专利名称：保护正常细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学、药理学和医学领域。更具体地，本发明涉及通过减少对细胞 和组织的氧化性损伤来促进健康和延长寿命的方法和组合物。
背景技术：
氧广泛地参与正常的代谢反应，并且对于所有需氧生物，包括人类，是必不可少 的。活性氧化物(R0Q，例如过氧化物，是进入呼吸链的氧发生不完全还原反应所大量形成 的副产物。超氧化物是其它损伤性氧化物，包括过氧化氢、次氯酸根离子和羟基自由基的前 体。细胞(例如吞噬细胞)中的氧化酶和一氧化氮合成酶是ROS的其它来源。在正常生理状态下ROS的存在水平较低，但是过量的ROS例如会氧化细胞大分子 如核酸、脂质和蛋白质，对细胞和组织造成氧化性损伤。通过这种方式对细胞的累积损伤可 导致病状。并不奇怪的是，氧化性损伤已经显示与多种疾病和病症有关，包括慢性阻塞性肺 部疾病如，吸烟者的肺气肿、再灌注损伤、神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病 和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、心脏病发作、中风、多种自身免疫性疾病以及衰老。对于后者，经推测对细胞大分子的氧化性损伤会加速衰老和缩短寿命。例如，已经 观察到蛋白质中氧化蛋氨酸的水平随着动物年龄的增加而增加。此外，果蝇中过氧化物歧 化酶和过氧化氢酶表达过度，对ROS有较高的耐受性，这与寿命的延长相关，而且中断过氧 化物歧化酶和过氧化氢酶的遗传则与寿命的缩短有关。细胞经过进化，自身具有中和ROS的抗氧化酶系统(例如，过氧化物歧化酶、过氧 化氢酶和过氧化物酶)，但是该系统并不能在理想水平起作用，以将衰老速率和疾病的发生 降至最低水平。因此，明显需要非天然组合物和方法以阻止或者降低对细胞的氧化性损伤。 一种增强细胞抗氧化剂活性的方法是给细胞提供直接清除ROS的组合物，如维生素C、E和 A、谷胱甘肽、泛醌、尿酸、类胡萝卜素等。然而，这种常规抗氧化性化合物在中和一种或者两 种ROS分子后就失活了。因此它们由于能清除的ROS的量相对较小而受到了限制。发明概述本发明涉及保护正常细胞免受环境因素(例如紫外线照射)或者体内和细胞内因 素(例如氧化性损伤)的损伤。保护正常细胞的组合物包括舒林酸、舒林酸R差向异构体、 舒林酸S差向异构体及其混合物。在优选实施例中，保护受试者正常细胞免受损伤的方法，包括提供含有舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体、衍生物、代谢物及其结构类似物的组合物，所 述舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体、衍生物、代谢物及其结构类似物的 浓度为至少约0.010% (w/w)；使用治疗有效剂量的所述舒林酸与至少一种活细胞接触；以 及保护受试者正常细胞免受损伤。在另一优选实施例中，舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体、衍生 物、代谢物及其结构类似物的浓度范围在约0. 001%到100% (w/w)。在又一优选实施例中，含有舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体、 衍生物、代谢物及其结构类似物的组合物通过全身、腹腔内、静脉内、皮下、肌内和局部给药。在另一优选实施例中，组合物包含舒林酸、舒林酸衍生物、代谢物及其结构类似 物。在另一优选实施例中，组合物包含舒林酸R-差向异构体、衍生物、代谢物及其结 构类似物。在另一优选实施例中，组合物包含舒林酸S-差向异构体、衍生物、代谢物及其结 构类似物。在另一优选实施例中，组合物含有一种或多种舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒 林酸S-差向异构体、衍生物、代谢物及其结构类似物。在另一优选实施例中，组合物含有不同比例的舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒 林酸S-差向异构体、衍生物、代谢物及其结构类似物。在另一优选实施例中，舒林酸舒林酸R-差向异构体舒林酸S-差向异构体的 比例为从约0到1000。在另一优选实施例中，组合物保护正常细胞免受包括坏境损伤、疾病、生物或太阳 光线的损伤。在另一优选实施例中，组合物保护正常细胞免受氧化性损伤。定义根据本发明和本文中的使用，除非另有明确规定，以下术语定义为如下含义。当用于本文时，“一”、“一种”和“这”包含复数涵义，除非上下文另有明确说明。当用于本文时，术语“蛋氨酸部分”和“蛋氨酸类似物”包括本文说明的蛋氨酸通 式1中所包括的所有结构，包括硒蛋氨酸衍生物。当用于本文时，术语“催化抗氧化剂”指被氧化剂(例如ROQ氧化后可被酶再生 的非天然(或纯化的，天然存在的)抗氧化剂化合物，因此每个当量的抗氧化剂化合物可清 除多于一个当量的氧化剂。当用于本文时，“保护”正常细胞指细胞可能承受的任何损伤，尤其是环境因素， 例如太阳光、致癌物导致的氧化性损伤；疾病，例如神经疾病、癌症；药物，如阿霉素和三氧 化二砷；生物体引起的疾病，如病毒、细菌等。在一实施例中，“损伤”指氧化性损伤。保护 正常细胞免受氧化性损伤包括避免、抑制、减少对细胞造成损伤的氧化反应中间体。当用于本文时，“癌症”指见于哺乳动物中的各种癌症或者肿瘤或者恶性肿瘤，包 括但不限于白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、癌和肉瘤。癌症的实例有脑癌、乳腺癌、胰腺癌、宫 颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤癌、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤癌、胃癌、子宫癌和成神经管细胞瘤癌。本文中使用的术语“肿瘤”和“肿瘤细胞”指细胞或者细 胞的聚集体，其特征在于细胞生长不受控制、进行性生长和分化，或者由于细胞生长不受控 制、进行性生长和分化而形成。这些细胞一般对宿主生物体有害。肿瘤细胞可位于体内，尤 其是人类，但是也包括其它动物。肿瘤细胞也可位于体外，并且可根据本发明的方法，使用 本发明的组合物进行治疗，例如用于研究和/或药物开发。对肿瘤细胞抑制包括抑制这种 细胞的生长、抑制生理过程、抑制转移，优选包括杀死该种细胞。“症断”意为对病理状态的存在或性质的确认。诊断方法的敏感性和特异性各异。 诊断方法的“敏感性”指测试为阳性的患病个体百分数(“真阳性”的百分数)。未被诊断 方法检出的患病个体为“假阴性”。没有患病的受试者和诊断方法检测为阴性的受试者，定 义为“真阴性”。诊断方法的“特异性”是指1减去假阳性率，“假阳性”率定义为未患病的 受试者但检测为阳性的比例。虽然特定的诊断方法可能不能提供疾病状态的明确诊断，如 果该方法提供了有助于诊断的阳性指示，其也足以成为诊断方法。本文所使用的术语“患者”、“受试者”或者“个体”可互换，是指的正常细胞受到保 护免受损伤的哺乳动物、动物、禽或爬行动物受试者，优选人类受试者。在一些情况下，本发 明方法可应用于试验动物、兽医应用以及疾病动物模型的开发，包括但不限于，啮齿类包括 小鼠、大鼠和仓鼠；和灵长类动物。“治疗”是出于阻止病症的发展或改变疾病的病理或者症状的意图而实施的干预。 因此，“治疗”既指治疗性治疗，也指预防性措施。“治疗”也可特指舒缓护理。需要治疗受 试者包括已经患病的和需要预防疾病的受试者。在肿瘤(例如，癌症)的治疗中，治疗试剂 可直接降低肿瘤细胞的病理学，或者使得肿瘤细胞对其它治疗试剂更敏感，例如，放射疗法 和/或者化学疗法。本文所定义的“微球”或者“微粒”，包括直径约1毫米到约1微米或者更小的生物 相容的固相材料，其中微粒可包含生物活性试剂，并且其中固相材料可延缓包含舒林酸、舒 林酸R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体、衍生物、变体、结构类似物及其混合物的组合物 从微球中释放。微球可以是球形、非球形或不规则形。典型的微球通常为球形。本文所定义的“生物相容性”材料，指材料和该材料的任何降解产物对受试者无毒 并且对受试者的身体无显著毒性或者不良反应。本文所使用的术语“持续释放”(例如缓释和/或控释)指给予受试者包含有效 量的舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体、衍生物、变体、结构类似物及其 混合物的组合物后，在预定时间内持续释放一种或多种舒林酸组分(例如，舒林酸、舒林酸 R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体、衍生物、变体、结构类似物及其混合物)的流，并且在 整个预定时间期间其水平足以达到需要的效果(例如，保护细胞或者整个动物免受太阳光 损伤)。关于持续释放，其意欲包括组合物、或基质、或其组分生物降解导致的释放，或添加 的营养成分或者其它需要的成分的代谢转换或溶解导致的释放。除非另有规定，本文使用的所有的技术术语具有与本发明所属领域普通技术人员 通常理解的含义相同。尽管与本文所述的方法和材料相似或者等同的方法和材料可应用于本发明的实 施和检验，合适的方法和材料的描述见下文。以下讨论的具体实施例仅为说明而非限定。本 文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容均以引用的方式并入本文。如有冲突，以本说明书，包括定义为准。
图1为根据本发明具体实施方式
的催化抗氧化作用机理的示意图。图2为根据本发明具体实施方式
，在MsrA酶的催化下舒林酸的催化抗氧化活性循 环示意图。图3A和;3B为根据本发明具体实施方式
，在MsrA酶作用下产生舒林酸硫化物的两 个动力学图。图4A和4B为根据本发明具体实施方式
，舒林酸的蛋氨酸衍生物(化合物加和 3a)的化学合成路线示意图。图5A和5B为根据本发明具体实施方式
，舒林酸蛋氨酸衍生物(化合物如和5a) 的化学合成路线示意图。图6A和6B为根据本发明具体实施方式
，基于水杨酸和甲芬那酸(分别为化合物 6a和7a)制备催化抗氧化剂的化学合成路线示意图。图7A-C为根据本发明具体实施方式
，基于布洛芬、茚甲新和Vioxx (分别为化 合物8a、9a和IOa)制备催化抗氧化剂的化学合成路线示意图。图8显示了本发明化合物加的NMR谱图。图9是TLC板的显微照片，显示了舒林酸⑶和舒林酸蛋氨酸亚砜(SMO)在经MsrA 和MsrB酶的孵育后的还原产物的存在。结果表明S为MsrA的底物，SMO为MsrA和MsrB两 者的底物。图10为显示了暴露在由百草枯诱导的氧化应激中，经舒林酸处理的蝇的存活率 的增加的图表。图11为显示了患有神经变性疾病的过度表达突变超氧化物歧化酶的G93A转基因 小鼠经舒林酸处理后存活率增加的图表。图12为显示了经舒林酸治疗后G93A转基因小鼠的运动行为增加的图表。图13显示了 G93A小鼠的脊髓部分神经细胞数目的图表。接受舒林酸的动物的神 经细胞存活率明显较高。图14为舒林酸及其代谢物结构的示意图。舒林酸指舒林酸亚砜R-和S-差向异 构体的混合物。理论上，舒林酸亚砜R-差向异构体和舒林酸亚砜S-差向异构体都可被氧 化形成舒林酸砜或还原形成舒林酸硫化物。图15为使用手性柱分离舒林酸R-和S-差向异构体的色谱图。舒林酸(7mg/ml) 溶解于含有0.1%的醋酸的己烷/乙醇(65/35)的混合溶液中，手性柱上样75 μ 1该混合 液。使用以上混合溶剂洗色谱柱，流速为1. 5ml/min,以300 μ 1的级分收集。舒林酸洗脱后 在256nm下检测吸光度。洗脱后22. 5和观分钟观察到两个峰(0D 256)。R-构型先洗脱 (22. 5min) S-构型后洗脱(28min)。图16为心肌细胞中舒林酸R-和S-差向异构体代谢转换成硫化物的图表。IO6细 胞与400 μ M舒林酸R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体或R和S差向异构体混合物一起 培养产生的舒林酸硫化物的量随培养时间进行了测量。使用HPLC分离细胞裂解物进行分 析，使用C18柱，50/50% 50mM的醋酸钠(pH为4. 73)和乙腈为流动相。在330nm下测定吸光度。图17为显示了经500Mm舒林酸S-构型(舒林酸S-差向异构体)处理后暴露在 叔丁基过氧化氢(TBHP)中正常肺细胞存活率的图表。图18为显示了经500Mm舒林酸R-构型(舒林酸R-差向异构体)处理后暴露在 叔丁基过氧化氢(TBHP)中正常肺细胞存活率的图表。图19为显示了 Langendorff型心脏缺血/再灌注后，体内给药舒林酸R-差向异 构体减少LDH释放的图表。
具体实施例方式本发明包括与保护正常细胞免受多种因素导致氧化性损伤的组合物和方法，例如 暴露在阳光下、紫外辐射；体内因素造成的损伤，例如任何疾病造成的氧化性损伤。以下描述的优选实施例说明了本发明的不同组合物和方法。尽管如此，从对这些 实施例的描述，基于以下所提供的这些实施例，可以作出和/或实施本发明的其它方面。生物学方法本文所述的方法涉及传统化学、细胞生物学和分子生物学技术。这些技术已 为本领域熟知，并在方法学专著中有详细描述，例如Classics in Total Synthesis. Targets, Strategies, Methods, K. C. Nicolaou and E. J. Sorensen, VCH, New York,1996 ； 禾口 The Logic of Chemical Synthesis, E. J. Coney and Xue-Min Cheng, Wiley&Sons NY, 1989 ；分子生物学和细胞生物学方法在以下专著中有说明，例如=M0Iecular Cloning A Laboratory Manual,3rd ed. , vol. 1-3 ；ed.Sambrook et al. . Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N. Y. ,2001 ；禾口Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York, 1992 ；ed. Ausubel et al.，(定期更新).催化抗氧化剂本发明提供至少含有1个(例如，1，2，3或更多)甲基亚砜或者甲硫基团的小分 子，这些分子可进入细胞，并通过催化抗氧化机理防止氧化性损伤。化合物中的甲硫基团与 ROS反应，形成甲基亚砜。含有甲基亚砜基团的化合物，随后又作为Msr酶和/或其它酶的 底物被还原，并由此恢复其抗氧化性质。这些化合物可给药至细胞或者动物以减少ROS造 成的细胞损伤。参照图1，这些化合物1)由于它们结构中的活性基团可破坏ROS或与ROS反应， 用作ROS清除剂(抗氧化剂)，和2、作为催化抗氧化剂，将氧化的化合物还原成非氧化的 形式，从而能与ROS进一步反应。本发明中的抗氧化剂化合物的催化性能是由于其能够作 为Msr酶和/或其它能使亚砜基团还原成硫基团的酶的底物。这些酶识别的核心官能团是 甲基亚砜基团。就含有N-蛋氨酸的肽和蛋白质底物来说，这些官能团包含于氨基酸蛋氨酸 中。含有甲基亚砜或者甲硫官能团的任何化合物都可使用，这些化合物可作为可将亚 砜基还原成硫基的Msr酶和/或其它酶的底物。非留体抗炎药和COX抑制剂舒林酸，是用 作Msr酶底物的含有甲基亚砜基团的化合物的一个实例。舒林酸是前体药，仅在分子中甲 基亚砜基团被还原成硫基团时才具有COX抑制剂活性。在此之前，人们均不知舒林酸可作为Msr酶的底物。图2显示了在Msr酶的催化作用下舒林酸被还原成舒林酸硫化物。如以 下所描述，测试显示舒林酸是在细菌(E. coli)中鉴别的Msr酶家族中6个已知的成员的底 物，也是哺乳动物(牛)组织中的Msr酶的底物。已经显示MsrA酶和细菌的膜相关的Msr 酶能够将舒林酸还原成活性硫化物。在哺乳动物组织中，舒林酸的还原主要归因于MsrA酶 的活性。如下文中进一步描述，给药舒林酸⑴保护果蝇免受百草枯诱导生成ROS的损伤， (2)延长由氧化性损伤导致的神经变性疾病的小鼠的脊髓运动神经元的存活时间，和(3) 延长上述小鼠的寿命。基于蛋氨酸的催化抗氧化剂在一方面，本发明提供了含有蛋氨酸部分或蛋氨酸类似物的催化抗氧化化合物。 这些化合物可作为为识别蛋氨酸中甲基亚砜官能团的Msr酶(例如，MsrA和MsrB)的底物， 和/或作为任何其它的可将亚砜基还原到硫基的酶的底物。含有蛋氨酸的化合物中的蛋氨 酸部分或类似物具有以下通式结构
权利要求
1.保护受试者正常细胞免受损伤的方法，包括提供含有舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体、衍生物、代谢物及其结 构类似物的组合物，所述舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体、衍生物、代 谢物及其结构类似物的浓度为至少约0.010%重量；使用治疗有效剂量的所述舒林酸与至少一种活细胞接触；以及保护受试者正常细胞免受损伤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒林酸S-差向异 构体、衍生物、代谢物及其结构类似物的浓度范围在约0. 001%重量到100%重量。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述含有舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒林酸 S-差向异构体、衍生物、代谢物及其结构类似物的组合物通过全身、腹腔内、静脉内、皮下、 肌内和局部给药。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的组合物包含舒林酸、衍生物、代谢物及其结 构类似物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的组合物包含舒林酸R-差向异构体、衍生物、 代谢物及其结构类似物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的组合物包含舒林酸S-差向异构体、衍生物、 代谢物及其结构类似物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的组合物含有舒林酸、舒林酸R-差向异构体、 舒林酸S-差向异构体、衍生物、代谢物及其结构类似物中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的组合物含有不同比例的舒林酸、舒林酸 R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体、衍生物、代谢物及其结构类似物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的舒林酸舒林酸R-差向异构体舒林酸 S-差向异构体的比例为从约0到1000。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述的组合物保护正常细胞免受损伤，所述损伤 包括环境损伤、疾病、生物、或太阳光线引起的损伤。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的组合物保护正常细胞免受氧化性损伤。
全文摘要
本发明提供了组合物，包含舒林酸、舒林酸R-差向异构体、舒林酸S-差向异构体、衍生物、代谢物及其结构类似物，该组合物保护正常细胞免受太阳光线、氧化性损伤、环境因素、疾病和生物引起的损伤。
文档编号A61P17/18GK102112124SQ200980126810
公开日2011年6月29日 申请日期2009年5月4日 优先权日2008年5月5日
发明者内森·布洛特, 赫伯特·魏斯巴赫 申请人:佛罗里达州大西洋大学, 特殊外科医院