包含源自α<sub>s1</sub>酪蛋白的肽的抗焦虑组合物的制作方法

文档序号:1177072阅读:348来源:国知局
专利名称:包含源自α<sub>s1</sub>酪蛋白的肽的抗焦虑组合物的制作方法
包含源自CIs1酪蛋白的肽的抗焦虑组合物本发明涉及包含具有抗焦虑活性的源自α Sl酪蛋白的肽的药物组合物和食物组 合物。通过各种不同的分级分离技术,酪蛋白产生分别称为κ酪蛋白、β酪蛋白、α sl酪 蛋白和α S2酪蛋白的主要级分。这些酪蛋白的氨基酸序列是众所周知的,特别是Cisl酪蛋 白的氨基酸序列已由MERCIER等人(1)和NAGAO等人(2)进行了测定。已显示,这些各种不同的酪蛋白的某些肽片段具有多种多样的生物学活性,尤其 是阿片剂或抗阿片剂活性,和抑制血管紧张素I转化酶的活性。因此,α sl酪蛋白的肽90-96 和肽90-95具有经在体外证明的阿片剂活性[ZI0UDR0U等人(3)和LOUKAS等人]。第90 位的精氨酸残基看起来对于该阿片剂活性是重要的。其中删除了该精氨酸残基的肽91-95 和肽91-96几乎没有活性,并因此它们具有比肽90-96低得非常多的阿片剂活性。至于肽 23-34和肽194-199,它们是血管紧张素I转化酶的抑制剂[MARUYAMA和SUZUKI (5),以及 MARUYAMA 等人(6)]。已经在Cisl酪蛋白的胰蛋白酶消化水解物中揭示出了具有抗焦虑类型的原始活 性的肽[EP 0714910(7)]。它相应于片段91-100,并且已被命名为α-casoz印ine[MICL0 等人(8)]。Guesdon等人(18)还证明,酪蛋白的该同样的胰蛋白酶消化水解物(其包含肽 91-100)在经受长期应激的大鼠中改善了睡眠。通过二维1H-NMR研究了该十肽的结构。包 含在甘氨酸93残基和亮氨酸99残基之间的序列在胶束介质中采取31(|螺旋结构,其由α 螺旋旋转开始和结束。疏水残基的侧链位于螺旋的相同的面上,而亲水残基的侧链位于另 一个面上,这赋予该肽以两亲特征并且可以允许其与膜相互作用。精氨酸100残基的胍積. 基团与谷氨酸96残基和精氨酸100残基的羧基基团之间的离子相互作用显示了该羧基末 端精氨酸残基在螺旋状结构的稳定化中的首要作用。在这样的结构中,第91和94位的两 个酪氨酸残基的芳族环以这样的方式取向,即使得它们的中心之间的距离(平均0. 56nm) 与在因其抗焦虑特性而知晓的硝西泮、苯二氮杂革的芳族环的中心之间所观察到的距离相 当[LEC0UVEY等人(9)]。用丙氨酸残基置换精氨酸100残基大大地降低了该十肽的螺旋 度,并由此导致该肽对于GABAa受体的苯二氮杂革位点的亲和力以300,000倍的程度降低 [Celine Frochot的论文(10)]。在口服吸收后,该十肽可能经历由消化道的酶施加的蛋白 水解攻击,这可降低其生物利用率并因此阻碍其到达其生物学靶标。然而,对于小肽来说众 所周知的是,肠细胞吸收比更大片段的肠细胞吸收更有效,并且它们对于消化蛋白酶的抗 性增加。因此,在该十肽的消化过程中所产生的片段之中,某些可能是更可吸收的和更具抗 性的,但是从来源于该十肽的结构数据来看,没有能够保留丝毫的抗焦虑类型的活性。未决专利申请PCT/EP2007/063863令人惊讶地表明,源自该十肽且不包含精氨酸 100这一关键残基的肽91-97、91-98、91-99在大鼠中的体内行为测试中显示出抗焦虑特 性。从其小的尺寸来看,这些肽是更容易可吸收的和更不容易可降解的。现在,本申请涉及具有抗焦虑特性的药物组合物和食品,其包含源自Cisl酪蛋白 的肽91-95和91-96。可以在大鼠中的体内行为测试中证明这些肽的抗焦虑特性。序列列表
SEQ ID NO. 1 相应于α sl酪蛋白的位置91-95的五肽SEQ ID NO. 2 相应于α sl酪蛋白的位置91-96的六肽发明描述本发明的目标在于药物组合物,其包含作为活性成分的有效量的根据SEQID No. 1 的肽和/或根据SEQ ID No. 2的肽,以及与之相联合的合适的药物学载体。根据本发明的药物组合物具有苯二氮杂革类型的活性,并且更特别地适合于治疗 焦虑、睡眠障碍和癫痫。在一个特别的实施方案中,本发明涉及包含酪蛋白或α sl酪蛋白的水解物或水解 物级分的药物组合物,所述水解物和所述水解物级分包含有效量的根据SEQ ID No. 1的肽 和/或根据SEQ ID No. 2的肽。本发明还涉及用于尤其易患焦虑、睡眠障碍和/或癫痫的人的食品,其包含有效 量的至少一种根据SEQ ID No. 1和/或SEQ ID No. 2的肽。在本发明的一个有利的实施方案中,所述食品包含酪蛋白或α sl酪蛋白的水解物 或水解物级分,所述水解物和所述水解物级分包含有效量的根据SEQ ID No. 1的肽和/或 根据SEQ ID No. 2的肽。本发明的目标还在于分离的多核苷酸,其编码根据SEQ ID No. 1的肽或根据SEQ ID No. 2 的肽。本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸的表达载体。本发明的另一个目标为用根据本发明的多核苷酸和/或用根据本发明的表达载 体转化的宿主生物,不包括人。本发明的目标还在于表达根据SEQ ID No. 1的肽或根据SEQ ID No. 2的肽的经转 化的宿主生物,不包括人。本发明还涉及根据SEQ ID No. 1的肽、根据SEQ ID No. 2的肽、根据本发明的多核 苷酸、根据本发明的表达载体和/或根据本发明的宿主生物在制备用于治疗焦虑、睡眠障 碍和癫痫的药物中的用途。优选地,本发明涉及酪蛋白或α sl酪蛋白的水解物和/或酪蛋白或Cisl酪蛋白的 水解物级分在制备用于治疗焦虑、睡眠障碍和癫痫的药物中的用途,所述水解物和所述水 解物级分包含有效量的根据SEQ ID No. 1的肽和/或根据SEQ ID No. 2的肽。优选地,所述药物具有苯二氮杂革类型的活性。本发明的另一个目标为根据SEQ ID No. 1的肽、根据SEQ ID No. 2的肽、根据本发 明的多核苷酸、根据本发明的表达载体和/或根据本发明的宿主生物在制备用于尤其易患 焦虑、睡眠障碍和/或癫痫的人的食品中的用途。优选地,本发明的目标在于酪蛋白或α sl酪蛋白的水解物和/或酪蛋白或Cisl酪 蛋白的水解物级分在制备用于尤其易患焦虑、睡眠障碍和/或癫痫的人的食品中的用途, 所述水解物和所述水解物级分包含有效量的根据SEQ ID No. 1的肽和/或根据SEQ ID No. 2 的肽。因此,本发明的目标在于药物组合物和食品,其包含源自asl酪蛋白的肽, 该肽的序列表示在SEQ ID NO. 1和2中。因此,本发明涉及药物组合物和食品,所 述药物组合物和食品包含其氨基酸序列选自下列的肽=Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu和-Tyr-Leu-Glu0本发明还涉及包含经修饰的肽的药物组合物和食品,所述经修饰的肽具有SEQ ID NO. 1或之一并且保留其抗焦虑特性。本发明还涉及包含融合蛋白或重组蛋白的药物组合物 和食品,所述融合蛋白或重组蛋白包含根据SEQ ID No. 1和/或根据SEQ ID No. 2的肽。在第二个方面,本发明涉及编码根据SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的肽的多核苷 酸。由于遗传密码的简并性,不同的多核苷酸可以编码相同的肽。根据本发明,“多核苷酸” 是指可以为DNA或RNA类型的单链核苷酸链或其互补链,或者可以为cDNA(互补的)或基 因组类型的双链核苷酸链。优选地,本发明的多核苷酸为DNA类型,尤其是双链DNA类型。 术语“多核苷酸”还指经修饰的多核苷酸。优选地,本发明的多核苷酸可以通过常规的分子 生物学技术(例如由 Sambrook 等人(Molecular Cloning :A Labratory Manual, 1989)所 描述的)或者通过化学合成来制备。本发明的另一个目标为表达根据SEQ ID No. 1或2之一的肽的宿主生物。可以根 据本领域技术人员众所周知的技术在各种不同的宿主生物中表选和产生根据SEQ ID No. 1 和SEQ ID No. 2的肽。通常,用包含编码根据SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的肽的多核苷酸 的表达盒来转化宿主生物。该多核苷酸可以整合到宿主生物的基因组中,或者在宿主生物 中稳定地复制。特别地,根据本发明,“宿主生物”是指任何低等或高等的单或多细胞生物, 特别地选自细菌、酵母、真菌和哺乳动物。“宿主生物”是指非人的生物。因此,根据SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的肽可以从表达它们的经转化的宿主生物中产生,随后进行分离或纯 化。优选地,根据SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的肽从乳的酪蛋白,更优选地从α sl 酪蛋白获得。所使用的酪蛋白优选地是牛奶的酪蛋白,和更优选地是奶牛(家牛(Bos taurus))奶的酪蛋白。asl酪蛋白的序列以编号P(^662提供在Swiss 数据库中。在 乳的蛋白质的分级分离后,用合适的酶“消化”或水解酪蛋白以获得根据本发明的肽。在第 一个实施方案中,用酶直接水解乳的酪蛋白以获得所希望的肽。在该实施方案中,可能需要 在水解后部分地或完全地纯化根据SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的肽。在根据本发明的第 二个实施方案中,直接对于a sl酪蛋白进行酶促水解。在该实施方案中,所获得的水解物将 会已经富含根据SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的肽,并且额外的纯化步骤常常不是必需的。 本领域技术人员将会选择合适的酶来获得所希望的肽。这些技术是本领域技术人员众所周 知的,并且描述在文献中。因此,本发明的目标还在于酪蛋白的水解物,其包含根据SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的肽。优选地,它是a sl酪蛋白的水解物。根据本发明的药物组合物和食品具有苯二氮杂萆类型的活性,尤其是抗焦虑效应。本发明涉及具有苯二氮杂萆类型的活性的药物组合物,其尤其用于治疗焦虑、睡 眠障碍、癫痫。因此,本发明还涉及药物组合物,其包含作为活性成分的有效量的根据SEQ ID No. 1的肽和/或根据SEQ ID No. 2的肽,以及与之相联合的合适的药物学载体。可以将这些组合物配制用于给哺乳动物(其中包括人)施用。施用剂量根据所述 治疗和根据所涉及的病患而变化。产生这些组合物,以便可以通过消化途径或肠胃外途径 进行施用。
在用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、透皮、局部或直肠施用的本发明的药物细 合物中,活性成分可以与常规的药物学支持物相混合地,以单一施用形式施用给动物或人 类。合适的单一施用形式包括通过口服途径的形式(例如片剂、明胶胶囊(g6lule)、粉剂、 颗粒剂和口服溶液或悬浮液),舌下和颊施用形式,皮下、肌内、静脉内、鼻内或眼内施用形 式,和直肠施用形式。当制备以片剂形式的固体组合物时,将主要活性成分与药物学载体例如明胶、淀 粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石、阿拉伯胶或类似物相混合。可以用蔗糖或其他合适的材料包覆片 剂,或者还可以处理片剂从而使得它们具有延长或延迟的活性,并且它们连续地释放预定 量的活性成分。通过将活性成分与稀释剂相混合并且将所获得的混合物灌入软或硬明胶胶囊中 来获得明胶胶囊形式的制剂。糖浆剂或酏剂形式的制剂可以包含活性成分,以及与之相联合的甜味剂,防腐剂, 及提供味道的试剂和合适的着色剂。在水中可分散的粉剂或颗粒剂可以包含活性成分,以及与之相混合的分散剂或润 湿剂,或悬浮剂,及味道矫正剂或甜味剂。根据本发明的组合物可以单独地,或者与至少一种其他活性试剂相联合地在治疗 中使用。特别地,这些其他活性试剂选自对于治疗焦虑、睡眠障碍和癫痫来说合适的活性物 质。其可以是使得能够改善根据本发明的化合物的活性的辅助剂,或者因其在所述病患的 治疗中的使用而知晓的其他活性物质。此类活性试剂是本领域技术人员众所周知的,商购 可得的,或者描述在参考书例如每年重新出版的Le Dictionnaire Vidal中。因此,本发明还涉及药物组合物,其包含根据SEQ ID No. 1的肽和/或根据SEQ ID No. 2的肽以及其他活性试剂,以作为用于在治疗中,特别地在治疗焦虑和睡眠障碍中同时、 分开或在时间上错开使用的联合产品(produit de combinaison)。特别地,这些其他活性 试剂选自对于治疗焦虑来说合适的活性物质,例如苯二氮杂革类别的化合物或者5-羟色 胺再摄取的抑制剂。本发明还涉及根据SEQ ID No. 1的肽、根据SEQ ID No. 2的肽、根据本发明的多核 苷酸、根据本发明的表达载体和/或根据本发明的宿主生物在制备用于治疗焦虑、睡眠障 碍和癫痫的药物中的用途。优选地,本发明涉及酪蛋白或α sl酪蛋白的水解物和/或酪蛋白或Cisl酪蛋白的 水解物级分在制备用于治疗焦虑、睡眠障碍和癫痫的药物中的用途,所述水解物和所述水 解物级分包含有效量的根据SEQ ID No. 1的肽和/或根据SEQ ID No. 2的肽。本发明还涉及焦虑、睡眠障碍和癫痫的治疗性治疗的方法,所述方法包括给个体 施用有效量的根据SEQ ID No. 1的肽、根据SEQ ID No. 2的肽、根据本发明的多核苷酸、根 据本发明的表达载体和/或根据本发明的宿主生物。本发明还涉及焦虑、睡眠障碍和癫痫的治疗性治疗的方法,所述方法包括给个体 施用酪蛋白或α sl酪蛋白的水解物和/或酪蛋白或Cisl酪蛋白的水解物级分,其包含有效 量的根据SEQ ID No. 1的肽和/或根据SEQ ID No. 2的肽。本发明的另一个目标为根据SEQ ID No. 1的肽、根据SEQ ID No. 2的肽、根据本发 明的多核苷酸、根据本发明的表达载体和/或根据本发明的宿主生物在制备用于尤其易患焦虑、睡眠障碍和/或癫痫的人的食品中的用途。优选地,本发明的目标在于酪蛋白或α sl酪蛋白的水解物和/或酪蛋白或Cisl酪 蛋白的水解物级分在制备用于尤其易患焦虑、睡眠障碍和/或癫痫的人的食品中的用途, 所述水解物和所述水解物级分包含有效量的根据SEQ ID No. 1的肽和/或根据SEQ ID No. 2 的肽。“食品”是指任何适宜于用作食物的物料。可以将SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的 肽在与蛋白质、糖类或脂质性质的食品支持物相联合的食品中,或者在用于特殊膳食的食 品中用作活性成分。本发明的食品还可以以食品补充剂的形式存在。这些食品补充剂适合 于补充尤其易患焦虑、睡眠障碍和癫痫的人的膳食。本发明还涉及获得SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的肽的方法。根据众所周知的方 法,通过酸沉淀和用碱进行中和而从乳中获得完整的酪蛋白。例如,可以采用NITSCHMANN 和LEHMANN(ll)的方法。用作用于获得根据SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的肽的起始产 品的酪蛋白和α sl酪蛋白可以通过本领域技术人员众所周知的常规方法从乳、完整的酪蛋 白、酪蛋白酸盐和乳总蛋白质浓缩物开始来获得,例如根据由TH0MS0N(12)和MAUB0IS(13) 所描述的方法来获得。例如,可以通过采用由SANOGO等人(14)所描述的方法来制备Cisl 酪蛋白。该方法是通过使用氯化钙的不连续梯度作为洗脱剂在DEAE-纤维素上进行分级分 离的方法。该方法具有快速分离开全体酪蛋白的优点。有利地,可以使用DEAE-纤维素DE 52 [由WHATMAN Ltd, Springfeld, Grande-Bretagne进行销售]作为阴离子交换支持物来 施行该方法,所述DEAE-纤维素DE 52是在其第一次使用之前不需要任何酸_碱预循环的 经预调节的树脂。然后,可以通过用合适的酶水解酪蛋白来获得所述肽。然后,可以通过反 相高效液相色谱(HPLC),通过阴离子交换高效液相色谱,或通过阈值为1,OOODa的凝胶过 滤色谱,或者通过膜离心和其他膜分离技术(微量过滤、超滤,等等)来浓缩或分离所述肽。因此,本发明的另一个目标为制备具有苯二氮杂革类型的活性,尤其是抗焦虑活 性的肽的方法,其特征在于,所述方法包括下列步骤-酶促水解酪蛋白;-分离选自具有SEQID No. 1和2的肽中的至少一种肽。“分离”是指所述肽的部分或完全的纯化,或者仅仅是指使所获得的水解物富集根 据SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的肽。所述富集例如可以通过所获得的水解物的分级分离 来进行。备选地,可以将包含至少一种根据SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的肽的从α sl酪 蛋白开始获得的水解物直接用于获得根据本发明的药物组合物和食品。还可以根据本领域技术人员众所周知的方法,例如由MERIFFIELD(15)所描述的 那些方法,通过肽合成来获得所述肽。现在,将通过下面的非限制性实施例来更详细地描述本发明。MM图 1 高架十字形迷宫(labyrinthe en croix sureleve)测试图2 :明 / 暗箱(boite claire/obscure)测试
实施例1.获得五肽的方式
根据众所周知的方法,通过酸沉淀和用碱进行中和而从乳中获得完整的酪蛋白。分子量为627Da的具有下述氨基酸序列的五肽相应于α sl酪蛋白的肽91_95 Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu0它可以通过酶促水解从α sl酪蛋白获得,特别是使用胰蛋白酶和随 后使用胃蛋白酶。通过胰蛋白酶对α sl酪蛋白进行的水解释放出各种不同的肽片段。在对 于酶活性来说最佳的酸性PH下、在对于酶活性来说最佳的缓冲液中和在对于酶活性来说 最佳的温度下,以E/S = 1/200的比例,使所有胰蛋白酶消化片段经历通过胃蛋白酶A(EC 3. 4. 23. 1)(来源于猪胃粘膜,具有3,200-4, 500个单位/mg蛋白质的活性)的水解240分 钟。该后一种水解释放出新的片段,其中包括α sl酪蛋白的五肽91-95。该五肽还可以通 过使用Corolase PP ‘ (一种胰酶的混合物)进行水解而从α sl酪蛋白的胰蛋白酶消化 片段来产生。该水解在对于该酶混合物来说最佳的PH、温度下和在对于该酶混合物来说最 佳的缓冲液中,以E/S = 1/100的比例进行240分钟。然后,可以通过反相高效液相色谱 (HPLC),通过阴离子交换高效液相色谱,或通过凝胶过滤色谱,或者通过膜离心和其他膜分 离技术(微量过滤、超滤,等等)来浓缩或分离所述五肽。2.在Wistar大鼠中的药物-行为研究2. 1.高架十字形迷宫2. 1. 1.原理高架十字形迷宫测试使得能够测量在新的厌恶性情境中探索行为的密度[PELL0W 等人,1985(16)]。该实验利用在啮齿动物中对于开放空间的恐惧与探索新环境的欲望之间 的冲突。放置在装置中央处的大鼠被强迫探索其环境。开放臂构成引起焦虑的环境,而封 闭臂则不是这种情况。进入所有臂中的次数、进入开放臂中的次数、进入封闭臂中的次数、 在开放臂中度过的时间、进入第一个开放臂的潜伏时间构成了反映动物焦虑程度的参数。2. 1. 2.设备木制的高架十字形迷宫由互成90°的四个分枝构成。将两个开放的分枝 (45x10cm)和两个封闭的分枝G^clOcm;在40cm的高度上用木板围住)面对面地布置。中 央方格的尺寸为10x10cm。用强度为500勒克司的白光对开放的分枝进行照明。高架十字 形迷宫位于离地面50cm处。2. 1. 3.实验方案在早晨9点和11点之间进行观察,以使昼夜节律的影响最小化。在每次在高架十 字形迷宫中逗留之前,将动物置于旷野中10分钟以便刺激其探索行为。然后,将它置于高 架十字形迷宫的中央方格中,并观察5分钟。在两次逗留之间用95% (ν/ν)的乙醇洗涤十 字形迷宫以去除气味。2. 1. 4.处理该研究针对分配成三组的45只大鼠-接受2mL/kg的含有(ν/ν)甘油和0.2%(ν/ν)甲基纤维素的溶液(载体) 的对照组(15只大鼠),-以lmg/kg的剂量用悬浮在所述载体中的地西泮(Valiumι , Roche, Neuilly-sur-Seine, France)处理的组(15只大鼠),其用作阳性对照,-以0.5mg/kg的剂量用事先溶解在所述载体中的α sl酪蛋白地片段91_95处理 的组(15只大鼠)。
在旷野中逗留之前半小时,动物通过腹膜内途径接受其各自的处理。2. 1. 5 结果通过非参数方差分析(KruskalI-WalIis)研究了在Wistar大鼠中腹膜内注射 2mL/kg的含有1% (ν/ν)甘油和0. 2% (ν/ν)甲基纤维素的溶液(n = 15)或者lmg/kg的 地西泮(n = 15)或者0. 5mg/kg的五肽CNα sl-f (91-95) (η = 15)对于⑴进入不同臂 中的总次数,(ii)进入开放臂中的次数,(iii)在开放臂中度过的时间的影响,并且通过 Marm-Whitney检验进行了平均值的比较(A,B 对于每种处理而言显著不同的(ρ < 0. 05) 平均值;

图1)。由进入所有臂中的次数所反映的动物的探索活动性并不根据处理而显著不 同。用载体处理的动物的进入开放臂中的次数和在开放臂中度过的时间显著少于用地西 泮处理的动物和用α sl酪蛋白的片段91-95处理的动物。在地西泮和Cisl酪蛋白的片段 91-95之间没有发现任何显著的差异。在Wistar大鼠中的高架十字形迷宫测试之中,α sl 酪蛋白的片段91-95具有与地西泮所起的作用相似的作用,即增加了对于引起焦虑的区域 的探索。2. 2.明 / 暗箱2. 2. 1.原理明/暗测试基于啮齿动物所固有的对于经强烈照明的环境的厌恶,以及它们作为 对于轻微应激因素例如新环境和光线的应答而产生的自发探索行为。明/暗箱装置使得能 够研究在非厌恶性(昏暗的)隔间中适应(所述隔间因而成为熟悉的)之后,啮啮动物面 对不熟悉的厌恶性隔间(用白光强烈照明)的探索行为[B0URIN和HASC0ET,2003(17)]。 通过使用该装置可以检测典型的抗焦虑剂。2. 2. 2.设备和实验方案明/暗箱的尺寸为6^c49X35cm(hXLXl),并用一块开凿有三个8x8cm的门的板隔 离成两个相同的隔间。地面覆盖有锯末。将每只大鼠放置在所述箱的后部隔间中M小时, 其中与前部隔间相联系的门是不可进入的。因此,该后部隔间成为熟悉的隔间。动物随意 地取食和饮水。在测试的那天,在处理后,将大鼠重新放置在熟悉的隔间中,并且使与前部 隔间(不熟悉的)相联系的门成为可进入的,以便动物可以自由地探索环境。通过用强度 为1500勒克司的白光进行照明而使不熟悉的隔间变成厌恶性的。观察动物10分钟,并测 量在每个隔间中度过的时间。2. 2. 3.处理该研究针对分配成三组的36只大鼠-接受2mL/kg的含有(ν/ν)甘油和0.2%(ν/ν)甲基纤维素的溶液(载体) 的对照组(12只大鼠),-以lmg/kg的剂量用悬浮在所述载体中的地西泮(ValiumRoche, Neuilly-sur-Seine, France)处理的组(12只大鼠),其用作阳性对照,-以0.5mg/kg的剂量用事先溶解在所述载体中的α sl酪蛋白地片段91_95处理 的组(12只大鼠)。在打开熟悉的隔间与不熟悉的隔间之间的联系之前半小时,动物通过腹膜内途径 接受其各自的处理。2. 2. 4 结果
通过非参数方差分析(KruskalI-WalIis)研究了在Wistar大鼠中腹膜内注射 2mL/kg的含有1% (ν/ν)甘油和0. 2% (ν/ν)甲基纤维素的溶液(n = 12)或者lmg/kg的 地西泮(n = 12)或者0. 5mg/kg的五肽CN α sl-f (91-95) (η = 12)对于⑴进入不熟悉的 隔间中的次数,(ii)在熟悉的隔间中度过的时间,和(iii)在不熟悉的隔间中度过的时间 的影响,并且通过Marm-Whitney检验进行了平均值的比较(A,B 对于每种处理而言显著不 同的(ρ < 0. 05)平均值;图2)。用载体处理的动物的在不熟悉的厌恶性隔间中度过的时 间显著少于用地西泮处理的动物和用α sl酪蛋白的片段91-95处理的动物。同时,用载体 处理的动物的在熟悉的隔间中度过的时间显著增加。在地西泮和α sl酪蛋白的片段91-95 之间没有发现任何显著的差异。在Wistar大鼠中的明/暗箱测试之中,Cisl酪蛋白的片段 91-95显示出与地西泮的那种作用相似的抗焦虑类型的作用。参考文献(l)MERCIER, J. C.,GR0SCLAUDE, F.禾口 RIBADEAU-DUMAS,B.,1971,Structure primaire de la caseine α sl bovine. Sequence complete. Eur. J. Biochem. , 23,41-51.(2)NAGAO, M.,MAKI, Μ.,SASAKI, R.和 CHIBA,H.,1984,Isolation and sequence analysis of bovine α sl-casein cDNA clone. Agric. Biol. Chem. , 48,1663-1667.(3) Z10UDR0U, C.,STREATY, R. Α.和 KLEE, W. Α.,1979,Opioid peptides derived from food proteins :the exorophins. J. Biol. Chem. ,254,2446-2449.(4) LOUKAS, S.,VAR0UCHA, D.,Z10UDR0U, C.,STREATY, R. Α.禾口 KLEE,W. A.,1983, Opioid activities and structure of α -casein-derived exorphins. Biochemistry, 22,4567-4573.(5)MARUYAMA, S.禾口 SUZUKI,H.,1982,A peptide inhibitor of angiotensin I converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein. Agric. Biol. Chem. ,46, 1393-1394.(6)MARUYAMA, S.,MITACHI, H.,AffAYA, J.,KUR0N0, Μ.,TOMIZUKA, N.禾口 SUZUKI, H. , 1987, Angiotensin I—converting enzyme inhibitory activity of the C—terminal hexapeptide of α sl-casein. Agric. Biol. Chem. , 51, 2557-2561.(7)MICL0, L.,PERRIN, Ε.,DRIOU,Α.,B0UDIER, J. -F.,IUNG,C.和 LINDEN G., 1995, Utilisation d ‘ un decapeptide activitede type benzodiazepine pour la preparation de medicaments ed de complements alimentaires.欧沙专禾[!号 EP 0714910A1.(8)MICL0, L.,PERRIN, Ε. DRI0U, Α.,PAPD0P0UL0S, V.,B0UJRAD, N., VANDERESSE, R.,B0UDIER, J. -F.,DES0R, D.,LINDEN, G.和 GAILLARD,J. -L.,2001, Characterization of α -casozepine,a tryptic peptide from bovine α sl-casein with benzodiaz印ine-like activity. FASEB J. (June 8,2001) 10. 1096/fj. 00-0685fje.(9)LEC0UVEY, M.,FR0CH0T, C.,MICL0, L.,ORLEffSKI, P.,DRI0U, Α.,LINDEN, Α., GAILLARD, J. -L.,MARRAUD, Μ.,CUNG, Μ. -Τ.和 VANDERESSE R.,1997,Two dimensional 1H-NMR and CD structural analysis in a micellar medium of a bovine α Sl-casein fragment having benzodiazepine-like properties. Eur. J. Biochem. ,248,872-878.(10)FR0CH0T, C. 1998, Etude d ' un decapeptide aactivitede typebenzodiazepine issu d ‘ une prteine du Iait bovin. These de 1 ‘ Institut Polytechnique de Lorraine (INPL).(ll)NITSCHMANN, H. S.和 LEHMANN,W.,1947,Zum Problem der Labwirkung auf Casein, Helv. Chim. Acta,130,804.(12)THOMSON, A. R. ,1984, Recent developments in protein recovery and purification. J. Chem. Tech. Biotechnol. ,34B,190-198.(13)MAUB0IS, J.L. ,1984. Separation, extraction and fractionation of milk protein components. Lait,64,485-495.(14)SAN0G0, T. , PAQUET, D. , AUBERT, F.和 LINDEN, G. ,1989, Purification of α Sl-casein by Fast Protein Liquid Chromatography. J. Dairy Sci,72,2242-2246.(15)MERRIFIELD, R.B.,1963,Solid phase peptide synthesis. I. Synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc, 85, 2149-2154.(16)PELL0ff,S. ,CHOPIN,P. ,FILE, S. E.和BRILEY,M.,1985,Validation of open closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J. Neurosci. Methods,14,149-167.(17)B0URIN, M.和 HASC0ET,M.,2003,The mousw light/dark box test. Eur. J. Pharmacol. , 463, 55-65.(18) GUESD0N φ A, 2006, A typtic hydrolysate from bovine milk alpha Sl—caein improves sleep in rats subjected to chronic mild stress,27 :6, 1476-1482.
权利要求
1.用于治疗焦虑、睡眠障碍和癫痫的组合物,其特征在于,所述组合物包含有效量的根 据SEQ ID No. 1的肽和/或根据SEQ ID No. 2的肽作为活性成分。
2.根据权利要求1的组合物,其特征在于,所述组合物包含酪蛋白或asl酪蛋白的水 解物或水解物级分,所述水解物和所述水解物级分包含有效量的根据SEQ ID No. 1的肽和 /或根据SEQ ID No. 2的肽。
3.根据前述权利要求之一的组合物,其特征在于,所述组合物包含合适的药物学载体。
4.根据权利要求1-2之一的组合物,其特征在于,所述组合物为食品。
5.根据SEQID No. 1的肽和/或根据SEQ ID No. 2的肽在制备用于治疗焦虑、睡眠障 碍和癫痫的药物中的用途。
6.酪蛋白或asl酪蛋白的水解物和/或酪蛋白或Cisl酪蛋白的水解物级分在制备用 于治疗焦虑、睡眠障碍和癫痫的药物中的用途,所述水解物和所述水解物级分包含有效量 的根据SEQ ID No. 1的肽和/或根据SEQ ID No. 2的肽。
7.用于尤其易患焦虑、睡眠障碍和/或癫痫的人的食品,其特征在于,所述食品包含有 效量的至少一种根据SEQ ID No. 1和/或SEQ ID No. 2的肽。
8.根据权利要求7的食品,其特征在于,所述食品包含酪蛋白或Cisl酪蛋白的水解物 或水解物级分,所述水解物和所述水解物级分包含有效量的根据SEQ ID No. 1的肽和/或 根据SEQ ID No. 2的肽。
9.分离的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸编码根据SEQID No. 1的肽或根据SEQ ID No. 2 的肽。
10.表达载体,其特征在于,所述表达载体包含根据权利要求9的多核苷酸。
11.不包括人在内的宿主生物,其特征在于,用根据权利要求9的多核苷酸和/或用根 据权利要求10的表达载体转化所述宿主生物。
12.不包括人在内的经转化的宿主生物,其特征在于,所述宿主生物表达根据SEQID No. 1的肽或根据SEQ ID No. 2的肽。
全文摘要
药物组合物和食品,其包含具有苯二氮杂类型的活性,尤其是抗焦虑活性的源自乳的αs1酪蛋白的肽。
文档编号A61K38/01GK102083453SQ200980120762
公开日2011年6月1日 申请日期2009年6月5日 优先权日2008年6月6日
发明者F·巴朗德拉, F·洛朗, J-L·加亚尔, L·米克洛, Y·勒鲁 申请人:亨利·波安加乐-南锡第一大学, 洛林国立高等理工学院
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