专利名称：甲苯酚三聚体类化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及苯酚三聚体类化合物以及用扩张青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006，保藏编号是CCTCC M 2010022)制备甲苯酚三聚体类化合物的方法；本 发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
关于甲苯酚三聚体类化合物的研究尚未见报道，有研究者在2007年报道了新颖 的甲苯酚二聚体，他们是从昆虫致病性真菌Cordyc印s sp. BCC 1861分到该类化合物，显 示了 良好的细胞毒禾口抗病毒活性(Rukachaisirikul, V ；Kaeobamrung, J ；Panwiriyarat, ff；Saitai, P ；Sukpondma, Y ；Phongpaichit, S ；Sakayaroj, J. New Diphenyl Ethers from the Insect Pathogenic Fungus Cordyceps sp.BCC 1861.Chem. Pharm. Bull. 2007,55(2) 304-307)。而关于甲苯酚三聚体及其生物活性未见任何报道。本发明人研究发现扩张青霉 菌 091006 (Penicillium expansum 091006，保藏编号是CCTCC M 2010022)的液体发酵产 物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞周期抑制活性，遂对其活性成分进行了研究，结果 发现了 6个新的甲苯酚三聚体类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见任何对这6个化合物 的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。
发明内容
本发明旨在提供一种结构独特的具有细胞增值抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿 瘤活性的新化合物。本发明的目的还在于提供一类新化合物的制备方法及其新化合物在制备肿瘤细 胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。本发明首次从发酵物中发现了结构新颖的甲苯酚三聚体类化合物，如式I、式II、 式III所示 其结构特征是式I、式II、式III化合物的基本骨架为甲苯酚三聚体，其中队为 氢、烃基、酰基，r2、R3为氢、烃基、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。优选的本发明化合物是所述的式I化合物1 4及式II化合物5、6的Ri、R2均为 氢，R3分别为
上述发明中最优选的化合物是由红树植物(海漆)共生真菌一扩张青霉 091006 (Penicillium expansum091006)的液体发酵物经硅胶柱层析，以石油醚、石油 醚-氯仿、氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱。氯仿-甲醇98 2的洗脱物，再经S印hadex LH-20(氯仿-甲醇1 1)，再经制备HPLC，以甲醇-水85 15洗脱分别得到化合物1 6。本发明采用MTT法测试了式I、式II化合物对HL-60、和A549细胞株的抗肿瘤活 性。实验证实，式I、式II化合物对HL-60肿瘤细胞有较好的增殖抑制作用，对A549也有一 定增殖抑制作用。因此本发明的式I、式II、式III化合物可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤 剂。式I、式II、式III化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗 肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。式I、式II、式III化合物还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学 研究，作为探针应用时，式I、式II、式III化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二 甲基亚砜的含水溶液中加以应用。本发明的式I、式II、式III化合物可通过微生物发酵培养，然后从发酵物中分离 纯化而得到；也可由上述优选化合物经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I、式II、式III化合物的方法 可采用其它任何能生产该类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可作为 生产菌用于制备式I、式II、式III化合物。本发明的实施例中列举了利用扩张青霉菌 (Penicillium expansum)091006制备本发明式I、式II、式III的优选化合物的实例，但本 发明制备的新化合物不只局限于本实施例中该化合物的制备方法和应用实例。该扩张青霉菌(Penicillium expansum)091006系从海南文昌头苑红树植物海漆 的根部分离得到的一株共生真菌，并经分类学研究鉴定为扩张青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)。该菌株已于2010年01月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(保 藏编号:CCTCC M 2010022)。该扩张青霉(Penicillium expansum)菌株091006具有如下形态学特征菌落 平坦铺展，粉状，略显絮状，有时集成壳状，中间稍突起，12-14天直径3-4厘米，暗粉色， 渐转为暗黄绿色，反面淡黄色转为深褐色；分生孢子梗100-120X500-750微米，壁光滑， 单生，间或有成束的；扫状枝长而排列不松散，一般在下部分枝1-2次；间枝3-6个，一般 10-15 X 2-3为微米，梗基3-5微米，小梗5-7，3-6微米，一般不做披针形；分生孢子椭圆形， 3-5微米，孢子结成链珠状，长而纠结。该扩张青霉(Penicillium expansum)菌株091006具有如下生理生化特征菌株 可以同化葡(萄)糖胺、D-树胶醛醣、树胶醛醣、杨梅苷、赤藻糖醇、葡(萄)糖酸、葡萄糖 磷酸盐、葡(萄)糖醛酸、丙三醇、葡(萄)糖酸、L-鼠李糖、核糖、柳醇、D-戊醛糖、氨基-丁酸、羟基丁酸、羟基丁酸、对羟苯基乙酸、金鸡纳酸、琥珀酸、琥珀酸甲基酯、 L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺酸、L-天(门)冬氨酸、L-谷氨酸、L-鸟氨酸、 L-苯基丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、2-氨基乙醇。该扩张青霉(Penicillium expansum)菌株091006具有如下分子生物学特征其 18S rRNA基因序列信息为(基因的GenBank号为DQ401105)CTGATGACTCGTGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCAGACCTCTCGGCCAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCCTAAGAAGCCAGCGGCCCGCAAATGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAACGGGTCATCATAGAATCCCGTCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGCCATGAGGTTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTTCTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTATCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGATTCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCGTTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCCTGAAGTCGGGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCCTTCGCAGTTTCACAGTATAAAGTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTAAT(KBr)vmax :3300、2960、2850、1600、1580、1508、1460、1380、1285、1100、1015、985、 840cm—1 ；1H及13C NMR数据分别见表1和表2。化合物4，无色油状物，HRESIMS :m/z 469. 2357 [M+Na]+ ；UV A max (MeOH) nm(log e ) 272(4. 15)nm ；IR(KBr) vmax :3300、2958、2850、1590、1500、1445、1385、255、1165、1072、980、 845CHT1 ；1H及13C_NMR数据分别见表1和表2。化合物5，无色油状物，HRESIMS :m/z 469. 2351 [M+Na]+ ；UV A max (MeOH) nm (log e ) 272(3. 56) ；IR(KBr)vmax :3360、2980、2850、1600、1505、1430、1385、1255、1160、1005、950、 840CHT1 ；H及13C-NMR数据分别见表1和表2。化合物6，无色油状物，HRESIMS m/z 469. 2350 [M+Na]+ ；UV A max (MeOH) nm(log e ) 272(3. 88) ；IR(KBr)vmax :3350、2960、2910、1595、1500、1440、1380、1287、1166、1019、980、 850cm"1 ；1H及13C-NMR数据分别见表1和表2。
表1.化合物1 6的1H NMR娄t据(600MHzin CH3COCH3"d6)
aRecorded inCDC13
表2.化合物1 6的13C匪Ri改据(150MHzin CH3COCH3"d6)
Recorded in CDC具体实施例方式在如下的实施例中所指的化合物的化学结构是(结构式中的阿拉伯数字是化学 结构中碳原子的标位)式I、式II化合物，其中氏为氢、烃基、酰基，R2、R3为氢、烃基、氨基、 羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。
式I式II其中式I化合物1 4和式II化合物4、5的礼、R2均为氢，R3分别为实施例1化合物1 6的发酵生产及分离精制1发酵生产生产菌的发酵培养按培养微生物的常规方法，扩张青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)适量，接种到PDA斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。取斜面培养4天的扩张青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)适量，接 种到装有150mL培养液(培养基组成甘露醇2.0%、麦芽糖2.0%、葡萄糖1.0%、KH2P04 0. 05%,MgS047H20 0. 03%、酵母膏 0. 3%、味精 1. 0%、玉米浆0. 1%、海水素 3. 3%、pH 6. 5) 的500mL锥型瓶中，在28°C、120转/分条件下摇床培养48小时，获得种子培养液。将该种 子培养液按5%接种量分别接种于装有300毫升生产培养液(培养基组成同上)的1000mL 三角烧瓶中，于25°C静置，进行为期30天的生产发酵，获得菌丝体和发酵液。2浸膏的获得用棉布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓缩至不含丙酮， 所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏。发酵液减 压浓缩为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共20克。3化合物的分离精制浸膏(20克)甲醇溶解后，加60克200-300目硅胶H(青岛海洋化工集团公司产 品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-氯仿、氯仿-甲醇为溶剂进 行梯度洗脱，分为9个流份。组分5 (氯仿-甲醇98 2洗脱物)，经S印hadex LH-20 (氯 仿-甲醇1 1)，再经HPLC，以甲醇-水85 15洗脱得化合物1 6。化合物1，无色油状物，[a ]2°D+4. 3(c 0. 09, MeOH) ；HRESIMS :m/z 501. 2636[M+Na]+ ；UV(MeOH)入 max(log e ) :274(3. 55)nm ；IR(KBr)vmax :3380、2950、2850、 1600、1508、1476、1380、1268、1154、1101、980011-1 ；1H 及 13C NMR 数据分别见表 1 和表 2。化合物2，无色油状物，[a ]2°D+7. 3(c 0. 03, MeOH) ；HRESIMS :m/z 487. 2442[M+Na]+ ； UV (MeOH)入 max(log e ) :272(4. 00) nm ； IR(KBr)vmax :3400、2980、2860、 1595、1500、1470、1385、1287、1100、980、85001^ ；1H and 13C_NMR 数据分别见表 1 和表 2。化合物3，无色油状物，HRESIMS m/z 469. 2359 [M+Na]+;UV 入 max(Me0H)nm(log ￡ ) 272(3. 76) ；IR
实施例2抗肿瘤活性的测试1实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物1、2、3、 5。准确称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供活性测试。细胞系及细胞的继代培养活性测试采用A549和HL-60细胞系。各种细胞均用含 10% FBS的RPMI-1640培养基，在37°C通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。细胞增殖抑制活性测试方法(MTT法)本发明采用MTT法，测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。活细胞 线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5_ 二甲基噻唑)-2，5_ 二苯基四氮唑为 蓝紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于 formazan的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物抑 制或杀伤肿瘤细胞的能力。活性测试时，取对数生长期的A549和HL60细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制 成密度为每毫升5 X 104个细胞的细胞悬液，按每孔200 u L接种于96孔板中，在37°C下培 养24小时后，每孔加入2 y L不同浓度的样品溶液，继续培养72小时。然后加入20y L含 MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培养4小时，移出150 y L培养液后加入150 u L DMS0溶 解formazan，在540nm处测定其吸收度。按照IR%= (0D s自对照-0D样)/0D s自对照X 100 % 式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR% )。2实验结果表3.化合物1 3、5的对人肿瘤细胞的增殖抑制活性(IC5(1，u M) a由于量的原因，化合物4、6未进行活性测试。3 结论化合物1、2、3、5对人来源的癌细胞具有抗肿瘤作用。其中化合物2对HL-60、A549 细胞表现出较强的抑制活性，因此，本发明的式I、式II、式III化合物可作为抗肿瘤剂(即 抗肿瘤药物)用于肿瘤的治疗，也可作为细胞增殖抑制的低分子生物探针用于探索生命现 象本质的生命科学实验研究中。
权利要求
式I、式II、式III化合物其中R1为氢、烃基、酰基，R2、R3为氢、烃基、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。FSA00000035960800011.tif
2.权利要求1所述的式I化合物，其中化合物1-4的礼、R2均为氧，R3分别为
3.权利要求1所述的式II化合物，其中化合物5、6的礼、R2均为氧，R3分别为
4.权利要求1所述的式III化合物。
5.权利要求2、3、4所述式I、式II、式III化合物的制备方法，其特征是发酵培养扩张 青霉真菌(Penicilliumexpansum) 091006，获取含有上述式I、II化合物的发酵物，然后从 发酵物中分离纯化出式I化合物1 4，式II化合物5、6。
6.权利要求5所述的制备方法，其中将所述发酵物经硅胶柱层析，以石油醚、石油 醚-氯仿、氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，氯仿-甲醇98 2的洗脱物，再经S印hadex LH-20柱层析，氯仿-甲醇1 1洗脱产物再经制备HPLC分离纯化，以甲醇-水85 15洗 脱分别得到化合物1 6。
7.权利要求6所述式I、II、III化合物的制备方法，其中所述甲苯酚三聚体类类化合 物的生产菌是扩张青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)，其保藏号为CCTCC M 2010022，其 18S rRNA 基因的 GenBank 号为 DQ401105。
8.权利要求1所述的式I、II、III化合物在制备细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中 的用途。
9.权利要求1所述的式I、II、III化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
10.权利要求10所述的菌株用于生产权利要求1所述的式I、II、III化合物的用途。
全文摘要
本发明涉及甲苯酚三聚体类化合物及其制备方法和用途。本发明用从红树植物海漆根部样品中分离得到的共生真菌-扩张青霉(Penicillium expansum)091006生产出结构新颖的上述类型的化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。
文档编号A61K31/09GK101875601SQ20101012717
公开日2010年11月3日 申请日期2010年2月22日 优先权日2010年2月22日
发明者付鹏, 刘培培, 卢圳域, 庄以彬, 张志华, 朱伟明, 林海鹏, 洪葵, 王乂 申请人:中国海洋大学;中国热带农业科学院热带生物技术研究所