蛋白质赖氨酸乙酰化修饰对代谢的调控及其应用的制作方法

专利名称：蛋白质赖氨酸乙酰化修饰对代谢的调控及其应用的制作方法
技术领域：
本申请涉及生物技术领域。具体地说，本申请涉及通过蛋白质(如酶)赖氨酸乙酰化修饰对代谢的调控及其应用。
背景技术：
乙酰化修饰是通过乙酰基转移酶(Acetyltransfearases)将乙酰基团加到蛋白质内部赖氨酸残基的ε-NH2上，通过去乙酰化酶(Deacetylases)移去乙酰基团，是一种可逆的动态的修饰，通过改变被修饰蛋白质的电荷和空间结构来改变蛋白活性(Yangand Seto 2007)。自1958年第一次在组蛋白上发现乙酰化修饰以来，有将近200种蛋白质被发现并实验证实有乙酰化修饰，包括许多重要的转录调控因子，如p53、RB、NF-K B、E2F1和 HIF-I α等，因而乙酰化修饰参与调控细胞凋亡、亚细胞定位、DNA和蛋白质相互作用、DNA 复制和修复、DNA转录活性及蛋白质稳定性等众多重要的生命活动，乙酰化修饰逐渐被认为是一种重要的翻译后修饰而被广泛研究。近年来，人们采用质谱和免疫沉淀等新技术与新方法研究鼠肝线粒(Kim SC, S. R. et al. 2006)和人肝组织乙酰化修饰的底物蛋白，筛选得到一系列的乙酰化底物蛋白， 发现乙酰化修饰同生物体内的各种代谢酶类的活性调控密切相关，并且在体外和体内试验都证明了这一点。同样，在原核生物中也发现乙酰化修饰同代谢酶类的活性密切相关。真核生物的乙酰化酶与去乙酰化酶真核生物蛋白质的乙酰化最先在酵母(hast)等模式生物的组蛋白中被发现。乙酰化的生物功能最先被确定为调节组蛋白的结构进而影响相关基因的转录。参与组蛋白乙酰化修饰的调节酶分为乙酰基转移酶(Histone acetyltransferase，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDACs) 其中 HAiTs 包括 P300、CBP、GCN5 等。已知的 HDACs 有多种，在调节细胞组蛋白乙酰化的过程中有不同的功能。HDACs的共同特征是受一类抑制剂TSA(Tricostatin A)及其类似物小分子的抑制。乙酰化后来被发现也修饰组蛋白之外的蛋白。P53是最先被发现的受乙酰化调控的非组蛋白转录调控因子之一。后来陆续发现的其他很多转录调控因子活性也受乙酰化修饰调控。和组蛋白一样，转录调控因子也是核内蛋白，它们的乙酰化与去乙酰化也是受到 HATs与HDACs的调控。在对酵母的代谢研究过程中人们发现酵母的代谢也受到乙酰化修饰的调控。参与酵母乙酰化修饰的乙酰化酶包括GCN5等，而其去乙酰化酶则是一类与HDACs完全不同的酶，其中最著名的去乙酰化酶是Sir2。Sir2参与的去乙酰化过程需要NAD+与乙酰辅酶 A(Acetyl-CoA)的参与，Zn2+离子也是必不可少的辅基。TSA等抑制组蛋白去乙酰化酶的抑制剂不能抑制Sir2的酶活力，其去乙酰化产物之一的NAMfcicotimamide)则被通常用于抑制Sir2的催化活力。调节Sir2活力可以明显影响酵母代谢活性。在人鼠等脊椎动物细胞内发现了至少7个Sir2蛋白的类似物，分别被命名为 SirTl-7。尽管到目前它们是否都具有去乙酰化酶活力还没有完全被确定，但是至少可以肯定它们都与细胞能量代谢相关，它们的酶活力也都能够被NAM所抑制。目前开发的很多NAM 分子结构类似物不但可以抑制SirT，还能够对一些SirT具有特异性。通过抑制剂或激活剂调节HATs，HDACs与SirT活力可以调节细胞的能量代谢与细胞分裂，用于治疗包括肿瘤、延长寿命及减缓衰老等医用目的。已经用于临床与实践的 SirTl激活剂包括Resveraltol，用于肿瘤治疗的HDACs抑制剂等。原核生物的乙酰化酶与去乙酰化酶乙酰-CoA 合成酶(Acetyl-Coenzyme Synthetases，ACQ 是原核生物中发现的第一个受乙酰化修饰调控的代谢酶(V. J.Marai 2002)，此后在原核生物中又发现 Escherichia coli的趋化调节蛋白CheY (Barak R 2004)和古细菌硫矿硫化叶菌P2的染色质蛋白AlbaGt印hen D.Bell 2002 ；Victoria L. Marsh 2005)等也是受赖氨酸的乙酰化修饰调控。其中，以对Mlmonella enterica的ACS研究最为透彻，并且在真核生物的ACS中也得到了印证。在S. enterica中，负责对ACS乙酰化修饰的酶分别是乙酰基转移酶Pat (V. J. Starai and Escalante-Semerena 2004)和去乙酰化酶 CobB (V. J. Marai 2002)，其中 Pat负责对ACS进行乙酰化修饰，CobB负责对其进行去乙酰化修饰，这是目前Mlmonella enterica中唯一已知的一对乙酰化修饰酶。Starai等人发现，Pat的乙酰基转移酶作用可以有效的阻断ACS的腺苷化作用，当 ACS的609位赖氨酸被乙酰化修饰时，ACS的活力就被关闭，不能合成乙酰-CoA。而CobB则能够使609-赖氨酸去乙酰化，通过控制ACS的乙酰化状态进而调控它的活力(V. J. Starai, Jeffrey G. Gardner et al. 2005)。Marai等人进一步认为乙酰化修饰能够调节所有 AMP-生成酶家族，包括非核糖肽合成酶、荧光素酶、芳基-CoA和乙酰-CoA合成酶，并推测赖氨酸的乙酰化修饰是在真核和原核生物中都普遍存在的一种调节机制。在表型试验方面， 当ACS在乙酰基转移酶Pat的作用下被修饰，处于乙酰化失活状态，不能够利用乙酸盐合成乙酰-CoA，也就不能利用乙酸盐而不能在乙酸盐培养基上生长；而CobB的去乙酰化作用能够激活ACS，使其保持一定去乙酰化状态，恢复ACS的活力，进而调控乙酰-CoA的合成，促使S. enterica能利用乙酸盐和丙酸盐形成乙酰-CoA满足自身生长的需要。如果敲除掉去乙酰化酶CobB (cobB-)，这时就可以观察CobB缺失的S. enterica菌株不能在以低浓度乙酸盐(< IOmM)为唯一碳源和能源的基本培养基上生长(V. J. Starai, Jeffrey G. Gardner et al. 2005)。Stephen D. Bell等在研究古细菌硫矿硫化叶菌P2时发现，古细菌DNA结合蛋白Alki存在乙酰化和去乙酰化两种状态，对DNA转录有调节作用，而且它能够被古细菌的 Sir2同源蛋白去乙酰化，如用Sir2同源蛋白处理体外重建转录系统，可以观察到转录抑制现象。深入研究发现，Alki是在Lysl6上被乙酰化修饰而受调控的，对该位点进行乙酰化修饰的是乙酰基转移酶I^at，并指出Pat的功能是很保守的，不仅在古细菌中存在，而且在真细菌中也存在(St印hen D.Bell 2002)。Barak R等人在研究Ε. coli的化学趋化蛋白CheY时发现，CheY的乙酰化是受ACS 修饰的，这与已经发现的ACS和Alki的乙酰化修饰酶均不同。在ACS的乙酰化修饰反应中， 乙酸盐或乙酰-CoA可能是ACS乙酰化的底物，且发现CheY的乙酰化位点集中在C末端附近，主要包括91，92，109，119，122和126的赖氨酸。因此CheY同一些真核的信号蛋白比较类似，同样经历了蛋白的磷酸化和多乙酰化，只是乙酰化的位点集中在特定的区域(Barak R 2004)。Ε. coli的Rim蛋白被发现能对核糖体蛋白进行乙酰化修饰Woshikawa A，Isono Set al. 1987 ；Tanaka S,Matsushita Y et al. 1989)。已有研究发现Ε. coli 中的核糖体蛋白S18、S5和L12能够被Rim蛋白乙酰化修饰，包括RimI，RimJ，RimL等。另有研究表明，在 E. coli中表达真核生物的α -1胸腺素，发现它是被乙酰化修饰的，而RimJ敲除的E. coli 表达的α -1胸腺素则是没有乙酰化修饰的，这说明了 RimJ能对真核生物的α _1胸腺素起乙酰化修饰作用，同时也进一步说明了乙酰基转移酶的功能是比较保守的(Hongqing Fang, Xu Zhang et al. 2009)。

发明内容
本发明人发现对位于真核细胞的细胞质和线粒体中的催化中间体代谢的酶类和对于细菌细胞中参与中心代谢的酶类而言，赖氨酸乙酰化是一种主要的修饰方式。实验显示，赖氨酸乙酰化代表了一种在进化上保守的、响应营养获取量和代谢状态的代谢调控机理。它及时地感受胞内的能量状态、灵活地调节全局酶的反应方向、反应速度或稳定性，以保证细胞能够因此合理地响应外部环境的变化。这样一种即时、灵活、双向、全局地调控细胞代谢的机制，是从细菌到人在进化上保守的一种代谢调控网络。因此，本发明涉及调节蛋白乙酰化水平的物质在制备用于调节生物能量代谢的物质中的应用。本发明另一方面涉及调节蛋白乙酰化水平的物质在制备用于改善或缓解与代谢相关的疾病或失调的物质中的应用。本发明的其它优选技术方案和优点将在下文结合附图和实施例作进一步详细描述。


图1 S. enterica中心代谢酶类的乙酰化修饰。(A) S. enterica中心代谢酶类整体水平的乙酰化修饰；⑶S. enterica中西代谢酶类乙酰化修饰的SILAC相对定量结果。图中酶类缩写如下AceA =Isocitrate Lyase (异柠檬酸裂解酶)；AceK IsocitrateDehydrogenase Kinase/Phosphatase (异柠檬酸脱氢酶激酶 / 磷酸酯酶)； ACO =Aconitase (乌头酸酶)；ACS =Acetyl-CoA Synthetase (乙酰 CoA 合成酶)；AE Aldosel-印imerase (酸糖 1_ 表异构酶)；ALD :Fructose_bisphosphate Aldolase (果糖二磷酸醛缩酶)；APase =Acylphosphatase (酰基磷酸酯酶)；CS =Citrate Synthase (柠檬酸合成酶)；ENL :Enolase (烯醇酶)；FBPase :Fructose_l，6-bisphosphatase (果糖 _1， 6_ 二磷酸酶)；FH:Fumarate Hydratase (延胡索酸水合酶)；GapA :Glyceraldehyde-3_P hosphateDehydrogenase (磷酸甘油酸脱氢酶)；GK :Glucose Kinase (葡萄糖激酶)；GPI Phosphohexose Isomerase (磷酸己糖异构酶)；ICDH Isocitrate Dehydrogenase (异梓檬酸脱氢酶)；MDH:Malate Dehyrogenase (苹果酸脱氢酶)；MS :Malate Synthase (苹果酸合成Sl ) ；PDH pyruvate Dehydrogenase (丙||酸月兑S1SI) ；PEPCase :Phosphoenolpyruvate Carboxylase (磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)；PEPCK :Phosphoenolpyruvate Carboxykinase (磷
5酸烯醇丙酮酸羧激酶)；Pi7K =Phosphofructokinase (磷酸果糖激酶)；PGK Phosphoglycerate Kinase (磷酸甘油酸激酶)；PGM :Phosphoglycerate Mutase (磷酸甘油变位酶)；PK =Pyruvate Kinase(丙酮酸激酶)；PTS =Glucose-Specific Phosphotransferase Enzyme IIA Component (葡萄糖特异性磷酸转移酶 IIA 组分)；SCS Succinyl-CoA Synthetase (A ^j^BI) ；SDH =Succinate Dehydrogenase ( M
珀酸脱氢酶)；TPI Triose Phosphate Isomerase (磷酸丙糖异构酶)；50S L4 :ribosomal protein (核糖体蛋白)50S L4 ；50S Lll :ribosomal protein (核糖体蛋白)50S Lll ；50S L14 :ribosomal protein (核糖体蛋白)50S L146 ；50S35 :ribosomal protein (核糖体蛋白)50S L35.图2 S. enterica乙酰基转移酶Pat敲除突变株(Δ pat)和去乙酰化酶CobB敲除突变株(AcobB)的生长表型。(A)wt(^)，Apat(A), Δ cobB ( ■ ), Δ pat/Δ cobB (〇) 在5. OmM葡萄糖和柠檬酸基本培养基上的生长表型；(B)野生型S. enterica在葡萄糖(红色，左上)和柠檬酸(蓝色，右下)基本培养基含有(▲)或没有(眷)烟酰胺的生长曲线；(C) S. enterica在1 标记的葡萄糖和柠檬酸基本培养基上的体内代谢流。胞内的代谢流分布同13C标记和GC-MS来测定，箭头表示净代谢流的方向，箭头宽度与代谢流的大小对应；(D) Δ pat和Δ cobB代谢流比值变化结果。糖酵解(用vGapA表示)，糖异生(用vP。kA表示)，乙醛酸旁路(用^cek表示)和TCA循环(用Vioti表示)的代谢流均被定量，并计算 VGapA/VpckA和VA。eA/VlmH的代谢流比值，每个数据均是三次独立试验的平均结果，并加上标准偏差SD。图3乙酰化修饰激活EHHADH和MDH。(A)脱乙酰化酶抑制剂提高EHHADH的乙酰化水平。免疫沉淀异源表达的EHHADH，再用乙酰化赖氨酸抗体进行免疫印迹验证。(B)用 iTRAQ对EHHADH乙酰化修饰进行定量分析。肽段定量根据iTRAQ标签相对密度计算。(C) 脱乙酰化酶抑制剂刺激胞内EHHADH活力。此实验以及后续实验结果图都是来源于3次重复结果。(D)脂肪酸诱导EHHADH乙酰化修饰和活力。用HEK293T细胞内表达异源EHHADH 来检测EHHADH乙酰化修饰和活力。(E) MDH乙酰化修饰。在HEK293T细胞内表达带Myc标签的MDH，然后用免疫印迹检测乙酰化修饰。(F)MDH定量质谱分析。在HEK293T细胞内表达带FLAG标签的MDH，免疫沉淀后用傅立叶变换-离子回旋共振质谱法(FTICR)检测。(G) 葡萄糖增强MDH乙酰化修饰。(H)乙酰化修饰激活MDH。以Actin为内参检测Chang，s和 HEK293T细胞内的内源和异源表达的MDH乙酰化修饰与活力。(I)体外脱乙酰化处理导致 MDH失活。用脱乙酰化酶CobB处理免疫沉淀获得的MDH，然后检测MDH酶活力。阴性对照为不添加CobB必需辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。(J)葡萄糖激活MDH。实验设计依照本图H部分，只是用葡萄糖处理培养的细胞。图4乙酰化修饰(A和B)导致ASL失活。ASL乙酰化修饰。在HEK293T细胞中表达FLAG标记的ASL或ASLI^88R，免疫沉淀后用乙酰化赖氨酸抗体(A)或乙酰化K288抗体 (B)进行免疫印迹检测。(C)外源氨基酸抑制ASL的乙酰化修饰。HEK293T细胞用不同浓度氨基酸处理，然后通过免疫沉淀获得ASL。(D)曲古抑菌素A和烟酰胺抑制ASL。在经曲古抑菌素A和烟酰胺处理的HEK293T细胞内表达野生型ASL和突变体ASL_D88R(活力为野生型的132%)。以全蛋白为参照检测免疫沉淀获得的ASL活力。(E)氨基酸激活ASL依赖于ASL第288位赖氨酸的乙酰化修饰。在用不同浓度氨基酸培养的HEK293T细胞内表达野生型ASL和突变体。(F，G)葡萄糖对ASL乙酰化修饰和酶活力的影响。在用不同浓度葡萄糖培养的HEK293T细胞内表达ASL，经免疫沉淀后检测ASL的乙酰化修饰和酶活力。(H)体外脱乙酰化修饰激活ASL。体外脱乙酰化修饰系统类似于图21。图5乙酰化修饰破坏PEPCKl稳定性。(A)葡萄糖诱导PEPCKl乙酰化修饰水平。(B) 氨基酸降低PEPCKl乙酰化修饰水平。(C)葡萄糖诱导胞内PEPCKl含量下降。采用PEPCKl 抗体检测胞内PEPCKl含量。(D)曲古抑菌素A和烟酰胺处理降低了胞内PEPCKl含量。(E) 葡萄糖降低PEPCKl稳定性。在实验起始时加入放线菌酮，抑制HEK293T细胞的蛋白质翻译。 用免疫印迹检测胞内PEPCKl蛋白质丰度。(F)抑制脱乙酰化酶可使野生型PEPCKl不稳定性增加，但对乙酰化修饰缺陷突变体不起作用。图6乙酰化修饰调控中心代谢酶类的活性。㈧中心代谢关键酶在wt，Δ cobB和 Apat菌株中表达的乙酰化水平的差异。带有His标签的GapA，AceA和AceK蛋白分别在 wt, AcobB和Δ pat菌株中过表达并纯化。使用等量的每种蛋白并检测乙酰化修饰的水平。 (B)和(C)用Pat进行乙酰化处理和CobB进行脱乙酰化处理后GapA，AceA和AceK的活力。 带有His标签GapA，AceA和AceK蛋白分别在野生型的S. enterica中表达并纯化，并在体外用Pat进行乙酰化处理或CobB进行脱乙酰化处理。(B)通过Pat和CobB处理来交互调控GapA的糖酵解和糖异生活力。(C)通过体外的Pat和CobB处理来交互调控AceA的活力和调控AceK控制I⑶H的活力。
具体实施例方式鉴于Kim等人在鼠线粒体乙酰化底物蛋白的筛选结果，发明人设想S. enterica体内也应该存在这广泛的乙酰化修饰现象。发明人尝试将免疫沉淀的高灵敏和质谱分离的高分辨率相结合，首次对S. enterica的Lys乙酰化底物蛋白进行了蛋白组学水平上的扫描， 结果发现有191个蛋白的235个肽段是被乙酰化的，其中约有50%的蛋白是代谢相关的，且发现90%的中心代谢蛋白是被乙酰化修饰的，也有相当一部分蛋白与S. enterica的毒性相关。根据以往的研究结果，发明人设想Pat和CobB是目前唯一已知的一对乙酰化修饰酶，故分别构建了 S. enterica的乙酰基转移酶Pat敲除突变株(pat null mutant)、去乙酰化酶CobB敲除突变株(cobB null mutant)、乙酰基转移酶Pat和去乙酰化酶CobB双敲除突变株(pat/cobB double null mutant)，分别将野生型的S. enterica及这些衍生菌在LB 营养培养基、葡萄糖和柠檬酸基本培养基中培养，并且分别在对数期中期和稳定期收菌，考察在不同培养条件下，不同菌体内的乙酰化修饰会有如何的变化。结果发现，S. enterica的赖氨酸-乙酰化底物蛋白几乎覆盖了 S. enterica所有的代谢过程。这些蛋白或与中心代谢有关，或与毒性相关，或与能量代谢有关，或与碳骨架的合成有关，包括糖酵解、糖异生、 柠檬酸循环、乙醛酸循环、氨基酸代谢、尿素循环、电子氧化呼吸传递链、碳水化合物代谢、 脂多糖生物合成、tRNA生物合成、核苷酸代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、外膜蛋白代谢、维生素代谢和卟啉代谢等。如果考虑方法本身存在的不足而漏掉的没有被检测鉴定到的蛋白，乙酰化底物蛋白的范围将大大超出上述代谢蛋白的范畴，其覆盖范围之广超乎想象。尤其是，发明人发现S. enterica的中心代谢相关酶类绝大部分都是受到乙酰化修饰调控的，如TCA循环相关的蛋白有7个，糖酵解相关的蛋白有9个，糖异生相关的蛋白有9个，这与在鼠肝线粒体和肝组织中的研究结果相似，从而进一步证明了赖氨酸乙酰化修饰可能是从真核生物到原核生物都十分保守的调控方式，而且赖氨酸乙酰化修饰在原核生物S. enterica中是一种非常广泛的调控方式，它可能是通过对中心代谢关键酶类的“微调”进而实现从整体水平上的调控。上述试验还为发明人未来乙酰化的研究向遗传学和分子生物学纵深方向发展提出了很多新的研究方向，比如至今为止尚只在S. enterica中发现一种乙酰基转移酶I^at 和去乙酰化酶CobB，面对如此众多的乙酰化底物蛋白，发明人有理由相信在S. enterica 中肯定还存在其他的乙酰基转移酶和去乙酰化酶。Driscoll等人在酵母中新发现了一种与Sir2没有任何同源的乙酰基转移酶就是一个很好的例子(RobertDriscoll 2007)； Jeffrey G. Gardner等人在研究B. subtilis的AcsA的乙酰化修饰时发现，AcsA的乙酰化由乙酰基转移酶AcuA负责修饰，而AcuC和SrtN则负责对AcsA进行去乙酰化来保持其乙酰-CoA合成的活性，其中SrtN则需要NAD+作为辅酶，而AcuC的活性发挥不需要NAD+，且在 S. enterica中没有发现有AcuC的同源蛋白(Jeffrey G. Gardner and Escalante-Semerena 2009)。为了进一步确认代谢酶的乙酰化修饰酶，发明人又克隆了其他的已经报道的乙酰化修饰酶SpeG，RimI，YjgM和^icA,并在体外对GapA，AceA和AceK进行了乙酰化修饰处理， 发现这些乙酰化酶并不能对代谢酶类进行乙酰化修饰，在S. enterica体内到目前为止只存在一对乙酰化修饰酶Pat和CobB负责对代谢酶类的乙酰化修饰。根据结果，发明人认为赖氨酸乙酰化在原核生物S. enterica和哺乳动物细胞之间在进化上是很保守的。虽然早已有很多的实验事实表明可能存在这种关系，但发明人是第一次在原核生物S. enterica中证明了乙酰化修饰是一种广泛存在调控方式。综合本说明书中生长表型、生化试验和定量RT-PCR分析试验结果，认为 S. enterica在不同碳源和不同生长时期，胞内的乙酰化水平最终是由乙酰基转移酶Pat和去乙酰化酶CobB的共同转录水平决定的，从而完成了在不同碳源条件下不同代谢通路的转换。虽然对Pat和CobB转录的具体机制还不清楚，但胞内乙酰-CoA的水平及乙酰-CoA/ CoA-SH的比值可能是调节碳源和能量代谢一个重要的信号。本发明一个方面提供了调节蛋白乙酰化水平的物质在制备用于调节生物能量代谢的物质中的应用。在一个优选的实施方案中，所述调节酶乙酰化水平的物质选自乙酰化酶或脱乙酰化酶、增强或抑制乙酰化酶或脱乙酰化酶基因转录、翻译或表达的物质、增强或抑制乙酰化酶或脱乙酰化酶的酶活性的物质。在一个更优选的实施方案中，所述乙酰化酶或脱乙酰化酶选自赖氨酸乙酰转移酶、依赖NAD的脱乙酰化酶、组蛋白脱乙酰酶或SIRT家族脱乙酰酶。“增强或抑制某基因转录、翻译或表达”是本领域技术人员已知的技术。例如，可采用编码乙酰化酶或脱乙酰化酶基因的反义序列来实现反义抑制。对于反义核酸的长度没有特别的限制，但通常反义核酸片段的长度为lO-lOObp，较佳地为15-50bp，更佳地为 20-2^p。所用的反义核酸片段可以是一种或多种反义核酸片段，如果使用多种反义核酸片段，各反义核酸片段之间可以不存在重迭区域，也可存在重迭区域。另一种抑制乙酰化酶或脱乙酰化酶基因转录及/或翻译的物质可以是基因的(小)干扰RNA(SiRNA)。RNA干扰 (RNA interference)也是近年来发展起来的一种封闭基因表达的有效方法。它采用与目的基因同源的21-23核苷酸长的小干扰RNA转染至靶细胞。RNA干扰的作用过程包括两个步骤一起始步骤和效应步骤。在起始步骤中，导入的dsRNA被特异性识别dsRNA的RNaseIII 家族成员消化成21-23nt大小的小干扰RNA，每个siRNA的3’端都有2 3个突出核苷酸， 5’端带磷酸基团。在效应步骤中，siRNA与核酸酶复合物(包括核酸外切酶，核酸内切酶，解旋酶和类RecA蛋白等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silence complex, RISC)，RISC在ATP存在的情况下将siRNA解链成单链从而激活RISC，激活后的RISC通过碱基配对特异性识别目的基因的mRNA，继而将mRNA降解。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链 RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。另外，调控乙酰化酶或脱乙酰化酶表达的调控蛋白或顺式作用位点序列也包含在本发明的范围内。本领域技术人员也可以采用增强或抑制乙酰化酶或脱乙酰化酶的酶活性的物质来实现对能量代谢的调控。这些物质是本领域技术人员已知的，例如组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)或SIRT家族脱乙酰酶抑制剂烟酰胺(NAM)，或者是本领域技术人员根据常规筛选实验所能确定的。该筛选实验包括使乙酰化酶或脱乙酰化酶与候选物质接触， 然后测定乙酰化酶或脱乙酰化酶的活性，如果乙酰化酶或脱乙酰化酶的酶活性有上调或下调，则确定该候选物为增强或抑制乙酰化酶或脱乙酰化酶酶活性的试剂。在一个优选的实施方案中，蛋白是参与糖酵解、糖异生、三羧酸循环、尿素循环、月旨肪酸代谢、糖元代谢的酶。在更优选的方案中，所述酶选自磷酸甘油醛脱氢酶、烯酰辅酶A 水合酶/3-羟酰基-辅酶A脱氢酶、苹果酸脱氢酶、精氨基琥珀酸裂解酶、酸磷烯醇丙酮酸羧激酶、异柠檬酸裂解酶、或异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酯酶。本发明不仅适用于原核生物，也适用于真核生物。在优选的实施方案中，本发明所述的生物是细菌，例如沙门氏菌。在另一个优选的实施方案中，本发明所述的生物宜为哺乳动物，包括人、家畜和农场动物、非人灵长类、以及动物园、运动场动物，或宠物，如狗、马、 猫、奶牛等。在发现的所有这些乙酰化底物蛋白中，有很多是与代谢相关的，因此通过调节底物蛋白的乙酰化水平，就能够实现对细胞代谢的调控，进而改善或缓解与代谢相关的疾病或失调。能通过本发明来改善或缓解的疾病或失调例如包括不受控细胞增殖性疾病如癌症(因为已知慢性炎症反应是不受控细胞增殖性疾病的一个因素)，例如包括但不局限于， 癌、淋巴瘤、胚母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特定的癌症例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、 非小细胞肺癌、肠胃癌、胰癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳房癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、 肝细胞癌和各种类型的头颈癌。能通过本发明来改善或缓解的糖类代谢和/或脂类代谢相关的失调或疾病，例如包括但不局限于，I型糖尿病、II型糖尿病、不当葡萄糖耐受性、胰岛素抗性、高血糖症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常等。能通过本发明通过抑制病原微生物的代谢来抑制病原微生物的生长或休眠，所述病原微生物可以是例如大肠杆菌、钩端螺旋体、葡萄球菌等胞外感染菌或结核杆菌、沙门氏菌、莱姆氏菌、李斯特菌等胞内感染菌，具体包括，但不局限于，葡萄球菌(金黄色酿脓葡萄球菌、表皮葡萄球菌)和链球菌(无乳链球菌、粪链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌)；革兰氏阴性球菌(淋病双球菌)和革兰氏阴性杆菌如肠杆菌，例如大肠杆菌、流感杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌属；克雷白氏杆菌属(肺炎杆菌)、肠杆菌属(产气肠杆菌、聚团肠杆菌)、粘质沙雷氏杆菌、变形杆菌属(奇异变形杆菌、雷特格氏变形杆菌、普通变形杆菌)、普罗威登斯杆菌、耶尔森菌、不动杆菌、假单胞菌属(绿脓假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌)、脆弱拟杆菌、 消化链球菌、梭状芽胞杆菌、支原体属、分枝杆菌(结核分枝杆菌)、莱姆氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体等。能 通过本发明通过调节微生物的代谢来改良实验室或工业菌种，例如包括但不局限于大肠杆菌、放线菌、枯草杆菌等细菌；黑曲霉、啤酒酵母、甲醇酵母等工业真菌。下面结合具体实验，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989) ； ((DNA克隆》第I和II卷 (D. N. Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M. J. Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B. D. Hames 和S. J. Higgins编辑· 1984)；《蛋白质纯化原理和实践》第2版(Springer-Verlag, N. Y.)， 以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D. C. Weir和C. C. Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。一.以人肝为模型的研究工作利用质谱技术鉴定了 1，300多条乙酰化短肽，并与1047条不同的人类蛋白相对应，其中包括以前尚未报道发现乙酰化的703个蛋白(实验1. 1)。进一步分析发现，人肝组织中参与糖酵解(glycolysis)、糖异生(gluconeogenesis)、三羧酸循环(tricarboxylic acid (TCA) cycle)、尿素循环(urea cycle)、脂肪酸代谢(fatty acidmetabolism)和糖元代谢(glycogen metabolism)的几乎所有的酶都是被乙酰化的(实验1. 2)。进而鉴定了其中四条途径(脂肪酸氧化、三羧酸循环、尿素循环和糖异生)上各一个代表性的酶(实验见第三部分)。其中对这些蛋白脱乙酰化起主要作用的有组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase HDAC I and II)(抑制剂 trichostatin A，TSA)和 SIRT 家族脱乙酰酶(SIRT family deacetylases)(抑制剂烟酰胺，NAM)(实验1. 3)。发明人进而发现，代谢燃料如葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的浓度影响代谢酶的乙酰化状态(实验1. 4)。实验1. 1 人肝蛋白质“乙酰化组”为了研究非核蛋白乙酰化修饰，发明人对人肝组织进行了亚细胞分级分离，获得了细胞核、线粒体和细胞质三种组分。线粒体和细胞质蛋白先用胰蛋白酶处理，然后用乙酰化赖氨酸抗体进行富集和纯化，得到乙酰化肽段。随后，利用多维色谱-串联质谱联技术 (LC/LC-MS/MS)进行鉴定，结果鉴定了 1300多个乙酰化肽段，这些肽段代表了 1047个不同蛋白，其中703个蛋白首次发现乙酰化修饰现象。Kim等人在小鼠肝脏中鉴定了 195个乙酰化蛋白，其中135个(70%)也被发明人的实验所证实，说明发明人的蛋白质组实验的覆盖率较高。Choudhary等在人白血病细胞株中发现了 1750个乙酰化的蛋白，但只有240个出现在发明人的质谱数据中。这三组数据的比较结果表明蛋白乙酰化修饰在人和小鼠的肝脏中比较类似，但在肝脏和白血病细胞中差异较显著。实验1. 2 人肝蛋白中参与中间代谢的酶绝大部分被乙酰化
本实验比较了乙酰化蛋白和肝脏全蛋白质组，发现较多的参与中间代谢的酶蛋白被乙酰化修饰。事实上，糖酵解、糖异生、三羧酸循环、尿素循环、脂肪酸代谢以及糖原代谢途径的所有酶都存在乙酰化修饰。这可能是由于只有少量的核糖体蛋白被乙酰化修饰(80 个胞质核糖体蛋白只有7个被乙酰化修饰)，降低了核糖体蛋白在总乙酰化修饰蛋白中的丰度，使得其他乙酰化修饰蛋白能被鉴定。这些结果表明发明人发现的乙酰化修饰不仅在细胞内普遍存在，而且在细胞代谢中很可能有很广泛的调节作用。因此发明人研究了四个代谢途径上的一些关键酶的乙酰化修饰作用。实验1. 3 人肝组蛋白脱乙酰酶histone deacetylase HDAC I and II (抑制剂 trichostatin A，TSA)和 SIRT 家族脱乙酰酶 SIRT family deacetylases (抑制剂烟酰胺， NAM)对代谢酶的脱乙酰化作用酰辅酶A水合酶/3-羟酰基-辅酶A脱氢酶(巴豆酸酶，enoyl-Coenzyme Ahydra tase/3-hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase,EHHADH,EC 1.1.1.35)是被乙酰化修饰的。用人肝组蛋白脱乙酰化酶HDAC I and II抑制剂曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA) 和SIRT家族脱乙酰化酶抑制剂烟酰胺(nicotinamide，NAM)处理细胞后，EHHADH的乙酰化水平增加了 80% (图3A)。曲古抑菌素A和烟酰胺处理可使EHHADH的第171位赖氨酸乙酰化水平从43. 5% 增加到62%，第346位赖氨酸乙酰化水平从46. 8%增加到77. 8% (图3B)。同时相应的非乙酰化肽段由于曲古抑菌素A和烟酰胺的处理而降低。EHHADH突变体(四个推测的乙酰化修饰赖氨酸残基都被替换成谷胺酰胺， EHHADH4KQ)的乙酰化修饰水平降低，而且活力不再受曲古抑菌素A和烟酰胺的调节(图 3C)。另外，曲古抑菌素A和烟酰胺处理细胞可使苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH, ECl. 1. 1. 37)的乙酰化水平从26. 9%增加到67. 4%，而且出现三重和四重乙酰化修饰现象(图3E和3F)。在HEK293T细胞中，曲古抑菌素A和烟酰胺处理可激活野生型MDH，但不能激活突变体(四个乙酰化修饰赖氨酸残基都被替换成精氨酸)(图3H)。免疫印迹分析显示曲古抑菌素A和烟酰胺处理使精氨(基)琥珀酸裂解酶 (argininosuccinate lyase, ASL, EC4. 3. 2. 1)第 288 位赖氨酸乙酰化水平增加了 2. 8 倍 (图4B)。培养基中添加氨基酸降低了 ASL总体乙酰化水平以及第288位赖氨酸乙酰化水平(图4C)。曲古抑菌素A和烟酰胺处理导致ASL活力下降，而添加氨基酸会使其活力上升，表明乙酰化修饰抑制了 ASL的活力(图4D和图4E)。ASL突变体(第288位赖氨酸残基替换成精氨酸)则没有类似的现象(图4D和图4E)。曲古抑菌素A和烟酰胺处理HEK293T和Chang肝细胞导致酸磷烯醇丙酮酸羧激酶 (phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCKl，EC4. 1. 1. 32)含量下降 70% (图 5)。即使在不含葡萄糖培养基或添加氨基酸条件下，曲古抑菌素A和烟酰胺处理 都会导致PEPCKl失去稳定性。此外，曲古抑菌素A和烟酰胺处理不能改变突变体PEPCK13KR(3 个赖氨酸残基都被突变成精氨酸)的稳定性。实验1. 4 人肝细胞中代谢酶乙酰化与代谢燃料的关系培养基中添加脂肪酸可使EHHADH的乙酰化水平和活力分别增加1. 7倍和1. 3倍(图3D)。因此，EHHADH的乙酰化水平能被细胞外燃料调节，说明乙酰化修饰在生理方面具有调节EHHADH和脂肪酸代谢的作用。高浓度的葡萄糖提高细胞内MDH的乙酰化水平约60% (图3G)。因此外源氨基酸可能通过对第288位的赖氨酸残基脱乙酰化修饰来激活ASL。发明人检测了葡萄糖对ASL活力和乙酰化水平的影响，发现葡萄糖使ASL乙酰化水平增加了 2. 7倍(图4F)，同时使其活力降低了 50% (图4G)。ASL受氨基酸和葡萄糖共同调节现象说明乙酰化修饰在不同代谢途径协调过程中具有非常重要的作用。高浓度的葡萄糖提高细胞PEPCKl乙酰化水平(图5A)，但不含葡萄糖培养基中添加氨基酸则降低PEPCKl乙酰化水平(图5B)。PEPCKl在不含葡萄糖培养基生长的细胞中较稳定，但在高糖培养基中不稳定(图 5E)。二.以鼠伤寒沙门氏菌为模型的研究工作 利用质谱技术鉴定了 235条乙酰化短肽，并与191条不同的沙门氏菌蛋白相对应(表2，仅仅要说明部分)发明人的结果显示鼠伤寒沙门氏菌的中心代谢酶被广泛地乙酰化(90% )([实验2. 1])。进一步生理和遗传研究证明在沙门氏菌中，对中心代谢酶起乙酰化和脱乙酰化修饰的是一对乙酰化酶(Pat)和NAD依赖的脱乙酰化酶(CobB)[实验 2. 2]，其生理功能是协同调控细菌对不同碳源转换的适应[实验2. 3]，而这一调控的结果得到细胞代谢流实验的佐证[实验2. 4]。总之，响应不同的碳源(发酵型碳源葡萄糖经酵解(glycolysis)相对于氧化型碳源柠檬酸经糖异生(gluconeogenesis))，细菌细胞中心代谢途径酶的乙酰化、细胞的生长和细胞中中心代谢物的代谢流的状态，这三者又表现出一些一致的差异。进一步的实验还说明，Pat和CobB的转录在不同的碳源上具有不同特征 (Pattern)[实验2. 5]，说明其表达有可能受碳源的差异调控。为得到乙酰化调控的直接证据，发明人进一步鉴定了其中控制糖酵解和糖异生方向的关键酶(磷酸甘油醛脱氢酶-glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GapA))以及决定三羧酸循环和乙醛酸旁路分叉点方向的两个关键酶(异柠檬酸裂解酶-isocitrate lyase (AceA)和异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酯酶-isocitrate dehydrogenase (ICDH) kinase/phosphatase (AceK))。总之，代谢酶的可逆乙酰化，保证了细胞能够通过及时地感受细胞内部的能量状态和灵活地改变反应速度或方向来响应外部环境的变化。它代表了一种从细菌到人类都保守的代谢调控机理。实验2. 1沙门氏菌在不同碳源上生长条件下的蛋白质“乙酰化组”为了研究原核生物中赖氨酸乙酰化修饰对代谢的整体调控机理，发明人分别在发酵性碳源葡萄糖和非发酵性碳源柠檬酸两种生长状态下检测了 S. enterica蛋白总的乙酰化状态。利用乙酰化赖氨酸特异性抗体来免疫沉淀分离被乙酰化修饰的肽段，并结合高分辨率的质谱技术，共鉴定到S. enterica中191个蛋白的235个肽段是被乙酰化修饰的。其中有50%的乙酰化蛋白是各种代谢相关的，且发现中心代谢90%以上的酶类是被乙酰化修饰的(图1A)。利用SILAC定量分析技术发现15个中心代谢相关酶在响应不同碳源时它们的乙酰化状态发生了改变，这些结果表明S. enterica在以葡萄糖为碳源时其乙酰化水平要高于以柠檬酸为碳源(图1B)，这一点与发明人计数检测到的乙酰化肽段结果相一致。实验2. 2生理和遗传实验证明Pat和CobB是沙门氏菌中负责对代谢酶乙酰化和脱乙酰化修饰的一对酶在以葡萄糖为碳源时，相对于野生型的S.enterica，Δ pat (乙酰基转移酶敲除突变株)菌株中心代谢酶类的乙酰化水平是降低的，而AcobB(去乙酰化酶敲除突变株)菌株中心代谢酶类的乙酰化水平则是上升的(图1B)。当以柠檬酸为碳源时，AcobB菌株中心代谢酶类的乙酰化水平也比野生型高(图1B)。另一方面，AcobB和Apat菌株的核糖体蛋白的乙酰化水平则没有发生变化，这支持了一个概念——Pat和CobB是负责对S. enterica 的中心代谢酶进行可逆乙酰化和脱乙酰化修饰的一对主要修饰酶。 实验2. 3 Pat和CobB的生理功能适应碳源的转换一生长实验通过比较野生型，Apat和AcobB菌株在不同碳源下的不同生长状态，揭示了乙酰化修饰酶类在调控细胞适应不同碳源时的生理功能(图2)。在葡萄糖基本培养基中， Δ cobB菌株(高乙酰化水平)的生长要比野生型快，在柠檬酸基本培养基中却要比野生型长得慢(图2Α)，而Apat菌株(低乙酰化水平)却有着相反的生长状态(图2Α)，Apat/ Δ cobB双突变株的生长表型与Δ pat菌株比较相似，这说明了脱乙酰化酶CobB不能对没有被Pat乙酰化修饰的目标蛋白进行去乙酰化修饰(图2A)。用脱乙酰化酶CobB的抑制剂 (6)NAM(烟碱)对野生型菌株进行处理，这类似于脱乙酰化酶突变，发现菌株在柠檬酸基本培养基上的生长抑制比较明显，而在葡萄糖基本培养基上的生长受抑制则要轻微得多(图 2B)，这与S. enterica在葡萄糖为碳源时体内代谢酶类的乙酰化水平要高于柠檬酸为碳源时的结论相一致(图1)。实验2. 4 Pat和CobB的生理功能适应碳源的转换一代谢流实验发明人以13C标记的葡萄糖或柠檬酸为碳源，结合GC-MS技术来检测了 Pat和CobB 对S. enterica体内的代谢流分布调控的生理功能。发明人发现在葡萄糖和柠檬酸为碳源时，S. enterica具有不同的代谢流分布模式。在柠檬酸为碳源时，乙醛酸旁路被激活，且糖异生途径更活跃。发明人也定量比较了野生型，Δ pat和Δ cobB菌株的糖酵解(vGapA)，糖异生(vPckA)，三羧酸循环(vICDH)和乙醛酸旁路(vAceA)的代谢流来评价不同的代谢流和乙酰化状态。发现在葡萄糖为碳源时，AcobB菌株的糖酵解/糖异生代谢流比值要比Apat 菌株高出2. 07倍(图2D)，而野生型菌株的糖酵解/糖异生的代谢流比值要比AcobB菌株低47%，但要比Δ pat菌株高40. 7% (图2D)。以柠檬酸为碳源，Δ pat菌株的乙醛酸旁路 /三羧酸循环的代谢流比值要比Δ cobB菌株高出2. 21倍(图2D)，而野生型菌株的乙醛酸旁路/三羧酸循环的代谢流比值要比Apat菌株低55%，但要比AcobB菌株高43% (图 2D)。这些结果加上上述葡萄糖对中心代谢酶类乙酰化水平影响的结果(Fig 1)说明了碳源相关的乙酰化修饰会影响各种代谢酶的活力，进而调控代谢流分布。实验2. 5 Pat和CobB的转录在不同的碳源上具有不同特征(Pattern)发明人也研究了在不同碳源情况下pat和cobB的表达。通过实时反转录PCR分析，以16S rRNA为内参，发明人发现pat和cobB两个基因不管是在葡萄糖还是柠檬酸为碳源时，它们在对数期的转录要比其它生长时期活跃(Fig 4A)。同样，Pat和CobB的蛋白水平在对数期也是上升的(图4B，fig. S6)。在稳定期的情况下，S. enterica在葡萄糖和柠檬酸为碳源时的pat mRNA/cobB mRNA的比值相似。当将丰富培养基培养的菌转入葡萄糖基本培养基时，乙酰化水平在对数中期达到顶峰(图4A)，而将丰富培养基培养的菌转入柠檬酸基本培养基时，乙酰化在对数前期和早对数期均是下降的，然后逐渐回升并在对数后期和稳定期达到稳定(图4A)。这说明低水平的乙酰化对细胞高效利用柠檬酸是有利的。虽然其机理Pat和CobB的转录调控机理仍待发明人探究，但这些结果表明，Pat和CobB通过不同水平的蛋白表达(或相对于总细胞的活力)来响应不同的碳源，以转换不同代谢通路。三.乙酰化酶和脱乙酰化酶在代谢调控中的作用及其自身的表达调控和乙酰化靶点酶的功能验证

前述实验证明了对于中间(中心)代谢酶的可逆乙酰化是由乙酰化酶和脱乙酰化酶完成的，因此它们也就有可能成为控制代谢的重要操纵靶点，包括调控这些酶表达的调控蛋白或顺式作用位点序列。这些酶的抑制剂是已有的公共试剂，但是，也说明了为特殊作用，可以设计特殊的抑制剂。乙酰化相关酶类赖氨酸乙酰转移酶(Pat)依赖NAD的脱乙酰化酶(CobB) :Sir2家族酶。histone deacetylase HDAC I&II (抑制剂 trichostatin A，TSA)-组蛋白脱乙酰酶SIRT family deacetylases (抑制剂烟酰胺，NAM)-SIRT 家族脱乙酰酶2.靶点酶(被乙酰化和被脱乙酰化的代谢酶)和乙酰化位点，它们直接在代谢中发挥作用1).细菌的三个重要的酶细菌糖酵解/糖异生[实验3. 2. 1. 1]glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GapA)-磷酸甘油醛脱氢酶(K331)， 乙酰化调整酶反应方向乙酰化加强糖酵解，脱乙酰化加强糖异生。发明人将GapA在沙门氏菌pat、cobB突变菌株中表达并纯化，在体外用赖氨酸乙酰化修饰多克隆抗体进行免疫印迹检测，并以沙门氏菌野生型菌株中表达的目的蛋白作为对照。结果显示，GapA在cobB突变菌株中的乙酰化水平最高，野生型其次，pat突变株中的最低。利用在沙门氏菌野生型菌株中表达的GapA蛋白，发明人在体外分别用乙酰基转移酶Pat和去乙酰化酶CobB进行乙酰化和去乙酰化处理，以考察由于乙酰化修饰程度的变化所引起的酶活力的变化。结果显示，当用Pat提高GapA的乙酰化水平时，GapA的糖酵解方向的酶活性增加了 100%，而糖异生方向的酶活性降低了 30%。当用CobB对GapA进行去乙酰化后，GapA的糖异生方向的酶活性增加了 30%，而糖酵解方向的酶活性降低了 27%。此外，发明人结合质谱的结果，对GapA可能的乙酰化位点进行点突变，并考察对酶活力的影响。考虑到空间结构的缘故，由于谷氨酰胺Q的空间结构在质谱检测时类似于乙酰化修饰，所以发明人将赖氨酸K位点突变为Q，在体内模拟蛋白的乙酰化修饰，而将K位点突变为精氨酸R时，则该位点不能够被乙酰化修饰。结果显示，当GapA的K331位点突变为Q以模拟乙酰化修饰时，GapA的糖酵解方向的酶活力上升。细菌糖异生[实验3. 2. 1.2]isocitrate lyase (AceA)-异柠檬酸裂解酶(K308)乙酰化抑制乙醛酸途径
发明人将AceA在沙门氏菌pat、cobB突变菌株中表达并纯化，在体外用赖氨酸乙酰化修饰多克隆抗体进行免疫印迹检测，并以沙门氏菌野生型菌株中表达的目的蛋白作为对照。结果显示，AceA在cobB突变菌株中的乙酰化水平最高，野生型其次，pat突变株中的最低。而且，比较菌体在葡萄糖或柠檬酸培养基上生长的状况，前者的AceA乙酰化水平要比后者的高。利用在沙门氏菌野生型菌株中表达的AceA蛋白，发明人在体外分别用乙酰基转移酶Pat和去乙酰化酶CobB进行乙酰化和去乙酰化处理，以考察由于乙酰化修饰程度的变化所引起的酶活力的变化。结果显示，当用Pat提高AceA的乙酰化水平时，AceA的酶活性降低了 30%。当用CobB对AceA进行去乙酰化后，AceA的酶活性增加了 24%。此外，发明人结合质谱的结果，对AceA可能的乙酰化位点进行点突变，并考察对酶活力的影响。考结果显示，当AceA的K308位点突变为Q以模拟乙酰化修饰时，导致AceA 的酶活力下降。细菌三羧酸循环[实验3. 2. 1. 3] isocitrate dehydrogenase (ICDH) kinase/phosphatase (AceK) _ 胃月兑激酶/磷酸酯酶(K3)乙酰化抑制激酶，激活ICDH发明人将AceK在沙门氏菌pat、cobB突变菌株中表达并纯化，在体外用赖氨酸乙酰化修饰多克隆抗体进行免疫印迹检测，并以沙门氏菌野生型菌株中表达的目的蛋白作为对照。结果显示，AceK在cobB突变菌株中的乙酰化水平最高，野生型其次，pat突变株中的最低。而且，当菌体在葡萄糖或柠檬酸培养基上生长时，前者的AceK乙酰化水平要比后者的高。利用在沙门氏菌野生型菌株中表达的AceK蛋白，发明人在体外分别用乙酰基转移酶Pat和去乙酰化酶CobB进行乙酰化和去乙酰化处理，以考察由于乙酰化修饰程度的变化所引起的酶活力的变化。AceK的酶活力通过它对异柠檬酸脱氢酶IDH的磷酸化使IDH 失活来测定，IDH是TCA循环中的一个关键酶，催化异柠檬酸生成alpha酮戊二酸。结果显示，当用Pat提高AceK的乙酰化水平时，AceK对IDH的失活能力下降60%。而用CobB对 AceK进行去乙酰化，增强了 AceK对IDH的失活能力。2).人肝的四个重要酶脂肪酸氧化烯酰辅酶A水合酶/3-羟酰基-辅酶A脱氢酶(巴豆酸酶)(K165，171，346，584) 乙酰化激活[实验 3. 2. 2.1]烯酰辅酶A水合酶/3-羟酰基-辅酶A脱氢酶(巴豆酸酶，enoyl-Coenzyme Ahy dratase/3-hydroxyacyI-Coenzyme A dehydrogenase, EHHADH, EC 1. 1. 1. 35)在月旨肪酸氧化过程中催化2个步骤反应，此酶的缺陷导致脂肪酸代谢异常。发明人在EHHADH中发现了 4个赖氨酸残基被乙酰化修饰，免疫沉淀细胞内表达的带FLAG标签EHHADH后，利用免疫印迹验证了这4个乙酰化修饰位点。用人肝组蛋白脱乙酰化酶HDAC I and II抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)和SIRT家族脱乙酰化酶抑制剂烟酰胺(nicotinamide，NAM) 处理细胞后，EHHADH的乙酰化水平增加了 80% (图3A)。为了再次确认EHHADH的乙酰化修饰，发明人换用同位素标签技术结合免疫沉淀方法获得了胞内表达的EHHADH，并通过质谱(iTRAQ)进行了相对定量和绝对定量分析。结果表明曲古抑菌素A和烟酰胺处理可使 EHHADH的第171位赖氨酸乙酰化水平从43. 5%增加到62%，第346位赖氨酸乙酰化水平从 46. 8%增加到77. 8% (图3B)。同时相应的非乙酰化肽段由于曲古抑菌素A和烟酰胺的处理而降低。这些结果表明相当部分的EHHADH存在乙酰化修饰，而且此种修饰在体内是动态变化的。为了研究EHHADH乙酰化修饰与其酶活力的关系，发明人用曲古抑菌素A和烟酰胺处理Chang肝细胞，发现胞内EHHADH的活力增加了 2倍(图3C)。换用HEK293T细胞也获得了类似的结果(图3C右侧)。EHHADH突变体(四个推测的乙酰化修饰赖氨酸残基都被替换成谷胺酰胺，EHHADH4KQ)的乙酰化修饰水平降低，而且其活力不再受曲古抑菌素A和烟酰胺的调节(图3C)。培养基中添加脂肪酸可使EHHADH的乙酰化水平和活力分别增加 1. 7倍和1. 3倍(图3D。因此，EHHADH的乙酰化水平能被细胞外燃料调节，说明乙酰化修饰在生理方面具有调节EHHADH和脂肪酸代谢的作用。三羧酸循环 苹果酸脱氢酶(K185，K301, K307 and K314)，乙酰化激活[实验 3. 2. 2. 2]三羧酸循环中的全部7个酶都被乙酰化修饰，其中在苹果酸脱氢酶 (malatedehydrogenase，MDH，ECl. 1. 1.37)中有 4个赖氨酸残基(第 185、301、307 和 314位， 表S2和表3)都被乙酰化修饰。细胞中表达外源的MDH同样被乙酰化修饰，而且用曲古抑菌素A和烟酰胺处理后导致其乙酰化水平升高2.4倍(图3E)。为了验证MDH的乙酰化修饰， 发明人用傅立叶变换_离子回旋共振质谱法(FTICR)对MDH进行进一步分析。结果发现除了未修饰的全长的MDH峰还有2个额外的峰，这两个额外的峰质量分别递增了 42. OlDa，表明MDH存在相应的单乙酰化修饰和双乙酰化修饰(图3F)。曲古抑菌素A和烟酰胺处理细胞可使MDH的乙酰化水平从26. 9%增加到67. 4%，而且出现三重和四重乙酰化修饰现象。 随后的二级质谱分析确认了 MDH的4个乙酰化修饰赖氨酸残基中的3个。这些数据表明乙酰化修饰是MDH最主要的修饰，而且大部分MDH蛋白分子在细胞内能被乙酰化修饰。高浓度的葡萄糖提高细胞内MDH的乙酰化水平约60% (图3G)。抑制肝细胞脱乙酰化酶活力，导致胞内MDH活力增加2倍。在HEK293T细胞中，曲古抑菌素A和烟酰胺处理可激活野生型MDH，但不能激活突变体(四个乙酰化修饰赖氨酸残基都被替换成精氨酸) (图3H)。在体外用脱乙酰化酶(CobB)处理免疫沉淀获得的MDH导致其MDH活力下降(图 31)，表明乙酰化修饰直接激活MDH。此外高浓度葡萄糖刺激内源以及胞内诱导表达的野生型MDH活力，但对MDH突变体(MDH4KR，4个乙酰化修饰赖氨酸残基都被突变成精氨酸)却没有作用(图3J)。这些实验结果表明葡萄糖激活MDH部分原因是通过对MDH乙酰化修饰来进行的。尿素循环精氨(基)琥珀酸裂解酶(K69 and K288)，乙酰化抑制[实验 3. 2. 2. 3]尿素循环是解毒氨基酸代谢产物氨的必需途径。精氨(基)琥珀酸裂解酶 (argininosuccinate lyase, ASL, EC4. 3. 2. 1)发生突变导致尿素循环故障，进而使得精氨 [基]琥珀酸尿的产生发生紊乱。发明人鉴定了 ASL的2个乙酰化修饰位点(第69和288位)，并通过胞内表达外源ASL进行了验证(图4A)。免疫印迹分析显示曲古抑菌素A和烟酰胺处理使ASL第288位赖氨酸乙酰化水平增加了 2. 8倍(图4B)。培养基中添加氨基酸降低了 ASL总体乙酰化水平以及第288位赖氨酸乙酰化水平(图4C)。曲古抑菌素A和烟酰胺处理导致ASL活力下降，而添加氨基酸会使其活力上升，表明乙酰化修饰抑制了 ASL的活力(图4D和图4E)。ASL突变体K288R(第288位赖氨酸残基替换成精氨酸)则没有类似的现象(图4D和图4E)。限制性蛋白水解和圆二色谱分析表明ASL突变体K288R并没有改变ASL蛋白结构，因此外源氨基酸可能通过对ASL第288位的赖氨酸残基脱乙酰化修饰来激活ASL (图4E)。尿素循环产生的延胡索酸盐能进入三羧酸循环进而产生能量或进行糖异生 (RefS)。发明人检测了葡萄糖对ASL活力和乙酰化水平的影响，发现葡萄糖使ASL乙酰化水平增加了 2. 7倍(图4F)，同时使其活力降低了 50% (图4G)。体外用脱乙酰化酶CobB 处理哺乳动物细胞表达的ASL会导致其活力升高，表明乙酰化修饰直接使ASL失活。ASL受氨基酸和葡萄糖共同调节现象说明乙酰化修饰在不同代谢途径协调过程中具有非常重要的作用。当葡萄糖供应充分，为能量产生的氨基酸代谢合糖异生途径则受到抑制。当氨基酸供应充足而葡萄糖缺乏的情况下，细胞将通过增强尿素循环途径来利用氨基酸来产生能量。细胞可以利用乙酰化修饰协调各种代谢途径以获得在代谢方面的适应。糖异生酸磷烯醇丙酮酸羧激酶(K70，K71和K594).乙酰化降低酶稳定性[实验 3. 2. 2. 4] 酸磷烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK 1， EC4. 1. 1. 32)是糖异生途径中关键的受调节的酶。通过质谱分析，发明人发现PEPCKl有3个赖氨酸残基被乙酰化修饰(分别为第70、71和594位)。高浓度的葡萄糖提高细胞PEPCKl 乙酰化水平(图5A)，但不含葡萄糖培养基中添加氨基酸则降低PEPCKl乙酰化水平(图 5B)。这些结果表明细胞可能根据胞外燃料的情况通过调节PEPCKl乙酰化修饰来调节糖异生途径。发明人发现内源PEPCKl的表达受胞外高浓度葡萄糖抑制。此外用曲古抑菌素A 和烟酰胺处理HEK293T和Chang肝细胞导致PEPCKl含量下降70% (图5D)。PEPCKl在不含葡萄糖培养基生长的细胞中较稳定，但在高糖培养基中不稳定(图5E)。即使在不含葡萄糖培养基或添加氨基酸条件下，曲古抑菌素A和烟酰胺处理都会导致PEPCKl失去稳定性。 这些结果表明乙酰化修饰可以调节PEPCKl的稳定性。发明人分别将质谱鉴定的3个乙酰化修饰位点的赖氨酸残基全部突变成精氨酸(PEPCK13KR)或者谷胺酰胺(PEPCK13KQ)，以此来去除或者是模仿乙酰化修饰。结果显示突变体PEPCK13KR稳定性高于野生型PEPCK1， 而突变体PEPCK13KQ仍然不稳定(图5F)。此外，曲古抑菌素A和烟酰胺处理不能改变突变体PEPCK13KR的稳定性。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的， 即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。参考文献
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权利要求
1.调节蛋白乙酰化水平的物质在制备用于调节生物能量代谢的物质中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调节酶乙酰化水平的物质选自乙酰化酶或脱乙酰化酶、增强或抑制乙酰化酶或脱乙酰化酶基因转录、翻译或表达的物质、增强或抑制乙酰化酶或脱乙酰化酶的酶活性的物质。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乙酰化酶或脱乙酰化酶选自赖氨酸乙酰转移酶、依赖NAD的脱乙酰化酶、组蛋白脱乙酰酶或SIRT家族脱乙酰酶。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白是参与糖酵解、糖异生、三羧酸循环、尿素循环、脂肪酸代谢、糖元代谢的酶。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述酶选自磷酸甘油醛脱氢酶、烯酰辅酶A 水合酶/3-羟酰基-辅酶A脱氢酶、苹果酸脱氢酶、精氨基琥珀酸裂解酶、酸磷烯醇丙酮酸羧激酶、异柠檬酸裂解酶、或异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酯酶。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物是细菌或哺乳动物。
7.调节蛋白乙酰化水平的物质在制备用于改善或缓解与代谢相关的疾病或失调的物质中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述与代谢相关的疾病或失调是不受控细胞增殖性疾病、或与糖类代谢和/或脂类代谢相关的失调或疾病。
9.调节蛋白乙酰化水平的物质在制备用于抑制病原微生物的生长或休眠的物质中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述病原微生物选自胞外感染菌或胞内感染菌。
11.调节蛋白乙酰化水平的物质用于改良实验室或工业菌种的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述实验室或工业菌种选自工业细菌或工业真菌。
全文摘要
本发明涉及蛋白质赖氨酸乙酰化修饰对代谢的调控及其应用。通过调节底物蛋白的乙酰化水平，能够实现对细胞代谢的调控，进而改善或缓解与代谢相关的疾病或失调，或者抑制致病菌的生长，提高工程菌对目标产物的表达水平。
文档编号A61K45/00GK102151335SQ20101010992
公开日2011年8月17日 申请日期2010年2月12日 优先权日2010年2月12日
发明者姚玉峰, 张雅坤, 徐薇, 曾嵘, 李亦学, 杨琛, 熊跃, 王启军, 管坤良, 蒋文卿, 赵世民, 赵国屏 申请人:上海交通大学, 上海人类基因组研究中心, 中国科学院上海生命科学研究院, 复旦大学