专利名称：用具有增强的n-酰基转移酶酶活性的微生物产生n-酰化的含硫氨基酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有L-氨基酸-N酰基转移酶酶活性的分离的多肽，和其中所述酶过 表达的经修饰的微生物。所述酶的底物包括甲硫氨酸及其衍生物或类似物。产生含硫氨 基酸的微生物中的过表达允许产生大量N-酰化的含硫氨基酸。还涉及从发酵培养基分离 N-酰化的含硫氨基酸。
背景技术：
N-酰基转移酶催化酰基的转移，通常从酰基供体酰基-辅酶A转移至氨基。酰基 是来自RC 0 OH形式的羧酸的官能团。其具有式RC ( = 0)-，具有碳和氧原子之间的双键 (即羰基)，和R和碳之间的单键。酰基的实例为甲酰基(CH2 = 0)、乙酰基(C2H4 = 0)、 丙酰基(C3H6 = 0)和丁酰基(C4H8 = 0)。N-酰基转移酶在原核生物和真核生物中是重要的酶，并参与如生物周期(Klein DC, 2007, J Biol Chem, 282 (7) :4233-7)、抗生素抗性(Zahringer 等，1993，FEMS Microbiol Lett.，110(3)，331-4 ；Lacalle RA 等，1989，Gene 79(2) :375-80)和对除草剂抗性的过程。 在植物中，由基因产物“Bar”和“Pat”催化的草丁膦的酰化导致草胺膦抗性(Tan W.等， 2006，Amino Acids,30(2) :195-204)。一些N-酰基转移酶特异地催化基团如甲酰基或乙酰基的转移，并且为所谓的 “N-甲酰转移酶”或“N-乙酰转移酶”。其它转移酶具有更一般的催化活性，并且简单地称 为“N-酰基转移酶”。甲硫氨酸的N-末端乙酰化，作为共翻译过程，是真核生物中最常见的蛋白修饰之 一。然而，识别多肽N-末端的乙酰化酶不将甲硫氨酸视为游离氨基酸(参见Polevoda和 Sherman 2000JBC 275,47, pp 36479-36482)。在原核生物中，作为共翻译过程的甲硫氨酸 乙酰化是罕见的(Driessen 等· 1985，CRC Crit. Rev. Biochem. 18,281-325)。已经描述了 N-酰化的酶，其可能将甲硫氨酸酰化成游离氨基酸。例如， ArgA编码大肠杆菌中的N-乙酰-谷氨酸合酶(Marvil和Leisinger 1977 JBC 252， 10pp. 3295-3303) 0尽管已经描述了甲硫氨酸衍生物如甲硫氨酸砜亚胺(sulfoximine)和 甲硫氨酸砜(Davies等，2007，Biochemistry, 46 (7)，pp 1829-39)，但对于游离甲硫氨酸具 有显著酰基化活性的酶目前是未知的。N-乙酰-L-甲硫氨酸(NAM)是甲硫氨酸在氨基上乙酰化的衍生物。已显示NAM 具有与纯甲硫氨酸相同的甲硫氨酸保护值(methionine-sparing value) (Baker, 2006, Journal of Nutrition 136，pp. 16705-55)。它还被包括在大豆面包或豆奶(soymilk) 中，其中它在感觉检测方面的性能比纯甲硫氨酸好(Hippe和Warthesen，1978，Journal of food science 43 (3)pp 793-6)。N-乙酰甲硫氨酸的化学生物合成产生D-和L-立体异构体的外消旋物，并且已知 N-乙酰-D-甲硫氨酸不能像其L-异构体那样被动物吸收(incorporate)。去外消旋是昂 贵的过程，使NAM的产生无利可图。因此，用于食品/饲料和药学应用的纯N-乙酰-L-甲硫氨酸的发酵产生可为经济可行的方法。甲硫氨酸的另一个重要的衍生物是N-丙酰-L-甲硫氨酸(下文称作NPM)，其中甲 硫氨酸在氨基上丙酰化。已显示由L-甲硫氨酸的酰化产生的产物有利于羊的羊毛生产(US4，093，740，题 为“丙酰-甲硫氨酸反刍动物的饲料”)和化妆品的生产(美国专利3，624，114，题为“脂 肪酸酰胺-甲硫氨酸产物”)。发明简述本发明涉及具有L-氨基酸-N-酰基转移酶酶活性的分离的多肽，其包含SEQID NO 1的序列，其片段或同源序列。更具体地，分离的多肽对底物甲硫氨酸、赖氨酸和谷氨酸，它 们的衍生物和类似物具有L-氨基酸-N-酰基转移酶活性。本发明还涉及具有L-氨基酸-N-酰基转移酶活性的经修饰的微生物，其中所述 酶活性得到修饰，特别是增强。与在未修饰微生物中观察到的产生相比，所述微生物显示 N-酰化的氨基酸的产生增加。发明详述本发明涉及具有L-氨基酸-N-乙酰转移酶酶活性的分离的多肽，其包含SEQ ID NO 1的序列，其片段或同源序列。已显示分离的多肽对于底物甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酸，它们的衍生物和类似物具 有L-氨基酸-N-酰基转移酶活性。如本文所使用的，可使用下述术语解释权利要求和说明书。根据本发明，术语“多肽”指包含用肽键连接的两个或更多个氨基酸的序列的肽或 蛋白质。术语“分离的”指从其天然相关的至少一个组分去除的蛋白质或DNA序列。 术语“酶活性”和“酶活”可互换使用，指酶催化特定化学反应的能力，例如对于甲 硫氨酸N-乙酰转移酶酶活性为将甲硫氨酸转化成NAM。术语“L-氨基酸N-转乙酰酶酶活性或L-氨基酸-N-酰基转移酶活性”指将酰基 添加至底物的氨基，例如向氨基酸甲硫氨酸的氨基加入酰基(见
图1)。优选地，酰基是丁酰 基，更优选其为丙酰基并且在甚至更具体的实施方案中，其为乙酰基。将甲硫氨酸、赖氨酸或谷氨酸的衍生物或类似物定义为甲硫氨酸砜亚胺、高半胱 氨酸、甲硫氨酸砜、甲硫氨酸砜亚胺谷氨酰胺或草丁膦(草甘膦)。本发明的分离的多肽可由具有甲硫氨酸N-酰基转移酶活性的微生物获得，例如 通过使用下述实施例中所述的纯化规程。能用于分离多肽的微生物包括，但不限于大肠杆 菌。术语“包含SEQ ID NO 1的序列”表示多肽的氨基酸序列不严格限于SEQID NO 1， 但可包含其它氨基酸。术语“SEQ ID NO 1的片段”表示多肽的序列可包括比SEQ ID NO 1 更少的氨基酸，但是仍有足够的氨基酸以赋予L-氨基酸-N-酰基转移酶活性。本领域公 知，可以通过取代、插入、缺失和/或添加一个或多个氨基酸的而修饰多肽，同时保持其酶 活性。例如，常见的是用化学上等同的氨基酸在指定位置取代一个氨基酸而不影响蛋白质 的功能性质。就本发明而言，取代定义为下组之一内的交换·小的脂族、非极性或轻微极性残基Ala、Ser, Thr、Pro, Gly
·极性、带负电荷的残基和它们的酰胺ASp、ASn、Glu、Gln·极性、带正电荷的残基HiS、Arg、LyS·大的脂族、非极性残基Met、Leu、lie、Val.Cys·大的芳族残基Wie、Tyr、Trp。因此，可预期导致用一个带负电荷的残基取代另一个(如用谷氨酸或天门冬氨 酸)或用一个带正电荷的残基取代另一个(如用赖氨酸取代精氨酸)的变化产生功能上等 同的产品。修饰氨基酸的位置和氨基酸序列中进行修饰的氨基酸的数目没有特定的限制。本 领域技术人员能识别可引入而不影响蛋白质活性的修饰。例如，可预期蛋白质的N-或C-端 部分中的修饰在某些环境下不改变蛋白质的活性。术语“同源的”指进行(如上面定义的)修饰而仍保持初始酶活性的多肽。根据本发明，具有L-氨基酸-N-酰基转移酶酶活的多肽可包含与SEQ IDNO 1中所 示序列具有至少70%同一性，优选至少80%同一性，并且更优选至少90%同一性的序列。用于确定两个蛋白质序列之间同一性百分比的方法是本领域技术人员已知的。例 如,可通过使用网站http://www. ebi. ac. uk/cIustalw/上可用的软件CLUSTALW及网站上 所示的默认参数比对序列后得到同一性百分比。由比对，可以通过记录与残基总数相比的 在相同位置处相同残基的数目容易地进行同一性百分比的计算。或者，可通过使用例如网 站http://www. nchi. nlm. nih. gov/BLAST/上可用的BLAST程序及网站上所示的默认参数 进行自动计算。根据本发明，具有氨基酸N-酰基转移酶酶活性的多肽可以包含来自SEQID NO 1 的序列的至少100个连续氨基酸，优选SEQ ID NO 1中所示序列的至少120个，至少140个， 至少160个或者更优选至少172个连续氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，具有L-氨基酸-N-酰基转移酶酶活性的多肽具有 与SEQ ID NO 1的序列严格相同的多肽序列。本发明还涉及包含编码本发明多肽的序列的多核苷酸。发明人报道了来自大肠杆 菌的编码蛋白质的基因的鉴定，所述蛋白质对于底物甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸 亚砜、甲硫氨酸砜、甲硫氨酸砜亚胺、天冬氨酸和天冬酰胺具有L-氨基酸-N-酰基转移酶 活性。这个基因先前在大肠杆菌的完全基因组分析的过程中得到鉴定，在大肠杆菌中称为 yncA。这个基因已经报道为推定的酰基转移酶，但是尚未证明具体功能(http://eC0gene. org/)。它还在鉴定调整Mar-调节基因的表达的化合物的方法中报道为Mar调节基因，已 知参与多药抗性(W0 01/70776)。术语“多核苷酸”指核糖核苷酸(或RNA)的聚合物或脱氧核糖核苷酸(或DNA)的 聚合物，其为单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA形式的分 离的多核苷酸可包含合成的DNA、基因组DNA或cDNA的一个或多个区段。多核苷酸的来源不一定是初始测量其中酶活性的生物体。本领域技术人员可以使 用在不同严紧条件下与包含SEQ ID NO 2的核苷酸序列的探针的杂交在基因文库中筛选这 样的多核苷酸。杂交的详细规程公开于Sambrook等(1989)中。可以使用例如上文定义的BLAST程序并用SEQ ID NO 2的核苷酸序列搜索同源 性，或用SEQ ID NO 1的多肽序列搜索，并获取相应的多核苷酸序列，从而从数据库提取这种多核苷酸的序列。本发明优选的多核苷酸是与SEQ ID NO 2的核苷酸序列至少60%相同的多核苷 酸。本发明更优选的多核苷酸是与SEQ ID NO 2的核苷酸序列至少80%相同的多核苷酸。 更优选的多核苷酸与SEQ ID NO 2的核苷酸序列至少90%相同。本发明甚至更优选的多核 苷酸是与SEQ ID NO 2的核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸。特别地，包含SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸包括在本发明中。术语“编码”指经过转录和翻译的机制，多核苷酸产生氨基酸序列的过程。这个过 程由遗传编码进行，其为DNA中碱基序列和蛋白质中氨基酸序列之间的关联。遗传编码的 一个主要特点是简并性，表示一个氨基酸可以由多于一个三联碱基(一个“密码子”)编码。 直接的结果是相同的氨基酸序列可以由不同的多核苷酸编码。例如，由于遗传编码的简并 性，源自SEQ ID NO 2的多核苷酸序列也可以编码SEQ ID NO 1的多肽序列，并且因此涵盖 在本发明中。本领域技术人员公知密码子选择可在不同生物体中变化。在编码相同的氨基 酸的密码子中，有些可以由给定微生物优先使用。因此令人感兴趣的是设计适用于具体微 生物的密码子选择的多核苷酸以优化相应蛋白质在此生物体中的表达。本发明还涉及包含在宿主微生物中有功能的调节元件控制下的本发明的多核苷 酸的表达盒。术语“表达”指基因序列的转录和翻译，导致产生相应蛋白质，即基因产物。术语“表达盒”指优选与调节元件，如启动子、增强子、核糖体结合位点或终止子相 连接的多核苷酸，使得在合适的宿主生物体中表达多核苷酸中包含的基因。这样的调节元 件可以是基因自身的调节元件，也可以是修饰或合成的元件，使基因得到更强的表达。例 如，通过用更强的启动子替换基因的天然启动子可以获得更强的表达。对于大肠杆菌，这些 启动子为，例如lac启动子、tac启动子、trc启动子和λ CI启动子。对于其它生物体，技 术人员能选择最合适的启动子。术语“宿主微生物”指能接收外来或异源基因或其自身基因额外拷贝并能表达这 些基因以产生活性蛋白产物的微生物。本发明还涉及包含根据本发明的表达盒，或本发明的多核苷酸的转化载体。术语“转化”指将DNA，例如新基因或现有基因的额外拷贝导入宿主生物体。获得 的基因可以并入染色体DNA或作为染色体外元件导入。例如，在大肠杆菌中，用于将DNA转 入宿主生物体的一种方法是电转化。术语“转化载体”指用于将多核苷酸导入宿主生物体的任何运载体。这种运载体 可以是例如质粒、噬菌体或本领域的技术人员根据使用的生物体已知的其它元件。除了多 核苷酸或表达盒之外，转化载体通常包含其它元件以促进具体宿主细胞的转化。表达载体 包含表达盒和其它元件，所述表达盒允许适当地表达由其携带的基因，所述其它元件允许 在宿主生物体中复制载体。表达载体可以以单拷贝或多拷贝在宿主生物体中存在。在本发明的一个具体实施方案中，将载体或分离的DNA片段导入微生物，所述载 体或片段允许根据本发明的盒或多核苷酸进行染色体整合。本领域技术人员知道用于基因 的染色体整合的不同的有用载体。本发明还提供具有受调整的L-氨基酸-N-酰基转移酶酶活性的经修饰的微生物， 其中根据本发明具有L-氨基酸-N-酰基转移酶活性的多肽的活性增强。
术语“经修饰的微生物”指已经以增加发酵培养液中N-酰化的产物的积累为目标 进行遗传修饰的微生物。本领域技术人员知道如何调整特定基因的表达。通常的修饰包括 用遗传元件转化微生物，包括基因的缺失、基因替换、启动子的修饰，和导入用于表达异源 基因的载体。术语“多肽的活性”表示酶活性，其特征在于将底物转化成为可测量并且与催化反 应的L-氨基酸-N-酰基转移酶的活性直接关联的终产物。本发明的N-酰基转移酶多肽的“增强的活性”意指用转化的微生物进行的N-酰 化的产物，特别是含硫氨基酸的生产与修饰前的相同微生物相比增加。本发明的N-酰基转移酶多肽的增强的活性可以通过任何手段获得，如制备和表 达活性增加的变体或者，更具体地，通过过表达所述多肽进行。可以通过本领域已知的不同 方法获得过表达，如调整影响编码所述多肽的天然基因的表达的因子(如果存在的话)的 表达来进行。它也可通过如下来获得用可使基因产物表达更强的调节元件修饰所述天然 基因的启动子(如果存在的话)所述调节元件是本领域已知的，如增强子，或者最终使用已 知的强启动子。过表达也可以通过如下获得最终以多拷贝导入具有在强启动子控制下的 编码本发明多肽的序列的新基因。用于转化微生物的所有技术，和用于增强本发明的蛋白质产生的调节元件为本领 域所公知并可在文件中得到，所述文件包括申请人自己关于多种微生物中生物合成途径的 修饰的专利申请，包括 W02008/052973、W02008/052595、W02008/040387, W02007/144346、 W02007/141316、W02007/077041、W02007/017710、W02006/082254、W02006/082252、 W02005/111202、W02005/073364、W02005/047498、W02004/076659，其内容通过提述并入本 文。更特别地，可以在培养基中测量N-酰化的产物生产水平的增加。测定培养基中N-酰化的产物的生产/积累的水平。与用未修饰生物体的相同方 法中积累的量相比，N-酰化的产物的积累增加至少20%，优选50%，更优选75%和甚至更 优选95%。使用折射HPLC，以NAM (Sigma，Ref 01310)为标准品，确定发酵培养液中积累的 NAM的量。使用GC-MS，以NAM (Sigma，Ref 01310)为标准品，确定发酵培养液中N-丙酰-甲 硫氨酸的量。在本发明的一个具体实施方案中，本发明的经修饰的微生物中至少一个其它酰基 转移酶的表达增加。所述酶和它们的编码序列在本领域中已知，包括ArgA(N-乙酰谷氨酸 合成酶)、YjdJ, YfaP, YedL, YjhQ。至少这些基因之一的表达增加，意味着这些基因的组合 的增加也是本发明的微生物中所预期的。在本发明的另一个实施方案中，催化酰化的氨基酸脱酰基的基因的活性弱化。本 领域已知的弱化所述基因的活性优选通过弱化它们的表达来获得。特别地，弱化编码催化 NAM脱酰基的酶的argE基因的表达。在本发明的另一个具体实施方案中，涉及甲硫氨酸生物合成的至少一个基因 的表达增加。涉及甲硫氨酸生物合成的基因已经在专利申请(如W02007/077041和WO 2005/108561)中深入描述，其通过提述并入本文。优选地，本发明的微生物选自下组细菌、酵母和真菌。更优选地，细菌选自下组肠杆菌科、芽孢杆菌科、链霉菌科和棒状杆菌科。更优选地，微生物是埃希氏菌属、克雷伯氏 菌属、泛菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属或棒状杆菌属的菌种。甚至更优选地，细菌选自大肠 杆菌和谷氨酸棒状杆菌的菌种。本发明还涉及用于在培养基中产生N-酰化的氨基酸的方法，其包括在存在酰 基-辅酶A的情况下，用如上文和下文所公开的具有L-氨基酸-N-酰基转移酶酶活的多肽 接触所述氨基酸，并回收N-酰化的氨基酸。培养基定义为其中可存在酶活性的任何培养 基，其通常由具有适于酶的最佳活性的PH的水溶液组成。本领域技术人员可以选择最合适的条件进行此催化转化。本发明还涉及通过在包含碳源、硫源和氮源的适当培养基中培养根据本发明的微 生物和从培养基回收N-酰化的含硫氨基酸，从而产生N-酰基含硫氨基酸的方法。在本发明的一个具体实施方案中，产生的N-酰化的含硫氨基酸是N-乙酰-甲硫 氨酸。在本发明的另一个实施方案中，产生的N-酰基氨基酸是N-丙酰-甲硫氨酸。“合适的培养基”是适合于微生物的培养和生长的培养基，所述培养基包含碳源、 硫源和氮源。这样的培养基为微生物发酵领域的技术人员所公知，依赖于所培养的微生物。根据本发明，术语“碳源”表示可由本领域技术人员使用以支持微生物正常生长的 任何碳源，其可以是己糖(如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、单糖、二糖(如蔗糖、纤维二糖 或麦芽糖)、寡糖、糖蜜、淀粉或其衍生物、半纤维素、甘油和它们的组合物。特别优选的简单 碳源是葡萄糖。另一个优选的简单碳源是蔗糖。在本发明的一个具体实施方案中，碳源源自可再生物料。可再生物料定义为某些 工业方法所需的原材料，其可以在短暂延迟后并以足量再生，以使其转化成期望的产品。特别地，氮源是铵盐或氨气。氮源可以以铵或氨的形式提供。用于L-甲硫氨酸，其前体或衍生化合物的发酵生产的硫源，可以是下述中的任一 个硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐、甲硫醇、二甲基二 硫化物或它们的组合物。在本发明的一个优选实施方案中，硫源是硫酸盐和/或硫代硫酸盐。发酵通常在发酵罐中以适于使用的微生物的合适培养基进行，所述培养基包含至 少一种简单氮源，并且如果必要的话，包含产生代谢物所需的共底物。作为大肠杆菌的已知培养基的实例，培养基可具有与M9培养基(Anderson，1946， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32 :120-128)、M63 培养基(Miller，1992 ;A Short Course in Bacterial Genetics :A Laboratory Manual and Handbookfor Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)或如Schaefer等(1999，Anal. Biochem. 270 :88-96)所定义的培养基相同或相似的 组成。作为谷氨酸棒状杆菌的已知培养基的实例，培养基可具有与BMCG培养基(Liebl 等，1989，Appl. Microbiol. Biotechnol. 32 :205-210)或如 Riedel 等(2001，J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3 =573-583)所述的培养基相同或相似的组成。本领域技术人员能限定根据本发明的微生物的培养条件。特别地，细菌在 200C -550C，优选25°C -40°C，并且更具体地对于谷氨酸棒状杆菌为约30°C和对于大肠杆菌 为约37°C的温度发酵。
在本发明的一个具体实施方案中，方法包括从反应培养基、发酵培养液成分和/ 或从生物质(任选地在终产物中保留部分或总量(0-100%))分离期望的N-酰化的氨基酸 作为进一步的步骤。在本发明的一个具体实施方案中，方法包括限制微生物或使其缺乏(starving) 磷酸盐和/或钾。在本发明的一个特定实施方案中，回收的酰化的氨基酸选自N-乙酰-甲硫氨酸和 N-丙酰-甲硫氨酸。附图简述图1表示使用乙酰-辅酶A为辅因子，通过酶^icA催化的L-甲硫氨酸到N-乙 酰-L-甲硫氨酸的乙酰化过程。
实施例实施例1 :MNAT (甲硫氨酸N-酰基转移酶)活性的纯化体外MNAT活性测试通过监控用DTNB显现HS-CoA而在微孔板中追踪甲硫氨酸L-氨基酸_N_酰基转移 酶活性。加入样本的反应溶液,包含200mM Tris-HCl,pH 9. 0,100 μ M DTNB，3mM乙酰-CoA 和 20mM 甲硫氨酸。使用 μ Quant 微孔板读数器(BioTek Instrumentsw, Inc. USA)在 408nm 监测DTNB-CoA复合物的形成。MNAT 纯化用提取缓冲液(EB)(50mM 磷酸盐，pH 7. 0，50 μ M PLP, 500 μ M DTT)将约 3g 干重 细胞冲洗3次，并悬浮于70mL EB中。使用Rosett细胞，用BandelinSonoplus超声均质 器(Bandelin Electronic, Germany)通过声处理裂解细胞，所述均质器装有UW2070探头 和SH70G尖端(6次脉冲，30s，100%效率，75W)。离心粗提物(30分钟，12，000g，4°C )，并 向上清液中加入固体硫酸铵至终浓度为2. 3M，并在冰上温育30分钟。离心溶液(15分钟， 15，000g，4°C )，并将沉淀(pellet)悬浮于40mL磷酸盐缓冲液(50mM磷酸盐，pH 7.0)。添 加固体硫酸铵至终浓度为1. 5M，并将溶液在冰上温育30分钟，然后离心(15分钟，15，000g, 4°C )。使用 AKTA 纯化器单元(Amersham Biosciences, USA)及其软件(Unicorn 软件， Amersham Biosciences, USA)进一步处理上清。然后使溶液过先前以10倍床体积的磷酸盐 缓冲液平衡的苯基-HP柱(GE Healthcare, Amersham Biosciences，USA)。用磷酸盐缓冲液 中1. 5至OmM硫酸铵梯度以ImL/分钟的流速洗脱蛋白质。在约0. 5mM硫酸铵时获得具有最 大活性的级分并在4°C对20mM Tris pH 7. 0缓冲液透析过夜。然后进行阴离子层析，使用 以10倍床体积的20mM Tris pH 7. 0平衡的并用20mM Tris pH 7. ONaCl梯度缓冲液(0至 0. 5M NaCl) VX Resource Q (GE Healthcare Bio-Science AB，Sweden)。 在约0. 25M NaCl浓度洗脱得到具有最大活性的级分。在凝胶过滤步骤前，使用Amicon从超 15滤器(Millipore Corporation,USA)浓缩蛋白溶液。浓缩的提取物通过用两倍床体积的 20mM tris>150MM NaCl 缓冲液平衡的 Superdex 200 柱(GE HealthcareBio-Sciences AB, Sweden)。在约15. 3mL的洗脱体积时获得含最大MNAT活性的级分，对应于分子量36kDa。 最后，将蛋白质溶液加载于先前根据制造商的说明平衡的并使用10至500mM磷酸盐缓冲液 梯度(PH 6.8)以2mL/分钟的流速洗脱的生物级陶瓷羟基磷灰石柱(Bio-scale ceramichydroxylapatite column) (Bio-RadLaboratories, USA)上。在约 130mM 磷酸盐的洗脱浓 度获得具有最大活性的级分。不同级分的变性SDS凝胶电泳显示在纯化过程中约17kDa条
带被富集。
步骤比活性(mUI/mg蛋白)活性(UI)产率纯化因子离心的粗提取物215. 234100纯化的蛋白196890. 1262958表1通过纯化富集甲硫氨酸N-酰基转移酶。所示为比活性、总纯化活性、纯化产 率和纯化因子的增加。条带分析在SDS凝胶电泳后，切下17kDa区域处的条带并进行胰蛋白酶消化。通过在 CapLC-Q-T0F2 (Waters Corporation, USA)上的纳米 LC-MS/MS 分析消化的蛋白质，并用 ProteinLynx Global Server (Waters Corporation, USA)禾口 Mascot (MatrixScience)处理 结果。将纯化的蛋白质鉴定为办(^，一种GCN5相关的酰基转移酶。序列如SEQ ID NO 1所 示。^icA与来自铜绿假单胞菌O^seudomonasaeruginosas)的N-乙酰-甲硫氨酸砜亚胺 转移酶PA4688有63%的同一性。已显示假单胞菌PA4866蛋白质不将L-甲硫氨酸乙酰化 (Davies 等，Biochemistry, 2007)。实施例2 =YncA底物特异性的确定底物特异性测试使用基于DTNB的试验(见上文)测试底物特异性。底物特异性分别用甲硫氨酸砜、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜亚胺和甲硫氨酸观察到强活性。用 赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺获得弱活性。优选的以甲硫氨酸为底物的酰基供体是丙酰-CoA。乙酰-CoA也正确地作为这些 条件中的酰基供体，而丁酰-CoA以甲硫氨酸为底物时给出弱活性。
底物%活性比活性甲硫氨酸100745赖氨酸1. 612甲硫氨酸砜亚胺166. 91243甲硫氨酸亚砜147. 61100甲硫氨酸砜178. 81332谷氨酸0. 6权利要求
1.具有L-氨基酸-N-酰基转移酶酶活性的分离的多肽，其包含SEQIDNO 1的序列，其 片段或同源序列。
2.多核苷酸，其包含编码权利要求1的多肽的序列。
3.具有受调节的L-氨基酸-N-酰基转移酶酶活性的经修饰的微生物，其中权利要求1 的多肽的活性增强。
4.权利要求3的微生物，其中至少一种其它酰基转移酶的表达增加。
5.权利要求4的微生物，其中所述其它酰基转移酶选自下组argA、yjdJ、yfaP、yedL、 yjhQ及其组合。
6.权利要求3的微生物，其中催化酰化的氨基酸脱酰基的基因的活性弱化。
7.权利要求6的微生物，其中所述催化酰化的氨基酸脱酰基的基因是argE。
8.权利要求3的微生物，其中参与甲硫氨酸生物合成的至少一个基因的表达增加。
9.权利要求3的微生物，其中所述微生物选自下组细菌、酵母和真菌。
10.权利要求9的微生物，其中细菌选自下组肠杆菌科(EntercAacteriaceae)、 芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒状杆菌科 (Corynebacteriaceae)。
11.权利要求10的微生物，其选自下组大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
12.用于在培养基中产生N-酰化的含硫氨基酸的方法，其包括在存在酰基-辅酶A的 情况下将所述含硫氨基酸与权利要求1的多肽接触，和回收N-酰化的氨基酸。
13.用于产生N-酰化的含硫氨基酸的方法，其包括在包含碳源、硫源和氮源的适当的 培养基中培养根据权利要求3的微生物，并从所述培养基回收N-酰化的含硫氨基酸。
14.用于产生N-丙酰化的含硫氨基酸的方法，其包括在包含碳源、硫源和氮源的适当 的培养基中培养根据权利要求3的微生物，并从所述培养基回收N-丙酰化的含硫氨基酸。
15.用于产生N-乙酰化的含硫氨基酸的方法，其包括在包含碳源、硫源和氮源的适当 的培养基中培养根据权利要求3的微生物，并从所述培养基回收N-乙酰化含硫氨基酸。
16.权利要求13的方法，其中所述硫源选自下组硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫 酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐、甲硫醇、二甲基二硫化物和它们的组合。
17.权利要求16的方法，其中所述硫源是硫酸盐或硫代硫酸盐，和它们的混合物。
18.权利要求13的方法，其中所述碳源源自可再生物料。
19.权利要求13的方法，其中所述碳源是葡萄糖或蔗糖。
20.权利要求13的方法，其中所述氮源以铵或氨的形式供应。
21.权利要求12或13中任一项的方法，其包括进一步的步骤，即从反应培养基、发酵培 养液和/或从所述生物质分离期望的酰化的氨基酸。
22.权利要求12或13中任一项的方法，其中回收的酰化的氨基酸选自N-乙酰-甲硫 氨酸和N-丙酰-甲硫氨酸。
全文摘要
本发明涉及具有L-氨基酸-N-酰基转移酶酶活性的分离的多肽和过表达所述酶的经修饰的微生物。所述酶的底物主要包括甲硫氨酸及其衍生物或类似物。产生含硫氨基酸的微生物中的过表达允许产生大量N-酰化的含硫氨基酸。还涉及从发酵培养基分离N-酰化的含硫氨基酸。
文档编号A61K48/00GK102131923SQ200980132546
公开日2011年7月20日 申请日期2009年8月21日 优先权日2008年8月22日
发明者格维内尔·贝斯特尔-科尔, 纪尧姆·巴比尔, 雷纳·菲格 申请人:代谢探索者公司