专利名称：质粒介导的端粒酶rna基因干扰构建体及其构建方法
技术领域：
本发明属于基因沉默技术领域，具体涉及一种针对人端粒酶RNA基因亚基的RNA 干扰载体以及这种载体的制备方法和应用。
背景技术：
基因治疗是指运用DNA转移来治疗乃至于预防一些疾病。比较准确的说，它指的 是遗传信息相关的特异性DNA序列的转移，是一项高度集成、综合性高难度的生物技术。基 因治疗是最初是以治疗单基因遗传病为主，而现已广泛应用于肿瘤等疾病的治疗研究。基因治疗是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使其表达此基因而获得特定 的功能，继而执行或介导对患病细胞的杀伤和抑制作用，从而达到治疗之目的。基因治疗涉 及目的基因、载体及受体细胞三方面。有效的基因治疗依赖于外源基因高效而稳定的表达。 利用病毒载体介导基因转移，以其高转染率和良好的靶向性而成为肿瘤基因治疗中应用最 广泛的方法治疗基因的靶向性表达决定了基因治疗能否成功。理想的肿瘤基因治疗是， 目的基因的表达应能区别正常组织和肿瘤组织，且对肿瘤组织的类型无选择性，能在多 种肿瘤组织中表达。利用特异性的基因启动子使目的基因在特定的组织、细胞或器官 中表达，实现对肿瘤靶向性治疗的目的。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链 RNA (double-strandedRNA, dsRNA)引发的转录后基因静默机制。RNAi是真核生物中普遍存 在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前已成功用于基因功能 和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐 步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。RNAi 作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极 为迅速。在利用RNAi技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择 病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免 对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的 恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此 外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子 如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表 达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。外源的或体内产生的长双链RNA(long double stranded RNA, dsRNA)首先被降解为长21 23bp的小分子双链RNA，这种RNA分子称为 小干扰RNA(smallinterfering RNA, siRNA), siRNA通过碱基互补配对识别具同源序列的 mRNA，并介导其降解。近年研究发现，端粒酶在80% 90%的肿瘤细胞中呈高密度表达，而在大部分正 常的体细胞中不表达。构建基于端粒酶基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异性表达可以很 好的显示和检测肿瘤细胞；而且可以达到较好的治疗肿瘤的目的；基于端粒酶的基因治疗 策略也在临床应用中逐渐增加。
体外的siRNA的制备主要有5种方法，包括化学合成、体外转录、用RNaseIII消化 长片断双链RNA制备siRNA、siRNA表达载体、siRNA表达框架。多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III启动子(pol III)中的一种，操 纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达(1-4)。这3类启动子包括人源和鼠源的 U6启动子和人Hl启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞 中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类 载体，需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III启动子 下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列 是正确的。siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带 有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即使是 对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮 助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。最近多个厂家及实验室开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其 优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来 的种种不便。然而，病毒载体介导的目的基因长期表达已经被全世界许多实验室应用，没有 出现过任何意外，但仍具有潜在的致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕，所有 操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行；必须高度注意被污染的尖锐物品；所有接触过 病毒的器具均应高压消毒再进行下一步处理；装盛慢病毒载体的实验用品，要单独放置，标 示清楚，并标注“危险品”字样；对共用实验室的人员进行病毒安全培训或提示。本发明由 此而来。
发明内容
本发明的目的是提供一种质粒介导的端粒酶RNA基因干扰构建体，解决了现有技 术中病毒载体操作过程不够安全、基因沉默时间短、存在一些潜在致癌危险等问题。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案如下一种质粒介导的端粒酶RNA基因干扰构建体，其特征在于所述构建体包括U6启动子，所述启动子为DNA依赖的RNA聚合酶III所识别；与启动子有效连接的DNA片段，所述DNA片段具有为SEQ ID No 1的核苷酸单链 序列或其互补寡核苷酸单链。优选的，所述质粒选自PUC119质粒载体、EGFP-Cl质粒载体。优选的，所述的启动子为人源或鼠源。优选的，所述的DNA片段的互补寡核苷酸单链序列为SEQ ID No 2SEQ ID No :3。本发明的又一目的在于提供一种质粒介导的端粒酶RNA基因干扰构建体的构建 方法，所述方法包括以下步骤(1)、根据人端粒酶RNA基因选择合适的干扰靶点合成互补的两条寡核苷酸单链， 所述互补寡核苷酸单链序列分别为SEQ ID No 2和SEQ IDNo 3 ；
(2)、以Hela细胞的基因组DNA为模板扩增得到TO启动子，pUC119质粒载体多克 隆位点HindIII和BamHI间接U6启动子，获得重组体pUC119_U6启动子；(3)、将互补寡核苷酸单链退火后得到的双链定向克隆入质粒载体_启动子载体， 获得重组质粒pUC119-U6-shTR ；(4)以重组质粒pUC119-U6_shTR为模板以一对引物扩增获得TO-shTR产物；(5)对TO-shTR产物进行酶切后，克隆入经线性化和去磷酸化处理的载体EGFP-Cl 中，获得RNAi表达载体pEGFP-U6-shTR。优选的，所述方法中步骤(2)扩增是通过一对PCR引物PCR扩增得到的5’和3’ 端引入HindIII和BamHI酶切位点的U6启动子。优选的，所述一对引物具有下列核苷酸顺序上游引物SEQ ID No 4 ；下游引物 SEQ ID No :5。优选的，所述方法步骤(4)中所述的一对引物具有下列核苷酸顺序上游引物 SEQ ID No 6 ；下游引物=SEQ ID No :7。优选的，所述方法中载体EGFP-Cl通过MluI限制性内切酶线性化形成。本发明优选技术方案中采用HeLa细胞的基因组DNA为模板经PCR扩增得到U6启 动子，为了避免TO启动子末端序列被酶切位点的置换造成的转录活性的丧失，在pUC119质 粒载体多克隆位点HindIII和BamHI间接入U6启动子，获得重组体pUC119_U6。对所研究人端粒酶RNA基因[GI 38176147]选择合适的干扰靶点，并将其按 照特定形式分别合成两条互补的寡核苷酸单链，按特定参数退火后，两互补单链形成 一对双链，将该退火双链定向克隆入PUC119-U6载体的TO启动子下游，获得重组质粒 pUCl 19-U6-shTR,并以TO启动子、下游退火DNA双链及作为终止转录的连续5个T组成的表 达框为模板，用一对引物经PCR技术获得TO-shTR产物，经引物中引入的酶切位点酶切后， 克隆入经线性化和去磷酸化处理的载体EGFP-Cl中，获得理想的针对人端粒酶RNA亚基的 RNAi 表达载体，称 pEGFP-U6-shTR。本发明的又一目的在于提供一种药物组合物，其特征在于包括权利要求1所述的 端粒酶RNA基因干扰构建体。与现有技术中各类生物质秸秆制气已有技术相比，本发明的有益效果在于1.本发明技术方案中采用质粒介导的RNA干扰载体来转染人肿瘤细胞，摈去了现 有技术中病毒载体可能带来的潜在致癌危险，所以本发明进行RNA干扰来维持基因沉默操 作较为安全。2、本发明的技术方案采用质粒介导的RNA干扰载体能带来较高的转染成功率，而 且能维持长时间的基因沉默，可以应用于对人端粒酶RNA基因更安全、高效、长期的沉默研允。序列说明SEQ ID No 1表示具有人端粒酶RNA亚基(hTR)包含模板区的特异性19个碱基 序列(靶位点)。SEQ ID No :2表示具有按照shRNA设计原则合成的、针对hTR模板区的、按照shRNA 设计原则合成的、5’带有BamHl酶切位点和3’端带有作为转录终止序列的5个连续T的 shRNA核苷酸单链序列。
5板区的、按照shRNA设计原则合成的、5，端带有 带有EcoRl酶切位点的shRNA互补寡核苷酸单链。SEQ ID No 4表示具有针对人U6启动子序列设计的、5，端带有HindIII酶切位点 及保护碱基的PCR上游引物核苷酸单链序列。SEQ ID No 5表示具有针对人U6启动子序列设计的、5’端带有BamHI酶切位点及 保护碱基的PCR下游引物核苷酸单链序列。SEQ ID No 6表示具有针对重组质粒pUC119-U6_shTR中U6启动子及与其有效连 接的shTR片段序列设计的、5’端带有MluI酶切位点及保护碱基的PCR上游引物核苷酸单 链序列。SEQ ID No 7表示具有针对重组质粒pUC119-U6_shTR中U6启动子及与其有效连 接的shTR片段序列设计的、5’端带有MluI酶切位点及保护碱基的PCR下游引物核苷酸单 链序列。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为本发明实施例pUC119-U6载体模式图；图2为本发明实施例pUC119-U6_shTR重组体模式图；图3为本发明实施例pEGFP-Cl质粒模式图；图4为本发明实施例pEGFP-U6_shTR重组体模式图；图5为pEGFP-U6-shTR的Hela细胞转染后第210天光镜下转染效果图；其中图 5-A为普通光镜40倍下观察得到的，图5-B为普通光镜100倍下观察得到的；图5-C为普 通光镜400倍下观察得到的，图5-D为荧光镜40倍下观察得到的，图5-E为荧光镜100倍 下观察得到的，图5-F为荧光镜400倍下观察得到的；图6为RT-PCR方法检测不同实验组hTR的表达水平；图7为MTT法绘制的细胞生长曲线。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例lpEGFP-U6_shTR重组载体的构建以HeLa细胞的基因组DNA为模板经PCR扩增得到U6启动子；将碱裂解法提取的 质粒pUC119和纯化的U6启动子PCR产物分别用HindIII和BamHI双酶切，低熔点琼脂糖 凝胶电泳回收目的片段，连接，转化感受态JM109，涂板蓝白斑筛选，双酶切鉴定和PCR鉴定 重组体pUC119-U6(如图1)，最后测序确认。合成两个寡核苷酸单链片段用TE溶为lOOuM，上下两互补链以1 1比例混合，按 以下程序进行95°C 30s ；72°C 2min ；37°C 2min ；25°C 2min ；冰浴lOmin。退火形成的双链 即可与RNAi载体连接或贮于-20°C备用。将碱裂解法提取的质粒pUC119-U6分别用BamHI和EcoRI双酶切，低熔点琼脂糖
6凝胶电泳回收目的片段，与退火双链片段连接，转化感受态JM109，涂板蓝白斑筛选，双酶切 鉴定和PCR鉴定重组体PUC119-U6，最后测序确认。将碱裂解法提取的质粒EGFP-Cl用MluI酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收目的片 段后去磷酸化处理。以 pUC119-U6-shRNA 为模板，用引物(SEQ ID No 6 和 SEQ ID No 7)经 PCR 技术 获得TO-shRNA产物，利用引物中引入的MluI酶切后，克隆入经MluI线性化载体EGFP-Cl 中，获得理想的RNAi表达载体，为pEGFP-U6-shRNA，筛选后的阳性克隆进行测序证实。实施例2将pEGFP-U6_shTR重组载体转染入肿瘤细胞的步骤分空白组、空载体组和实验组进行细胞转染处理；转染步骤如标准步骤，可如下1.脂染前24h，选择状态良好的Hela细胞以6X 105个/孔接种于六孔板，加2ml 完全培养基，转染时细胞汇合度应达到90% _95%，转染前细胞换新鲜的完全培养基。2.取 2 支 1. 5mlEP 管，A 管 250ul 无血清 DMEM+4ugpEGFP_U6_shRNA ；B 管 250ul 无 血清DMEM+lOul脂质体lipofectamineTM2000分别室温放置5min，将两管内液体充分混合， 室温放置20min。3.将混合物加到含细胞和完全培养基的孔内，充分混合。4.将六孔板放回37°C，5% CO2培养箱中继续培养。该细胞转染后损伤较轻，不必 换液。如果细胞对脂质体较敏感损伤严重，需在转染后6小时换新鲜完全培养基。按此操 作步骤转染效率可大于80 %。5.稳定转染细胞克隆的筛选如要获得100%转染效率，需进行稳定转染细胞克隆的筛选。稳定转染细胞克隆 的筛选转染后24h，将转染细胞以1 10的比例传代，24小时后，加选择培养基G418，对于 HeLa细胞可用600ug/mlG418筛选阳性细胞，10至14天后，非稳定转染细胞死去，阳性克隆 长出。可在荧光显微镜下标记发绿色荧光的细胞克隆并挑取，经有限稀释后扩大培养。经 转让后的效果如图5所示。用RT-PCR方法分析各细胞株hTR的表达分别收集转染24、48、72h细胞，提取细胞 总RNA，并进行逆转反应。其中内参DAPDH扩增产物理论大小为311bp，目的基因hTR扩增 产物理论大小为179bp。对heLA细胞2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，测得结果如图6所示，其中M =DLlOOO Marker 条带分子量从小到大依次为100，200，300，400，500，700，IOOObp ； 1-3 依次为 RT-PCR检测Hela细胞空白组、空载体组和实验组细胞内参GAPDH的表达水平；4_6 依次为 RT-PCR检测Hela细胞空白组、空载体组和实验组细胞hTR的表达水平；由图6可知，第6泳 道中实验组细胞hTR的表达水平明显被沉默。按上法处理细胞24、48、72、96、120、144h后，进行MTT染色，MTT法检测He 1 a细胞 空白组、空载体组和实验组细胞的增殖速度如图7所示，实验组细胞生长速度较空白组和 空载体组显著减慢。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>顾天一
<120>质粒介导的端粒酶RNA基因干扰构建体及其构建方法
<130>
<160>7
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>
<400>1
GTCTAACCCT AACTGAGAA19
<210>2 <211>58 <212>DNA <213> <400>2
GATCCGTCTA ACCCTAACTG AGAATTCAAG58
AGATTCTCAG TTAGGGTTAG ACTTTTTG
<210>3
<211>57
<212>DNA
<213>
<400>3
CAGATTGGGA TTGACTCTTA AGTTCTCTAA57
GAGTCAATCC CAATCTGAAA AACTTAA
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>
<400>4
GCGAAGCTTA AGGTCGGGCA GGAAGAGGG 29
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>
<400>5
GCGGGATCCT CGTCCTTTCC ACAAGATAT 29 <210>6 <211>28 <212>DNA
8
<213><400>6CCGACGCGTT CACACAGGAA ACAGCTAT28<210>7<211>27<212>DNA<213><400>7CCGACGCGTT TGTAAAACGA CGGCCAG2权利要求
一种质粒介导的端粒酶RNA基因干扰构建体，其特征在于所述构建体包括U6启动子，所述启动子为DNA依赖的RNA聚合酶III所识别；与启动子有效连接的DNA片段，所述DNA片段具有为SEQ ID No1的核苷酸单链序列或其互补寡核苷酸单链。
2.根据权利要求1所述的端粒酶RNA基因干扰构建体，其特征在于所述质粒选自 PUC119质粒载体、EGFP-Cl质粒载体。
3.根据权利要求1所述的端粒酶RNA基因干扰构建体，其特征在于所述的启动子为人 源或鼠源。
4.根据权利要求1所述的端粒酶RNA基因干扰构建体，其特征在于所述的DNA片段的 互补寡核苷酸单链序列为SEQ ID No 2SEQ ID No :3。
5.一种权利要求1所述的干扰构建体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)、根据人端粒酶RNA基因选择合适的干扰靶点合成互补的两条寡核苷酸单链，所述 互补寡核苷酸单链序列分别为SEQ ID No 2和SEQ ID No 3 ；(2)、以Hela细胞的基因组DNA为模板扩增得到U6启动子，pUC119质粒载体多克隆位 点HindIII和BamHI间接入U6启动子，获得重组体pUC119_U6启动子；(3)、将互补寡核苷酸单链退火后得到的双链定向克隆入质粒载体_启动子载体，获得 重组质粒 pUC119-U6-shTR ；(4)以重组质粒pUC119-U6-shTR为模板以一对引物扩增获得TO_shTR产物；(5)对TO-shTR产物进行酶切后，克隆入经线性化和去磷酸化处理的载体EGFP-Cl中， 获得RNAi表达载体pEGFP-U6-shTR。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中步骤(2)扩增是通过一对PCR 引物PCR扩增得到的5’和3’端引入HindIII和BamHI酶切位点的U6启动子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述一对PCR引物包括上、下游引物，所 述上游引物具有下列核苷酸顺序SEQ ID No :4;所述下游引物具有下列核苷酸顺序SEQ ID No :5。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法步骤(4)中所述的一对引物包括 上下游引物，所述上游引物具有下列核苷酸顺序SEQ ID No :6 ；所述下游引物具有下列核苷 酸顺序 SEQ ID No :7ο
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中载体EGFP-Cl通过MluI限制性 内切酶线性化形成。
10.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求1所述的端粒酶RNA基因干扰构建体。
全文摘要
本发明公开了一种质粒介导的端粒酶RNA基因干扰构建体，其特征在于所述构建体包括U6启动子，所述启动子为DNA依赖的RNA聚合酶III所识别；与启动子有效连接的DNA片段，所述DNA片段具有为SEQ ID No1的核苷酸单链序列或其互补寡核苷酸单链。该干扰构建体能够高效转染人肿瘤细胞、能维持长时间的基因沉默，操作过程安全，无潜在致癌危险。
文档编号A61K48/00GK101921805SQ201010109279
公开日2010年12月22日 申请日期2010年1月26日 优先权日2009年4月8日
发明者顾天一 申请人:顾天一