专利名称：重组杆状病毒及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种含猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性 克隆的重组杆状病毒及其构建方法和应用。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征，即猪“蓝耳病”病原，于上世纪八十年代末首先发现 于美国，九十年代初相继分离于欧洲和美国。PRRSV属于套式病毒目(Nidovirales)，与马 动脉炎病毒(Equine arteritis virus, EAV)、猴出血热病毒(Simian hemorrhagic fever virus, SHFV)禾口 HILSI月兑fiBlit"(Lactate dehydrogenase-elevating virus, LDV) 一起形成动脉炎病毒科。根据病毒的血清学和遗传学特征，将病毒分成两型，即PRRSV I型(欧洲型，代表株为Lelystad Virus)和PRRSV II型(美洲型，代表株为VR-2332)，两 株间基因组的同源性约为63%。PRRSV基因组为一单股正义RNA，长约15Kb，有5，端帽状 结构和3，poly(A)尾，含9个开放性阅读框(open reading frames, ORFs)。左端占基因 组总长四分之三的ORF Ia和Ib编码病毒的非结构蛋白，其余的0RF(2a，2b和3-7)编码病 毒结构蛋白。结构蛋白的表达需要通过不连续转录(discontinuous transcription)产生 至少七个亚基因组mRNA(subgenomic mRNA，sgmRNA)，这与冠状病毒中结构蛋白的表达机制 相同。非结构蛋白与病毒基因组的复制和亚基因组mRNA的转录相关。结构蛋白中，GP2a、 GP3、GP4和GP5是4种膜糖蛋白；M蛋白是非糖基化的膜蛋白，N蛋白是核衣壳蛋白，以及新 发现的E蛋白是由0RF2b编码的73个氨基酸的非糖基化。根据病毒粒子中蛋白的含量，可 将结构蛋白分成主要结构蛋白(包括GP5、N和M蛋白)和次要结构蛋白(包括GP2a、GP3、 GP4和E蛋白)。结构蛋白中，GP5和GP3可诱导机体产生保护性免疫反应。ItMMi^IiE (Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 是导致养猪业损失惨重的一种主要传染病，世界各国猪场普遍流行。我国自1996年郭宝清 等从猪群中分离出PRRSV以来，各地陆续报道存在PRRSV感染，如今我国猪群中的PRRSV感 染率高达90%。特别是2006年我国华东和南方部分地区爆发的“猪高热综合征”，导致了 约3000万头生猪死亡，沉重打击了我国养猪业。调查认为，高致病性PRRSV是其主要致病原 之一。目前，我国预防PRRS的主要途径是接种疫苗，商品化的疫苗有CH-Ia株和NVDC-JXA1 株，弱毒活疫苗有CH-IR株和JXAl-R株。由于PRRSV的易感细胞仅有猪肺泡巨噬细胞和 MA104及其衍生细胞系Marc-145。猪肺泡巨噬细胞为原代细胞，不易获得大量细胞用来生 产疫苗，且质量也难以控制。而用于生产疫苗的基质细胞MA104和Marc-145细胞都为美国 勃林格公司专利所限制。因此，有必要寻找一种新的无需通过MA104细胞或Marc-145细胞 的途径来呈递或生产PRRSV。病毒反向遗传技术的兴起极大地促进了病毒的研究。现代病毒的研究，已越来越 依赖于病毒的反向遗传技术。通过建立病毒的感染性克隆，并在克隆的特定区域进行突变、 缺失、插入及置换等操作，来解析特定基因的功能、突变蛋白对病毒的影响、寻找病毒的毒力决定因子及作为病毒疫苗的研发平台等。在利用感染性克隆拯救病毒中，体外实验常用 脂质体转染细胞产生病毒，也有将感染性克隆直接注射入体内或通过基因枪或电击接种体 内产生病毒，但效率低，操作繁琐，难以将感染性克隆作为疫苗推广使用或在非敏感细胞上 产生病毒来研究非细胞培养病原。大的DNA病毒，如禽痘病毒、腺病毒、伪狂犬病毒和杆状病毒等，常作为异源蛋白 的真核表达载体，在真核细胞中表达功能性蛋白，或作为疫苗载体，在机体中表达呈递异源 蛋白刺激免疫反应。但是，到目前为止，还没有出现含猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感 染性cDNA克隆的重组杆状病毒的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能有效呈递感染性PRRSV的重组杆状病毒， 该重组杆状病毒包含猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染性克隆，在昆虫和哺乳细胞中都能成 功表达出感染性PRRSV颗粒。此外，还需要提供一种上述重组杆状病毒的构建方法和应用。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了 一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒包含编码猪繁 殖与呼吸综合征病毒感染性病毒颗粒蛋白的核苷酸序列。优选的，所述重组杆状病毒包含SEQ ID NO. 1所示的猪繁殖与呼吸综合征病毒全 基因组序列。更优选的，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列置于CMV启动子的控 制下，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列的3’末端添加有丁型肝炎病毒的核酶序 列。最优选的，所述重组杆状病毒的保藏号为CCTCC V201005。杆状病毒常作为异源蛋白的真核表达载体，在真核细胞中表达功能性蛋白，或作 为疫苗载体，在机体中表达呈递异源蛋白刺激免疫反应。由于杆状病毒不能在哺乳细胞中 复制和表达自身蛋白，因此是一种安全的基因治疗载体。优选的，本发明的杆状病毒是指苜蓿银纹夜蛾多形核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)。在本发明的另一方面，提供了一种包含上述重组杆状病毒的细胞。在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组杆状病毒的构建方法，包括以下步 骤构建含有猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性基因序列的供体质粒；将所述供体质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得包含猪繁殖与呼吸综 合征病毒感染性基因序列、以及杆状病毒全基因组序列的质粒，并将该质粒转染到sf9昆 虫细胞中，以获得重组杆状病毒。所述重组杆状病毒中，猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性基因序列置于杆状病毒的 核多角体启动子的下游，形成核多角体启动子和CMV启动子串联的重组杆状病毒；猪繁殖 与呼吸综合征病毒感染性基因序列的3’端位于SV40转录终止/多腺苷加尾信号上游。在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组杆状病毒在制备预防或治疗猪繁殖 与呼吸综合征的疫苗中的应用。在本发明的另一方面，还提供了 一种上述重组杆状病毒用于建立体外病毒培养系
4统的用途。本发明重组杆状病毒，利用杆状病毒的呈递作用，在昆虫细胞、以及PRRSV敏感和 非敏感哺乳细胞中都能成功表达出感染性PRRSV颗粒，可用于研制PRRSV疫苗，避免利用哺 乳细胞作为基质细胞生产疫苗时的外源污染。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例1中PRRSV的RT-PCR检测图；图2是本发明实施例2阳性重组质粒pBacAPS的Sma I酶切鉴定图；图3是本发明实施例2重组bacmid的SF12-SR683和SF14413-SR15497引物的 PCR鉴定图；图4是本发明实施例2重组杆状病毒AcAPRRS的SF12-SR683和SF14413-SR15497 引物的PCR鉴定图；图5是本发明实施例2AcAPRRS和AcLacZ的生长曲线图；图6是本发明实施例2中sf9细胞上抗杆状病毒GP64单抗(AcVl)、抗PRRSV nsp2 单抗(Anti-nSp2)和抗N蛋白单抗(Anti-N)的染色结果图；图7是本发明实施例2PRRSV颗粒的电子显微镜图；图8是本发明实施例2sf9细胞上清中PRRSV RNA的RT-PCR检测图；图9是本发明实施例3Marc_145细胞上抗N蛋白单抗(anti-N)的染色图；图10是本发明实施例3Marc_145细胞上清中PRRSV的RT-PCR检测图；图11是本发明实施例3vASM与APRRS的5'末端和3'末端序列的比较分析图；图12是本发明实施例3vASM和APRRS在Marc_145上的空斑形态图；图13是本发明实施例3vASM和APRRS在Marc_145细胞上的一步生长曲线图；图14是本发明实施例4BHK-21细胞和vero细胞上抗N蛋白单抗染色图；图15是本发明实施例4AcAPRRS接种BHK-21细胞和vero细胞后产生的PRRSV曲 线图。
具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物 学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京 科学出版社，2004)中所述的方法进行。实施例IPRRSV感染性克隆pCAPRRS的构建根据GenBank 登录号为 GQ330474 的 PRRSV APRRS 全长序列、pCMV_Script 的载体 序列和丁型肝炎病毒(HDV)的核酶序列，设计合成8条引物；以一对引物从pCMV-Script 中扩增CMV启动子的序列，并克隆入pBluescript SK(+)中，再以一对从pAPRRS中扩增 PRRSV 5’端片段，并克隆入CMV启动子的下游；以双酶切将CMV启动子及5’序列片段置换 下pAPRRS中的T7及相应5，序列片段；以其余4条引物从pAPRRS中扩增PRRSV 3，端片 段，扩增获得的片段在PRRSV 3’末端加有HDV核酶序列，通过酶切将含核酶序列的3’片段 置换下相应的片段，获得的克隆称为pCAPRRS。以pCAPRRS转染MA-104细胞，通过免疫荧光和RT-PCR检测，证实pCAPRRS转染Marc_145细胞后，可产生PRRSV。具体过程如下1. 1引物设计根据GenBank 登录号为 GQ330474 的 PRRSV APRRS 全长序列、pCMV-Script 的载体 序列和丁型肝炎病毒(HDV)的核酶序列，设计合成8条引物，具体序列如下
引物名称引物序列(5’ -3’ ) 1. 2CMV启动子序列的克隆1. 2. IpCMV-Script 质粒的提取将含pCMV-Script的T0P10细菌接种含卡那霉素的LB液体，培养12h，按说明书以 华舜质粒小量抽提(W5002)提取pCMV-Script。1. 2. 2CMV启动子片段的扩增以PCMVF和PCMVR为引物，以5ng的pCMV-Script为模板，进行PCR。将PCR产物以的琼脂糖电泳，按说明书以博大泰克小量DNA片段快速胶回收试 剂盒回收约600bp目的片段。1. 2. 3CMV启动子片段的克隆以Not I酶切上述回收的CMV启动子片段，37°C酶切12h，以的琼脂糖电泳回 收酶切片段。同时以Not I和EcoRV酶切pBluescript SK(+)，并以的琼脂糖电泳回收 载体片段。以T4连接酶将酶切的CMV启动子片段和pBluescript SK(+)连接。16°C连接 过夜，转化T0P10感受态细胞，挑选氨苄抗性菌落，提取质粒，并以Not I和Xho I酶切筛选 阳性质粒。阳性质粒称为pBSCMV。1. 3 丁型肝炎病毒核酶序列的添加以5ng的pAPRRS为模板，以SF14413为上游引物，以PHDVRl为下游引物，进行PCR。将PCR产物以的琼脂糖电泳，按说明书以博大泰克小量DNA片段快速胶回收试 剂盒回收约IlOObp目的片段。以上轮回收PCR目的条带为模板，以SF14413为上游引物， 分别以PHDVR2和PHDVR3为下游引物，再进行二轮PCR扩增。以的琼脂糖电泳回收第三 轮PCR的目的条带，并以Xho I和Xba I酶切回收条带。37°C酶切12h，以的琼脂糖电 泳回收酶切片段。同时以Xho I和Xba I酶切pAPRRS，并以的琼脂糖电泳回收大的片 段。以T4连接酶将酶切的带核酶的3'端片段与pAPRRS连接。16°C连接过夜，转化T0P10 感受态细胞，挑选氨苄抗性菌落，提取质粒，并以SF14413与PHDVR2为引物PCR筛选阳性质 粒。阳性质粒称为pAPRRSr。
6
PHDVRl PIIDVR2
1. 4CMV启动子控制下PRRSV感染性克隆的构建1.4. IPRRSV 5'末端修饰序列的扩增与克隆为了将PRRSV全长克隆置于CMV启动子下游，以CMV-SFl和SR2573为引物，以5ng 的pAPRRS为模板，扩增PRRSV 5，端序列并同时引入酶切位点。以琼脂糖电泳回收目的片段，并以Sph I酶切该片段。37°C酶切10h，以琼 脂糖电泳回收酶切片段。同时，以Xho I酶切pBSCMV，回收后以T4 DNA聚合酶补平粘端， 再以Sph I酶切，琼脂糖电泳回收大片段。以T4 DNA连接酶将酶切后的5'修饰片段 和pBSCMV相连接，16°C连接过夜，转化TOPlO感受态细胞，挑选氨苄抗性菌落，提取质粒， 并以Mlu I酶切筛选阳性质粒。阳性质粒称为PCM5PS。1. 4. 2CMV启动子下全长PRRSV克隆的拼结以 Not I 和 Afl II 酶切 pCM5PS 和 ρAPRRSr。37°C酶切12h，以1 %琼脂糖电泳回收PCM5PS酶切后的小片段和pAPRRSr酶切后 的大片段，并以T4DNA连接酶将回收的两个片段连接，16°C连接过夜，转化T0P10感受态细 胞，挑选氨苄抗性菌落，提取质粒，并以Sma I酶切筛选阳性质粒。阳性质粒称为pCAPRRS。1.4. 3pCAPRRS感染性的鉴定参照说明书，以FuGENE HD将2 μ g pCAPRRS转染Marc_145细胞。转染3d后， Marc-145细胞明显细胞病变。将细胞上清在Marc_145细胞传一代，2d后即出现明显的细 胞病变。按说明书以QIAamp Viral RNA Mini Kit提取Marc-145细胞第一代及传代上清 中的RNA为模板，以Qst为引物，用Quant Revers Transcriptase作反转录。以SF14413 和SR15497为引物作PCR0将PCR产物以琼脂胶电泳，如图1所示出现约IOOObp的目的条带(箭头所指 的目的条带)，这表明pCAPRRS转染Marc-145细胞可产生感染性PRRSV。在图1中，“1”指 DNA MarkerDL2000, “2”指转染pCAPRRS的Marc-145细胞上清，“3”指传代上清。在实施例1中，将pAPRRS中的T7启动子更换为CMV启动子，并在3 ‘末端插入丁 型肝炎病毒核酶序列，获得pCAPRRS。将pCAPRRS直接转染Marc-145细胞，3天后出现细胞 病变，传代及RT-PCR证实产生了 PRRSV，表明pCAPRRS具有感染性。实施例2猪繁殖与呼吸综合征病毒重组杆状病毒的构建利用bac-to-bac系统，将pCAPRRS中PRRSV APRRS全长cDNA重组入杆状病毒中， 构建了重组杆状病毒AcAPRRS。AcAPRRS在sf9细胞上连续传5代，通过对嵌合处序列分析， 证实AcAPRRS具有较好的稳定性。比较了 AcAPRRS与空载体杆状病毒AcLacZ在sf9细胞上 的生长曲线，结果显示AcAPRRS具有与AcLacZ相近的生长动力特性。以RT-PCR和间接免 疫荧光检测了 PRRSV基因在sf9细胞中的转录和表达，结果显示，AcAPRRS感染sf9细胞后， 有低水平的PRRSV亚基因组转录和N蛋白的表达。通过PRRSV颗粒的浓缩与纯化，在电镜 下发现样品中存在PRRSV颗粒，并以RT-PCR检测到样品中存在PRRSV RNA,这表明AcAPRRS 感染sf9细胞后产生PRRSV。2. 1引物设计根据PCAI3RRS和bac-to-bac中pFastbac 1的序列，设计合成下列引物 2. 2重组供体质粒的构建以 Not I 和 Xho I 酶切 pCATORS 和 pFastbacl。37°C酶切12h，以的琼脂糖电泳回收pCAPRRS酶切后的大片段(含PRRSV全长 cDNA)和载体pFastbacl。并以T4 DNA连接酶将PRRSV全长cDNA片段和载体pFastbacl 相连接，连接产物转化大肠杆菌TOPlO感受态细胞。以质粒小量快速提取纯化试剂盒提取 重组质粒，并以Sma I酶切鉴定，pCAPRRS作为对照质粒，酶切结果见图2，鉴定阳性重组质 粒称之为pBacAPS，pBacAPS经Sma I酶切后的条带基本与pCAPRRS的相同，只有一条较 大，这是因为pFastbacl载体质粒比pBluescript SK(+)大所致，与预期结果一致。在图2 中，“ 1” 指 DNAMarker DL2000，“ 2，，指 pBacAPS 1，“ 3，，指 pBacAPS2，“ 4，，指 pBacAPS3，“ 5 ” 指 pCAPRRS，“6” 指 DNA Marker DL15000。pFastbacl 载体质粒可以将 PRRSV 全长 cDNA 转座 到杆状病毒的基因组中。2. 3重组bacmid的筛选以分光光度仪测定pBacAPS的浓度。按照上述转化方法，以Ing pBacAPS转化 DH10BacTME. coli感受态细胞。在本发明中，bacmid是指在杆状病毒表达系统中，一种含 有经修饰的杆状病毒AcMNPV全基因组DNA的质粒。以含卡那霉素(50 μ g/ml)，庆大霉素 (7 μ g/ml)和四环素(10 μ g/ml)的 LB 平板(含 100 μ g/ml 的 Χ-gal 和 40 μ g/ml IPTG)筛 选阳性菌落。挑选白色单菌落在上述三抗LB平板纯化一次。参照说明书，以碱裂解法分离 重组杆状病毒基因组(bacmid)，并以引物SF12-SR683和SF14413-SR15497作PCR检测。以SF14413-SR15497为引物的PCR如上例1. 4中所述方法。如图3a和3b所示，所鉴定的6个菌落，以SF12-SR683和SF14413-SR15497为 引物的PCR鉴定结果均扩增出目的条带，以SF12-SR683为引物扩增出的目的条带大小为 700bp (见图3a)，以SF14413-SR15497为引物扩增出的目的条带大小为IOOObp (见图3b)， 表明筛选得到的重组bacmid都含有PRRSV cDNA序列。在图3a和3b中，“ 1 ”指DNA Marker DL2000, “2” 指重组 bacmid-1，“3” 指重组 bacmid-2，“4” 指重组 bacmid-3，“5” 指重组 bacmi d-4，“ 6 ” 指重组 bacmi d_5，“ 7 ” 指重组 bacmi d_6，“ 8 ” 指 pBacAPS 对照，“ 9 ” 指 H2O 对 照。2. 4重组杆状病毒的获得与鉴定参照说明书，以S. N. A. P. MidiPrep Kit从IOOml培养物中提取重组bacmid,并 以分光光度计测定其浓度，以备转染之用。以SF-900II SFM培养的sf9细胞，分种于35mm培养皿。经过夜生长，细胞密度达
870%左右用于转染。按说明书操作，以6μ1 cellfectin将Iyg重组bacmind转染Sf9细 胞。转染后每天观察细胞，当细胞出现明显的病变，收获细胞上清，并添加FBS至终浓度为 2%, 一部分保存于4°C，另一部分冻存_75°C。重组杆状病毒称之为AcAPRRS，该重组杆状病 毒保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学 保藏中心)，其保藏号为CCTCC V201005，保藏日期为2010年2月25日，其分类命名为 Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus(AcMNPV)。将 AcAPRRS在 sf9 细胞上扩大培养，感染后5d收上清，添加2% FBS,冻存于-75°C。按照上述方法，提取DHlOBac Ε. coli中未重组的bacmid转染sf9细胞，获得的 杆状病毒称之为AcLacZ，以作为对照杆状病毒。按说明书，以DNeasy Tissue Kit 提取 AcAPRRS 基因组 DNA，以 SF12-SR683 和 SF14413-SR15497为引物，按2. 3所述方法作PCR检测，并以AcLacZ的DNA做对照。PCR产物 经1 %琼脂电泳，如图4a和4b所示，以AcAPRRS基因组DNA为模板可扩增出约700bp (见图 4a)和IOOObp (见图4b)的条带，而以AcLacZ基因组DNA为模板则未扩增出条带。这表明， AcAPRRS携带有PRRSV基因组cDNA。图4a是重组杆状病毒AcAPRRS的SF12-SR683引物的 PCR 鉴定图，其中，“1” 指 DNA Marker DL2000，“2” 指 AcAPRRS Pl，“3” 指 AcAPRRS P2，“4” 指pBacAPS对照，“5”指AcLacZ对照。图4b是重组杆状病毒AcAPRRS的SF14413-SR15497 引物的 PCR 鉴定图，其中，“1”指 DNA Marker DL2000，“2”指 AcAPRRS Pl，HAcAPRRSP2， “ 4 ” 指 pBacAPS 对照，“ 5 ” 指 AcLacZ 对照。2. 5重组杆状病毒在sf9细胞上的稳定性将AcAPRRS在sf9上连续传5代。将第5代上清接种Marc-145细胞，同时以AcLacZ 作对照。另以DNeasy Tissue Kit提取第5代AcAI3RRS基因组DNA，以引物PBacF350_CMVnR 和SF15008-M13R为引物分别扩增重组病毒中PRRSV 5'和3'嵌合序列。以DNA片段小量 快速回收试剂盒回收目的片段，以PBS-T载体克隆目的片段，筛选阳性克隆，委托上海桑尼 生物。16°C连接过夜，按上述方法转化ToplO感受态细胞，以含X_gal和IPTG的Amp平 板作蓝白斑法筛选阳性克隆。将阳性克隆委托上海桑尼生物公司测定序列。序列比较分析 表明，经sf9细胞传代后，重组杆状病毒中与PRRSV病毒嵌合处序列并未出现改变。3. 1. 8AcAPRRS与AcLacZ在sf9细胞上的生长曲线将AcAPRRS和AcLacZ以0. 1M0I (感染复数)接种35mm细胞培养皿中的sf9细胞， 27°C孵育lh，并以SF-900 II SFM洗两遍，每培养皿加入SF-900 II SFM 3ml，27°C培养。接 种后每24h收取细胞上清200 μ 1，保存于_75°C。以96孔板中的sf9细胞测定各点的每毫 升半数组织感染量(TCID5ciAil)。杆状病毒TCID5Q/ml的具体测定方法如下(a)以SF-900 II SFM将样品作10倍系列稀释，每个96孔板稀释四个样品。(b)向96孔板中每孔加入50 μ 1稀释病毒液。(c)再向每孔加入100 μ 1 Sf9细胞液(3 X IO5细胞/ml)。(d)上样后的96孔板置27°C培养箱中培养，1周后观察并记录细胞病变。(e)以Reed-Muench法计算病毒滴度，并以GraphPad Prism软件绘制病毒的生长 曲线。
9
AcAPRRS和AcLacZ的生长曲线如图5所示，在对数生长期，AcLacZ的增殖速度比 AcAPRRS稍快，但感染后96h，AcAPRRS和AcLacZ的滴度都可达到107TCID5(1/ml，且二者的峰 值滴度相近。这表明，长达16kb的PRRSV基因组cDNA的插入不影响重组杆状病毒的生产。2. 6间接免疫荧光(IFA)以0. 2M0I (感染复数)的AcAPRRS接种35mm细胞培养皿中的sf9细胞，同时以 0. 2M0I的AcLacZ和5M0I的PRRSV APRRS接种sf9细胞作为病毒对照，设一 35mm细胞培 养皿中的sf9细胞作为空白对照。接种3d后以抗PRRSV NSP2单抗(Anti_nsp2)、抗PRRSV N蛋白单抗(Anti-N)和抗杆状病毒GP64单抗(AcVl)作IFA检测NSP2蛋白和N蛋白的表 达。IFA方法如下将细胞以PBS洗一次，每平皿加入Iml冰甲醇在-20°C固定lOmin。以含的 Tween-20的PBS洗两次，每次5min。加入BSA 37°C封闭30min，用抗PRRSV N蛋白的特 异性单抗37°C孵育1. 5h，PBS洗5次，每次3-5min，再加入FITC标记羊抗鼠的二抗，37°C孵 育lh，PBS洗3遍后，在荧光显微镜下观察结果。如图6所示，以抗NSP2和N蛋白单抗作荧光染色，仅有AcAPRRS感染的昆虫细胞 呈阳性染色；以抗GP64单抗作荧光染色，则AcAPRRS和AcLacZ感染昆虫细胞呈阳性染色。 这表明，PRRSV不能感染sf9细胞，sf9细胞中出现的PRRSV蛋白是由于AcAPRRS所携带的 PRRSV基因组发生转录与表达所致。2. 7sf9细胞中产生的PRRSV颗粒纯化以0. 2M0I的AcAPRRS接种T75细胞培养瓶中的sf9细胞，接种7天后，收获细胞 上清，以2000rpm 4°C离心20分钟，然后IOOOOrpm 4°C离心30分钟(Sigma，H-12150)，取上 清。将上清以50，OOOXg 4°C离心lh(BeckMan，SW32 Ti)，二次离心以沉淀去除其中的杆状 病毒，上清在30%蔗糖垫上以106，750\8超速离心211出6010&111，SW32 Ti)，沉淀以STE缓 冲液重悬。收集的重悬液再在30%蔗糖垫上以106，750 Xg超速离心2h，沉淀以STE重悬。 将最终的重悬液滴一滴在铜网上，以的磷钨酸负染1分钟，在电子显微镜下观察。经过 浓缩和纯化的重悬液中，存在一些直径为45-60nm的颗粒(见图7)，与PRRSV颗粒大小一 致。为了检测AcAPRRS感染的sf9细胞上清经浓缩纯化的样品中是否存在PRRSV基因 组RNA，以北京天根公司RNApr印pure Cell/Bacteria Kit提取上清中的核酸。为了消除 样品中的DNA污染，在提取过程中使用DNase I。为了检测RNA，先使用Qst为引物作RT，再 以SF14413和SR15497为引物作PCR0为了检测是否存在DNA，直接以SF14413和SR15497 为引物作PCR。检测结果如图8，超离心样品经过DNase I消化后，PCR检测为无条带(图8 中“2”)，而RT-PCR检测出现预期大小条带(图8中“1”)，这表明样品中含有PRRSV RNA0在实施例2中，通过bac-to-bac系统获得了重组杆状病毒AcAPRRS，通过传代后 序列分析证实AcAPRRS的稳定性；通过与AcLacZ的生长曲线比较分析，表明长达16kb的 PRRSV序列插入对重组杆状病毒的生产无影响；通过间接免役荧光证实，AcAPRRS携带的 PRRSV cDNA可在昆虫细胞中表达；通过病毒纯化和核酸检测，证实AcAPRRS感染的sf9细 胞上清中存在包装有PRRSV RNA的PRRSV颗粒。实施例3Marc_145细胞上产生感染性猪繁殖与呼吸综合征病毒将重组杆状病毒AcAPRRS接种Marc_145细胞，3天后接种的Marc_145细胞出现细胞病变，以抗PRRSV N蛋白单抗作免疫荧光染色，出现荧光。将接种的Marc-145细胞上 清在Marc-145细胞上传代，传代接种细胞均能出现细胞病变。以RT-PCR检测接种与传代 的Marc-145细胞上清，样品均呈现PRRSV阳性。以上结果表明，AcAPRRS接种Marc_145细 胞后，能产生感染性PRRSV。将源自于AcAPRRS的PRRSV称之为vASM。比较了 vASM与亲本 毒株PRRSVAPRRS的一步生长曲线和空斑形态，结果显示，vASM与APRRS的生长特性相近。 5' -Race和3' -Race分析结果显示，vASM与APRRS具有相同的末端序列。上述结果表 明，重组杆状病毒未改变携带外源病毒基因组的特性。3. 1引物设计本例所用引物如下 3. 2间接免疫荧光生长于6孔板中的Marc-145细胞，当生长成单层时，用PBS洗两次，以5M0I的 AcAPRRS 接种 Marc-145 细胞。同时以 5M0I 的 AcLacZ 和 0. 01M0I 的 PRRSV APRRS 作为对照 病毒接种Marc-145细胞。37°C吸附2h后，用PBS洗细胞一次，每孔加入3ml含2% FBS的 MEM,在37°C含5%的C02培养箱中培养3d后，以抗PRRSV N蛋白单抗按上例2. 6方法进行 IFA。IFA结果如图9，AcAI3RRS和AI3RRS接种Marc-145细胞出现阳性染色，而AcLacZ 接种细胞与阴性对照细胞一样，未显示荧光。这表明AcAPRRS接种的Marc-145细胞中出现 PRRSV N蛋白的表达，且AcAPRRS接种细胞的荧光染色率与APRRS接种细胞的荧光染色率相 近，显示AcAPRRS接种Marc-145细胞可能产生感染性PRRSV。3. 3AcAPRRS转导Marc-145细胞后子代PRRSV病毒的产生生长于35mm细胞培养皿中的Marc-145细胞单层，用PBS洗两次，以5M0I的 AcAPRRS接种Marc-145细胞，同时以另一 35mm培养皿中的Marc-145细胞接种AcLacZ作为 对照。37°C吸附Ih后，用PBS洗细胞一次，每培养皿加入3ml含2% FBS的MEM，37°C含5% 的CO2培养箱中培养。3d后AcAI3RRS接种的Marc-145细胞上出现细胞病变。4d后，AcAPRRS 接种的Marc-145细胞病变显著，而AcLacZ接种的Marc-145细胞未出现病变。收获上清，称 之为vASM，冻存于-75°C备用。再将vASM作1 100稀释，和AcLacZ转导Marc-145细胞上清(vALZ)原液分别感染Marc-145细胞，vASM接种的Marc-145细胞2d后即出现细胞病 变，3d后收获其上清。vALZ接种的Marc-145细胞至接种后7d未出现病变。按说明书，以 QIAamp Viral RNAMini Kit提取vASM第一代Fl及继代上清F2中的RNA为模板，按1. 4. 3 中所述方法，以Qst为引物用Quant Revers Transcriptase作反转录。以SF14413-SR15497 作为引物，作PCR检测。RT-PCR检测结果(见图10)显示，AcAPRRS接种的Marc-145细胞 的上清中的vASM与其传代均为PRRSV阳性，而AcLacZ接种的Marc-145细胞上清与传代均 为PRRSV阴性。这表明，AcAPRRS接种的Marc-145细胞产生感染性PRRSV。3. 35' -Race 禾口 3' -Race以 QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取 vASM在Marc-145 上原代(Fl)和第二代(F2) 的RNA，以大连宝生物公司的5' -Full Race Kit和3' -Full Race Core Set，按试剂盒 说明书进行5' -Race和3' -Race。具体方法如下。5' -Race 按试剂盒说明书，经过去磷酸化、“去帽子”和5' RACE Adaptor的连 接的RNA进行反转录反应。反转录反应条件如下30°C IOmin ；42°C Ih ；70°C 15min。反应结束后，cDNA冻存 于-30°C备用。以上述cDNA为模板，以5' outer primer和SR1124为引物进行第一轮PCR。以第一轮PCR产物为模板，以5' inner primer和SR683为引物进行第二轮PCR 的扩增。3' -Race (1)反转录反应。反转录反应条件为42°C Ih ；70°C 15min。反应结束后，cDNA冻存于_30°C备用。(2)以上述cDNA为模板，以SF14413和3' outer primer为引物，仅作一轮PCR。以的琼脂胶回收5' -Race和3' -Race的PCR目的条带，并以pBS-Τ载体 克隆，委托上海桑尼生物公司测序。序列分析结果如图11所示，在图11中，“A”为PRRSV APRRS末端序列，“B”为vASM Fl和F2的5，末端与APRRS 5，末端序列的比较，“C”为vASM Fl和F2的3，末端与APRRS 3，末端序列的比较，可见vASM Fl和F2序列与APRRS的末端 序列一致，这表明，AcAPRRS可介导产生的完整的PRRSV。3. 4空斑试验将vASM和PRRSV APRRS作10倍系列稀释至IO"5,分别取1(T3、IO"4和IO"5稀释病 毒液200 μ 1接种6孔板中的Marc-145细胞单层。37°C吸附Ih后，以PBS将细胞洗涤二 次，每孔加入5ml覆盖培养基(含2%FBS和琼脂糖)。在CO2培养箱中培养4天后，以 5%的结晶紫染色。空斑结果如图12，vASM所致空斑与APRRS所致空斑大小相近。3. 5—步生长曲线分别以5M0I的vASM和PRRSV AI3RRS接种35mm细胞培养皿中的Marc-145细胞单 层。接种Ih后以PBS洗细胞2次，每平皿加入3ml含2% FBS的MEM，置37°C C02中培养。 分别于接种后4h、8h、12h、16h、20h、24h和28h收获200ul细胞上清，同时补充200ul含2% FBS的MEM。收获上清冻存于_75°C，以96孔板中的Marc-145细胞测定不同时间点上清中 的病毒 TCID5Q/ml。PRRSV的TCID5Q/ml的测定方法如下
12
(a)以含2% FBS的MEM将样品作10倍系列稀释，每个96孔板稀释四个样品。(b)向96孔板中每孔加入50 μ 1稀释病毒液。(c)再向每孔加入100 μ 1 Marc-145细胞液(3 X IO5细胞/ml)。(d)上样后的96孔板置37°C CO2培养箱中培养，1周后观察并记录细胞病变。(e)以Reed-Muench法计算病毒滴度，并以GraphPad Prism软件绘制病毒的生长 曲线。生长曲线如图13，虽然在对数生长期APRRS的生长速度比vASM稍快，但在感染后 24h，vASM和APRRS都达到病毒滴度的峰值，且峰值滴度相近。在实施例3中，重组杆状病毒接种Marc-145细胞，出现N蛋白的表达，并可产生感 染性PRRSV。测定了 AcAPRRS介导产生PRRSV的末端序列，并比较了其与亲本株APRRS的一 步生长曲线和空斑，结果表明AcAPRRS介导产生的PRRSV与亲本株末端序列完全一致，生长 特性与亲本株也相近，这些表明AcAPRRS对携带的全长PRRSV cDNA的活性无影响。实施例4BHK-21细胞和vero细胞上产生感染性猪繁殖与呼吸综合征病毒将重组杆状病毒AcAPRRS接种BHK-21细胞和vero细胞。接种2天后，以抗PRRSV N 蛋白单抗作免疫荧光染色，出现荧光。将接种的BHK-21细胞和vero细胞上清接种Marc-145 细胞，2天后，Marc-145细胞出现细胞病变。以RT-PCR检测BHK-21细胞和vero细胞上清 及传代的Marc-145细胞上清，均呈PRRSV阳性。以上结果表明，AcAPRRS接种BHK-21细胞 和vero细胞后，可产生感染性PRRSV。以AcAPRRS接种BHK-21和vero后，测定了 PRRSV的 生产曲线，结果显示，PRRSV的滴度最高可达104TCID5Q/ml以上。4. IAcAPRRS转导BHK-21和vero细胞后PRRSV N蛋白的表达分种于6孔板中的BHK-21和vero细胞，当生长成单层时，用PBS洗两次，以5M0I 的 AcAPRRS 接种 BHK-21 和 vero 细胞。同时以 5M0I 的 AcLacZ 和 5M0I 的 PRRSV APRRS 作 为对照病毒接种BHK-21细胞。37°C孵育8h后，以PBS洗细胞二次，每孔加入3ml含2% FBS 的DMEM，在37°C含5%的C02培养箱中培养2d后，以抗PRRSV N蛋白单抗按上例3. 2所述 方法作IFA。IFA试验结果(图14)显示，仅有AcAPRRS接种的BHK-21细胞和vero细胞呈现阳 性染色，而其它细胞染色均呈阴性。这显示，PRRSV虽然不能感染BHK-21和vero细胞，但 AcAPRRS可介导其携带的PRRSV cDNA在其中表达。4. 2AcAPRRS 转导 BHK-21 和 vero 细胞产生感染性 PRRSV以5M0I的AcAPRRS接种35mm细胞培养皿中的BHK-21和vero细胞单层，同时以 AcLacZ作为对照病毒以5M0I接种BHK-21和vero细胞。37°C孵育8h后，以PBS洗细胞二 次，每孔加入3ml含2% FBS的DMEM。接种后3d收获细胞上清，并取一部分上清感染35mm 培养皿中的Marc-145细胞单层。感染2d后，接种过AcAPRRS的BHK-21和vero细胞上清 均能引致Marc-145细胞出现病变。3d后收获上清。按照上例3. 3所述方法，将BHK-21和 vero细胞上清及Marc-145细胞上清以QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA，以Qst为引 物，反转录为cDNA,以SF14413-SR15497为引物，作PCR检测PRRSV序列。PCR检测结果显 示，接种过AcAPRRS的BHK-21和vero细胞上清及其传代的Marc-145细胞上清均呈现PRRSV 阳性，而AcLacZ接种的BHK-21和vero细胞上清及其传代的Marc-145细胞上清则均为阴 性。这表明，AcAPRRS接种BHK-21和vero细胞后，可产生感染性PRRSV。
4. 3BHK-21细胞和vero细胞上PRRSV的生产曲线生长于35mm培养皿中的BHK-21细胞和vero细胞单层，以PBS洗两次后，均以5M0I 的AcAPRRS接种。37°C孵育8h后，以DMEM洗两次，每培养皿加入3ml含2%的DMEM，37°C 培养。在培养中，每8h收获细胞上清200μ 1，并相应补充200μ 1含2%FBS&DMEM。按上 例3. 5所述方法，以96孔板中的Marc-145细胞测定各点的PRRSV病毒滴度。如图15所示，BHK-21和vero细胞接种AcAI3RRS后，BHK-21细胞中产生PRRSV较 快，16h即出现PRRSV，而vero细胞出现PRRSV稍慢。但从产生的PRRSV最高滴度看，vero 细胞中产生的PRRSV滴度(104'28TCID50/ml)比BHK-21细胞中的(104 05TCID50/ml)略高。在实施例4中，以AcAPRRS接种BHK-21和vero细胞，以抗N单克隆抗体作间接免 疫荧光染色，证实了 BHK-21和vero细胞出现N蛋白的表达。将BHK-21和vero细胞上清 在Marc-145细胞上传代和RT-PCR检测，证实了 BHK-21和vero细胞虽不是PRRSV敏感细 胞，但经AcAPRRS转导，可产生感染性PRRSV。综上所述，将PRRSV感染克隆pAPRRS中T7启动子替换为CMV启动子，并在PRRSV cDNA3 ‘末端添加HDVr序列，获得的感染性克隆pCAPRRS直接转染Marc-145细胞可产生感 染性PRRSV。将CMV启动子控制下的全长PRRSV cDNA重组入杆状病毒，获得的重组杆状病 毒AcAPRRS在感染的昆虫细胞后，可表达携带的PRRSV基因，并产生PRRSV颗粒，这有利于 利用杆状病毒_昆虫细胞系统来研究体外非培养病毒。AcAPRRS接种Marc-145细胞后，可 产生感染性PRRSV，且来自AcAPRRS产生的PRRSV与其亲本病毒在生长特性上无差异，经杆 状病毒呈递后产生的PRRSV序列也无变异。此外，AcAPRRS接种PRRSV非敏感细胞后，也可 产生感染性PRRSV。这表明，可以利用杆状病毒来建立体外非培养病毒的培养系统，或利用 杆状病毒作为呈递系统接种机体，来研制疫苗，避免利用哺乳细胞作为基质细胞生产疫苗 时的外源污染。以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范 围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
1权利要求
一种重组杆状病毒，其特征在于，该重组杆状病毒包含编码猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性病毒颗粒蛋白的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒包含SEQID NO. 1所示的猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列。
3.根据权利要求2所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒 全基因组序列置于CMV启动子下游。
4.根据权利要求3所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒 全基因组序列的3’末端添加有丁型肝炎病毒的核酶序列。
5.根据权利要求4所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒的保藏号为 CCTCC V201005。
6.一种细胞，其特征在于，包含权利要求1至5中任一项所述的重组杆状病毒。
7.—种权利要求1所述重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤构建含有猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性基因序列的供体质粒；将所述供体质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得包含猪繁殖与呼吸综合征 病毒感染性基因序列、以及杆状病毒全基因组序列的质粒，并将该质粒转染到sf9昆虫细 胞中，以获得重组杆状病毒。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述重组杆状病毒中，猪繁殖与呼吸 综合征病毒感染性基因序列置于杆状病毒的核多角体启动子的下游。
9.权利要求1所述的重组杆状病毒在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中 的应用。
10.权利要求1所述的重组杆状病毒用于建立体外病毒培养系统的用途。
全文摘要
本发明公开一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒包含编码猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性病毒颗粒蛋白的核苷酸序列。本发明还公开了重组杆状病毒的构建方法及应用。本发明的重组杆状病毒，在昆虫细胞、以及PRRSV敏感和非敏感哺乳细胞中都能成功表达出感染性PRRSV颗粒，可用于研制PRRSV疫苗，以及建立体外培养病毒的培养体系。
文档编号A61K39/12GK101899421SQ20101011550
公开日2010年12月1日 申请日期2010年3月1日 优先权日2010年3月1日
发明者于丹丹, 刘萍, 刘长龙, 周艳, 孙志, 庄金山, 李燕华, 王小敏, 蔺涛, 袁世山, 邓宇, 郑浩, 郑海红, 韦祖樟, 高飞, 龙进学 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所