作为针对hcv感染的抗病毒治疗的靶标的宿主细胞激酶的制作方法

专利名称：作为针对hcv感染的抗病毒治疗的靶标的宿主细胞激酶的制作方法
作为针对HCV感染的抗病毒治疗的靶标的宿主细胞激酶相关申请本申请要求于2008年9月沈提交的欧洲专利申请EP 08 305 604. 4的优先权。 将该欧洲专利申请全部内容引入本文作为参考。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)是全球性的重大健康问题，据估计在世界范围内有1. 5-2亿人感染了丙型肝炎病毒，其中在欧盟国家内至少有500万感染个体(PaWlOtsky，2004)。根据世界卫生组织(World Health Organization)报告，每年新增300-400万感染患者。该感染通常是无症状的，但是大多数HCV感染个体会发展成慢性感染(HOOfnagle，2002，Lauer， 2001和keff，1995)。慢性HCV感染通常会导致严重的肝脏疾病，包括纤维化和脂肪变性 (Chisari，2005)。约20 %的慢性HCV感染患者会发展成为肝硬化，其中约5 %的患者会恶化成为肝细胞癌。慢性HCV感染是肝移植的主要适应症(Seeff，20(^)。不幸的是，肝移植并不能治愈丙型肝炎。病毒的复发是必须面对的问题和移植失败的主要原因(Brown，2005)。还没有对抗HCV的疫苗。目前的治疗包括给予利巴韦林和/或α干扰素(IFN-α)，这是两种非特异抗病毒剂。使用聚乙二醇化α干扰素和利巴韦林的联合治疗在约50%-80%的慢性丙型肝炎患者中获得持久的清除率。但是大量患者对该组合中的一种成分有禁忌，不能耐受该治疗，对IFN治疗完全无反应或者在停止给药后发生复发。除了疗效有限、重大的副作用 (例如中性粒细胞减少、溶血性贫血和严重的抑郁)外，当前的抗病毒治疗成本也很高。直到最近，开发更有效的抗HCV感染的治疗由于缺少支持HCV复制的细胞培养系统而受到阻碍。目前已使用源自日本爆发性丙型肝炎患者血液的独特HCV基因组(JFH-I) 实现了感染性HCV在细胞培养物中的稳定生产(Wakita，2005 ；Lindenbach, 2005 ；Zhong, 2005)。HCV的JFH-I株在细胞培养物中释放感染性颗粒(HCVcc)和产生逆转录病毒HCV拟颗粒(HCVpp)的能力(BartOSch，2003 ；Hsu, 2003)使得能够对完整病毒生命周期进行研究。 这又导致了新的针对HCV蛋白加工和复制的抗病毒剂的开发。然而，已经证明这些药剂中的许多药剂具有毒性并且非常容易发生病毒抗性，提示HCV感染的治疗需要不同的策略。HCV是一种正链RNA病毒，属于黄病毒(Flaviviridae)科的肝病毒属 (Hepacivirus)。HCV基因组的主要开放阅读框的翻译导致产生了约3000个氨基酸长度的多聚蛋白，该蛋白质在细胞和病毒蛋白酶的协同作用下在翻译同时和翻译后切割成至少 10个成熟蛋白质，包括两种包膜糖蛋白(El和E2)。HCV通过附着到肝细胞表面的分子或受体而开始传染。由于HCV进入是病毒-宿主相互作用的第一步，它代表了抗病毒治疗的有前途的靶标。已经鉴别了几种在病毒结合和进入过程中与HCV相互作用的细胞表面分子。其中包括四跨膜蛋白(tetraSpanin)CD81(Pileri，1998)、B类I型清道夫受体(SB-RI) (BScarsell i，2002)、紧密连接蛋白密蛋白(Claudin)-1 (CLDNl) (Evans, 2007)、闭合蛋白 (Occludin) (Ploss，2009)、高度硫酸化的硫酸肝素(Barth，200 和低密度脂蛋白(LDL)受体(综述参见Barth，2006和kisel，2008)。所有这些因子在许多组织中表达，并且不是肝脏特异性的。尽管CD81、SR-BI和紧密连接蛋白的过量表达可以使某些细胞系具有HCV敏感性，但是其他表达被鉴别的进入因子的细胞系仍然不能接受。这些发现提示存在其它介导或调节HCV进入的辅助进入因子。已知病毒在其生命周期的一个或多个步骤(包括进入、内化、复制和释放)中利用它们的靶细胞的信号传导途径(Cirone，1990 ；Constantinescu，1991 ；Pelkmans, 2005 ； Root, 2000 ；和Sieckarski，2003)。最近几年，已经清楚在病毒-宿主相互作用第一步过程中，进入病毒与宿主细胞之间的形成交换不限于细胞给予病毒的、导致病毒的细胞结合和进入的线索。对于许多病毒来说，病毒-宿主相互作用类似于双向对话，其中病毒利用细胞自身的信号转导系统向细胞传送信号(Smith，2004)。这些信号-通常在细胞表面产生-诱导可促进进入的改变、使细胞准备好被侵入以及中和宿主的防御。利用对结合至肝细胞瘤细胞的HCV包膜糖蛋白的应答的基因组分析，本申请人的实验室先前已经证明了 HCV包膜糖蛋白与宿主细胞的结合导致可调节细胞基因表达的细胞内信号级联，这可以调节细胞使其支持病毒繁殖(Fang，2006)。发明概述本发明涉及用于医疗干预哺乳动物、特别是人类中丙型肝炎病毒(HCV)感染和 HCV相关疾病的新靶标。本发明提供人细胞蛋白激酶的鉴别，该人细胞蛋白激酶可以作为新型治疗方案的靶标用于治疗和/或预防由HCV引起的感染和疾病，以及用于鉴别和开发新的HCV抗病毒剂。更具体而言，以鉴别新型HCV进入因子为目的，本申请人应用了针对691种细胞激酶和相关蛋白的功能性siRNA(小干扰RNA)筛选，并且采用基于HCV假型(pseudotyped) 颗粒(HCVpp)的模型系统(BartOSch，2003)研究了激酶基因沉默化对HCV进入的影响。在某些实验中，为了区别HCV特异性的和非特异性的效应，他们也在并排(side-by-side)实验中研究了激酶基因沉默化对水泡性口炎病毒拟颗粒(VSVpp) (Barth,2006)的影响。初步实验(见实施例1)导致鉴别出101种蛋白激酶，它们的相应基因的沉默化导致HCV进入细胞显著减少。其中，69种蛋白激酶的基因沉默化导致HCV特异性的病毒进入细胞的减少，而不影响VSVpp的进入(见

图1)，32种蛋白激酶的相应基因的沉默化导致HCV病毒进入细胞显著减少，不考虑基因沉默化对VSVpp进入引起的变化(见图2)。第二组实验(见实施例2)导致鉴别出78种可影响HCV进入和HCV感染启动的人激酶(见图 5)。这 78 种人激酶是CALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、 EPHB4、FASTK, FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYTl、PLK3、PRKD2、STK24、 WEEl、CDKL3、ADRBKl、CKS1B、DCAMKLU DDR2、EPS8L1、GAK, ITPKA, MAPK7、PAK4、STKl 1、 STK38、TYK2、ACVR2B、APEGl、ATM、AURKB、BMX、BRAF、CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA、CHKB、 CIB2、CKMTl、DGKB、EGFR、EPHA3、EPHBl、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK、GKAPl、GRK4、IKBKB, MAP3K7IP1、MAPKAP1、NEK9、PANK3、PI4KII、PIP5K2A、PRKAG2、PSKHU PTK2、PTK2B、RIOKU RPS6KA5、RPS6KL1、Sharp in, SKIP、STK22C、TNK2 和 ULK2 (这些激酶的全称和相应基因的 GenBank登录号示于图5中)。在上述78种人激酶中，发现有34种对HCVpp进入和HCVcc感染有功能性影响，但是对VSV进入没有影响(实验细节见图5A和实施例2)。这34种人激酶是CALM2、CSK、 MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、 GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38和TYK2 (这些激酶的全称和相应基因的GenBank登录号示于图5A中)。利用STRING数据库对这78种人激酶进行的生物信息学分析揭示了调节细胞形态学(包括细胞极性、紧密连接渗透性和整联蛋白信号传导)的激酶网络，以及参与细胞周期的激酶的网络(图6C)。这样鉴别出总共23种人激酶，尤其包括2种调节细胞极性的激酶 STKll和PRKAG ；3种调节紧密连接的激酶MAGI_l、EphA2和EGFR ；4种参与整联蛋白信号传导的激酶CSK、PTK2、PTK2B和ILK ；和8种参与细胞周期的激酶CDC2、CDK3、CDK4、CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 和 WEEl。本申请人然后利用细胞培养产生的感染性HCV(HCVcc) (Wakita，2005)证实了鉴别的候选激酶对于病毒生命周期的相关性，并且评估了已经批准的激酶抑制药物用于抗 HCV治疗的潜力。已经利用该方法证实的人激酶包括STK11、PRKAG2、EPHA2、EGFR和细胞周期蛋白依赖性激酶(即⑶C2、⑶K3、⑶K4、CHKA,⑶KNlB和⑶KN2C中的一种或多种)。所有鉴别的细胞蛋白激酶都代表新型抗病毒干预的潜在靶标。因此，本发明的一个方面提供了这些蛋白激酶作为针对HCV感染和HCV相关疾病的抗病毒治疗的靶标。另一方面，本发明提供了鉴别可用于预防和/或治疗HCV感染和/或HCV相关疾病的化合物的方法。具体地，这些方法包括将表达或能够表达至少一种此处公开的蛋白激酶的生物系统(例如细胞)与候选化合物接触，并且确定所述蛋白激酶的活性或代表所述激酶的活性的因子(factor)。如果该蛋白激酶的活性在存在候选化合物时低于不存在该候选化合物时，则该候选化合物被鉴别为潜在的HCV抗病毒剂(即，可能用于治疗和/或预防由HCV引起的感染或疾病的化合物)。或者，如果代表所述激酶活性的因子在存在候选化合物时和不存在候选化合物时不同(较低或较高，取决于因子和活性之间的关系)，则该候选化合物被鉴别为潜在的HCV抗病毒剂。在某些实施方式中，本发明的方法用于筛选候选化合物个体。在其他实施方式中， 本发明的方法用于筛查候选化合物的文库。候选化合物可能属于广泛多种分子家族中的任一种。在某些实施方式中，候选化合物选自小分子、单克隆抗体、多克隆抗体、RNA聚合酶抑制剂、反义化合物、核酶、siRNA, siDNA及其任意组合。通过此处所述的筛选方法鉴别的任何潜在HCV抗病毒剂包括在本发明中。特别是，本发明提供用于防止细胞被HCV感染的药剂，其中该药剂抑制至少一种此处公开的蛋白激酶的活性，从而防止、阻断或抑制HCV进入细胞。本发明还提供用于预防或治疗受试者的HCV感染或HCV相关疾病的药剂，其中该药剂抑制至少一种此处公开的蛋白激酶的活性，从而防止、阻断或抑制HCV进入该受试者的易感细胞。本发明还提供用于预防肝移植患者的HCV复发的药剂，其中该药剂抑制至少一种此处公开的蛋白激酶的活性，从而防止、 阻断或抑制HCV进入该患者的易感细胞。这些药剂(或激酶抑制剂)可以是小分子、单克隆抗体、多克隆抗体、RNA聚合酶抑制剂、反义化合物、siRNA, siDNA、核酶等。在某些实施方式中，这些药剂是本领域已知的抑制至少一种此处公开的蛋白激酶的活性的化合物。本领域已知的抑制至少一种蛋白激酶的活性的化合物包括2-氰基-3，12- 二氧代齐墩果-1， 9-二烯-28-酸甲酯(methyl 2-cyano_3，12-dioxoolean-l，9-dien-28_oate)、西妥昔单抗 (cetuximab)、AEE 788、帕木单抗(panitumumab)、BMS-599626, ARRY-334543, XLM7、卡纽替尼(canertinib)、吉非替尼(gefitinib)、HKI-272、PD 153035、拉帕替尼(Iapatinib)、 凡德他尼(vandetanib)、埃罗替尼(erlotinib)、BMS-387032、夫拉平度(flavopiridol)、 XL647、达沙替尼(dasatinib)、AZM-475271、伊马替尼(imatinib)、AZD-1152、索拉非尼 (sorafenib)、PD-0332991，其衍生物、其生理学可接受的盐、及其任意组合。本发明还涉及用于预防和/或治疗HCV感染和HCV相关疾病的靶向系统和方案。 具体地，本发明涉及通过抑制此处公开的激酶的活性干扰HCV-宿主细胞相互作用、特别是 HCV进入的药剂。这些激酶抑制剂可用于预防或治疗HCV感染(急性或慢性HCV感染)和 HCV相关疾病或紊乱(例如肝炎、肝硬化及肝细胞瘤)。抑制HCV进入细胞的激酶抑制剂 (例如本文提供的那些)作为抗病毒治疗药物是特别有吸引力的。本发明的激酶抑制剂可应用于多种预防和治疗应用中。因此，在另一方面，本发明的激酶抑制剂提供防止细胞(例如易感细胞或易感细胞群)的HCV感染、防止或治疗受试者中的HCV感染或HCV相关疾病、和防止肝移植患者的HCV复发。在相关的方面，本发明提供了降低易感细胞由于接触HCV而感染HCV的可能性的方法，该方法包括使易感细胞与有效量的本发明的激酶抑制剂接触。本发明也提供了降低受试者的易感细胞由于与HCV接触而受到HCV感染的可能性，该方法包括给予受试者有效量的本发明的激酶抑制剂。本发明也提供了在需要的受试者中治疗或预防HCV感染或HCV 相关疾病(例如肝疾病或病理状态)的方法，该方法包括给予受试者有效量的本发明的激酶抑制剂。本发明也提供了防止肝移植患者的HCV复发的方法，该方法包括给予患者有效量的本发明的激酶抑制剂。将本发明的激酶抑制剂给予受试者可以通过任何合适的途径， 包括例如肠胃外、气雾剂、口服和局部途径。本发明的激酶抑制剂可以单独给予或与例如抗病毒剂的治疗剂联合给予。因此，本发明的激酶抑制剂包括那些本领域已知为至少一种此处所述目标激酶的活性抑制剂的药剂和那些通过此处公开的任一种筛选试验鉴别的药剂。特别是，在一个实施方式中，本发明提供了 Dorsomorphin、达沙替尼、埃罗替尼、夫拉平度、凡德他尼、吉非替尼或拉帕替尼在预防或治疗HCV感染中的应用。在另一个实施方式中，本发明提供了达沙替尼或埃罗替尼在防止肝移植患者的HCV复发中的应用。本发明的激酶抑制剂可以以本来的形式给予或以药物组合物的形式给予。因此， 在另一方面，本发明提供了将本发明的激酶抑制剂用于制备治疗和/或预防HCV感染和HCV 相关疾病的药物、药物组合物、药物试剂盒的用途。在相关的方面，本发明提供了包含有效量的本发明的激酶抑制剂以及至少一种可药用载体或赋形剂的药物组合物。在某些实施方式中，药物组合物适合与另外的治疗剂 (例如抗病毒剂)联合给药。在其它实施方式中，药物组合物还包含另外的治疗剂，例如抗病毒剂。适用于本发明方法和药物组合物中的抗病毒剂包括但不限于干扰素(例如，α 干扰素和聚乙二醇化的α干扰素)、利巴韦林、抗HCV(单克隆或多克隆)抗体、RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、IRES抑制剂、解旋酶抑制剂、反义化合物、核酶及其任意组合。对于阅读了以下优选实施方式的详细说明的本领域普通技术人员，本发明的这些和其它目的、优势和特征将会变得明显。附图简述图1是一张表格，其中示出了在初步实验(见实施例1)中鉴别为针对HCV感染的抗病毒治疗的潜在靶标的69种人蛋白激酶。如果使用SiRNA进行沉默化，则编码这些蛋白激酶的基因显示对病毒进入细胞有HCV特异性的影响(即，使用HCVpp的HCV感染减少，但对对照假型VSVpp没有类似的影响)。各蛋白激酶的全称及相应基因的GenBank登录号也在表格中给出。图2是一张表格，其中示出了在初步实验(见实施例1)中鉴别为针对HCV感染的抗病毒治疗的潜在靶标的32种蛋白激酶。如果使用siRNA进行沉默化，则编码这些蛋白激酶的基因显示病毒进入细胞显著减少，而不考虑基因沉默化对VSVpp进入引起的变化。各蛋白激酶的全称及相应基因的GenBank登录号也在表格中给出。图3证明表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂显著抑制HCVpp进入和HCVcc感染(实验细节见实施例1)。在与埃罗替尼(图3A)、吉非替尼(图3B)、拉帕替尼(图3C)和凡德他尼(图3D)孵育后，通过Huh7. 5. 1细胞中HCV RNA的萤光素酶报道基因表达或RT-PCR评估了 HCVpp进入(HCVpp H77C，基因型la)和HCVcc JFHl感染。细胞与溶剂(CTRL)、1 μ M 或10 μ M抑制剂孵育，从感染前1小时到感染后3小时。感染后72小时评价萤光素酶活性， 并相对于总蛋白质含量标准化。数据表示为相对于对照细胞的％ HCVpp进入或HCVcc感染 (CTRL = 100%，示出了平均值士SD)。图4显示在第二次实验中用来鉴别宿主细胞来源的HCV进入辅助因子的功能性 RNAi HCVpp进入筛选的示意略图。筛选的细节在实施例2中给出。图5是一张表格，其中示出了在第二组实验(见实施例幻中鉴别的78种可影响 HCV进入和HCV感染启动的人蛋白激酶。发现表格中示出的前34种人蛋白激酶对HCV进入和HCV感染有功能性影响，而对VSV进入没有影响(图5A)。各蛋白激酶的全称及相应基因的GenBank登录号也在表格中给出。图6显示在第二组实验中鉴别为对HCV进入有显著影响的细胞激酶的生物学过程和蛋白质缔合网络分析的结果。鉴别的78种参与HCV进入的细胞激酶(A)和鉴别的34 种影响HCV进入但不影响VSV进入的激酶⑶利用hgenuity Pattiways数据库进行分析。 该分析确定了生物体内具有与鉴别的候选激酶相关的最普遍的生物过程的项(阈值P值 < IO-5)。最显著的生物学功能项按P值升序排列。(C)通过STRING分析鉴别的78种参与 HCV进入的激酶的蛋白质缔合网络。连接激酶的线显示来自大量来源的直接(物理)和间接(功能性)缔合，这些来源包括实验储库、计算预测方法和公共文本收集。参与调节细胞形态、紧密连接和细胞极性(绿色)、细胞粘附(深绿色)和细胞周期进展(蓝色)的激酶被突出显示。(D)在RNAi筛选中鉴别的细胞激酶对HCV进入机制的影响模型。HCV进入因子以橙色显示，在进入筛选中鉴别的细胞激酶以红色示出。图7证明了肝激酶Bl (STKll)和AMP-活化蛋白激酶亚基Y 2 (PRKAG2)表达的沉默化导致HCVpp进入和HCVcc感染的抑制(见实施例2)。Huh7. 5细胞中特异性siRNA个体对STKll (A)或PRKAG2 (B)的沉默化导致来自于基因型la、la、2a、3a和如的HCVpp进入 (左栏)和HCVcc感染(HCVcc Luc-Jcl ；基因型h/a2)(右栏)的抑制。相反，对照siRNA 转染(CTRL)不影响HCV感染。蛋白激酶抑制剂Dorsomorphin对AMPK活性的抑制抑制了 Huh7. 5细胞中的HCVpp进入(HCVpp H77C ；基因型la) (C)和Huh7. 5. 1细胞中的HCVcc 感染(HCVcc Luc-Jcl ；基因型(D)。Huh7. 5细胞中的细胞生存力没有降低，但是在 Huh7. 5. 1中略微降低(如通过MTT试验显示)(C-D)。细胞用10 μ M Dorsomorphin预处理1小时并在感染过程中处理6小时。数据表示为相对于CTRL siRNA-感染细胞或溶剂对照处理细胞的HCVpp进入、HCVcc感染或细胞生存力的百分比(CTRL = 100% ；示出了平均值士 SD)。图8证明了人肝细胞瘤细胞中EphA2和EGFR表达的沉默化导致独立于基因型的 HCVpp进入和HCVcc感染的抑制。(A)使用siRNA个体对Huh7. 5细胞中EphA2或EGFR基因转录的沉默化导致相应蛋白质的表达减少。如通过免疫沉淀和Western印迹法所示，将表达与对照SiRNA(CTRL)转染的细胞进行比较。模拟物=未处理的细胞。(B)特异性siRNA 个体对EphA2、EGFR或⑶81表达的沉默化导致来源于基因型la、lb、2a、3a和4a的HCVpp 进入的抑制。与EGFR相反，EphA2沉默化对VSVpp对照颗粒的进入没有影响。(C) siRNA个体对EphA2、EGFR或CD81表达的沉默化导致HCVcc感染(HCVcc Luc-Jc 1，基因型2a/2a)的显著抑制。相反，对照siRNA转染(CTRL)不影响HCV感染。数据表示为相对于CTRL_siRNA 转染细胞的％ HCVpp进入或HCVcc感染(CTRL = 100% ；示出了平均值士SD)。图9显示蛋白激酶抑制剂达沙替尼和埃罗替尼对HCVcc感染和HCVpp进入的剂量依赖性抑制。与达沙替尼或埃罗替尼孵育后，通过萤光素酶报道基因表达评价Huh7. 5细胞的HCVcc感染(HCVcc Luc-Jc 1，基因型2a/2a) (A)和原代人肝细胞中的HCVpp进入(HCVpp JFHl ；基因型2a) (B)0达沙替尼和埃罗替尼以剂量依赖的方式抑制HCVcc感染(A)和原代人肝细胞中的HCVpp进入(B)。激酶抑制剂在感染前1小时加入。处理的细胞的生存力利用MTT试验评价，并且显示为灰色虚线。数据表示为HCVcc感染或HCVpp进入相对于溶剂处理的对照细胞的百分比(CTRL = 100% ；示出了平均值士SD)。(C)达沙替尼和埃罗替尼不抑制HCV复制，作为HCVcc复制百分比。如实施例2所述，Huh7.5细胞用来自亚基因组 HCV JFHl复制子的HCV RNA转染。电穿孔4小时后，细胞与溶剂对照、达沙替尼或埃罗替尼孵育24小时。HCV RNA和GAPDH RNA通过Northern印迹法进行分析。图10证明用多激酶抑制剂靶向宿主细胞激酶导致来源于肝移植患者的HCV分离株感染的抑制。来自HCV株VD、VH、VK、VN的带有包膜糖蛋白的HCVpp(基因型lb)在肝移植过程中从4名不同HCV感染患者中分离。在Huh7. 5中使用针对EphA2、EGFR或⑶81的特异性siRNA个体进行基因沉默化(A)，和在感染前1小时用浓度为10 μ M的达沙替尼或埃罗替尼处理Huh7.5细胞(B)或原代人肝细胞(PHH) (C)，抑制了所有株的进入。相反，渥曼青霉素(10 μ M)不抑制HCVpp进入。基因沉默化(与非特异性对照siRNA相比)或抑制剂处理(与溶剂对照相比)都不降低细胞生存力(B-C)。数据表示为相对于对照siRNA-感染的细胞或溶剂对照处理的细胞的HCVpp进入或细胞生存力的百分比(CTRL = 100% ；示出了平均值士 SD)。定义在整个说明书中使用了一些术语，这些术语在下文中定义。术语“激酶”和“蛋白激酶”在本文中可以互换使用。它们指催化磷酸基团从核苷三磷酸转移至参与信号途径的另一分子(在此称为“底物”或“激酶底物”)的特定氨基酸残基的酶。例如，磷酸基团可以从ATP或GTP(腺苷或鸟苷三磷酸)转移。激酶可以是跨膜或细胞内蛋白质。真核蛋白激酶的特征在于构成催化(激酶)结构域的大约250个氨基酸的连续区段的序列。激酶可以是酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、组氨酸激酶或双特异性激酶。
术语“激酶活性”和“激酶的活性”在本文中可以互换使用，是指蛋白激酶催化底物分子的特定氨基酸残基磷酸化的能力。当用于化合物时，术语“激酶活性抑制剂”是指该化合物能够抑制(例如完全抑制或部分降低)蛋白激酶催化磷酸基团从核苷三磷酸转移到底物分子的特定氨基酸残基的能力。在本发明的实践中，激酶活性的抑制可以通过多种机制中的任一种实现。但是，无论机制如何，激酶活性的抑制都导致激酶催化其底物磷酸化的能力降低。因此，“抑制”的意思是在化合物存在下孵育后，例如在本发明的试验中，底物的磷酸化水平降低至少50 %。优选地，该化合物使底物的磷酸化水平降低至少90%。更优选地，该化合物使底物的磷酸化水平降低至少95%。在本发明的激酶分析中诱导这种底物分子磷酸化水平降低的候选化合物被“鉴别”为激酶活性抑制剂。因此，在某些实施方式中，“激酶活性抑制剂”是已经通过本发明的筛选方法确定为抑制/阻抑给定激酶活性的化合物。术语“蛋白激酶信号途径”和“蛋白激酶级联”在本文中可以互换使用。它们是指激酶蛋白信号级联的上游和下游成分。术语“底物”和“激酶底物”在本文中可以互换使用。它们是指参与一个或多个信号途径的分子，它们通过激酶的作用可以被磷酸化，并且其磷酸化最终导致一个或多个细胞应答的改变。示例性的底物包括但不限于代谢酶、基因调节蛋白、细胞骨架蛋白或其他蛋白激酶(例如，参与相同信号途径的下游激酶)。当用于本文时，术语“激酶激活物”是指任何细胞外或其他类型的刺激物，它能引发激酶的活化，激酶的活化又诱导底物分子的磷酸化。激酶激活物的例子包括环境应激信号(例如渗透压休克、热休克、低氧和UV照射)、化学应激信号(例如氧化应激、人类致癌物和环境污染物)和生化刺激物(例如生长因子、细胞因子、生长激素和神经递质)。生化刺激物通常是影响其他细胞功能的细胞自然分泌的分子。当用于蛋白激酶时，术语“组成型活性”是指激酶在不存在激酶激活物的情况下具有催化底物磷酸化的能力。组成型活性激酶可以在本发明的筛选试验中使用的细胞中内源性表达，或者，细胞可以被转化从而表达组成型活性激酶。当用于本文时，术语“基因”是指编码不连续产物(RNA或蛋白质)的多核苷酸，并且可以包括位于编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。由于一种以上的多核苷酸可以编码不连续产物，该术语也包括编码同一产物的基因的等位基因和多态性，或其功能相关(包括功能的获得、丧失或调节)的类似物。本文使用的术语“基本同质群”当用于细胞时是指这样的细胞群体该群体中至少大约80%、优选至少大约90%的细胞具有相同的细胞型。细胞型的例子包括但不限于血小板、淋巴细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、上皮细胞、粒细胞、单核细胞、肥大细胞、神经细胞等等。术语“系统”和“生物系统”在本文中可以互换使用。它们是指体外、体内或离体生物实体，如细胞、生物流体或生物组织。例如，系统可以来源于活的受试者(例如它可以通过活检或通过抽血获得)或来自死亡的受试者(例如，它可以在尸检时获得)。从中获得生物系统的受试者可以是HCV感染的动物模型。或者，它可以是人类。当用于本文时，术语“受试者”是指可以成为丙型肝炎病毒(HCV)宿主的人或其它的哺乳动物，例如灵长类、狗、猫、山羊、马、猪、小鼠、大鼠、兔等，但是可以受到或未受到该病毒的感染和/或患上或未患上HCV相关疾病。非人类受试者可以是转基因的或用其它方法改变的动物。在本发明的许多实施方式中，受试者是人类。在这样的实施方式中，受试者常被称为“个体”。术语“个体”不表示特定的年龄，并因此包括新生儿、儿童、青少年和成年人。当用于本文时，术语“HCV”是指任何主要的HCV基因型、亚型、分离物和/或准种。 HCV基因型包括但不限于基因型1、2、3、4、5和6 ;HCV亚型包括但不限于亚型la、lb、2a、2b、 2c、3a、4a_f、5a 禾口 6a。术语“患有HCV”或“感染HCV”在本文中可互换使用。当这两个术语用于受试者时，是指患者的至少一个细胞被HCV感染。术语“HCV感染”是指例如通过靶细胞膜与HCV 或HCV包膜糖蛋白阳性细胞的融合将HCV的遗传信息引入靶细胞中。术语“HCV相关疾病”和“与HCV有关的疾病”在本文中可互换使用。其是指已知或怀疑与HCV有关的和/或直接或间接地由HCV引起的疾病或紊乱。HCV相关(或与HCV有关) 的疾病包括但不限于众多的肝脏疾病，例如急性肝炎的亚临床携带者状态(subclinical carrier state)、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。该术语包括任何HCV感染的症状和副作用， 包括潜伏的、持续的和亚临床的感染，无论感染是否是临床显性的。术语“治疗”在本文中用于表示目的在于(1)延缓或防止疾病或病症(例如HCV 感染或HCV相关疾病)的发作；(2)减慢或阻止疾病或病症的症状的发展、恶化或劣化；(3) 促进疾病或病症的症状的改善；或(4)治愈疾病或病症的方法或过程。治疗可以在疾病或病症发作前进行，以发挥预防或防止作用。可选择地或另外地，治疗可在疾病开始后进行以发挥治疗作用。“药物组合物”在本文中定义为包含有效量的至少一种生物活性成分(例如蛋白激酶抑制剂)和至少一种可药用载体或赋形剂。当用于本文时，术语“有效量”是指足以实现其预期的目的(例如在细胞、组织、系统或受试者中期望的生物或医学反应)的化合物或组合物的任何量。例如，在本发明某些实施方式中，所述目的可以是抑制激酶的活性；防止HCV感染，防止HCV相关疾病的发作， 减慢、减轻或阻止HCV相关疾病(例如慢性丙型肝炎、肝硬化等)的症状的发展、恶化或劣化，促进疾病症状的改善和/或治愈HCV相关疾病。术语“可药用载体或赋形剂”是指不会干扰活性成分生物活性的效力并且在所施用的浓度下对宿主没有过度的毒性的载体介质。该术语包括溶剂、分散体、介质、涂料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。将这类介质和试剂用于药物活性物质在本领域中是公知的(见例如"Remington' s Pharmaceutical Sciences" ，Ε· W. Martin，第 18 版， 1990，Mack Publishing Co. :Easton，PA，将该文献全部内容通过引用并入本文)。术语“易感细胞”和“HCV易感细胞”在此可互换使用。它们是指可被HCV感染的任何细胞。易感细胞包括但不限于肝脏或肝细胞、原代细胞、肝细胞瘤细胞、CaCo2细胞、 树突细胞、胎盘细胞、子宫内膜细胞、淋巴结细胞、淋巴样细胞(B和T细胞)、外周血单核细胞和单核细胞/巨噬细胞。当术语“防止、抑制或阻断HCV感染”用于药剂(例如蛋白激酶抑制剂)时，是指与不存在该药剂的情况下引入的HCV遗传信息的量相比，减少引入易感细胞或易感细胞群中的HCV遗传信息的量。
12
术语“候选化合物”是指任何天然存在的或非天然存在的分子，如生物大分子(例如核酸、多肽或蛋白质)、有机或无机分子、或从将要检测目标活性的诸如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物，包括人类)细胞或组织等生物材料获得的提取物。在本发明的筛选方法中，评价候选化合物抑制给定蛋白激酶的活性的能力。本文使用的术语“小分子”是指任何天然或合成的低分子量有机或无机化合物或因子。优选的小分子的分子量为大于50道尔顿且小于2500道尔顿。更优选地，小分子的分子量小于600-700道尔顿。再更优选地，小分子的分子量小于350道尔顿。本文使用的术语“生理学可接受的盐或前药”是指这样的盐或前药它们在合理的医学判断范围内，适用于与患者的组织接触，而不引起过度的毒性、刺激、变应性应答等，具有合理的收益/风险比，并且对于预期应用是有效的。术语“盐”是指任何酸加成盐或碱加成盐，它们分别保留相应的游离碱或游离酸的生物活性和性质，并且在生物学或其它方面是理想的。酸加成盐由无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)和有机酸(例如乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等)形成。碱加成盐可由无机碱(例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、锌、铝盐等)和有机碱(例如以下物质的盐伯胺、仲胺和叔胺、取代胺，包括天然存在的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基-氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、氨基丁三醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱(theobromine)、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、 聚胺树脂等)形成。术语“前药”是指在体内给药后被代谢或以其他方式转化为该化合物的生物学、药学或治疗活性形式的化合物。前药可以设计为改变化合物的代谢稳定性或转运特性、掩蔽副作用或毒性、改善化合物的香味、和/或改变化合物的其他特性或性质。基于对体内药效学过程和药物代谢的了解，一旦确定了药物活性化合物，制药领域的技术人员通常可以设 ifHHMit^^^mM (Nogrady,"Medicinal Chemistry A Biochemical Approach", 1985, Oxford University Press :N. Y.，第388-392页)。选择和制备合适的前药的程序也是本领域已知的。当术语“大约”和“约”在本文中用于数值时，除非另外指明或从上下文中另外证明的外，通常包括落入该值沿任一方向(大于或小于该值)的10%范围内的值(除了所述值超过可能值的100%的情况)。某些优选实施方式的详细说明如上所述，本发明提供了一组作为抗病毒物质的假定目标的新的HCV进入因子， 所述因子通过应用靶向691种细胞激酶和相关蛋白的功能性siRNA筛选并研究激酶基因沉默化对于HCV进入因子的效应来鉴别。已鉴别的在HCV进入和感染中直接或间接地发挥作用的蛋白激酶提供新的治疗方案、有用的抗病毒疗法和新的筛选方法(如分析)和材料，以发现和开发新的抗病毒剂。I-宿主细胞蛋白激酶在精选的一组实验中(参见实施例2和图3)，申请人进行了初步和二级筛选，以鉴别可影响HCV进入和HCV感染启动的人激酶基因。更具体地说，这些基因的沉默化导致HCVpp和HCVcc进入细胞显著减少。这些筛选导致鉴别了具有以下GenBank登录号的 78 种激酶基因NM_001743、NM_004383、NM_173515、NM_001123、NM_001258、NM_004064、 NM_001262、NM_004431、NM_004444、NM_006712、NM_005248、NM_004517、NM_001570、 NM_007229、NM_152835、NM_003559、NM_004203、NM_004073、NM_016457、NM_003576、 NM_003390、NM_016508、NM_001619、NM_001826、NM_004734、NM_006182、NM_017729、 NM_005255、NM_002220、NM_002749、NM_005884、NM_000455、NM_007271、NM_003331、 NM_001106、NM_005876、NM_000051、NM_004217、NM_001721、NM_004333、NM_001786、 NM_033487、NM_000075、NM_001260、NM_001277、NM_005198、NM_006383、NM_020990、 NM_004080、NM_005228、NM_005233、NM_004441、NM_005246、NM_002011、BF688722、 NM_022158、NM_000162、NM_025211、NM_182982、NM_001556、NM_006116、NM_024117、 NM_033116、NM_024594、NM_018425、NM_005028、NM_016203、NM_006742、NM_173176、 NM_031480、NM_004755、NM_031464、NM_030 974、XM_051221、NM_05284U NM_005781 和 NM_014683。因此，本发明提供78种人细胞蛋白激酶作为针对HCV感染和HCV相关疾病的医疗干预的新靶标。这些蛋白激酶由上述78种基因编码。更具体地说，这些激酶是CALM2、CSK、 MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、 PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、 GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、AURKB、BMX、BRAF、CDC2、 CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA、CHKB、CIB2、CKMT1、DGKB、EGFR、EPHA3、EPHB1、FER、FGFR4、FLT3LG、 FN3K、GCK、GKAP1、GRK4、IKBKB、MAP3K71P1、MAPKAP1、NEK9、PANK3、P14KII、PIP5K2A、PRKAG2、 PSKHl、PTK2、PTK2B、RIOKl、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin,SKIP、STK22C、TNK2 和 ULK2。在图 5所列的表中提供了蛋白激酶(和相应的基因)的全称和基因的GenBank登录号。进行并排筛选(side-by-side screen)以鉴别激酶基因，如果使用siRNA进行沉默化，该激酶基因显示HCVpp和HCVcc进入细胞显著减少，但没有导致VSVpp进入细胞有任何变化。这导致鉴别了具有以下GenBank登录号的34种激酶基因NM_001743、NM_004383、 NM_173515、NM_001123、NM_001258、NM_004064、NM_001262、NM_004431、NM_004444、 NM_006712、NM_005248、NM_004517、NM_001570、NM_007229、NM_152835、NM_003559、 NM_004203、NM_004073、NM_016457、NM_003576、NM_003390、NM_016508、NM_001619、 NM_001826、NM_004734、NM_006182、NM_017729、NM_005255、NM_002220、NM_002749、 NM_005884、NM_000455、NM_007271 和 NM_003331。因此，本发明提供34种人细胞蛋白激酶作为针对病毒感染、特别是HCV感染和 HCV相关疾病的医疗干预的新靶标。这些蛋白激酶由上述34种基因编码。更具体地说，这些激酶是CALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKNlB, CDKN2C、ΕΡΗΑ2、ΕΡΗΒ4、FASTK, FGR、ILK、 IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、 DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STKll、STK38 和 TYK2。在图 5A 所列的表中提供了激酶(和相应的基因)的全称和基因的GenBank登录号。使用STRING数据库对78种人激酶进行的生物信息学分析揭示了调节细胞形态 (包括细胞极性、紧密连接渗透性和整联蛋白信号传导)的激酶网络以及参与细胞周期的激酶网络(图6C)。这样鉴别了总共23种人激酶，尤其包括2种调节细胞极性的激酶、3种调节紧密连接的激酶、4种参与整联蛋白信号传导的激酶；和8种参与细胞周期的激酶。因此，本发明提供17种人细胞蛋白激酶作为针对病毒感染、特别是HCV感染和HCV 相关疾病的医疗干预的新靶标。这17种蛋白激酶是STKll、PRKAG2、MAGI-l、EphA2、EGFR、 CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 和 WEEl。申请人:已经使用批准的激酶抑制药物验证了鉴别的蛋白激酶是针对HCV感染的医疗干预的新靶标(参见实施例1和幻。他们发现，用D0rS0m0rphin(AMPK活性的抑制剂)预孵育Η 7. 5细胞显著抑制HCVpp进入，从而证实了 STKll和PRKAG2的作用。类似地，与达沙替尼(EphA2功能的抑制剂)预孵育显著抑制在原代人肝细胞中的HCVpp进入和Huh7. 5. 1细胞的HCVcc感染，这证实EphA2功能对于HCV进入是重要的。此外，申请人发现，使用埃罗替尼抑制EGFR活性剂量依赖性地抑制了 HCV进入和HCV感染，从而证实了 EGFR的作用。使用其他EGFR抑制剂如凡德他尼、吉非替尼和拉帕替尼，获得类似的结果。 最后，夫拉平度(良好表征的CDK家族的抑制剂)显著抑制在原代人肝细胞中的HCVpp进入，证实细胞周期蛋白依赖性激酶、特别是CDK3的作用。因此，本发明提供以下蛋白激酶作为针对病毒感染、特别是HCV感染和HCV相关疾病的医疗干预的新靶标。这些蛋白激酶是STK11、PRKAG2、EPHA2、EGFR和细胞周期蛋白依赖性激酶、特别是CDK3。II-作为HCV抗病毒剂的激酶抑制剂本发明者鉴别的人细胞蛋白激酶可以用作鉴定、设计和开发新的HCV抗病毒剂的靶标。可用作HCV抗病毒剂的激酶抑制剂可以属于多种分子家族中的任一个，包括但不限于有机化合物(例如，小分子、糖类、类固醇类等)、单克隆或多克隆抗体(例如，结合激酶的抗体)、肽、多肽、核酸分子(例如，反义化合物、核酶、三股螺旋分子、SELEXRNAs等)。如上文提及，本发明的激酶抑制剂可以通过多种机制中的一种或多种发挥其作用，该机制导致感兴趣的蛋白激酶催化其底物磷酸化的能力受到抑制(例如，完全抑制或部分降低)。因此，激酶抑制剂可以通过以下方式来发挥其作用例如，通过抑制、阻断或防止编码感兴趣的激酶的基因的表达(基因治疗方法)，和/或抑制、阻断或防止酶活性(包括通过激酶底物的活性或功能的竞争或调节，或通过竞争性结合激酶或其催化/酶结构域，通过竞争性结合激酶底物和/或任何上游和/或下游激酶效应器)。本发明提供通过根据抑制至少一种本文公开的(见下文)激酶的活性的能力筛选候选化合物，鉴别可用于预防和/或治疗HCV感染的化合物的方法。本发明包括通过本发明的筛选方法鉴别为激酶抑制剂的任一种化合物。然而，本发明还包括本领域的已知化合物在抑制本文公开的至少一种蛋白激酶的活性中的应用。这些蛋白激酶抑制剂通常被设计为抗癌药物，且由不同公司开发，所述公司包括但不限于Genetech、Boehringer Ingelheim, Imclone、Novartis、Roche、AstraZeneca、OSI> Onyx、Bayer> Pfizer、BMS> Sanofi> GSK 禾口 Amgen。已知的激酶抑制剂的例子包括但不限于2-氰基-3，12- 二氧代齐墩果-1，9- 二烯-28-酸甲酯(用于CHUK的抑制)；西妥昔单抗(用于EGFR的抑制)、AEE 788、帕木单抗、BMS-599626、ARRY-334543、XL647、卡纽替尼、吉非替尼、HKI-272、PD 153035、拉帕替尼、凡德他尼和埃罗替尼(用于EGFR的抑制)；BMS-387032和夫拉平度(用于⑶K2、⑶K3、 CDK4和CDK8的抑制)；XL647 (用于EPHB4的抑制)；达沙替尼和AZM-475271 (用于SRC的抑制)；伊马替尼(用于BCR的抑制作用)；达沙替尼(用于EPHA2的抑制)；和AZD_1152(用于AURKB的抑制)。已知的激酶抑制剂的其他例子包括但不限于索拉非尼(用于BRAF的抑制)；BMS-599626 (用于ERBB4的抑制)；PD-0332991和夫拉平度(用于CDK4的抑制)。如上文提及，本申请人已经表明，一些激酶的已知抑制剂可以显著抑制HCV进入和HCV感染(参见实施例1和2)。因此，本发明提供所有已知的EGFR活性抑制剂埃罗替尼 (Tarceva )、凡德他尼(Zactima )、吉非替尼(Iressa )或拉帕替尼(Tyverb )在预防和/或治疗HCV感染中的用途。本发明还提供了 AMPK活性抑制剂D0rS0m0rphin、EphA2功能抑制剂达沙替尼(Sprycel )或⑶K家族(包括⑶K3、⑶C2、⑶K2、⑶K4和⑶K8)的良好表征的抑制剂夫拉平度(Alvocidib )在预防和/或治疗HCV感染中的用途。本申请人还表明，埃罗替尼和达沙替尼分别对EGFR和EphA2功能的抑制，阻断了所有主要HCV基因型的进入和在肝移植过程中从HCV感染患者分离的一大组病毒株的进入 (参见实施例2)。因此，本发明提供埃罗替尼或达沙替尼在预防肝移植患者的HCV复发中的用途。在相关方面，本发明提供这些已知的激酶抑制剂中的任何一种在制造预防或治疗 HCV感染与HCV相关疾病的药物中的用途。III-鉴别激酶抑制剂为HCV抗病毒剂的方法如上所述，本发明提供鉴别化合物的方法，所述化合物通过抑制本发明的至少一种激酶的活性减少、抑制或阻抑HCV进入细胞和/或HCV感染。各种分析方案和检测技术是本领域公知的，且可以很容易地为本领域的技术人员用于此目的。这些方法包括但不限于高通量分析(如，微阵列技术、噬菌体展示技术)及体外和体内细胞和组织分析。在某些优选的实施方式中，本发明的方法包括在一定条件下将表达(或可以表达)本发明的至少一种激酶的生物系统与候选化合物一起孵育一段时间，该条件和时间足以使得该候选化合物调节激酶活性；和测量激酶活性。降低激酶活性的候选化合物被鉴别为激酶抑制剂和潜在的HCV抗病毒剂。在某些实施方式中，本发明的方法更具体地包括在一定条件下将表达(或可以表达)本发明的至少一种激酶的生物系统与候选化合物一起孵育一段时间，该条件和时间足以使得该候选化合物调节激酶活性，从而获得测试系统；在没有该候选化合物的情况下，在相同条件下孵育生物系统相同的时间，从而获得对照系统；在测试系统中测量至少一种代表激酶活性的因子；在对照系统中测量该因子；比较在测试系统和对照系统中测量的因子；如果在测试系统测量的因子小于或大于在对照系统中测量的因子，则确定该候选化合物抑制激酶的活性。本文提供的筛选方法将导致HCV抗病毒剂的发现和开发，所述HCV抗病毒剂通过抑制本发明的一种或多种激酶的活性发挥作用。这些药剂可以潜在地用于治疗和/或预防 HCV感染和/或HCV相关疾病和病症。A.生物系统可以使用任何类型的生物系统(即细胞、生物流体、生物组织、或动物)进行本发明的分析和筛选方法。在某些实施方式中，系统是表达(或可以表达)本发明的至少一种激酶的生物实体(例如，细胞、血液样本、组织样品、器官的全部或部分例如肝脏、或动物模型)。在某些实施方式中，生物系统可以受HCV感染(例如，易感HCV的细胞)。在某些实施方式中，可以使用在标准组织培养塑料制品中生长的细胞进行本发明的分析和筛选方法。这些细胞包括所有正常的细胞和来自于任何认可来源的转化的细胞。 优选地，细胞是哺乳动物(人类或动物，如啮齿动物或猿)来源的。更优选地，细胞是人类来源的。哺乳动物细胞可以是任何器官或组织来源(如脑、肝、肺、心、肾、皮肤、肌肉、骨骼、 骨髓或血液等)和任何细胞类型的。合适的细胞类型包括但不限于基底细胞、上皮细胞、 血小板、淋巴细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞、粒细胞、单核细胞、肥大细胞、神经细胞、成神经细胞、巨细胞、树突状细胞、巨噬细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、间质细胞、 枯否细胞(Kupffer cell)、郎格罕氏细胞(Langerhans cell)、衬细胞(littoral cell)、 组织细胞如肌肉细胞和脂肪细胞、去核细胞等。在某些实施方式中，使用HCV易感的并表达本发明的至少一种激酶的细胞进行本发明的分析和筛选方法。这种细胞的例子包括但不限于，肝脏或肝细胞、原代人肝细胞、人类或其他物种的原代细胞、肝细胞瘤细胞、CaCo2细胞、 树突状细胞、胎盘细胞、子宫内膜细胞、淋巴结细胞、淋巴样细胞(B和T细胞)、外周血单核细胞和单核细胞/巨噬细胞。用于实施本发明的分析和筛选方法的细胞可以是原代细胞、次级细胞或永生化细胞(如确立的细胞系)。它们可以通过本领域熟知的技术来制备(例如，可以通过从患者或健康供体抽取血液或活检获得细胞)，或从免疫和微生物商业来源购买(例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA))。可选择地或另外地，可以遗传改造细胞以包含，例如，感兴趣的基因，如表达感兴趣的激酶的基因。在某些实施方式中，用于本发明的筛选方法的细胞具有一种以上的细胞类型。在其他实施方式中，细胞是单一细胞类型。优选地，细胞来自基本上同质的细胞群体，其中，群体中的至少大约80%、优选至少大约90%的细胞是相同的细胞类型。用于本发明的方法的细胞可以来自同一物种的不同受试者或个体。不过，优选地，细胞来自单一受试者或个体。为了进行本发明的分析而选择特定的细胞类型和/或细胞株取决于一些因素，如正在研究其活性的激酶的性质，以及该分析的预期目的。例如，可以使用确立的细胞系优选地进行为了初级药物筛选(即第一轮筛选)而开发的分析，所述确立的细胞系是可商购的， 通常比较容易生长；而可以优选使用原代或次级细胞进行药物开发过程后期使用的分析， 所述原代或次级细胞往往比永生化细胞更难获得、维持和/或生长，但它代表用于体内情况的更好的实验模型。可以用于实施本发明的分析和筛选方法的建立的细胞系的例子包括!fepG2肝细胞瘤细胞、IfepIBB肝细胞瘤细胞、原代肝细胞、Huh7衍生的细胞系和永生化肝细胞。可以用于实施本发明的筛选方法的原代和次级细胞包括但不限于上皮细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞、肌细胞、巨噬细胞、肝细胞、内皮细胞等。用于本发明的分析的细胞可以根据标准细胞培养技术来培养。例如，细胞通常在合适的容器中、无菌的环境下、37°C下、含有加湿的95%空气-5% CO2气氛的培养箱中生长。容器可以含有搅拌或静止的培养物。可以使用不同细胞培养基，包括含有成分不确定的生物流体如胎牛血清的培养基以及成分完全确定的培养基如^3SFM无血清培养基 (Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA) 0细胞培养技术是本领域公知的，且确立的方案可以用于多种细胞类型的培养(例如，参见，R. I. Freshney，“Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique，，,第二版，1987, Alan R. Liss, Inc.)。在某些实施方式中，使用在多孔分析板的多个孔中包含的细胞进行筛选方法。这些分析板是例如可从 Strategene Corp. (La Jolla, CA)和 Corning Inc. (Acton, MA)商购的，且包括例如48孔、96孔、384孔和1536孔板。如果需要，可以在分析之前确定细胞生存力，例如，使用标准的技术，包括组织学、 用放射性同位素定量评估、使用光学或扫描电子显微镜或荧光显微镜目视观察。可选择地， 可以通过荧光活化细胞分选技术(FACS)评估细胞生存力。在其中感兴趣的激酶是非组成型活性激酶的实施方式中，响应于胞外或其他类型的刺激物(本文称为“激酶激活物”)而发生底物分子的磷酸化。因此，在某些实施方式中， 本发明的分析包括在一定条件下将细胞暴露于激酶激活物，并持续一段时间，在这段时间内可以发生激酶的活化并导致底物磷酸化(在没有抑制剂的情况下)。可以用于实施本发明的方法的激酶激活物可以是多种刺激物中的任一种，包括环境应激信号、化学应激信号、 生化刺激及这些刺激的任意组合。本领域的技术人员可以理解，为了开发本发明的分析方法而选择激酶激活物取决于在存在候选化合物的情况下评估其活性的激酶的性质。在涉及组成型活性的激酶(即在没有刺激存在的情况下显示催化底物分子磷酸化的能力的激酶)的实施方式中，本发明的方法不涉及使用激酶激活物的激酶刺激。在本发明的某些方法中，将细胞暴露于试剂、将细胞与试剂接触、或将细胞与试剂孵育包括将试剂加入含有细胞的容器中(例如，多孔板的一个孔)，在一定条件下，在试剂存在下，在合适的培养基中孵育细胞，持续一段时间，使得实现或可以实现特定试剂的预定作用。更具体地说，优选在一定的条件下使细胞暴露于激酶激活物，所述条件允许在缺乏抑制剂的情况下，感兴趣的(非组成型活性)蛋白激酶被激活和底物分子被磷酸化。优选在一定的条件下使细胞暴露于待测试其对于给定激酶的活性的效应的候选化合物，所述条件允许这种激酶活性的已知抑制剂发挥其作用。这些条件或者是本领域公知的，或者可以很容易地由本领域的技术人员，例如，根据经验确定。在某些实施方式中，本发明的分析和筛选方法可以包括在将细胞暴露于不同试剂前使其饥饿(Starve)的步骤。在感兴趣的蛋白质激酶没有组成型活性的情况下，细胞饥饿可能特别有用。可以通过任何合适的方法进行细胞饥饿，例如，通过在无血清或生长补充物的培养基中培养细胞。在某些实施方式中，本发明的分析和筛选方法可以包括固定细胞。 一般进行这一步骤以使细胞保持或“冻结”在一定状态，优选保持细胞结构的精确表示。例如，通常需要维持细胞的原始大小和形状，以最小化细胞材料的损失，和/或保留它的细胞内成分的反应性和/或状态。可以通过本领域熟知的任一种合适的化学和物理方法固定细胞。在某些实施方式中，本发明的分析和筛选方法包括细胞透化(permeabilization)的步骤。进行透化是为了方便进入细胞质或细胞内分子、细胞的组成部分或结构。特别地，透化可以允许药剂进入细胞并在细胞内达到比在缺乏这种透化处理的情况下正常渗入细胞的浓度更大的浓度。可以通过任何适当的方法进行细胞的透化，包括但不限于暴露于去污剂或有机醇。B.候选化合物本发明的筛选方法可以用于鉴别能够抑制至少一种本发明鉴别的激酶的活性的化合物或药剂。进行本发明的筛选一般是为了开发用于预防和/或治疗HCV感染和/或 HCV相关疾病的治疗。如本领域的技术人员所理解的，可以使用本发明的方法测试任一种化合物或药剂。候选化合物可以是合成或天然化合物；它可以是单分子或不同分子的混合物或复合物。 在某些实施方式中，本发明的方法用于测试一种或多种化合物。在其他实施方式中，本发明的方法用于筛选化合物的集合或文库。本文所用的术语“集合”指化合物、分子或药剂的任何集合，而术语“文库”指为结构类似物的化合物、分子或药剂的任何集合。鉴别和表征新的和有用的药物候选物的传统方法一般包括产生化合物的大的集合和/或文库，接着针对已知或未知的靶标进行测试。可以通过本发明的方法测试天然产物和化学化合物。天然产物的集合一般来源于微生物、动物、植物或海洋生物；它们包括聚酮化合物(polyketide)、非核糖体肽和/或其变体(非天然存在的)。化学文库往往包括已知化合物的结构类似物，或者通过天然产物筛选而被鉴别为“命中物”(“hits”)或“先导物”(“leads”)的化合物。化学文库通过传统自动合成、PCR扩增、克隆或专有合成方法相对容易地制备。细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的集合，例如，可以从Pan Laboratories (Bothell, WA)或 Mycc^earch (Durham，NC)获得。可以用于实施本发明的候选化合物的文库可以制备或从许多公司购买。合成化合物文库可以从例如 Comgenex (Princeton, NJ)、Brandon Associates(Merrimack, NH)、Microsource(New Milford，CT)和Aldrich (Milwaukee，WI)的公司商购获得。候选化合物的文库也可以由大的化工企业开发和从其商购,包括例如，Merck、Glaxo Welcome、Bristol-Meyers-Squibb、 Novartis>Monsanto/Searle禾口 Pharmacia Upjohn。此夕卜，天然集合禾口合成产生的文库禾口化合物可以通过传统的化学、物理和生物化学方法容易地修改。本发明的激酶活性的有用的抑制剂可能存在于许多种类的化学品中，包括小分子、抗体、肽、核酸分子、糖类、类固醇等。在某些实施方式中，本发明的方法用于确定为小分子化合物的化合物或药剂。在其他实施方式中，本发明的方法用于筛选小分子文库。优选的有机小分子的分子量大于大约50道尔顿且小于2500道尔顿，优选小于600-700道尔顿， 更优选小于约350道尔顿。通过本发明的试验测试或筛选的候选化合物可以是以前未知具有任何药理活性的化合物，也可以是本领域已知的药物。特别地，如上所述，可以在本领域已知抑制激酶活性的药剂或药剂的衍生物中选择候选化合物。例如，嘌呤环系统被认为是用于寻找各种蛋白激酶的抑制剂的好的起点，且已经开发了 2，6，9_三取代嘌呤库用于上述目的(参见，例如，P. Shultz, Science, 1998,281 :533-538 ；和 Y. T. Chang 等人，Chem Biol. 1999,6 361-375)。同样，ATP结合口袋的保守的和极好确定的性质是用于激酶抑制的最常见和成功的靶标之一。因此，靶向ATP的化合物的文库已经生成，并可以用于本发明的筛选方法。 可选择地，可以在本领域已知可用于治疗与激酶介导的事件引发的异常细胞反应相关或怀疑与其相关的疾病或病理生理病症的药物或药物衍生物中，选择候选化合物。根据本发明的方法筛选文库提供“命中物”或“先导物”，即具备所需的但不是最优化的生物活性的化合物。在开发有用的候选药物中的下一步骤通常包括分析“命中”化合物的化学结构与其生物学或药理活性的关系。通过观察系统性结构修饰对于确定的生物终点的结果，使分子结构和生物活性相关。由第一轮筛选获得的构效关系信息可以用来生成小的二级库，随后对于该二级库筛选具有高亲和力的化合物。进行生物活性化合物的合成修饰以满足临床有用性所需的立体电子、物理化学、药代动力学和毒理学因素的过程被称为先导优化。通过本发明的筛选方法鉴别的候选化合物同样可以经受结构关系分析，并经化学修饰以提供改善的候选药物。本发明还包括这些改善的候选药物。C.激酶活性抑制剂的鉴别根据本发明的筛选方法，测定候选化合物抑制感兴趣的激酶活性的能力包括测量激酶的活性或至少一种代表激酶活性的因子。测定激酶活性的方法是本领域已知的。代表激酶活性的因子(factor)可以是任何合适的因子，包括但不限于表达的激酶的量、磷酸化激酶底物的量、由于激酶底物磷酸化导致的细胞性质的改变等。在本发明的筛选方法中，如果在候选化合物存在的情况下的激酶活性低于不存在候选化合物的情况下的激酶活性，或者如果代表激酶活性的因子在存在和不存在候选化合物的情况下是不同的(较高或较低，根据因子和激酶活性之间的关系而定)，则该候选化合物被鉴别为感兴趣的激酶的抑韦剂。可以使细胞与相同浓度的相同候选化合物孵育来测试结果的可重复性(例如，在分析板的一个以上的孔中)。此外，由于候选化合物可能根据化合物的性质和其作用机理的性质而在不同浓度时有效，可以向含有细胞的不同的孔添加不同浓度的候选化合物。一般地，大约IfM至大约IOmM的浓度用于筛选。优选的筛选浓度为大约IOpM至大约100 μ Μ。 此外，根据本发明的方法筛选不同浓度的候选化合物允许确定该化合物的IC5tl值。在某些实施方式中，本发明的方法进一步包括使用一种或多种阴性或阳性对照化合物。阳性对照化合物可以是已知在筛选方法中抑制研究的激酶活性的任何分子、试剂或药物。阴性对照化合物可以是已知对于研究的激酶活性没有效应的任何分子、试剂或药物。 在这些实施方式中，本发明的方法进一步包括比较候选化合物的效应与阳性或阴性对照化合物的效应(或不存在)。这种阴性和阳性对照化合物是本领域已知的，或可以通过本文所述的方法或由通过任何其他激酶分析来鉴别。如上所述，鉴别为感兴趣的激酶抑制剂的化合物可以通过单一的作用机理抑制激酶的活性。可选择地，它可以通过不同的作用机理的组合抑制激酶活性。例如，该化合物可以抑制(例如，通过排除、反转或破坏)激酶激活物与其细胞表面受体的结合。可选择地， 该化合物可以支持或刺激激酶激活物与其细胞表面受体的结合。该化合物可以，另外地或者可选择地，防止或支持下游细胞内蛋白激酶的活化，和/或可以影响磷酸基团向底物分子的转移。D.激酶活性的候选抑制剂的表征如本领域的技术人员所理解的，一般需要通过本发明的筛选方法或本领域已知的激酶抑制剂进一步表征激酶抑制剂。例如，如果候选化合物已在细胞培养系统(例如，建立的细胞系)中被鉴别为感兴趣的激酶活性的抑制剂，可能需要在不同的细胞培养系统(例如，原代或次级细胞)中测试这种能力。可选择地或另外地，可能需要直接测试化合物对于HCV进入细胞和/或细胞的 HCV感染的效应(参见，例如，描述HCVpp系统和HCVcc系统的应用的实施例2)。也可能需要进行药代动力学和毒理学研究。也可以在允许测定化合物的体内性质的分析中，进一步测试通过本发明的筛选方法鉴别为激酶抑制剂的候选化合物。合适的动物模型包括但不限于已经开发用于HCV感染研究的用人类肝细胞重构(!^populated)的嵌合转基因小鼠(Mercer，2001)。这些动物是通过将正常的人类肝细胞移植进入携带纤溶酶原激活物转基因的SCID小鼠(Alb-uPA) 而产生的。Alb-uPA转基因的表达对于有利于肝细胞植入的小鼠肝细胞是细胞毒性的。与 SCID小鼠回交允许异种肝细胞的移植和重构(!^population)。一旦人类肝细胞被稳定地移植到SCID/Alb-uPA小鼠，这些动物可以感染人类嗜肝病毒，包括丙型肝炎病毒。人类SCID/Alb-uPA小鼠模型已经成功地用于研究中和抗体用于控制HCV感染的效力(Law， 2008)以及抗病毒的效力(Vamrolleghem，2007)。其他小鼠模型包括表达HCV蛋白的转基因小鼠(参见Barth，2008的综述)和黑猩猩(Kato，2008)。本文所述的系统可以被制成试剂盒。例如，表达本文公开的一种或多种激酶的细胞或表达本文公开的一种或多种激酶并能够持续HCV复制的细胞或其细胞裂解产物可以包装在各种容器中，例如，小瓶、管、微量滴定孔板、瓶等。其他试剂可以包含在单独的容器中，并用试剂盒提供，例如，阳性对照样品或化合物、阴性对照样品或化合物、缓冲液、细胞培养基、特异性检测探针等。IV-HCV感染与HCV相关疾病的治疗或预防本发明涉及用于治疗和/或预防HCV感染和/或HCV相关疾病的新的治疗方案， 其用于靶向由本申请人鉴别为靶标的至少一种人蛋白激酶。更具体地，本发明提供用于治疗或预防受试者的HCV感染或HCV相关疾病的方法，包括向受试者施用有效量的抑制本发明鉴别的激酶活性的药剂的步骤。A.适应症本发明的蛋白激酶抑制剂可用于治疗和/或预防HCV感染或治疗和/或预防肝疾病或影响HCV-易感细胞(例如肝细胞、淋巴细胞或单核细胞/巨噬细胞)的病理状态的治疗和预防方法。在本发明的实践中，蛋白激酶抑制剂通过抑制本发明的激酶的活性干扰 HCV-宿主细胞的相互作用，从而减少、抑制、阻断或防止HCV进入细胞和/或细胞的HCV感染。本发明治疗方法可使用本发明的蛋白激酶抑制剂或含有本发明的蛋白激酶抑制剂的药物组合物(见下文)完成。这些方法通常包括给予需要的受试者有效量的至少一种蛋白激酶抑制剂或其药物组合物。给药可使用本领域技术人员已知的任何方法进行。具体地，蛋白激酶抑制剂或其组合物可通过各种途径给予，包括但不限于气溶胶、肠胃外、口服或局部途径。通常，本发明的蛋白激酶抑制剂或组合物以有效量给予，即足以达到其预定目的的量。根据待治疗的受试者的年龄、性别、体重、总体健康状况、期望的生物或医学反应(例如防止HCV感染或治疗HCV相关的肝疾病)等，给予的蛋白激酶抑制剂和药物组合物的精确量将不同。在许多实施方式中，有效量是抑制激酶活性从而抑制或防止HCV进入受试者易感细胞和/或感染受试者细胞从而防止HCV感染、治疗或防止受试者肝疾病或另外的HCV 相关的病理状况的量。本发明的蛋白激酶抑制剂和组合物可用于多种治疗和预防方法。具体地，本发明提供了治疗或预防受试者的HCV相关肝疾病或病理状况的方法，该方法包括给予受试者有效量的抑制本发明激酶活性从而抑制HCV进入或感染受试者细胞的本发明蛋白激酶抑制剂(或其组合物)，从而治疗或预防受试者的肝疾病或病理状况。肝疾病或病理状况可以是与HCV感染相关的肝的炎症、肝纤维化、硬化和/或肝细胞癌(即肝癌)。本发明也提供了治疗或预防受试者的HCV相关的疾病或病症(包括肝疾病)的方法，该方法包括给予受试者有效量的抑制本发明激酶活性从而抑制HCV进入或感染受试者细胞的本发明的蛋白激酶抑制剂(或其组合物)，从而治疗或预防受试者的HCV相关的疾病或病症。在本发明的某些实施方式中，蛋白激酶抑制剂或组合物给予诊断为患有急性丙型肝炎的受试者。在本发明的其它实施方式中，蛋白激酶抑制剂或组合物给予诊断为患有慢性丙型肝炎的受试者。根据该方法给予本发明的蛋白激酶抑制剂或组合物可导致患者遭受的至少一种症状得到改善，包括但不限于，急性丙型肝炎症状例如食欲下降、疲劳、腹痛、黄疸、瘙痒和流感样症状；慢性丙型肝炎症状例如疲劳、体重明显降低、流感样症状、肌肉痛、关节痛、间歇性的低度发烧、瘙痒、睡眠障碍、腹痛、食欲改变、恶心、腹泻、消化不良、认知改变、抑郁、 头痛和情绪不稳；肝硬化症状例如腹水、擦伤和流血倾向、骨痛、脉管曲张(特别是胃和食道中)、脂肪痢、黄疸和肝性脑病；和与HCV相关的肝外表现症状例如甲状腺炎、迟发性皮肤卟啉病、冷球蛋白血症、肾小球肾炎、干燥综合征、血小板减少症、扁平苔藓、糖尿病和B-细胞淋巴增殖性疾病。可选择地或另外地，根据本发明的方法给予本发明的蛋白激酶抑制剂或组合物可减缓、降低、停止或减轻HCV感染或HCV-相关疾病的进展，或逆转该进程至消除感染或疾病的点。根据这类方法给予本发明的蛋白激酶抑制剂或组合物也可导致病毒感染数量减少、 感染性病毒颗粒数目的减少和/或病毒感染细胞的数目减少。根据本发明的治疗的效果可使用本领域已知用于诊断HCV感染和/或肝病的任意分析方法来监测。这类分析包括但不限于，血清学血液测试、肝功能检测，以测定一种或多种白蛋白、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)和γ-谷氨酰转肽酶(GGT)，及使用不同技术的分子核酸检测，例如聚合酶链式反应(PCR)、转录介导的扩增(TMA)或分支 DNA (bDNA)。本发明的蛋白激酶抑制剂和组合物也可使用免疫疗法。相应地，本发明提供降低由于与HCV接触而使易感细胞被HCV感染的可能性的方法。该方法包括将易感细胞与有效量的本发明的激酶抑制剂或组合物接触，该蛋白激酶抑制剂或组合物抑制本发明激酶的活性从而抑制HCV进入或感染易感细胞，因此降低由于与HCV接触而使细胞被HCV感染的可能性。本发明也提供降低受试者的易感细胞由于与HCV接触而被HCV感染的可能性的方法。 在该方法中，可通过给予受试者本发明的蛋白激酶抑制剂或组合物来使易感细胞与本发明的蛋白激酶抑制剂或组合物接触。降低易感细胞或受试者被HCV感染的可能性意味着降低易感细胞由于与HCV接触而被HCV感染的机率。该降低可为任何有意义的量，例如，至少2倍的降低，多于2倍的降低，至少10倍的降低，多于10倍的降低，至少50倍的降低，多于50倍的降低，至少100倍的降低或多于100倍的降低。在某些实施方式中，受试者在给予本发明的蛋白激酶抑制剂或组合物之前感染 HCV。在其它实施方式中，受试者在给予本发明的激酶抑制剂或组合物之前未被HCV感染。 在再其它的实施方式中，受试者没被HCV感染，但是暴露于HCV。在某些实施方式中，受试者被HIV或HBV感染。
22
例如，本发明的方法可以用于降低受试者的易感细胞由于肝移植而被HCV感染的可能性。如上面已提及的，当患病的肝从感染HCV的患者摘除时，血清病毒水平直线下降。然而，在接受健康的肝移植后，病毒水平反弹并且可以在几天内超过移植前的水平 (Powers, 2006)。肝移植患者可以受益于给予抑制、阻断或防止HCV进入细胞的本发明的蛋白激酶抑制剂。可在肝移植前、肝移植过程中和/或肝移植后进行给药。其它可受益于给予本发明的激酶抑制剂或组合物的受试者包括但不限于，感染 HCV的母亲生产的婴儿，特别是母亲也为HIV-阳性的情况；已经与被HCV污染的血液或血液污染的医疗器械接触的卫生保健工作者；通过共享注射或以其它方式施用药物的设备而暴露于HCV的药物使用者；和通过感染控制不良的程序纹身、耳/体穿孔和针灸而暴露于 HCV的人。可受益于给予本发明的蛋白激酶抑制剂或组合物的其它受试者包括但不限于，表现出一种或多种已知增加HCV疾病进展速率的因素的受试者。这些因素包括，特别是，年龄、性别(男性通常比女性显示更快的疾病进展)、饮酒、HIV协同感染(与显著增加的疾病进展速率有关)和脂肪肝。在某些实施方式中，根据本发明的治疗方法单独给予本发明的蛋白激酶抑制剂或组合物。在其它实施方式中，本发明的激酶抑制剂或组合物与至少一种另外的治疗剂组合给药。本发明的激酶抑制剂或组合物可在给予治疗剂前给药、与治疗剂同时给药和/或给予治疗剂后给药。可与发明的激酶抑制剂或组合物组合给药的治疗剂可选自众多的本领域已知有益于治疗、控制或预防HCV感染或HCV相关的疾病或状态的生物活性化合物。这类治疗剂包括特别是抗病毒剂，包括但不限于干扰素(例如，α干扰素和聚乙二醇化的α干扰素)、 利巴韦林、抗HCV(单克隆或多克隆)抗体、RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、IRES抑制齐IJ、 解旋酶抑制剂、反义化合物、核酶及其任何组合。B.给药希望剂量的本发明的蛋白激酶抑制剂(任选地与一种或多种合适的可药用载体或赋形剂配制后)可以以任何合适的方式给予需要的受试者。各种不同的递送系统是已知的且可用于给予本发明的激酶抑制剂，包括片剂、胶囊、注射溶液、脂质体胶囊、微粒、微胶囊等。给药方法包括但不限于，表皮、皮内、肌内、腹膜内、病灶内、静脉内、皮下、鼻内、经肺、 硬膜外、经眼和口服途径。本发明的激酶抑制剂或组合物可以通过任何方便或另外合适的途径给药，例如，通过输注或快速注射(bolus injection)、通过上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔、粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收。可全身性或局部给药。肠胃外给药优先指向患者的肝，例如通过插管到肝动脉或到胆管中。如本领域的技术人员所理解的，在本发明的蛋白激酶抑制剂与另外的治疗剂联合给药的实施方式中，该激酶抑制剂和治疗剂可通过同样的途径(例如，静脉内)或不同的途径(例如，静脉内或口服)给药。C.剂量本发明的激酶抑制剂(或组合物)的给药剂量为使得输送的量有效达到预期的目的。给药途径、剂型和给药剂量取决于所需的治疗效果、需要治疗的HCV感染或HCV相关病症(如果已经存在)的严重程度、任何其他感染的存在、患者的年龄、性别、体重和总体健康状况以及取决于使用的激酶抑制剂或组合物的效力、生物利用度和体内半衰期、伴随治疗的使用(或未使用)和其它临床因素。这些因素可容易地在治疗过程中由主治医生确定。 可选择地或另外地，给药剂量可通过使用动物模型(例如，猩猩或小鼠)的研究确定。基于这些或其它方法调整剂量以达到最大效果是本领域熟知的，并且在训练有素的医生的能力内。随着使用本发明的激酶抑制剂的研究的进行，将会给出与合适的剂量水平和治疗进程相关的进一步信息。根据本发明的治疗可由单剂或多剂组成。因此，给予本发明的激酶抑制剂，或其组合物，可在某段时间内或定期的和以特定的间隔例如，每小时、每天、每周(或按照其它多天的间隔)、每月、每年(例如，以延时释放的形式)持续。可选择地，在给定的时间段内可进行多次给药，例如，每周两次或更多次；每月两次或更多次等。给药可以是一段时间内的持续给药，例如，静脉内给药。总的说来，优选激酶抑制剂的给药量在约lng/kg至约100mg/kg受试者体重的范围内，例如，在约lOOng/kg和约50mg/kg受试者体重之间，或者在约1 μ g/kg和约10mg/kg 受试者体重之间，或者在约100μ g/kg和约lmg/kg受试者体重之间。V-药物组合物如上所述，本发明的蛋白激酶抑制剂可以以自身形式给药或以药物组合物的形式给药。相应地，提供含有有效量的本文所述的激酶抑制剂和至少一种可药用的载体或赋形剂的药物组合物。在一些实施方式中，组合物进一步包含一种或多种另外的生物活性剂。本发明的激酶抑制剂和药物组合物可以以任何量和使用任何给药途径给药以有效地达到所需的预防和/或治疗效果。最佳的药物剂型可根据给药途径和所需的剂量变化。这类剂型可影响给予的活性成分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。本发明的药物组合物可以配制成单位剂量形式以易于给药和达到剂量均勻性。此处使用的表述“单位剂量形式”指用于需要治疗的患者的本发明的激酶抑制剂的物理分散单元。然而，应理解的是组合物的总的日剂量可由主治医生在合理的医学判断的范围内决定。A.制剂注射用制剂，例如无菌的注射用水性的或油性的悬浮液可根据已知的技术使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制。无菌的注射制剂也可为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、悬浮液或乳液，例如，作为2，3_ 丁二醇中的溶液。可使用的可接受载体和溶剂为水、林格氏溶液(Ringer' s solution) ,U. S. P.和等渗氯化钠溶液。另外，通常使用无菌的非挥发油作为溶液或悬浮介质。出于该目的，可使用任何温和的非挥发油，包括合成的单-或二-甘油酯。脂肪酸例如油酸也可用于注射制剂的制备。无菌的液体载体用于在肠胃外给药的无菌液体形式的组合物中。注射用制剂可以是灭菌的，例如，通过阻挡细菌的过滤器过滤，或通过引入无菌固体组合物形式的灭菌剂，该固体组合物可在使用前溶解或分散到无菌水或其它无菌的注射介质中。作为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物可通过，例如静脉内、肌内、腹膜内或皮下注射给药。注射可通过单次推注或逐步输注进行。当必要或希望时，组合物可包括局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。为延长活性成分(本处指激酶抑制剂)的作用，通常希望减慢从皮下或肌内注射的成分的吸收。延迟肠胃外给药的活性成分的吸收可通过溶解或悬浮该成分在油性载体中达到。可注射的储库形式通过在可生物降解的聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成活性成分的微胶囊化基质来制备。根据活性成分与聚合物的比率和使用的具体聚合物的性质， 成分释放的速率可得到控制。其他的可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚 (酸酐)。可注射的储库制剂也可通过将活性成分捕获在脂质体或与人体组织相容的微乳液中来制备。口服给药的液体剂型包括但不限于，可药用乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆剂、 酏剂和加压组合物。除激酶抑制剂外，液体剂型可包含本领域通常使用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂外，口服组合物也可包括助剂例如湿润剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、和芳香剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。适合口服给药的液体载体的实例包括水(可能含有上述添加剂如纤维素衍生物，例如羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇例如二醇类)及其衍生物和油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于加压组合物，液体载体可为商代烃或其他可药用推进剂。口服给药的固体剂型包括，例如，胶囊、片齐IJ、丸齐IJ、粉末剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，本发明的激酶抑制剂可与至少一种惰性的、生理可接受的赋形剂或载体(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)和一种或多种以下成分混合(a)填充剂或扩充剂，例如淀粉、乳糖、 蔗糖、葡萄糖、甘露醇(marmital)和硅酸；(b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、 聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如甘油；(d)崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙、土豆或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(e)溶液缓凝剂(solution retarding agent)，例如石蜡；吸收加速剂例，如季铵化合物；(g)湿润剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸收剂，例如高岭土和膨润土 ；和⑴润滑剂例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物。其他适合于固体制剂的赋形剂包括表面改性剂例如非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性实例包括但不限于，泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、十八醇十六醇混合物、聚西托醇(cetomacrogol)乳化蜡、山梨糖醇酯、 胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸镁铝和三乙醇胺。在胶囊、片剂和丸剂的情况，该剂型也可含有缓冲剂。在使用赋形剂例如乳糖和高分子量聚乙二醇等的软和硬填充明胶胶囊中，类似类型的固体组合物也可作为填充剂使用。片剂、锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可具有包衣和壳例如肠溶包衣、控释包衣和其它在药物制剂领域熟知的包衣。它们可任选地含有遮光剂且也可为使得仅释放一种活性成分，或优选地在肠道内的特定部位任选地以延释的方式释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。在某些实施方式中，可能希望的是局部地给予本发明的组合物到需要治疗的区域 (例如，肝)。这可通过，例如但不限于手术(例如，肝移植)过程中的局部灌注、局部施用、 通过注射、通过插管的方式、通过栓剂的方式或通过皮肤贴片或支架或其它植入物的方式来达到。对于局部给药，组合物优选配制为凝胶、软膏、洗剂或乳膏，其可含有载体例如水、 甘油、醇、丙二醇、脂肪醇、甘油三酯、脂肪酸酯或矿物油。其它局部载体包括液体石油、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇(95%)、聚氧乙烯单月桂酸酯(5%)的水溶液或十二烷基硫酸钠 (5%)的水溶液。必要时可添加其他物质例如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂和类似试剂。另外，在某些情况下，本发明的组合物预期可布置在置于皮肤上、皮肤中和皮肤下的透皮装置内。这类装置包括通过被动或主动释放机制释放活性成分的贴片、植入物和注射装置。透皮给药包括跨越体表和身体通道的内衬(包括上皮和粘膜组织)的所有给药。 这种给药可使用洗剂、乳膏、泡沫、贴片、悬浮液、溶液和栓剂(直肠和阴道)中的本发明组合物实施。透皮给药可通过使用含有活性成分(即，激酶抑制剂)和对皮肤无毒并使得用于系统性吸收的成分经由皮肤递送到血流中的载体的透皮贴片来实现。载体可采用多种形式，例如乳膏和软膏、浆料、凝胶和封闭装置。乳膏和软膏可为粘性液体或水包油或油包水型的半固体乳液。由分散在含有活性成分的石油或亲水石油中的吸收性粉末组成的浆料可能是适合的。多种封闭装置可用于释放活性成分到血流中，例如覆盖包含具有或没有载体的活性成分的储库的半渗透膜，或含有活性组分的基质。栓剂可由传统材料制备，包括可可脂(添加或不添加蜡以改变栓剂的熔点)和甘油。也可使用水溶性栓剂基质，例如具有不同分子量的聚乙二醇。当本发明的药物组合物用作防止HCV易感细胞被HCV感染的“疫苗”时，药物组合物可进一步包含本领域已知的疫苗载体，例如，甲状腺球蛋白、白蛋白、破伤风类毒素和聚氨基酸例如D-赖氨酸和D-谷氨酸的聚合物。该疫苗也可包括多种公知的佐剂中的任何一种，例如，不完全弗氏佐剂、明矾、磷酸铝、氢氧化铝、单磷酰脂质A(MPL，GlaX0SmithKline)、 皂苷、CpG寡核苷酸、Montanide、维生素A和由可生物降解的油(例如角鲨烯和/或生育酚)制备的各种油包水乳液、Quil A、Ribi Detox、CRL-1005、L-121及其组合。制备各种不同制剂的材料和方法为本领域已知，且可适用于实施本发明。合适的用于递送抗体的制剂可在，例如，“Remington' s Pharmaceutical Sciences “， Ε. W. Martin, 18th Ed. , 1990, Mack Publishing Co. =Easton, PA. B. Additional Biologically Active Agents 中发现。B.另外的生物活性剂在某些实施方式中，激酶抑制剂为本发明的药物组合物中仅有的活性成分。在其它实施方式中，药物组合物进一步包括一种或多种生物活性剂。合适的生物活性剂的实例包括但不限于，疫苗佐剂和治疗剂例如抗病毒剂(如上所述)、抗炎剂、免疫调节剂、镇痛剂、抗微生物剂、抗菌剂、抗生素、抗氧化剂、防腐剂及其组合。适用于实施本发明的抗病毒剂包括但不限于对相同蛋白激酶具有效果的抗病毒剂、对不同靶分子(即，不是蛋白激酶或不是相同的蛋白激酶)(包括参与病毒进入、病毒内化、病毒复制和/或病毒释放的靶分子)具有效果的抗病毒剂，防止或减少病毒抗性发生的抗病毒剂，等等。本发明的激酶抑制剂也可以与诱导IFN表达的药剂联合使用。本发明的抗病毒组合提供一种治疗手段，该治疗手段不仅可以减少抗病毒活性所需的任一种药物的有效剂量，从而降低毒性，而且由于通过多种机制攻击病毒可以提高绝对抗病毒效果。类似地，该组合提供一种防止对单一治疗发生病毒抗性的手段，从而提供更有效的治疗。在本发明的药物组合物中，激酶抑制剂和另外的治疗剂可结合在用于同时、分别或顺序给予激酶抑制剂和治疗剂的一种或多种制剂中。更具体地，本发明的组合物可以配制为使得激酶抑制剂和治疗剂可以一起给药或彼此独立地给药。例如，激酶抑制剂和治疗剂可一起配制在单一组合物中。可选地，它们可单独地保持(例如在不同的组合物中和/ 或容器中)和给药。C.药物包装或试剂盒在另一方面，本发明提供了包含含有本发明药物组合物的一种或多种组分的一个或多个容器(例如小瓶、安剖瓶、试管、烧瓶或窄颈瓶)的药物包装或试剂盒，使得可以给予本发明的激酶抑制剂。药物包装或试剂盒的不同组分可以以固体(例如冻干的)或液体形式提供。各成分通常适当地作为在各自容器中的等分试样或以浓缩的形式提供。药物包装或试剂盒可以包括用于冻干成分重构的介质。试剂盒的单个容器优选保持在封闭空间中以用于商业销
佳口。在某些实施方式中，药物包装或试剂包含一种或多种另外的治疗剂(例如一种或多种抗病毒剂，如上所述)。任选地，在容器上有管理药物或生物制品的生产、使用或销售政府部门规定的形式的告示或者包装插页，该告示表明了管理部门对生产、使用或销售的批准以用于人类施用。告示或包装插页可含有根据本文公开的治疗方法使用药物组合物的使用说明。例如条形码、无线射频、ID标签等的标识物可存在于试剂盒内或试剂盒上。标识物可用于例如唯一地确定试剂盒以达到质量控制、库存控制、工作区之间的跟踪运动等的目的。
实施例以下实施例描述了一些实现和实施本发明的优选方式。但是，应该理解的是这些实施例仅是出于说明目的，并不意图限制本发明的范围。另外，除非实施例中的说明以过去形式呈现，该表述如说明书其它部分一样，并不意图表明实验事实上已经实施或者数据实际上已经得到。下面报告的一些结果已经在第15届丙型肝炎病毒和相关病毒国际研讨会(15th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses,Antonio,Texas, USA, 5-9 October, 2008)上介绍，并且由 J. Lupberger 等人在标题为 “Identification of cellular kinases as co-factors for hepatitis C virus entry using a functional high-throughput siRNA screen”的摘要中对其进行了概述。以下报告的其他结果是提交给 Molecular Systems Biology 的手禾高主题(J. Lupberger 等人，“Genome-wide analysis of human kinases as host factors for hepatitis C virus entry”)。实施例1 作为HCV进入的辅助因子的宿主细胞激酶的初步鉴别1.材料和方法细胞和复制子。在本研究中使用的HEK 293T、Huh7和Huh7. 5. 1细胞以前已被描述过(Bartosch,2003 ；Barth,2003 ；Zhong，2005)。如以前所描述的(David，1998，其全部内容通过引用方式结合在本文中)，分离和培养原代人肝细胞。如以前所描述的(Kato，2005)， 在此使用亚基因组HCV复制子JFH1-SGR。
逆转录病毒HCV和VSV拟颗粒的产生。如之前所描述的(Bartosch，2003 ；Barth, 2006)，产生由H77衍生的HCVpp和VSVpp。不含包装糖蛋白(对照pp)的拟颗粒(pp)用作阴性对照(Barth，2003)。为了在Huh7感染后获得相等的萤光素酶活性，调节HCVpp和 VSVpp制剂。重组HCV的产生和感染分析。双顺反子质粒Pi7K-Luc-Jcl (Koutsoudakis，2006) 编码萤光素酶报道基因和被称为Jcl的由J6CF和JFHl片段构成的嵌合HCV基因组。如以前所描述的(Wakita，2005)，进行体外HCV RNA合成和RNA转染。澄清来自转染的细胞的培养上清液，且如上所述使用Amicon Ultra 15 (Millipore, USA)进行浓缩，直接使用或贮存在4°C或-80°C下。通过使用具有少许微小变化的有限稀释分析，在Huh7. 5. 1细胞上滴定病毒，并基于以前描述的方法(LindenbaCh，2005)计算TCID50值。使用siRNA的高通量基因沉默化。人激酶SiRNA套装版本2. 0 (Qiagen,德国)由 4个独立siRNA/靶基因的691个集合(pool)构成，并用于沉默化Huh7细胞中的691种细胞激酶和相关蛋白。使用1 μ L的Interferrin转染试剂(Polyplus，法国)和3. 5pmol siRNA来反向转染5，000个细胞/0. 3cm2。转染72小时后，除去上清液，使用50 μ L HCVpp和 VCVpp并排感染细胞。在37°C下培养6小时后，添加100 μ L新鲜的细胞培养基，感染48小时后，除去完全细胞培养上清液，并使用IOOyL Glo裂解缓冲液(Pr0mega，USA)裂解细胞。 细胞裂解10分钟后，在高通量发光计(Berthold，德国)上，使用25% (v/v)Bright-Glo萤光素酶底物(Promega，USA)测量萤火虫荧光素酶活性。使用Dc蛋白分析试剂盒(Biorad， USA)，通过总蛋白标准化来评估比感染性。新的HCV进入因子的鉴别。通过HCVpp进入的增加或降低(与转染有非特异性siRNA的细胞相比)来定义基因沉默的影响。具体而言，如以前描述的(Ploner，2006 ； Raffelsberger, 2008 ；Wettenhall，2004)，进行统计学分析，从而在不损害真阳性测试结果 (II型误差)的情况下，确保假阳性(I型误差)的最大降低。对HCV进入的HCV特异性影响在并排实验(HCV特异性作用HCV进入显著降低，VSVpp进入未明显改变或增加，反之亦然)中被确定为对对照病毒(VSVpp)的进入不存在明显类似的影响。此外，对病毒进入机理具有潜在普遍重要性的蛋白激酶被确定，沉默化该激酶的相应基因导致HCV病毒进入细胞显著减少(如果可重复性是统计学显著的话，等于> 80%的HCV进入的抑制)，不考虑基因沉默化对VSVpp进入所引起的改变。通过二级siRNA筛选确定了鉴别的候选激酶对感染性 HCV生命周期的影响，该筛选测量(如对上述pp-siRNA筛选所述)候选基因沉默化对HCVcc 感染的影响。此外，为了确保二级HCVcc-siRNA筛选的特异性，如以前所述(Cole，1986)，并排测试转染的siRNA的MTT-细胞毒性检测。使用蛋白激酶抑制剂对HCV感染的抑制。在本研究中使用的所有抑制剂均是从LC Laboratories(USA)获得的。使用之前，将它们溶解在DMSO中，并在Huh7. 5. 1细胞培养基中进行稀释(Zhong，2005)。培养之后，如以前所报道的(Pestka，2007 ；Zeisel，2007)，通过萤光素酶报道基因的表达和细胞中HCV RNA的RT-PCR来评估HCVpp的进入和HCVcc的感
^fe οNorthern印迹法。通过使用NEBlot试剂盒(NEB，USA)，使用α 32P-CTP将用 Xbal和EcoRI消化质粒JKHl (ffakita, 2005)得到的9. 7kb片段进行标记。根据标准方案 (F. M. Ausubel 等人，"Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley !Sons,Inc.，2007)进行 Northern 印迹法。2.作为HCV进入的辅助因子的宿主细胞激酶的鉴别使用现有技术一功能性高通量siRNA HCVpp进入筛选，本发明人已经鉴别出两组宿主细胞激酶。第一组激酶对HCVpp的进入显示出显著的、特异性的抑制，但不影响不相关的对照病毒(VSVpp)的进入。第二组激酶对HCVpp的进入/感染显示出显著的抑制，不考虑基因沉默对VSVpp进入所引起的改变。通过应用选择标准，在691种激酶和相关蛋白质的基因中沉默化69种基因导致对 HCVpp进入的特异性功能性影响，但不影响不相关的对照病毒(VSVpp)的进入。在图1中示出的 69 种激酶是FGR、CHUK、PSKH1、DGKB、ILK、CKS1B、PLK3、GKAP1、CALM2、RPS6KA5、MAGI1、 LTK、ITPKA, PIP5K2A、ADK、STK11、CDKN1B、CHKB, BUBIB, STK38、TYK2、PRKCABP、EGFR、CSK, AK3、FER、PRKD2、CDKL3、PDIK1L、CKMTl、CDKN2C、CDK2、CAMK2G、EPHB4、GAK, PACSIN2、SGK2、 DCAMKL1、MAP3K13、IRAK2、ARAF、PAK4、MAPK7、ATR、SRC、PTK2B、EPHB1、BCR、EPHA2、PIP5K2B、 CDK3、STK24、MKNK2、PKMYTU FES, ACVR2B、MAP2K1 IPl、APEGl、JAKU AURKB, CHKA, PRKACG, DDR2、PIK3C2A、ADRBK1、CALM3、FASTK、TOE1和JAK2。鉴别的匹配选择标准的激酶数目对应于所研究的基因总数的10%。有意思的是，鉴别的分子包括可用在确定药物的治疗干预中的 9 种激酶。这 9 种激酶是CHUK、EGFR、CDK2、EPHB4、SRC、BCR、EPHA2、CDK3 和 AURKB。在691种激酶中沉默32种激酶导致对HCV进入的极度抑制，不考虑基因沉默对 VSVpp进入所引起的改变。在图2中示出的这32种激酶是FN3K、CIB2、BCKDK、NEK9、STK33、 BRAF,STK22C、PI4KII、RIOKl、CKB、Sharpin、RPS6KL1、FLT3LG、HIPK3、CDC2、ERBB4、CDC2L1、 PANK3、SKIP、MAP4K5、ATM、CDK4、KIAA1446、BMP2K、BMX, CDK8、TNK2、NEK4、EPHA3、FGFR4、 MAP3K7IP1和MAPKAP1。鉴别的匹配选择标准的激酶数目对应于所研究的基因总数的约 5%。鉴别的分子包括可用在确定药物的治疗干预中的5种激酶，即BRAF、⑶C2、ERBB4、 CDK4 和 CDK8。为了证实通过HCV进入筛选鉴别的候选分子的功能性影响，本发明人已经分析了鉴别的基因产物对肝细胞瘤细胞感染的影响，该分析使用不同基因型的HCVpp和细胞培养物来源的感染性HCV (HCVcc)。作为通过siRNA HCVpp进入筛选来鉴别HCV辅助进入因子的可靠性和可行性的例子，本发明人已经表明，沉默化激酶EphA2显著和特异性地抑制了来自所有主要基因型的HCVpp的进入，并显著抑制了 Huh7. 5人肝细胞瘤细胞的HCVcc感染。有意思的是，蛋白激酶EphA2已显示通过磷酸化密蛋白(CLDN)蛋白家族的成员来调节细胞紧密连接的渗透性(Tanaka，2005)，且HCV非结构性蛋白NS4B向上调节EphA2的表达(Zheng，200 。EphA2在肝脏和人原代肝细胞和人肝细胞瘤细胞系中表达。这对于在分子水平上理解HCV进入具有重要意义，因为密蛋白家族的成员已表明代表Huh7肝细胞瘤细胞中HCV感染的关键宿主辅助因子(Evans，2007 ；Meertens，2008)。3.抑制HCV进入和感染的激酶抑制剂鉴别EphA2为推定的HCV辅助进入因子对于研发针对HCV进入的新型抗病毒策略也具有意义，因为已表明EphA2是达沙替尼的靶标(Huang，2007)，达沙替尼是用于治疗慢性骨髓性白血病的临床上许可的激酶抑韦剂。为了研究达沙替尼(针对EphA2的蛋白激酶抑制剂)是否抑制HCV的进入和感染， 本发明人已经将肝细胞瘤细胞与达沙替尼一起进行培养，并随后研究了达沙替尼对HCVpp进入和HCVcc感染的影响。据发现，在类似于临床治疗恶性血液病中所用的浓度的浓度下，达沙替尼以剂量依赖性方式显著影响HCVpp进入(H77c株-基因型la)和HCVcc感染 (JFH-1株-基因型2a)。使用HCV亚基因组复制子(JFH1株，Kato, 2005)的进一步分析表明，达沙替尼事实上特异性靶向HCV进入，而不是在病毒复制过程中的病毒-宿主相互作用。使用靶向表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂获得了相似的结果，该受体在本研究中也被鉴别为用于HCV进入的辅助因子。据发现，在类似于临床使用的治疗浓度的浓度下，埃罗替尼、凡德他尼、吉非替尼或拉帕替尼以剂量依赖性方式显著抑制huh7. 5. 1细胞的HCVcc感染(参见图3)。总之，一组宿主细胞激酶已被鉴别为新型HCV辅助因子，包括EphA2和EGF受体家族的成员。此外，HCV激酶相互作用代表用于针对HCV感染的治疗干预的新型和独创靶标， 如蛋白激酶抑制剂达沙替尼有效抑制HCV进入和感染所示。实施例2 作为HCV进入的辅助因子的宿主细胞激酶的精细鉴别1.材料和方法试剂和抗体。人激酶SiRNA套装版本2. 0 (4种siRNA的集合)和siRNA个体获自Qiagen。埃罗替尼(Tarceva )、达沙替尼(Sprycel )、吉非替尼(Iressa )、凡德他尼 (Zactima )和拉帕替尼(Tykerb )获自IC Laboratories，TpIII激酶抑制剂和渥曼青霉素获自 Calbiochem,Flavopiridol,Dorsomorphin 获自 Sigma-Aldrich0 抗 EphA2 C-20 禾P 蛋白A/G-琼脂糖珠粒获自Santa Cruz Biotechnologies，EGFR获自Millipore，且碱性磷酸酶标记的第二抗体获自GE Healthcare.细胞系、原代肝细胞和复制子。同上。基因组范围的RNAi 激酶 HCV 进入筛选。在 Transfected Cell Array (TCA)， Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire(IGBMC) in Illkirch, France平台上进行筛选。用于该筛选的文库是来自Qiagen的人激酶siRNA 套装版本2. O (4种siRNA的集合)。siRNA个体获自Qiagen。如图4所示，建立针对691种细胞激酶和相关蛋白质的功能性HCV进入siRNA筛选。对于每个靶标，使用 Interferrin(Polyplus)以 5，000 个 Huh7 细胞/0. 3cm2 反向转染 3. 5pmol siRNA。siRNA 转染三天后，使用携带萤光素酶报道基因的HCV假型颗粒(HCVpp H77C ；基因型la) (Bartosh, 2003 ；Pestka,2007)研究基因沉默化对病毒进入的影响。并排分析对VSVpp进入的影响。 使用具有 Mithras LB 940 发光计(Berthold Technologies)的 Bright Glo 萤光素酶分析系统(Promega)，通过测量细胞裂解产物中报道基因萤光素酶的活性，评估感染两天后的病毒进入。使用获自同一 siRNA文库(Qiagen)的四种不同的单个siRNA沉默化同一靶标 mRNA，独立确定命中物(hit)。通过如上所述的相同方案在Huh7. 5. 1细胞中使用HCVcc株 Luc-Jcl(Dimitrova, 2008 ；Pietschmann, 2006) (TCID5tl约 103/mL)进行验证。在96 孔细胞培养板上进行所有的siRNA的筛选。使用Dc蛋白分析(Bio-Rad)，通过裂解产物的蛋白质含量标准化萤光素酶结果。为了最小化由于蒸发所致的非特异性影响，外侧孔未用于筛选，而是用磷酸缓冲液(PBS)填充。通过测量单个孔中的蛋白质含量来标准化由于细胞增殖的改变所导致的基因沉默化的非特异性影响。通过计算Z因子(Zhang，1999)，在试验性实验中评估建立的高通量筛选的质量、单个板的设计和复制的数目。在用于筛选的96个中央板位置中的60个位置上一式两份地进行HCVpp的筛选(Z = 0. 37)。在用于筛选的96个中央板位置中的32个位置上进行HCVcc验证筛选(Z = 0.47)，一式三份进行。作为基因沉默化、 HCVpp和HCVcc感染的内部质量控制，在各个板上并排转染阳性和阴性对照siRNAs(GFP， ⑶81)。如下所述，通过分析代谢3-G，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5- 二苯基四氮唑溴化物 (MTT)的能力，评估对细胞的细胞毒性影响，一式三份进行。高通量筛选命中物的选择。基因沉默化的影响被定义为表示为进入比率(与进入转染的对照(靶向GFP的siRNA)中的实验平均值相比)的HCVpp进入的增加或减少。HCV特异性被确定为对VSVpp对照病毒的进入不具有显著类似的影响。使用应用于 Bioconductor (Gentleman, 2004)包 limma (Wettenhall，2004)的经验性 Bayes 方法，测试至 O的差异的log2-比率，从而在不损害真阳性测试结果(II型误差)的情况下，确保假阳性 (I型误差)的最大降低(Allison，2006)。研究从经验性测试所得到的B值的分布，以定义有用的截止值(未显示)。最后，基于基本的频率分布(数据未显示)，选择-3. 5的HCVpp 阈值(对应虹10_4的最大ρ值)、-4. 4的HCVpp阈值(对应3xl(T6的最大ρ值)和-3. 6的 VSVpp阈值(对应1. IxlO-3的最大ρ值)作为严格性参数。不考虑VSVpp的进入，对HCVpp 的进入具有显著影响(B-值>5)的基因(总共四个)也包括进来用于进一步的鉴别。使用文库“fdrt00l”6trimmer，2008)来确定每个基因对于所有对比的局部假发现率(fdr)。 用于确认，还包括了 10个另外的基因，这些基因降低HCV进入彡板平均值的2SD(即Brass， 2008使用的策略)，但由于高度内部变化性仅给出高的ρ值或低的相应B值，所以通过本发明人的方法可能不能发现这些基因。为了排除集合的siRNA的脱靶影响，如果至少两个单独的siRNA使HCV进入与对照转染的细胞相比降低彡50%，则证实候选物。基因本体论和基因注释。基因本体论术语和基因相关性获自hgenuity Pathways 数据库(Mountainview，CA, USA)确定的人激酶siRNA套装版本2. 0。使用Ingenuity Pattiways数据库对鉴别的激酶进行生物功能分析(Krishnan，2008 ；Tuvin，2009)。如果它们以< 10_5的ρ-值显著富集的话，生物功能术语是可接受的。此外，使用STRING mega-数据库来分析鉴别的命中物的已知和预测的蛋白质相互作用，该数据库将所有的相互作用证据绘制在一组普通的基因组和蛋白质上(Jensen，2009)。通过免疫沉淀反应和免疫印迹法对激酶表达的分析。使用包含50mM Tris，pH 8， 150mM NaCl, 1 % NP-40和蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液(Roche)，在转染的细胞裂解之后进行EphA2的免疫沉淀反应。对于免疫沉淀反应，使用2. 5 μ g抗-EphA2C-20抗体(180 μ g 蛋白含量)禾口 25μ L 蛋白 A/G 珠粒(Santa Cruz Biotechnologies)。根据 GE Healthcare 方案，使用Hybond-P膜进行Wfestern印迹法，使用ECF底物和Typhoon Trio高效荧光扫描仪(GE Healthcare)进行显示。Huh7来源的细胞系和人原代肝细胞感染HCVpp和HCVcc。如以前所述(Bartosch， 2003 ；Dimitrova,2008 ；Fati-Kremer, 2009 ；Pestka,2007 ；Pietschmann,2006 ；Tarr,2006 ； 和 kisel，2007)产生 HCVpp (株 H77C、HCV-J, UKN2A. 2. 4、UKN3A、UKN4A. 21. 16、VD、VH、 VK、VN)、VSPpp 和 HCVcc (株 Jcl、Luc-Jc 1)。如以前所述(Dimitrova, 2008 ；Fati-Kremer, 2009 ；Lan, 2008 ；Meunier, 2008 ；禾口 Zeisel，2007)进行 Huh7、Huh7. 5 细胞和人肝细胞被源自株 H77C(la)的 HCVpp、源自株 Jcl(^i/2a) ^P Luc-Jcl (2a/2a) (TCID50 1 03/mL)的 HCVcc 的感染。如RNAi筛选所述，感染前3天进行基因沉默。在0. 25% DMSO的最终溶剂浓度下使用蛋白激酶抑制剂(渥曼青霉素例外，它使用1%DMS0终浓度)。HCVpp或HCVcc感染前1 小时向细胞培养基中添加抑制剂。HCV复制的分析。如从前所述(Lan，2008)对来自质粒pSGR-JFHl的RNA进行电穿孔。电穿孔后4小时，细胞与蛋白激酶抑制剂在细胞培养上清液中培养24小时。如 (Lohmann, 1999)所述通过HCV RNA的Northern印迹分析来分离和分析总RNA。毒性分析。通过分析代谢3-(4，5_ 二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四氮唑溴化物(MTT)的能力(Lan，2008)，来评估对细胞的细胞毒性影响，一式三份进行。对于siRNA 实验，用siRNA转染5小时后3天，加入MTT。MTT的最终浓度是0. 6mg/mL。如(Mosmann, 1983)所述溶解和测量细胞所产生的甲勝晶体。2.使用基因组范围的RNAi激酶HCV进入筛选来鉴别参与HCV进入的细胞激酶在Huh7细胞中进行基于siRNA的筛选，沉默化691种人激酶，以全面地鉴别在人基因组中可能与HCV进入相关的所有的细胞激酶。在感染的较晚期(如复制、组装或分泌) 中的缺陷未在该分析中强调。该分析的读数包括基因沉默化的细胞被包含萤光素酶报告基因的HCVpp或HCVcc的感染。随后在感染72小时后通过分析报道基因的表达来定量病毒的进入。筛选包括三步并列使用HCVpp和来自水泡性口炎病毒的假型颗粒(VSVpp)(作为不相关的对照病毒)的初步筛选。为了确定鉴别的命中物对于感染性病毒生命周期的相关性，在初级筛选中鉴别的命中物在二级筛选中进行证实，该二级筛选使用基于重组HCVcc 和Huh7. 5. 1细胞的感染性HCV细胞培养模型(图4)。初级筛选和二级筛选使用靶向同一基因的四个siRNA的集合进行。来自二级筛选的候选基因进行第三轮筛选，其中每个集合中的四个组分siRNA被分别重新筛选(图4)。总而言之，通过初级HCVpp筛选鉴别出107种激酶，它们中的82种激酶通过与重组HCVpp的感染而被鉴别。该差异可能是由于以下事实HCVpp和HCVcc的进入机理可能存在略微不同。或者，某些激酶可随后对HCV生命周期中的进入后事件(如复制)具有拮抗作用。这得到如下发现的证实已显示提高复制的NEK4激酶的沉默化(Tai，2009)，提高了 HCVcc的感染，但抑制了 HCVpp的进入(数据未显示)。通过单个siRNA在82种激酶中鉴别出78种激酶(95%),它们对HCVpp进入和HCVcc感染启动具有相似的作用(图10)， 证明了事实上是基因沉默化，而不是单个siRNA序列的脱靶作用，导致了观测到的基因型。因此，基因组范围的RNAi激酶筛选鉴别出78种对HCV进入和HCV感染启动具有影响的激酶，如在感染性细胞培养模型中所鉴别的(图10)。为了鉴别可能特别参与HCV进入的激酶，研究了沉默化对不相关的对照病毒VSV的进入的影响。使用并列分析，鉴别了 34 个基因，它们对HCVpp进入和HCVcc感染具有功能性影响，但是对VSV的进入没有影响(图 10A)。该RNAi筛选方法的有效性是通过鉴别已知对对照病毒VSV的进入关键的激酶来确定的。在初级筛选和Pelkmans和同事(Pelkmans，2005)进行的筛选中，VSVpp进入鉴别的命中物的对比分析确定了 参与网格蛋白(clathrin)介导的病毒胞吞的激酶对HSV进入有功能相关性。此外，初步HCVpp筛选确定了蛋白激酶A对于HCVpp进入的相关性，如近期 Farquhar等人(Farquhar，2008)所表明的。这些激酶被鉴别为VSV和HCV进入的辅助宿主因子确定了本发明筛选方法的有效性。3.通过生物信息学分析对HCV进入中涉及的激酶网络的鉴别
为了获得鉴别的激酶和相关蛋白质的已知生理学功能的分类，如对于其他基于 RNAn siRNA 筛选所述的(Krishnan，2008 和 Tuvim，2009)，使用 Ingenuity Pathways 数据进行生物信息学分析。该分析表明了癌症和细胞死亡中涉及的基因的高度表现(图6A)。 当根据对HCV而不是对VSV进入的影响进行分类时，五种最高度表现的类别包括氨基酸代谢、翻译后修饰、小分子生物化学、细胞形态学、细胞发育、细胞周期、细胞信号传导和癌症 (图 6B)。接下来，使用STRING数据库(Jensen，2009)分析鉴别的命中物的已知和预测的蛋白质相互作用。强调的相互作用包括来自多种来源的直接(物理)或间接(功能性)的相关，该来源包括实验性储库、计算预测方法和公众文本收集(Jensen，2009)。STRING代表一个元数据库，该数据库将所有已知的蛋白质-蛋白质相互作用制图在基因组和蛋白质的常规套装上。对RNAi筛选中鉴别的78种激酶的分析揭示了调控细胞形态学(包括细胞极性、紧密接头的渗透性和整联蛋白的信号传导)的激酶网络和细胞周期中涉及的激酶的网络(图6C)。a)调控细胞极性的宿主细胞激酶。首先，使用后续的STRING分析的RNAi筛选鉴别出作为HCV进入的宿主因子的肝激酶Bl (STKll)和AMP-激活的蛋白激酶(ΑΜΡ，γ 2 非催化性亚基PRKAG2)(图6-7)。PRKAG2亚基作为AMPK的激活剂。如图7所示，沉默化 STKll或AMPK亚基PRKAG2的基因表达对来自所有主要的基因型的HCVpp的进入产生显著的抑制(图7Α-Β，左栏)。使用重组HCV感染获得类似的结果，这表明所鉴别的激酶对于生产性感染的启动是重要的(图7Α-Β，右栏)。相反，对照siRNA与细胞孵育没有显著改变 HCV的进入或HCV的感染(图7)。沉默化两个相应的抑制性AMPK亚基(即β 1 (PRKABl) 和β 2(PRKAB2))刺激了 HCVpp的进入，这表明AMPK的活性对HCV的进入和感染是关键的。 通过使用AMPK活性抑制剂Dorsomorphin进一步确定了该途径的影响(Zhou，2001)。使用 Dorsomorphin与Huh7. 5细胞预孵育显著抑制了 HCVpp的进入(图7C)，并表明，AMPK功能事实上对HCV的进入是重要的。STKll及其下游底物AMPK已显示在上皮细胞(包括肝细胞)中极性的确立中起主要作用(Williams，2008)。其他研究表明，AMPK介导STKll的控制极性和有丝分裂的功能 (Lee, 2007)。这对于HCV的进入是特别有利的，因为细胞极性已显示是HCV的进入的重要宿主因子(Brazzoli,2008 ；Evans, 2007 ；Mee, 2008 ；Meertens, 2008 ；Ploss, 2009)。细胞极性看起来改变HCV进入因子密蛋白-1的亚细胞定位，并调节H印G2肝细胞瘤细胞中的病毒进入(Mee，2009)。此外，Brazzoli 和同事(Brazzoli, 2008)已表明，HCV E2 糖蛋白与 CD81 的结合引发了 HCVE2/CD81复合物依赖于肌动蛋白地再定位于细胞-细胞接触区，在该接触区，CD81与紧密连接蛋白闭合蛋白(occluding)、Z0-1和密蛋白-1相接触。Dorsomorphin 对AMPK的抑制已显示阻断非肌肉肌球蛋白调控性轻链(MRLC)的磷酸化(Lee，2007)。结合起来，这些结果支持如下模型，其中STK11/AMPK功能可能对细胞表面或细胞内的肌动蛋白_肌球蛋白依赖性的HCV进入因子复合物的转运或运输是必需的(图6D)。b)调控紧密连接功能的宿主细胞激酶。RNAi筛选鉴别了几种与调控紧密连接 (TJ)功能有关的激酶。这些激酶包括MAGI-l、EphA2和EGFR(图6C)。在极化的肝细胞中， TJ将它们的质膜分成顶端结构域和基底外侧结构域。这对于HCV的进入是特别有利的和相关的，因为几种 TJ 蛋白(即密蛋白 _1、6 和 9) (Evans, 2007 ；Harris，2008 ；Meertens, 2008)和闭合蛋白(BenedictO，2009 ；Ploss,2009)已显示是HCV进入的辅助因子。使用几种具有不同细胞表面分布的摄取因子与以下的假设相一致HCV可以遵循协调的进入途径，该途径与柯萨奇病毒B的进入途径类似，依赖于肝细胞的TJ (Ploss, 2009)。或者，HCV可使用与 TJ无关的密蛋白-1形式(Mee，2009)。破坏TJ已显示出提高CaCo_2细胞中的HCV进入， 这支持如下的模型，其中TJ为病毒接触在侧面和基底外侧结构域上表达的HCV进入因子提供了物理屏障(Mee，2008)。MAGI-I是连接复合物形成过程中涉及的膜结合鸟苷酸激酶(Laura，2002)。 Ephrin受体2 (EphA2)是最大一类受体酪氨酸激酶的成员，并介导细胞定位、细胞形态学和移动性以及细胞旁TJ渗透性(Lackmarm，2008)。如图8所示，EphA2基因表达的沉默化(图 8A)导致对来自所有主要基因型1-4的HCVpp的进入(图8B)和重组HCV感染的显著抑制， 这表明鉴别的激酶对生产性感染的启动是重要的(图8C)。相反，使用对照SiRNA(CTRL)与细胞孵育没有显著改变HCV的进入或HCV的感染(图8)。对该途径的影响还进一步通过使用EphA2功能抑制剂达沙替尼进行了确定(HUang，2007)。使用达沙替尼的预孵育显著抑制了人原代肝细胞中HCVpp的进入和Huh7. 5. 1细胞的HCVcc感染(图9)，并确定了 EphA2 功能事实上对HCV的进入是重要的。EphA4已显示通过TJ蛋白密蛋白-4介导内皮组织中细胞旁渗透性(Tanaka，2005)。此外，表皮生长因子(EGFR)被鉴别为HCV进入的辅助因子。如图8所示，沉默化 EGFR表达(图8A)导致对来自所有主要基因型1-4的HCVpp的进入(图8B)和重组HCV感染的显著抑制。这些发现表明，该激酶对于生产性感染的启动是重要的(图8C)。如EphA2 一样，EGFR是调节细胞生物学的关键步骤的酪氨酸激酶受体，该关键步骤包括增殖、生存、 分化、发育过程、组织内稳态和肿瘤发生(Schneider和Wolf，2009)。EGFR在体内主要激活 Raf/MEK/ERK 和 PI3K/Akt 信号传导(Lackmann，2008 ；Schneider，2009)。有意思的是，所用的初级筛选还表明，沉默化介导EGFR信号传导的激酶显著抑制了 HCV的进入这些激酶包括 b-Raf (BRAF)、MEKl (MAP2K1)和 ERKl (MAPK3)(图 6D)。Raf/MEK/ERK 途径对 HCV 进入的相关性还进一步通过应用限定的抑制EGFR和EGFR的下游激酶的抑制剂得到支持。使用埃罗替尼对EGFR活性的抑制以剂量依赖性地抑制HCV的进入和HCV的感染(图9)。相反，使用渥曼青霉素(Arcaro，1993)对PI3K活性的抑制不会这样(图10B)。Raf/MAK/ERK信号传导途径对HCV进入的相关性还进一步得到近期研究的支持，该研究表明，CD81的参与激活Raf/MAK/ERK信号级联，且该途径影响病毒生命周期的进入后事件(Brazzoli，2008)。综合考虑，这些数据支持以下模型，其中通过MAP激酶途径的EGFR激活和信号传导是HCV进入所必需的。在HCV进入过程中的EGFR的分子功能是什么？ EGFR激活已显示诱导细胞再分布和增加密蛋白-1的表达(Flores-Benitez,2007 ；Singh，2004)，且EGF介导的MAP激酶信号传导已显示导致MAP激酶ERK-I与闭合蛋白的C末端区域的相互作用，其防止H2O2-诱导的EGF对紧密连接的破坏(Basuroy，2006)。综合考虑，这些数据和本RNAi筛选的结果进一步支持TJ蛋白对HCV进入的功能性作用，并表明了 EGFR与MAP激酶途径介导的TJ蛋白密蛋白-1或闭合蛋白之间的功能连接。(图6D)。有意思的是注意到，HCV非结构蛋白的表达已显示导致EphA2和EGFR表达的向上调节。事实上，HCV非结构蛋白NS4B已显示导致EphA2的总水平的伴随性增加(Zheng，2005)。NS5B已显示导致EGFR表达的增加和EGFR的运输分布的改变(Mankouri，2008)。该研究的作者已经表明，MAP激酶信号传导可能维持对于HCV持续性最佳的环境(Mankouri， 2008)。综合考虑，这些数据和本RNAi筛选的结果提示了正反馈环路，其中HCV复制和非结构蛋白NS4B和NS5A的表达造成HCV辅助进入因子EphA2和EGFR的向上调节，从而有利于 HCV的进入和病毒的繁殖。c)整联蛋白信号传导中涉及的宿主细胞激酶。STRING分析确定了细胞粘附和整联蛋白信号传导中涉及的四种激酶的网络=C-Src(CSK)、粘着斑激酶(PTK2)、粘着斑激酶2(PTK2B)和整联蛋白连接的激酶(ILK)，它们均调节细胞粘附和细胞-基质的相互作用(D Nichila，1999 ;Harburger，2009)(图 6C)。已显示，CD81 (—种关键的 HCV 进入因子)和其他四跨膜蛋白与整联蛋白家族的粘附受体关联，并调控整联蛋白依赖性细胞迁移 (BerditCheVski，2001)。因此，可以想到，功能性整联蛋白信号传导可能对于HCV进入因子的运输和在细胞表面上的定位和最终的HCV进入是必需的。在这种情况下，多种四跨膜蛋白包括⑶81与II型磷脂酰肌醇4-激酶关联，表明这可能通过将这些酶限制于整联蛋白异二聚体来促进信号传导复合物的组装(BerditchevskidOOl)。这得到以下发现的支持沉默化2型α磷脂酰肌醇4-激酶(ΡΙ4ΚΙΙ)特异性地损害HCV的进入和感染，但不影响VSV 的进入。此外，已知整联蛋白信号传导在其他病毒如腺病毒、汉坦病毒和疱疹病毒的进入中起关键作用(评论参见MeWart，2007)因此HCV可能具有另一整联蛋白依赖性进入机理。d)细胞周期中涉及的宿主细胞激酶。STRING指出了包括参与细胞周期调控的8种激酶的网络(图6C)，包括细胞分裂周期2激酶(CDC2)、细胞周期蛋白依赖性激酶3(CDK3)、 细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、胆碱激酶α (CHKA)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 1B(CDKN1B)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2C(CDKN2C)、膜结合赖氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 (PKMYTl)和TOEl同系物粟酒酵母(S. pombe) (WEEl)。尽管不能排除这些⑶K是由于细胞分裂依赖性肝细胞瘤模型系统的内在性质而被鉴别的可能性，但几种观察支持CDK对于 HCV进入的特定作用。首先，CDK3的沉默化显著抑制来自所有主要HCV基因型1_4的HCVpp 的进入，但不抑制VSVpp的进入。当⑶KN1B、⑶KN2C、WEEl和PKMYTl被沉默化时，也观察到对HCV进入的特定作用。第二，基因沉默化后(除了使用CHKA的实验)，通过MTT的细胞代谢测量没有观察到细胞毒性。这表明激酶的沉默化不是由于非特异性的毒性作用。第三，夫拉平度，一种公知的CDK3抑制剂，在人原代肝细胞中不存在可检测的细胞毒性作用， 但显著抑制HCVpp的进入。这些数据表明，CDK的作用与模型靶细胞系或拟颗粒进入分析均无关，但可能与HCV进入有关。公知的是，CDK在人免疫缺陷病毒和疱疹病毒的生命周期中起重要作用。这些作用包括通过⑶K9调节HIV的转录(3κηι，2009)和卡波西肉瘤相关疱疹病毒对⑶Κ4和⑶Κ6的激活，其中⑶Κ4和⑶Κ6调节微丝组织和细胞形态学(Cuomo， 2005)。因此，可以想到，HCV具有类似的机理。4.通过定义的抑制剂对宿主细胞激酶的抑制，所鉴别的激酶对于HCV进入的特定影响的证实为了进一步研究鉴别的激酶对于HCV生命周期的影响，表征了 EphA2和EGFR的功能影响。选择这些激酶，是因为它们是所确定的网络中的组分(图6C)。此外，EphA2和EGFR 被临床批准的激酶抑制剂达沙替尼(用于EphA^和埃罗替尼(用于EGFR)强烈抑制，使得可以研究这些激酶在病毒生命周期的不同阶段的功能影响。研究了激酶抑制剂对于HCV进入、复制和感染的影响。如图9所示，达沙替尼和埃罗替尼显著抑制HCV感染。埃罗替尼是 HCV进入和感染的最有效的抑制剂(IC5tl大约为0.5 μ M)，其次是达沙替尼(IC5tl为2μΜ)。 所观察到的IC5tl值均高于所述的纯化的EphA2 (Huang, 2007)或EGFR (Minami，2007)的IC5tl 值。在肝细胞或肝细胞来源的细胞株中观测的IC5tl值较高可能是由于抑制剂在肝细胞或肝细胞瘤细胞中的快速代谢。不过，也不能排除其他激酶对于达沙替尼和埃罗替尼的抗病毒影响产生贡献的可能性，但在EGFR的情况下，目前的结果(图9)由三种另外的以类似的 IC5tl (未显示)抑制HCV感染的EGFR抑制剂(吉非替尼、凡德他尼、拉帕替尼)证实。达沙替尼和埃罗替尼对于HCVcc感染的抑制效应也通过使用排除药物对于萤光素酶报告分子翻译的非特异性影响(数据未显示)的RT-PCR检测病毒RNA得到证实。为了证实这些分子对于HCV感染的抑制效应确实是对病毒进入的抑制，研究了它们对于HCV分离株JFHl的进入和复制的影响。如图9所示，达沙替尼和埃罗替尼抑制源自 JFHl的HCVpp进入，没有明显调节亚基因组JFHl复制子的复制。与此相反，抑制病毒复制的蛋白激酶抑制剂渥曼青霉素(Tai，2009)对于源自JFHl的HCVpp进入没有任何影响(数据未显示)。这些数据证实，被达沙替尼和埃罗替尼选择性抑制的激酶在HCV进入方面是重要的，但在病毒复制方面不重要。这些发现进一步证实，被达沙替尼和埃罗替尼选择性抑制的激酶在HCV进入方面是重要的，但在病毒复制方面不重要。这些发现进一步证实鉴别的激酶对于HCV进入的影响，并提示使用经批准的化合物抑制宿主激酶可能是一种有用的抗 HCV的治疗策略。5.使用多激酶抑制剂通过靶向宿主细胞激酶对源自经受肝移植患者的HCV分离株进入的抑制由于埃罗替尼在对应于可达到的血浆浓度(平均血浆浓度 4 μ M，Hidalgo和 Bloedow,2003)的剂量范围(IC5tl为0. 5 μ M)内有效抑制HCV进入和感染，评估其对于用患者来源的分离株感染的影响。使用原代人肝细胞和源自四个HCV感染的经受肝移植患者的携带病毒包膜糖蛋白的HCV准型，本申请人已经证明在肝移植物的HCV再感染过程中，增强的病毒进入和避开抗体介导的中和是选择病毒变异体的关键因素(Fafi-Kremer， 2009)。这个以前研究的结果已经表明，病毒进入是预防肝移植者的HCV再感染的可行的目标(Fafi-Kremer，2009)。在本研究中，研究了多激酶抑制剂对于源自在4个不同患者的移植和肝移植物再感染过程中选择的HCV株(HCV株VD、VH、VK、VN)的携带包膜糖蛋白的 HCVpp进入的影响。如图9所示，鉴别的宿主细胞激酶的沉默化以及细胞与激酶抑制剂达沙替尼和埃罗替尼的预先孵育可以显著抑制源自患者的HCVpp在Huh7. 5细胞和原代人类肝细胞中的进入。在Huh7. 5细胞中埃罗替尼似乎比达沙替尼更有效，但在原代人类肝细胞不是这样。与此相反，渥曼青霉素(图10)或基于二氮杂萘(naphthyridine)的TpI2激酶抑制剂(数据未显示)并不会导致可重复的HCVpp感染的抑制。这些数据表明，埃罗替尼和达沙替尼特异性地抑制感染肝移植物的源自患者的分离株的HCV进入。在基于MTT法测试的细胞生存力的并排分析中没有检测到毒性效应(图10)。总之，这些结果表明，调节HCV进入的宿主细胞激酶是抗病毒治疗的可行的靶标。 蛋白激酶抑制剂的临床开发提供了基于靶向病毒感染所必需的特异性宿主细胞激酶的抗病毒策略的新前景。由于这种方法与针对病毒蛋白的抗病毒策略是相辅相成的，它可以代表一种克服病毒抗性的有价值的方法。此外，使用许可的HCV激酶抑制剂抑制HCV进入可以构成一种新的预防原发HCV感染、特别是肝移植术后感染的治疗方法，也可以减弱病毒在慢性感染患者中的扩散。参考文献D. B. Allison et al.，Nat. Rev. Genet.，2006，7 :55-65.A. Arcaro et al.，Biochem. J.，1993，296 (2)，297-301.H. Barth et al.，J. Biol. Chem.，2003，278 :41003-41012.H. Barth et al.，J. Virol.，2006,80 10579—10590.H. Barth et al. , Hepatology 2006，44 :527-35.H. Barth et al.，J Hepatol.，2008，49 :134-42.B. Bartosch et al.，J. Exp. Med.，2003，197 :633-642.S. Basuroy, Biochem. J.，2006，393 :69-77.I.Benedictor et al, J. Virol. ,2009,83 :8012-8020.F. Berditchevski et al, J. Cell. Sci. ,2001,114 :4143-4151.Μ. Brazzoli et al.，J. Virol.，2008，82，8316—8329.R. S ；Brown, Nature, 2005，436 :973-978.Μ. A Cirone et al.，Int. J. Cancer, 1990,45 :490-493.F. V. Chisari, Nature, 2005,435 :930-932.S. N. Constantinescu et al.，FEBS Lett.，1991，292 :31-33.Μ. Ε. Cuomo, J. Biol. Chem.，2005，280 :35844-35858.P. David et al.，Hum. Exp. Toxicol.，1998，17 :544-553.Μ. 0 De Nichilo et al.，J. Cell Physiol.，1999，178 :164-172.Μ.Dimitova et al.，PNAS，USA,2008，105 :16320-16325.Μ. J. Evans et al.，Nature, 2007,446 :801-805.S. Fafi-Kremer et al. , "Escape from antibody-mediated neutralization and viral entry are key determinants for HCV re-infection in liver transplantation，，, 2009,已提交.X. Fang et al. , Hepatology 2006，43 :1326—36.M. J. Farquhar et al.，J. Virol.，2008，82 :8797-8811.J. J. Feld et al.，Nature, 2005，436 :967-972.D. Flores-Benites et al. , Am. J. Physiol. Renal. Physiol. , 2007, 292
F828-836.

C Gentleman et al. , Genome Biol. ,2004,5 :R80.
S. Harburger et al. , J. Cell. Sci. ,2009,122 :159-163.
J. Harris et al. , J. Virol. ,2008,82 :5007-5020.
Hildago et al. , Semin. Oncol. ,2003,30 :25-33.
H. Hoofnagle, Hepatology,2002, 36 :S21_S29.
Huang et al.，Cancer Res.，2007，67 :2226-2238.
Hsu et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003,100 :7271-727.
Huang et al.，Cancer Res.，2007，67 :2226-2238.J. L. Jensen et al. , Nucleic Acids Res. ,2009,37, D412-416.
T.Kato et al.，J Virol.，2005，79 :592-6.
Τ. Kato et al.，J. Virol.，2007，81 :4405-4411.
Τ.Kato et al. , Hepatology,2008,48 :732-40.
G.Koutsoudakis et al. , J. Virol. ,2006,80 :5308-53 20.
Μ. N. Krishnan et al, Nature,2008,455 :242-245.
Μ. Lackmann et al. , Sci. Signal. , 2008,1 :re2.
L. Lan et al.，J. Immunol.，2008，181 :4926-4935.
G. M-Lauer et al.，N. Engl. J. Med.，2001，345 :41-52.
R. P. Laura et al. , Exp. Cell. Res. ,2002,275 :155-170.
M. Law et al.，Nat Med.，2008，14 :25-7.
J. H. Lee et al.，Nature,2007，447，1017—1020.
B.D.Lindenbach et al.，Science,2005，309 :623-626.
B.D.Lindenbachet al. ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2006,103 :3805-3809. V.Lohmann et al. , Science,1999,285 :110-113.
J. Mankouri et al.，Traffic,2008，9 :1497-1509.
C.J. Mee et al.，J. Virol.，2008，82，461-470.
C.J. Mee et al.，J. Virol.，2009，83，6211-6221.
L. Meertens et al.，J.Virol.，2008，82，3555-3560. J. C. Meunier et al.，J. Virol.，2008,82 :966-973.
D.F.Merceret al.，Nat Med.，2001，7 :927-33.
Y. Minami et al. , Oncogene,2007, 26 :5023-5027. T. Mosmann et al. , J. Immunol. Methods, 1983,65 :55-63. J. M.Pestka et al.，PNAS，USA，2007，104 :6025-6030. Pawlotsky, Trends Microbiol. ,2004,12 :96-102. L.Pelkmans et al. , Nature,2005,436 :78-86.
J. M. Pestka et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，2007，104 :6025-6030.
Τ.Pietschmann et al.，PNAS,USA,2006，103 :7408-7413
P.Pileri et al. , Science,1998,282 :938-941.
C. N. Root et al.，J. Gen. Virol.，2000,81 :2697-2705.
A.Ploss et al. ，Nature，2009，457 :882-886.
M. R. Schneider et al.，J. Cell. Physiol.，2009，218 :460-466.
L. B. Seeff, Semin.Gastrointest. ,1995,6 :20-27.
L.B.Seeff and J. H. Hoofnagle, Hepatology,2002, 36 1-2.
E.Scarselliet al.，EMBO J.，2002，21 :5017-5025.
S. B. Sieczkarski et al.，J. Virol.，2003，77 :460-469. A. B. Singh et al.，J. Biol. Chem.，2004，279 :3543-3552. A.S. Smith et al. ，Science 2004,304 :237-42. P. L. Stewart et al. ，Trends Microbiol. ，2007,15 :500-507.
CN 102227237 A说明书34/35 页K. Strimmer, Bioinformatics,2008，24 1461—1462.A. W. Tai et al.，J. Hepatol.，2009，50 :412-420.M. Tanaka et al.，J. Biol. Chem.，2005，280 :42375-42382.A. W. Tarr et al.，Hepatology, 2006,43 :592-601.M. J. Tuvim et al.，PLoS ONE, 2009,4, e4176.Τ.Vanwolleghem et al. , Gastroenterology,2007,133 :1144-55.Τ. Wakita et al. , Nat. Med.，2005，11 :791-796.J. Μ. Wettenhall et al.，Bioinformatics，2004，20 :3705-3706.Τ. Williams et al. , Trends Cell. Biol.，2008，18，193-198.M. B. Zeisel et al.，H印atology，2007，46 :1722-1731.M. B. Zeisel et al.，H印atology，2008，48 :299-307Y. Zheng et al.，J. Biochem. Mol. Biol.，2005，38 :151-160.G.Zhou et al.，J. Clin. Invest.，2001，108，1167-1174.M-Zhou et al. , J.Virol.，2009，83 :1036-1044.其它实施方式本发明的其它实施方式在考虑了本文公开的本发明说明书或实施本发明后对于本领域技术人员将会是明显的。说明书和实施例意图被视为仅是示例性的，本发明的真实范围由下述权利要求书指明。
权利要求
1.一种用于防止细胞被丙型肝炎病毒(HCV)感染的药剂，其中所述药剂抑制至少一种蛋白激酶的活性，该蛋白激酶选自EGFR、PRKAG2、STKlU EPHA2和细胞周期蛋白依赖性激酶， 或者选自 STK11、PRKAG2、MAGI-1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、 CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 禾口 WEEl，或者选自 CALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKNlB, CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK, FGR、 ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、 CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38 和 TYK2,或者选自 CALM2、CSK、MAG11、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、 IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、 DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、 AURKB, BMX、BRAF, CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA, CHKB, CIB2、CKMTU DGKB, EGFR、EPHA3、 EPHBl、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK, GKAPl、GRK4、IKBKB, ΜΑΡ3Κ7ΙΡ1、MAPKAPU ΝΕΚ9、 ΡΑΝΚ3、ΡΙ4ΚΙΙ、ΡΙΡ5Κ2Α、PRKAG2、PSKHl、ΡΤΚ2、ΡΤΚ2Β、RIOKl、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、 SKIP、STK22C、TNK2 和 ULK2。
2.一种用于预防或治疗受试者的HCV感染或HCV相关疾病的药剂，其中所述药剂抑制至少一种蛋白激酶的活性，该蛋白激酶选自EGFR、PRKAG2、STKl 1、EPHA2和细胞周期蛋白依赖性激酶， 或者选自 STK11、PRKAG2、MAGI-1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、 CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 禾口 WEEl，或者选自 CALM2、CSK、MAGIU ADK, CDK3、CDKNlB, CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK, FGR、 ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、 CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38 和 TYK2,或者选自 CALM2、CSK、MAG11、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、 IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、 DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、 AURKB, BMX、BRAF, CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA, CHKB, CIB2、CKMTU DGKB, EGFR、ΕΡΗΑ3、 EPHBl、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK, GKAPl、GRK4、IKBKB, ΜΑΡ3Κ7ΙΡ1、MAPKAPU ΝΕΚ9、 ΡΑΝΚ3、ΡΙ4ΚΙΙ、ΡΙΡ5Κ2Α、PRKAG2、PSKHl、ΡΤΚ2、ΡΤΚ2Β、RIOKl、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、 SKIP、STK22C、ΤΝΚ2 和 ULK2。
3.一种用于预防肝移植患者的HCV复发的药剂，其中所述药剂抑制至少一种蛋白激酶的活性，该蛋白激酶选自EGFR、PRKAG2、STKlU EPHA2和细胞周期蛋白依赖性激酶， 或者选自 STK11、PRKAG2、MAGI-1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、 CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 禾口 WEEl，或者选自 CALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKNlB, CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK, FGR、 ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、 CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38 和 TYK2，或者选自 CALM2、CSK、MAG11、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、 DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、 AURKB, BMX、BRAF, CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA, CHKB, CIB2、CKMTU DGKB, EGFR、EPHA3、 EPHBl、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK、GKAPl、GRK4、IKBKB, MAP3K7IP1、MAPKAPU NEK9、 PANK3、PI4KII、PIP5K2A、PRKAG2、PSKHl、PTK2、PTK2B、RIOKl、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、 SKIP、STK22C、TNK2 和 ULK2。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的药剂，其中所述药剂选自小分子、单克隆抗体、多克隆抗体、RNA聚合酶抑制剂、反义化合物、核酶、siRNA, siDNA及其任意组合。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的药剂，其中所述药剂抑制EGFR的活性并且选自埃罗替尼、凡德他尼、吉非替尼和拉帕替尼。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的药剂，其中所述药剂为抑制AMPK的活性的 Dorsomorphin0
7.根据权利要求1-3中任一项所述的药剂，其中所述药剂为抑制EPHA2的活性的达沙替尼。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的药剂，其中所述药剂为抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的活性的夫拉平度。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的药剂在制备用于治疗和/或预防HCV感染或HCV 相关疾病的药物中的用途。
10.一种药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1-8中任一项所述的药剂和至少一种可药用载体或赋形剂。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，还包含至少一种生物活性剂。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其适合与至少一种生物活性剂联合使用。
13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，其中所述生物活性剂为抗病毒剂。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述抗病毒剂选自干扰素、利巴韦林、抗 HCV单克隆抗体、抗HCV多克隆抗体、RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、IRES抑制剂、解旋酶抑制剂、反义化合物、核酶及其任意组合。
15.一种鉴别潜在的HCV抗病毒剂的方法，包括以下步骤(a)在体外将表达至少一种人细胞蛋白激酶的生物系统与候选化合物接触，其中该蛋白激酶选自EGFR、PRKAG2、STKlU EPHA2和细胞周期蛋白依赖性激酶，或者选自 STK11、PRKAG2、MAGI-1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、 CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 禾口 WEEl，或者选自 CALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKNlB, CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK, FGR、 ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、 CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38 和 TYK2,或者选自 CALM2、CSK、MAG11、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、 IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、 DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、 AURKB, BMX、BRAF, CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA, CHKB, CIB2、CKMTU DGKB, EGFR、EPHA3、EPHBl、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK、GKAPl、GRK4、IKBKB, MAP3K7IP1、MAPKAPU NEK9、 PANK3、PI4KII、PIP5K2A、PRKAG2、PSKHl、PTK2、PTK2B、RIOKl、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、 SKIP、STK22C、TNK2 禾口 ULK2 ；禾口 (b)确定所述蛋白激酶的活性，其中，如果在步骤(b)中确定的活性低于在不存在该候选化合物的情况下在所述生物系统中确定的所述蛋白激酶的活性，则该候选化合物被鉴别为潜在的HCV抗病毒剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述候选化合物选自小分子、单克隆抗体、多克隆抗体、RNA聚合酶抑制剂、反义化合物、核酶、siRNA, siDNA及其任意组合。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述候选化合物属于候选化合物的集合或文库。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述生物系统是细胞。
全文摘要
本发明提供了几种细胞蛋白激酶网络，作为针对哺乳动物(包括人类)中丙型肝炎病毒(HCV)感染和HCV相关疾病和紊乱的医疗干预的潜在靶标。本发明涉及治疗方案和药物组合物，它们设计用来抑制这些蛋白激酶中的一种或多种的活性，用于预防和/或治疗由HCV引起的感染和疾病。本发明还涉及鉴别可用于治疗或预防HCV感染和HCV相关疾病的激酶抑制剂的方法。
文档编号A61K31/711GK102227237SQ200980147952
公开日2011年10月26日 申请日期2009年9月18日 优先权日2008年9月26日
发明者托马斯·博梅尔, 若阿基姆·吕普贝热 申请人:国家健康与医学研究院