专利名称：一种小干扰核酸和药物组合物及其制药应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰核酸和含有该小干扰 核酸作为活性成分的药物组合物以及所述小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝 炎的药物中的应用。
背景技术：
乙型病毒性肝炎简称乙型肝炎，是一种由乙型肝炎病毒(h印atitis Bvirus,HBV) 引起的传染病。据世界卫生组织(WHO)统计，全球乙肝病毒携带者超过了 20亿人，其中3. 6 亿乙肝慢性患者的病情正在恶化，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和 原发性肝细胞癌。中国是世界范围内感染HBV人数最多的国家，乙型肝炎病毒(HBV)感染率 高达57. 63%。全国现有慢性乙肝病人2000万，每年乙肝新发病人数约50万，每年有23. 7 万人死于乙型肝炎相关的疾病，其中有15. 6万人死于肝癌。据中国肝炎防治基金会2006 年报道，我国每年用于治疗慢性肝炎、肝硬化、肝癌的直接医疗耗费约300亿元人民币，HBV 造成的直接经济损失约为3600亿元/年。每人年均医疗花费高达观864. 89元人民币，是 我国2005年人均⑶P的2. 12倍。由此可见，乙型肝炎不仅严重危害我国人民的健康，而且 还为国家带来严重的社会经济负担。治疗乙肝的方法主要包括抗病毒复制、提高机体免疫功能、保护肝细胞、促进肝细 胞再生以及中医药治疗、基础治疗及心理治疗等综合治疗。全球公认的防治乙型肝炎的药 物主要可分为干扰素、核苷类似物2大类。干扰素作为乙肝治疗药物已使用了较长时间，其 治疗终末应答率只有30%，即使和其他抗病毒药物联合使用或增加剂量后，其治疗终末应 答率也只有50%，且停药、减量或减少注射次数后易复发，不良反应明显增加。另外，长期使 用会诱发干扰素抗体，失去药效。核苷类似物起效快，但终末应答率也不高，且核苷类似物 只抑制肝细胞质内的病毒，对肝细胞核内的CCC-DNA没有作用，需要长期维持用药。长期用 药面临的最主要问题是病毒变异而引发的耐药性，以及停药后也易出现病毒反弹、复发率 高。更为严重的是少数病人停药后出现肝功能急剧恶化，甚至死亡。从基因水平抑制HBV 的生成和复制来降低病毒代谢和对肝细胞的侵染无疑将是乙肝最为理想的治疗手段。RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA (double-strandedRNA，dsRNA) 分子在mRNA水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。但由于小干扰核酸 (siRNA)的稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解，因此人们对合成的siRNA进行化学修 饰，以增加siRNA的血清稳定性，从而有效地抑制目的基因的表达。目前，由于人们对小干扰核酸在血清中的降解过程和机制缺乏足够的了解，虽然 通过修饰在一定程度上提高了小干扰核酸的稳定性，但由于引入了过量的修饰，导致修饰 后的小干扰核酸的产生了潜在的细胞毒性，且修饰后的小干扰核酸的生物学活性也受到很 大的影响。因此，开发出一种血清稳定的、具有良好生物活性的且细胞毒性较低的抑制乙型 肝炎病毒基因表达的小干扰核酸成为迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是克服现有的用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰 核酸存在的细胞毒性高且生物活性差的缺点，提供一种具有血清稳定、良好生物活性的且 较低的细胞毒性特性的、用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰核酸。乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科(h印adnaviridae)，基因组长约3. 2kb，为 部分双链环状DNA;乙型肝炎病毒基因组含有4个开放读码框(0RF，S基因区、C基因区、P 基因区和X基因区)。S基因区包括S基因、前Sl基因和前S2基因，它们分别编码S蛋白、M蛋白和L蛋 白；其中，S蛋白和M蛋白与乙型肝炎病毒的嗜肝性、基因免疫及转录激活密切相关。C基因区包括前C基因和C基因，它们分别编码核壳蛋白HBeAg和BcAg，该核壳 HBeAg和HBcAg是组成乙型肝炎病毒核心部分的重要组成部分，是病毒复制的主体。P基因区包括P基因，编码P蛋白，P蛋白含816个氨基酸，具有4个功能结构域， 包括具有反转录酶活性的DNA聚合酶、RNA酶H等，参与HBV复制的全过程。X基因区包括X基因，是HBV病毒基因组中最小的开放性读码框，编码长度为IM 个氨基酸的蛋白，该蛋白能够直接或间接地对病毒自身的复制与增殖产生影响，并且能够 对宿主细胞中被感染的细胞的调亡和癌变过程产生影响。所述X、P、S、C基因的保守区在HBV基因组(Genbank登记号为U95551)相对位置 分别为 1376-1840bp,2309-3182bp 和 l-1625bpU57-837bpU816bp-2454bp0本发明提供了一种小干扰核酸，其中，该小干扰核酸的序列为正义链5，-GGAAACUACUGUU⑶UAGAdTdT-3，反义链5，-UCUAACAACAGUA⑶UUCCdTdT-3，；并且所述小干扰核酸具有E1-E8之一所示方式的修饰El)正义链中5:3、方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰， 第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核 苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷 酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；E2)正义链中5:3、方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰， 第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核 苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧 啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修 饰；E3)正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰； 反义链中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；E4)正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰； 反义链中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰， 第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰；E5)正义链中5:3、方向第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰， 第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-0H位被氟修饰；反义链中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸 的戊糖的2’ -OH位被氟修饰；E6)正义链中5’_3’方向的第1、11和14位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’_0H位被 氧甲基修饰，第7、13和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第8和17 位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中5’ -3’方向的第2位的胞嘧 啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第6和18位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH 位被氟修饰，第12位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰；E7)正义链中5’ -3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基 修饰，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中 5’_3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-0H位被氧甲基修饰，第6、18和19位的胞 嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰，第3、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH 位被氟修饰；E8)正义链中5’ -3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基 修饰，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中 5’ _3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6和19位的胞嘧 啶核苷酸的戊糖的2’-0H位被氟修饰，第3、15、16和17位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’_0H 位被氟修饰。本发明还提供了一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物，其中，该药物 组合物含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分。此外，本发明还提供了本发明所述的小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗乙型 肝炎的药物中的应用。本发明提供的小干扰核酸通过特异性的修饰，从而在仅引入少量修饰的情况下， 即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸 分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响，从而提供了一种能 够有效抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰核酸。
图1显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸的血清 稳定性的检测结果。图2显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对乙型 肝炎病毒mRNA表达抑制活性的检测结果。图3显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对乙型 肝炎病毒的HBV的S抗原和E抗原表达的抑制率。图4显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对小鼠 血清中ALT (丙氨酸氨基转移酶)、AST (谷草转氨酶)、LT (血清总蛋白)和LDH (乳酸脱氢 酶)的血液生化指标的影响。图5显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对HBV转 基因小鼠血清中HBsAg含量的影响。图6显示了本发明实施例中的小干扰核酸与对比例中的参比小干扰核酸对HBV转基因小鼠肝组织中乙型肝炎病毒的mRNA含量的抑制。
具体实施例方式本发明提供了一种小干扰核酸，其中，该小干扰核酸的序列为正义链5，-GGAAACUACUGUU⑶UAGAdTdT-3，反义链5，-UCUAACAACAGUA⑶UUCCdTdT-3，；并且所述小干扰核酸具有E1-E8之一所示方式的修饰El)正义链中5:3、方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰， 第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核 苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷 酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；E2)正义链中5:3、方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰， 第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核 苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰；反义链中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧 啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修 饰；E3)正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰； 反义链中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；E4)正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰； 反义链中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰， 第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰；E5)正义链中5:3、方向第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰， 第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-0H位被氟修饰；反义链中5:3、方向第1、 3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸 的戊糖的2’ -OH位被氟修饰；E6)正义链中5’_3’方向的第1、11和14位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’_0H位被 氧甲基修饰，第7、13和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第8和17 位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中5’ -3’方向的第2位的胞嘧 啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第6和18位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH 位被氟修饰，第12位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰；E7)正义链中5’ -3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基 修饰，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中 5’_3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-0H位被氧甲基修饰，第6、18和19位的胞 嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰，第3、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH 位被氟修饰；E8)正义链中5’ -3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基 修饰，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中 5’ _3’方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氧甲基修饰，第6和19位的胞嘧 啶核苷酸的戊糖的2’-0H位被氟修饰，第3、15、16和17位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’_0H
7位被氟修饰。本发明的发明人对用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的小干扰核酸及其修饰方式 进行了细致的研究，发现，具有上述E1-E8之一所示核苷酸序列的小干扰核酸不但血清稳 定性好，并且由于引入修饰的量很少，因而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞 毒性，并且小干扰核酸的生物活性所受到的影响也非常小。本发明提供的小干扰核酸的干 扰靶位点序列具有SEQID NO :2所示的核苷酸序列，该核苷酸序列是指与如SEQ ID N0:1所 示乙型肝炎病毒基因组(Genbank登记号为U95551)的2334-2352位相对应的乙型肝炎病 毒的mRNA序列。
权利要求
1.一种小干扰核酸，其特征在于，该小干扰核酸的序列为 正义链5，-GGAAACUACUGUU⑶UAGAdTdT-3，反义链5，-UCUAACAACAGUA⑶UUCCdTdT-3，； 并且所述小干扰核酸具有E1-E8之一所示方式的修饰El)正义链中5:3、方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第6 和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸 的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的 戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；E2)正义链中5:3、方向第1位鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-0H位被氧甲基修饰，第6和 9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的 戊糖的2’-0H位被氧甲基修饰；反义链中5、-3、方向第1、3、12、1 5、16和1 7位尿嘧啶核 苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰； E3)正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义 链中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；E4)正义链中的鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义 链中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰，第2 和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰；E5)正义链中5:3、方向第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰，第7、 12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-0H位被氟修饰；反义链中5、_3、方向第1、3、12、 15,16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’-0H位被氟修饰，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖 的2’ -OH位被氟修饰；E6)正义链中5’-3’方向的第1、11和14位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’-0H位被氧甲 基修饰，第7、13和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第8和17位的 腺嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中5’ -3’方向的第2位的胞嘧啶核 苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第6和18位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被 氟修饰，第12位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰；E7)正义链中5’ -3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰， 第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中5’ -3’ 方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰，第6、18和19位的胞嘧啶 核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰，第3、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被 氟修饰；E8)正义链中5’ -3’方向的第1位的鸟嘌呤核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰， 第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氧甲基修饰；反义链中5’ -3’ 方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2’-0H位被氧甲基修饰，第6和19位的胞嘧啶核苷 酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰，第3、15、16和17位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2’ -OH位被氟修饰。
2.根据权利要求1所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸具有E2、E4-E8之一所示方 式的修饰。
3.根据权利要求1所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸的正义链和反义链的_3’末端dTdT之间的磷酸二酯键被硫代磷酸修饰。
4.一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有 权利要求1-3中的任意一项所述的小干扰核酸作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为注射液，所述注射液还 含有药学上可接受的载体，相对于100重量份的小干扰核酸，所述药学上可接受的载体的 含量为100-10000000重量份。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体为PH值为 4. 0-9. 0的磷酸缓冲液、pH值为7. 5-8. 5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液、生理盐水或pH 为5. 5-8. 5的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述注射液还含有保护剂和/或渗透压调 节剂；以所述注射液的总重量为基准，所述保护剂的含量为0. 01-30重量％，所述保护剂选 自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压 为200-700毫渗摩尔/千克，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
8.权利要求1-3中的任意一项所述的小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎 的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种小干扰核酸，该小干扰核酸的序列为正义链5’-GGAAACUACUGUUGUUAGAdTdT-3’；反义链5’-UCUAACAACAGUAGUUUCCdTdT-3’；所述小干扰核酸具有E1-E8之一所示方式的修饰。本发明还提供了一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物，该药物组合物含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分。本发明还提供了所述小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物中的应用。本发明中通过特异性的修饰，从而在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性以及对生物学活性的影响。
文档编号A61P31/20GK102140459SQ20101010676
公开日2011年8月3日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者张鸿雁, 梁子才 申请人:苏州瑞博生物技术有限公司