胞比容。在一些实施方案中，在 用于在此所述的处理方法之前，已经将在此所述的红细胞组合物白细胞降低。在一些实施 方案中，没有将红细胞组合物的白细胞降低。可以按照在此公开的来处理将接触或引入活 的人、哺乳动物或脊椎动物体内的任何红细胞组合物，其中这样的接触由于污染的病原体 携带了传播疾病的风险。血液病原体如果存在，在本发明方法中灭活的病原体污染物包括能够在人、其他哺乳动物或 脊椎动物中引起疾病的任何含核酸物质。病原体可以是单细胞的或多细胞的。病原体的实 例是细菌、病毒、原生动物、真菌、酵母、霉菌和支原体，这些在人、其他哺乳动物或脊椎动物 中引起疾病。病原体的遗传物质可以是DNA或RNA，并且遗传物质可以作为单链或双链核酸 存在。表1列出了病毒的实例，并且不是以任何方式来限制本发明。表1.病毒的非限制性实例
权利要求
1.一种处理红细胞组合物的方法，其包括(a)混合(i)有效量的包含是或形成反应性亲电子基团的官能团的病原体灭活化合物； ( )有效量的包含硫醇基团的猝灭剂，其中该硫醇基能够与病原体灭活化合物的反应 性亲电子基团反应；和(iii)包含红细胞的组合物；和(b)将混合物中的猝灭剂浓度充分降低至一定的量，该量可降低由混合物的贮藏引起 的红细胞脱水的水平，该水平是相对于在猝灭剂的原始浓度下由混合物的贮藏引起的红细 胞脱水的水平而言的。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)进一步包括将合适的碱与包含红细胞的组合物混 合，并且其中碱是足量的，以相对于无碱的混合物而言，降低混合物中病原体灭活化合物与 红细胞的不利反应水平。
3.权利要求2的方法，其中病原体灭活化合物与红细胞的不利反应是病原体灭活化合 物对红细胞表面的改变。
4.权利要求2或3的方法，其中在将病原体灭活化合物与红细胞组合物混合之前、同 时、或之后不超过约30分钟时，将碱和猝灭剂与红细胞组合物混合。
5.权利要求2-4任一项的方法，其中在将碱或猝灭剂与红细胞组合物混合之前，将碱 和猝灭剂混合在一起。
6.权利要求2-5任一项的方法，其中碱是NaOH。
7.权利要求2-5任一项的方法，其中碱是碱性缓冲剂。
8.权利要求2-7任一项的方法，其中碱包含约0.5至1. 5当量的碱，其中当量意思是等 同于混合物中猝灭剂摩尔量的摩尔量。
9.权利要求8的方法，其中碱包含约0.75至1. 25当量的碱，其中当量意思是等同于步 骤(a)混合物中猝灭剂摩尔量的摩尔量。
10.权利要求8的方法，其中碱包含约1当量的碱，其中当量意思是等同于步骤(a)混 合物中猝灭剂摩尔量的摩尔量。
11.之前任一项权利要求的方法，其中步骤(a)所得到的混合物在37°C下具有约6.0 至7. 5的pH。
12.权利要求11的方法，其中步骤(a)所得到的混合物在37°C下具有约6.5至7. 1的pH。
13.权利要求11的方法，其中步骤(a)所得到的混合物在37°C下具有约6.8的pH。
14.之前任一项权利要求的方法，其中猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸的衍生物。
15.权利要求14的方法，其中猝灭剂是谷胱甘肽或其药物学上可接受的盐。
16.之前任一项权利要求的方法，其中步骤(a)所得到的混合物中的猝灭剂浓度高于2mM。
17.权利要求16的方法，其中步骤(a)所得到的混合物中的猝灭剂浓度为约5mM至约 30mM。
18.权利要求16的方法，其中步骤(a)所得到的混合物中的猝灭剂浓度为约15mM至约 25mM。
19.权利要求16的方法，其中步骤(a)所得到的混合物中的猝灭剂浓度为约20mM。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中步骤(b)中降低猝灭剂浓度包括混合物的离心 接着除去混合物的上清液。
21.权利要求1-19任一项的方法，其中步骤(b)中降低猝灭剂浓度包括大小-排阻分1 ο
22.之前任一项权利要求的方法，其中步骤(b)所得到的混合物中的猝灭剂浓度为低 于约10mM。
23.权利要求22的方法，其中步骤(b)所得到的混合物中的猝灭剂浓度低于约8mM。
24.权利要求22的方法，其中步骤(b)所得到的混合物中的猝灭剂浓度低于约6mM。
25.之前任一项权利要求的方法，其中官能团选自芥子、芥子中间体和芥子等价物。
26.之前任一项权利要求的方法，其中官能团是或能够形成吖丙啶鐺离子。
27.之前任一项权利要求的方法，其中反应性亲电子基团能够与核酸反应。
28.之前任一项权利要求的方法，其中病原体灭活化合物进一步包含核酸结合配体。
29.权利要求观的方法，其中核酸结合配体是嵌入剂。
30 权利要求28的方法，其中嵌入剂示吖啶。
31.权利要求观-30任一项的方法，其中病原体灭活化合物包含连接官能团和核酸结 合配体的易分解连接物。
32.权利要求31的方法，其中病原体灭活化合物是丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、 2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。
33.之前任一项权利要求的方法，其中步骤(a)所得到混合物中的病原体灭活化合物 的浓度为约0. 1 μ M至约5mM。
34.权利要求33的方法，其中步骤(a)所得到混合物中的病原体灭活化合物的浓度足 以灭活红细胞组合物中至少Ilog的病原体，如果存在的话。
35.权利要求33的方法，其中步骤(a)所得到混合物中的病原体灭活化合物的浓度足 以灭活红细胞组合物中至少31og的病原体，如果存在的话。
36.之前任一项权利要求的方法，其中步骤(a)和步骤(b)之间的时间为约1至48小时。
37.权利要求36的方法，其中步骤(a)和步骤(b)之间的时间为约10至30小时。
38.权利要求36的方法，其中步骤(a)和步骤(b)之间的时间为约15至25小时。
39.之前任一项权利要求的方法，其中处理灭活红细胞组合物中至少Ilog的病原体污 染物，如果存在的话。
40.权利要求39的方法，其中处理灭活红细胞组合物中至少31og的病原体污染物，如 果存在的话。
41.之前任一项权利要求的方法，进一步包括降低混合物中病原体灭活化合物浓度的步骤。
42.权利要求41的方法，其中降低混合物中猝灭剂浓度和降低混合物中病原体灭活化 合物浓度的步骤同时进行。
43.权利要求2-42任一项的方法，其中步骤(a)后20小时时，与来自相同条件下的相 同方法但没有使用碱的红细胞的抗体结合能力(ABC)值相比，所得到混合物的红细胞具有低于65%的ABC。
44.之前任一项权利要求的方法，其中所得到混合物的红细胞具有低于约50，000的平 均抗体结合能力(ABC)。
45.权利要求44的方法，其中所得到混合物的红细胞具有低于约40，000的平均抗体结 合能力(ABC)。
46.权利要求1-43任一项的方法，其中所得到混合物的红细胞具有在约25，000与 70，000之间的平均抗体结合能力(ABC)。
47.权利要求46的方法，其中所得到混合物的红细胞具有在约35，000与45，000之间 的平均抗体结合能力(ABC)。
48.之前任一项权利要求的方法，其中所得到混合物的红细胞在步骤(b)后具有低于 的溶血。
49.权利要求48的方法，其中所得到混合物的红细胞在步骤(b)后在4°C下42天时具 有低于的溶血。
50.之前任一项权利要求的方法，其中所得到混合物的红细胞在步骤(b)后具有高于 50%的收集细胞体积。
51.权利要求50的方法，其中所得到混合物的红细胞在步骤(b)后在4°C下42天时具 有高于50%的收集细胞体积。
52.之前任一项权利要求的方法，其中所得到混合物的红细胞在步骤(b)后在4°C下42 天后具有高于140的平均红细胞脆性值。
53.一种将红细胞输入个体中的方法，包括将通过权利要求1-52任一项的方法产生的 红细胞组合物输入个体中。
54.一种降低红细胞组合物脱水的方法，其中该组合物是包含能够与病原体灭活化合 物反应的猝灭剂和红细胞的混合物；该方法包括，将混合物中的猝灭剂浓度充分降低至一 定的量，该量可降低由混合物的贮藏引起的红细胞脱水的水平，该水平是相对于在猝灭剂 的初始浓度下由混合物的贮藏引起的红细胞脱水的水平而言的。
55.权利要求M的方法，其中猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸的衍生物。
56.权利要求55的方法，其中猝灭剂是谷胱甘肽或其药物学上可接受的盐。
57.权利要求讨-56任一项的方法，其中猝灭剂的浓度降至低于约10mM。
58.权利要求57的方法，其中猝灭剂的浓度降至低于约8mM。
59.权利要求57的方法，其中猝灭剂的浓度降至低于约6mM。
60.权利要求M-59任一项的方法，其中混合物的红细胞在降低猝灭剂浓度后具有低 于的溶血。
61.权利要求60的方法，其中混合物的红细胞在降低猝灭剂浓度后在4°C下42天时具 有低于的溶血。
62.权利要求M-61任一项的方法，其中混合物的红细胞在降低猝灭剂浓度后具有高 于50%的收集细胞体积。
63.权利要求62的方法，其中混合物的红细胞在降低猝灭剂浓度后在4°C下42天时具 有高于50%的收集细胞体积。
64.权利要求讨-63任一项的方法，其中混合物的红细胞在降低猝灭剂浓度后4°C下42天后具有高于140的平均红细胞脆性值。
65.一种组合物，其包含通过权利要求1-64任一项的方法产生的红细胞。
66.一种组合物，其包含通过权利要求1-64任一项的方法可制备的红细胞。
67.一种组合物，其包含(a)红细胞，其中红细胞与病原体灭活化合物的亲电子基团共价反应；和(b)猝灭剂，其包含能够与病原体灭活化合物反应的硫醇基团； 其中该组合物适于在4°C下贮藏42天后输入人体中。
68.权利要求67的组合物，其中灭活了至少Ilog的病原体，如果存在的话。
69.权利要求68的组合物，其中灭活了至少31og的病原体，如果存在的话。
70.权利要求67-69任一项的组合物，其中亲电子基团选自芥子、芥子中间体和芥子等 价物。
71.权利要求67-69任一项的组合物，其中亲电子基团是或能够形成吖丙啶鐺离子。
72.权利要求67-71任一项的组合物，其中亲电子基团能够与核酸反应。
73.权利要求67-72任一项的组合物，其中亲电子基团与红细胞的细胞表面共价反应。
74.权利要求67-73任一项的组合物，其中病原体灭活化合物进一步包含核酸结合配体。
75.权利要求74的组合物，其中核酸结合配体是嵌入剂。
76.权利要求75的组合物，其中嵌入剂是吖啶。
77.权利要求67-76任一项的组合物，其中病原体灭活化合物包含连接亲电子基团和 核酸结合配体的易分解连接体。
78.权利要求77的组合物，其中病原体灭活化合物是β-丙氨酸、Ν-(吖啶-9-基)、 2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。
79.权利要求67-78任一项的组合物，其中猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸的衍生物。
80.权利要求79的组合物，其中猝灭剂是谷胱甘肽或其药物学上可接受的盐。
81.权利要求67-80任一项的组合物，其中猝灭剂浓度足够低以避免贮藏过程中的红 细胞脱水。
82.权利要求81的组合物，其中猝灭剂浓度低于约10mM。
83.权利要求81的组合物，其中猝灭剂浓度低于约8mM。
84.权利要求81的组合物，其中猝灭剂浓度低于约6mM。
85.权利要求67-84任一项的组合物，其中红细胞具有高于55%的收集细胞体积。
86.权利要求85的组合物，其中红细胞具有高于60%的收集细胞体积。
87.权利要求67-84任一项的组合物，其中红细胞具有低于约50，000的平均抗体结合 能力(ABC)。
88.权利要求87的组合物，其中红细胞具有低于约40，000的平均抗体结合能力 (ABC)。
89.权利要求67-84任一项的组合物，其中红细胞具有在约25，000与70，000之间的平 均抗体结合能力(ABC)。
90.权利要求89的组合物，其中红细胞具有在约35，000与45，000之间的平均抗体结 合能力(ABC)。
91.一种红细胞输入的方法，包括将权利要求67-90任一项的红细胞组合物输入个体中。
92.权利要求1-52或M-64任一项的方法，其中混合物的贮藏是混合物在4°C下超过 10天的贮藏。
93.权利要求92的方法，其中混合物的贮藏是混合物在4°C下超过42天的贮藏。
94.权利要求5的方法，其中混合碱和猝灭剂形成猝灭剂的盐形式。
95.权利要求94的方法，其中碱是谷胱甘肽，并且盐形式是谷胱甘肽钾或谷胱甘肽钠。
96.权利要求1-52和92-95任一项的方法，其中步骤(a)之后和步骤(b)之前的氯化 物浓度低于约lOOmM。
97.权利要求96的方法，其中步骤(a)之后和步骤(b)之前的氯化物浓度低于约75mM。
98.权利要求1-52和92-97任一项的方法，其中步骤(b)后的氯化物浓度高于约 IOOmM0
99.权利要求98的方法，其中步骤(b)后的氯化物浓度高于约125mM。
100.权利要求1-52和92-99任一项的方法，其中步骤(a)中包含红细胞的组合物具有 在约70与90%之间的收集细胞体积。
101.权利要求100的方法，其中步骤(a)中包含红细胞的组合物具有在约75与85% 之间的收集细胞体积。
102.权利要求1-51和92-99任一项的方法，其中步骤(a)中包含红细胞的组合物具有 在约50与70%之间的收集细胞体积。
103.权利要求102的方法，其中步骤(a)中包含红细胞的组合物具有在约55与75% 之间的收集细胞体积。
104.权利要求1-51和92-99任一项的方法，其中步骤(a)中包含红细胞的组合物具有 在约30与50%之间的收集细胞体积。
105.权利要求104的方法，其中步骤(a)中包含红细胞的组合物具有在约35与45% 之间的收集细胞体积。
106.权利要求1-52和92-105任一项的方法，步骤(a)中的红细胞已经是白细胞降低的。
107.权利要求1-52和92-105任一项的方法，步骤(a)中的红细胞不是白细胞降低的。
108.权利要求1-52、54-65和92-107任一项的方法，其中降低猝灭剂的浓度包括添加 剂溶液的添加。
109.权利要求108的方法，其中添加剂溶液包含氯化钠、腺嘌呤、葡萄糖和甘露醇。
110.权利要求109的方法，其中添加剂溶液进一步包含磷酸盐。
111.权利要求109或110的方法，其中添加剂溶液进一步包含柠檬酸盐。
112.权利要求67-90任一项的组合物，进一步包含氯化钠、腺嘌呤、葡萄糖和甘露醇。
113.权利要求112的组合物，进一步包含磷酸盐。
114.权利要求112或113的组合物，进一步包含柠檬酸盐。
115.权利要求67-90和112-114任一项的组合物，其中氯化物以高于约IOOmM的浓度存在。
116.权利要求115任一项的组合物，其中氯化物以高于约125mM的浓度存在。
全文摘要
本发明提供了在提供合适的病原体灭活同时维持细胞存活力的条件下用病原体灭活化合物处理红细胞组合物的改进方法。还提供了降低红细胞脱水的方法以及处理过的红细胞组合物。
文档编号A61L2/00GK102046006SQ200980119812
公开日2011年5月4日 申请日期2009年4月9日 优先权日2008年4月9日
发明者A·埃里克森, A·诺思, N·穆夫蒂 申请人:塞鲁斯公司